CN112899364B - 一种检测lmna基因突变的引物探针组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物及其应用，所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物包括检测LMNA基因突变位点c.562C>G的实时荧光PCR引物和探针；所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；所述探针包括野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针；所述野生型LMNA的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型LMNA的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种检测LMNA基因突变的试剂盒和所述试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法。所述引物探针组合物灵敏性高，特异性好，应用价值高。

Description

一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物及其应用。
背景技术
扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy，DCM)是一种遗传异质性心脏疾病，主要临床表现为单侧或双侧心室扩张和收缩功能减弱，病理特征为心肌壁变薄、心室腔显著扩大并伴有血栓的形成，是导致心衰的最常见原因。该病发病率不低于1/2500，约30％～50％的患者为家族性遗传，称为家族性扩张型心肌病(Familial dilated cardiomyopathy，FDCM)。该病的遗传模式也有多种，常染色体显性遗传、常染色体隐形遗传、X连锁遗传和线粒体DNA遗传，其中最常见的是常染色体显性遗传和隐性遗传。
到目前为止，已经发现多个基因的相关位点突变可以引发DCM，主要致病基因编码的蛋白质有：β-肌球蛋白重链(MYH7)、心肌肌球蛋白结合蛋白C3(MYBPC3)、心肌肌钙蛋白T(TNNT2)、核纤层蛋白(LMNA)、肌钙蛋白I(TNNI3)、α-原肌球蛋白(TPM1)、α-心脏肌动蛋白(ACTC)、受磷蛋白(PLN)和肌营养不良蛋白(DMD)等。LMNA位于核膜内，由一个二维的矩阵蛋白构成，通过结蛋白(desmin)和粗肌丝及细肌丝发生作用。编码核纤层蛋白的LMNA基因定位于1q22，该基因变异不仅能导致营养不良症和家族性部分脂肪酸代谢障碍等疾病，还会引发骨骼肌和心脏传导阻塞。此外，众多证据表明，当LMNA基因突变后，LMNA基因介导的AKT-mTOR信号通路被激活，导致心肌细胞代谢紊乱、自噬功能受损和细胞供能不足，从而产生扩张型心肌病。
DCM死亡率较高，5年内的死亡率约为5％～15％，除心脏移植外，没有彻底的治疗方法，给家庭和社会带来了巨大的经济负担和沉重的精神压力。因此，对DCM的预防是关键。对DCM患者进行基因检测和家族筛查能够为临床诊断提供重要的指导作用，并且可以在症状发生前发现潜在的患病个体，进而对患病人群进行风险评估、危险分层和临床干预，最终降低患病人群的发病率或提高其生存率。
目前，遗传疾病基因突变的检测方法较多，如限制性片段长度多态性、SNP shot多重PCR技术、高分辨率溶解曲线分析、PCR扩增直接进行毛细管电泳测序和下一代测序技术等。上方法各有优缺点，毛细管电泳技术是基因突变检测的金标准，但因其对设备的要求高、费时费力、价格昂贵等缺点，很难从实验室普及到临床。CN101134960A公开了一种扩张型心肌病的LMNA基因突变及其检测方法，该方法利用普通PCR扩增技术结合Sanger测序技术，对LMNA基因877位碱基发生C→T杂合突变进行测序。该方法较为传统，过程繁琐，需要用到Sanger测序技术，耗时较长，且价格十分昂贵，不宜推广。
导致DCM发病的基因和突变位点较多，早期的分子检测和预防尤为关键。因此，如何建立一种简便、快速、经济和准确的DCM突变筛查方法，为DCM的预防、辅助临床诊断和预后评估提供技术支持，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物及其应用，通过使用不同的荧光报告基团分别标记野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针，再结合质控品的检测结果，可以准确分析样本LMNA基因的新突变位点c.562C>G的突变情况，结果准确，耗时较短，具有极高的应用价值。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物，所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物包括检测LMNA基因突变位点c.562C>G的实时荧光PCR引物和探针；
所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；
所述探针包括野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针；
所述野生型LMNA的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型LMNA的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：5'-CAGCTTCCTTCCAGTTCTTGTG-3'；
SEQ ID No.2：5'-GAAGTCCAGTTCCTCCTTCATG-3'；
SEQ ID No.3：ACTTCAGGATGAGATGCTGCGGC；
SEQ ID No.4：TTCAGGATGAGATGGTGCGGCG。
本发明中，所述野生型LMNA的探针为野生型LMNA的特异性探针，所述突变型LMNA的探针为突变型LMNA的特异性探针。
本发明中，所述实时荧光PCR引物的特异性很高，可以特异性扩增长度为169bp的目标序列，保证了结果的准确性；同时使用野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针，可以在一次实验中确定基因型，进而推测是否发生了c.562C>G突变及突变的类型，实现了新突变位点c.562C>G的快速灵敏检测，节约了试剂和时间；通过实时荧光定量的方法进行检测，操作更为简单快速，成本更低，耗时更短，应用价值更高。
优选地，所述探针为Taqman探针。
优选地，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团包括FAM和/或HEX。
优选地，所述淬灭基团包括MGB。
优选地，所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团与所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团不同。
优选地，所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团包括FAM。
优选地，所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团包括HEX。
