CN112941173A - 一种检测myl3基因突变的引物探针组合物及其应用 - Google Patents

一种检测myl3基因突变的引物探针组合物及其应用 Download PDF

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CN112941173A CN202110402351.5A CN202110402351A CN112941173A CN 112941173 A CN112941173 A CN 112941173A CN 202110402351 A CN202110402351 A CN 202110402351A CN 112941173 A CN112941173 A CN 112941173A
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Abstract

本发明提供了一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物及其应用，所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物包括检测MYL3基因突变位点c.374A>C的实时荧光PCR引物和探针。本发明还提供了一种检测MYL3基因突变的试剂盒及所述的检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法。所述引物探针组合物具有良好的特异性；所述检测MYL3基因突变的试剂盒灵敏度高，特异性好；所述试剂盒的使用方法准确性好，耗时较短，可同时对大量样本进行检测，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物及其应用。
背景技术
肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种以左心室或双心室不对称性肥厚或心肌肥大为特征的遗传性心脏疾病，主要病理特征为心肌细胞弥漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纤维紊乱等。
HCM是一种“肌节疾病”，许多研究表明，肌节蛋白基因变异是HCM的主要致病原因。心脏肌节主要包括粗肌丝和细肌丝，肌节相关基因位点的突变，破坏了肌球蛋白和肌动蛋白之间的肌丝滑动，改变了心肌细胞内的钙信号通路，影响了左心室的发育和心肌壁的结构，进而导致心脏的功能不全。MYL3是HCM的主要致病基因之一，该基因高表达于心肌组织，编码肌球蛋白轻链3，是肌小节粗肌丝肌球蛋白六聚体的重要组成部分，在心肌收缩中起到重要的调节作用。MYL3基因突变后，可能通过增强对Ca2+的诱捕导致细胞内Ca2+释放异常，激活了Ca2+依赖性的信号转导途径，使心肌细胞重塑，最终导致HCM的发生。
目前，遗传疾病基因突变的检测方法很多，如：限制性片段长度多态性、SNP shot多重PCR技术、高分辨率溶解曲线分析、PCR扩增直接进行毛细管电泳测序和高通量测序等。毛细管电泳技术是基因突变检测的金标准，但因其具有对设备的要求高、价格昂贵等缺点，很难从实验室普及到临床。CN111411149A公开了一种检测肥厚型心肌病基因突变的引物组、试剂盒和方法，通过对88个突变位点的引物组进行联合检测，成本较低，且无需荧光标记，适合大量样本的批量筛查。但该检测方法需要借助于复杂的专用仪器及基因分型系统，限制了产品的推广与使用，且对检测人员的技术水平要求较高。
对HCM患者进行基因检测和家族筛查能够为临床提供重要的指导作用。如何建立一种简便、快速、经济和准确的HCM基因突变筛查方法，为HCM的预防、辅助临床诊断和预后评估提供技术支持，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物及其应用，使用不同的荧光报告基团对野生型MYL3的探针和突变型MYL3的探针分别进行标记，再将待测样本与质控品一同进行扩增，根据荧光信号的相对强度即可确认样本的基因型，操作简单，成本较低。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物，所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物包括检测MYL3基因突变位点c.374A>C的实时荧光PCR引物和探针。
本发明中，所述荧光PCR引物可对MYL3基因中一段长度为134bp的片段进行特异性扩增，进而对MYL3基因突变位点c.374A>C进行快速检测，操作简单，耗时较短，准确性好，具有广阔的应用前景。
优选地，所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：5'-TGCAGAGCTCAATACCAAGATG-3'；
SEQ ID No.2：5'-CATTGCCCTCCTTGTCGAAGAC-3'。
优选地，所述探针包括野生型MYL3的探针和突变型MYL3的探针。
优选地，所述野生型MYL3的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型MYL3的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.3：TCCAAGAACAAGGACACAGGC；
SEQ ID No.4：CCAAGAACACGGACACAGGCA。
本发明中，所述野生型MYL3的探针为野生型MYL3的特异性探针，所述突变