第二方面，本发明提供了一种检测LMNA基因突变的试剂盒，所述检测LMNA基因突变的试剂盒包括第一方面所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物。
本发明中，通过将所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物制成试剂盒，配合检测试剂，可以对待测样本的LMNA基因的c.562C>G突变进行快速检测，结果准确性很高，操作更为简便，耗时更短，应用价值更高。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。
优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水。
优选地，所述染料包括Rox校正染料。
优选地，所述检测LMNA基因突变的试剂盒还包括质控品。
优选地，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品或杂合突变型质控品中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是野生型质控品、纯合突变型质控品、杂合突变型质控品、野生型质控品与纯合突变型质控品的组合、野生型质控品与杂合突变型质控品的组合、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品的组合或野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品的组合。
本发明中，所述质控品通过如下方法进行制备：
以野生型和/或纯合突变型的基因组作为模板，使用SEQ ID No.5～6所示的核苷酸序列进行PCR扩增。
SEQ ID No.5：5'-AGAGCTTGCAGTGAGCTGAGAT-3'；
SEQ ID No.6：5'-CTGAAACCTCTCGTTCTGAGGCTA-3'。
所述PCR扩增的程序包括：
预变性：
93～98℃，2.5～3.5min，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是2.5min、3min或3.5min；
循环扩增：
93～98℃，20～40s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
57～59℃，20～40s，温度例如可以是57℃、57.5℃、58℃、58.5℃或59℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
70～75℃，2.5～3.5min，温度例如可以是70℃、70.5℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃、74℃、74.5℃或75℃，时间例如可以是2.5min、3min或3.5min；
延伸：
70～75℃，4～6min，温度例如可以是70℃、70.5℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃、74℃、74.5℃或75℃，时间例如可以是4min、4.5min、5min、5.5min或6min；
所述循环扩增的次数为35～45次，例如可以是35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次或45次；
再对扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增产物连接到PMD-18T克隆载体上，再转化至大肠杆菌JM109中，经过挑选单克隆、提取质粒和测序验证，得到所述野生型质控品和/或纯合突变型质控品；
将所述野生型质控品和纯合突变型质控品按摩尔比为1:1混合，得到所述杂合突变型质控品。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
提取待测样本的基因组，使用所述检测LMNA基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，检测荧光信号，再进行分析。
本发明中，通过将待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，一方面，可以根据质控品的荧光信号判断反应体系及检测过程是否正确无误；另一方面，可以根据野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品中FAM和HEX的荧光强度进而确定待测样本的基因型，判断是否发生了突变及突变的类型，检测结果准确性好，操作简便，耗时较短。
优选地，所述待测样品包括外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓、肝脏或人工合成样本中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述扩增的程序包括：
预变性：
93～98℃，20～40s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
循环扩增：
93～98℃，3～7s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是3s、3.5s、4s、4.5s、5s、5.5s、6s、6.5s或7s；
57～59℃，30～40s，温度例如可以是57℃、57.5℃、58℃、58.5℃或59℃，时间例如可以是30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
延伸：60～67℃，2.5～3.5min，温度例如可以是60℃、60.5℃、61℃、61.5℃、62℃、62.5℃、63℃、63.5℃、64℃、64.5℃、65℃、65.5℃、66℃、66.5℃或67℃，时间例如可以是2.5min、3min或3.5min；
优选地，所述循环扩增的次数为35～45次，例如可以是35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次或45次。
优选地，所述分析包括：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
本发明中，根据待测样本的FAM和HEX的相对的荧光强度来判断待测样本的基因型：
FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱或无荧光信号，且与野生型质控品的检测结果一致，判定待测样本为野生型；
HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱或无荧光信号，且与纯合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为纯合突变型；
FAM与HEX的荧光信号强度相近，且与杂合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为杂合突变型。
作为优选技术方案，本发明所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)使用检测LMNA基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增的程序包括：
预变性：93～98℃，20～40s；
循环扩增：93～98℃，3～7s；57～59℃，30～40s；
延伸：60～67℃，2.5～3.5min；
所述循环扩增的次数为35～45次；
(3)检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物、第二方面所述的检测LMNA基因突变的试剂盒或第三方面所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法中的任意一种或至少两种的组合在制备检测LMNA基因突变的产品中的应用。
本发明中，所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物具有良好的特异性，所述检测LMNA基因突变的试剂盒重复性好，灵敏度高，所述检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法可以在一次检测中确定待测样本的基因型，并检测反应体系及检测反应的正确性，准确性好，检测用时较短，操作简单，制备成检测LMNA基因突变的相关产品，具有极高的应用价值。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物具有良好的特异性，可以检测样本的LMNA基因的新突变位点c.562C>G的突变情况，结果准确性好，且与传统的测序技术相比，检测时间更短，成本更低；
(2)本发明所述检测LMNA基因突变的试剂盒的扩增曲线正常，具有良好的扩增效率；标准曲线的R2值均不低于0.993，线性关系较好，灵敏度较高；批间变异系数不大于1.5％，批内变异系数不大于1.0％，重复性及稳定性均较好；特异性好，准确度高，满足试剂盒的相关标准；
(3)所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法操作简单，耗时较短，准确性高，并且可以一次性检测多个样本，成本较低，具有极高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中样本的基因组模板的扩增结果，图中，泳道M为DNA分子量marker，泳道1～3为样本的基因组模板的扩增结果，泳道4为体系中未添加模板的阴性对照组的扩增结果；
图2A为本发明实施例2中含有野生型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果图片；
图2B为本发明实施例2中含有突变型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果图片；
图3A为本发明实施例3中野生型质控品的扩增曲线图片，图中，从左至右依次为稀释了10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍和10-7倍的野生型质控品作为模板的扩增结果；
图3B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的扩增曲线图片，图中，从左至右依次为稀释了10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍和10-7倍的纯合突变型质控品作为模板的扩增结果；
图4A为本发明实施例3中野生型质控品的标准曲线图片；
图4B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的标准曲线图片；
图5A为本发明实施例3中野生型质控品的特异性验证的结果图片；
图5B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的特异性验证的结果图片；
图5C为本发明实施例3中杂合突变型质控品的特异性验证的结果图片；
图5D为本发明实施例3中特异性验证的基因分型散点图的结果图片；
图6为本发明实施例4中33例临床样本的基因分型散点图的结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
样品：
杂合突变型LMNA基因组样本来自大理大学第一附属医院心血管内科临床确诊的1例家族性扩张型心肌病患者，患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准；
临床样本来自扩张型心肌病患者，患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准；
小量基因组提取试剂盒购自Axygen；
Ex Taq PCR反应液购自大连宝生物；
DNA纯化试剂盒购自上海生工；
PCR反应液购自大连宝生物；
Rox校正染料购自大连宝生物。
实施例1
本实施例提供一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物，所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物包括检测LMNA基因突变位点c.562C>G的实时荧光PCR引物和探针；
所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；
所述探针包括野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针；
所述野生型LMNA的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型LMNA的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：5'-CAGCTTCCTTCCAGTTCTTGTG-3'；
SEQ ID No.2：5'-GAAGTCCAGTTCCTCCTTCATG-3'；
SEQ ID No.3：ACTTCAGGATGAGATGCTGCGGC；
SEQ ID No.4：TTCAGGATGAGATGGTGCGGCG。
所述探针为Taqman探针，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团与所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团不同，所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团为FAM，所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团为HEX。
实施例2
本实施例提供一种检测LMNA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中的检测LMNA基因突变的引物探针组合物、PCR反应液、染料和质控品，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水，所述染料包括Rox校正染料，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品。
所述质控品通过如下方法进行制备：
(1)提取基因组：使用小量基因组提取试剂盒提取样本的全基因组，琼脂糖电泳检测后测定浓度与OD值，当OD260/280为1.8～2.0之间时，可以用作扩增模板；
(2)以提取的基因组作为模板，同时设置未添加模板的阴性对照组，使用SEQ IDNo.5～6所示的核苷酸序列进行PCR扩增。
SEQ ID No.5：5'-AGAGCTTGCAGTGAGCTGAGAT-3'；
SEQ ID No.6：5'-CTGAAACCTCTCGTTCTGAGGCTA-3'。
所述PCR扩增的反应体系如下：
Figure BDA0003020414840000131
所述PCR扩增的程序如下：
预变性：95℃，3min；
循环扩增：95℃，30s；58℃，30s；72℃，3min，循环45次；
延伸：72℃，5min。
对所得PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。由图可知，样本的基因组模板扩增出目的条带，且产物的电泳条带大小与预期大小2117bp相符，可用于后续质控品的制备中；阴性对照组无扩增条带，证明扩增体系没有被污染。
(3)对扩增产物分别使用DNA纯化试剂盒进行纯化，将纯化后的扩增产物连接到PMD-18T克隆载体上，再转化至大肠杆菌JM109中，挑选单克隆，提取质粒，使用ABI3130毛细管电泳仪对克隆片段进行测序，结果如图2A和图2B所示。
图2A为含有野生型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果，图2B为含有突变型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果，可以看出相应位点上，由C突变为G，表明序列正确。
综上，野生型质控品和纯合突变型质控品构建成功。
(4)将所述野生型质控品和纯合突变型质控品按摩尔比为1:1混合，得到所述杂合突变型质控品。
本发明所述检测LMNA基因突变的试剂盒含有检测LMNA基因突变的引物探针组合物及检测所需的试剂，可以对样本的LMNA基因的c.562C>G突变进行快速检测，操作简单，使用方便，检测结果准确，耗时较短，应用价值很高。
实施例3
本实施例对实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒进行性能检测，包括构建扩增曲线、构建标准曲线、重复性验证和特异性验证，具体的实验步骤及结果如下。
构建扩增曲线
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，对模板进行10倍梯度稀释后，使用实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒，扩建扩增曲线。
扩增的体系如下：
Figure BDA0003020414840000141
扩增的程序如下：
预变性：95℃，30s；
循环扩增：95℃，5s；58℃，34s；循环45次；
延伸：64℃，3min。
野生型质控品的扩增曲线如图3A所示，纯合突变型质控品的扩增曲线如图3B所示。由图可以看出扩增曲线正常，且随着模板拷贝数的降低，Ct值相应增加，证明反应的扩增效率较好，扩增体系无异常，所用的引物探针组合物具有较好的灵敏性，可用于相关的检测实验中。
构建标准曲线
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，对模板进行10倍梯度稀释后，使用实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒，构建标准曲线，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同。
野生型质控品的标准曲线如图4A所示，纯合突变型质控品的标准曲线如图4B所示。由图可知，标准曲线的R2值均不低于0.993，满足R2值大于0.98的要求，表明线性关系较好，样本浓度与Ct值之间的拟合度较好，同时也说明了扩增反应具有良好的灵敏性，试剂盒可以检测的样本的浓度范围较广，应用价值较高。
重复性验证
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，使用实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒，分别进行3次批间重复和批内重复，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同，统计模板的Ct值，并计算变异系数。
变异系数(p)＝标准偏差(SD)/平均数(X)×100％
批间重复的统计结果如表1所示，批内重复的统计结果如表2所示。
表1
Figure BDA0003020414840000161
表2
Figure BDA0003020414840000162
由表1和表2可知，所述检测LMNA基因突变的试剂盒的批间变异系数不大于1.5％，批内变异系数不大于1.0％，均满足变异系数小于2％的要求，说明试剂盒的重复性与稳定性较好，保证了结果的准确性。
特异性验证
分别以野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品作为模板，使用实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒，进行特异性验证，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同。
图5A为野生型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱；图5B为纯合突变型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱；图5C为杂合突变型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出FAM与HEX的荧光信号强度相近，上述实验结果均与预期相符。
将上述检测结果使用检测仪器进行基因分型散点图分析，如图5D所示。由图可以看出，不同基因型样本单独成簇。
综合上述结果，本发明实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒具有良好的扩增效率、灵敏度、重复性和特异性，检测结果准确，并且可以比较待测样本和质控品的FAM和HEX的相对荧光信号的强度直接判断待测样本的基因型，节约了检测时间，应用价值更高。
实施例4
本实施例使用实施例2构建的检测LMNA基因突变的试剂盒，对33例扩张型心肌病临床样本(经过毛细管电泳测序已知c.562位点的基因型)的LMNA基因的c.562位点进行检测，同时设置野生型质控品、纯合突变性质控品和杂合突变型质控品各2个作为对照，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的基因组：与实施例2步骤(1)中的方法相同；
(2)使用检测LMNA基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增反应的体系及程序与实施例3中构建扩增曲线实验中的相同；
(3)检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号，确定所述待测样本的基因型。根据待测样本的FAM和HEX的相对的荧光强度来判断待测样本的基因型：
FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱或无荧光信号，且与野生型质控品的检测结果一致，判定待测样本为野生型；
HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱或无荧光信号，且与纯合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为纯合突变型；
FAM与HEX的荧光信号强度相近，且与杂合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为杂合突变型。
统计结果制作基因分型散点图，结果如图6所示。
由图可知，33例临床样本中c.562位点为野生型序列的有26例，发生了杂合c.562C>G突变的有4例，发生了纯合c.562C>G突变的有3例，且与毛细管电泳测序的结果一致，表明本发明所述试剂盒具有良好的准确性与特异性，耗时较短，检测成本较低。
综上所述，本发明提供了一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物，所述引物探针组合物特异性良好，可以检测样本的LMNA基因新突变位点c.562C>G的突变情况；所述检测LMNA基因突变的试剂盒扩增效率良好，灵敏度较高，具有良好的重复性与特异性，操作简单，准确性好，可以一次性检测多个样本，成本较低，耗时较短，具有极高的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 大理大学
<120> 一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物及其应用
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagcttcctt ccagttcttg tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagtccagt tcctccttca tg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acttcaggat gagatgctgc ggc 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcaggatga gatggtgcgg cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagcttgca gtgagctgag at 22
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgaaacctc tcgttctgag gcta 24

Claims (19)

1.一种检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述检测LMNA基因突变的引物探针组合物包括检测LMNA基因突变的实时荧光PCR引物和探针；
所述实时荧光PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1~2所示；
所述探针包括野生型LMNA的探针和突变型LMNA的探针；
所述野生型LMNA的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，所述突变型LMNA的探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2.根据权利要求1所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为Taqman探针。
3.根据权利要求2所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM和/或HEX。
5.根据权利要求3所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括MGB。
6.根据权利要求1所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团与所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团不同。
7.根据权利要求6所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述野生型LMNA的探针的荧光报告基团包括FAM。
8.根据权利要求6所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述突变型LMNA的探针的荧光报告基团包括HEX。
9.一种检测LMNA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测LMNA基因突变的试剂盒包括权利要求1~8任一项所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述染料包括Rox校正染料。
13.根据权利要求9所述的检测LMNA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测LMNA基因突变的试剂盒还包括质控品。
14.根据权利要求13所述的检测LMNA基因突变的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品或杂合突变型质控品中的任意一种或至少两种的组合。
15.一种权利要求9所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
提取待测样本的基因组，使用所述检测LMNA基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，检测荧光信号，再进行分析。
16.根据权利要求15所述的使用方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：
预变性：93~98℃，20~40 s；
循环扩增：93~98℃，3~7 s；57~59℃，30~40 s；
延伸：60~67℃，2.5~3.5 min；
所述循环扩增的次数为35~45次。
17.根据权利要求15所述的使用方法，其特征在于，所述分析包括：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
18.根据权利要求15~17任一项所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
（1）提取待测样本的基因组；
（2）使用检测LMNA基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增的程序包括：
预变性：93~98℃，20~40 s；
循环扩增：93~98℃，3~7 s；57~59℃，30~40 s；
延伸：60~67℃，2.5~3.5 min；
所述循环扩增的次数为35~45次；
（3）检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
19.权利要求1~8任一项所述的检测LMNA基因突变的引物探针组合物、权利要求9所述的检测LMNA基因突变的试剂盒或权利要求15~18任一项所述的检测LMNA基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法中的任意一种或至少两种的组合在制备检测LMNA基因突变的产品中的应用。
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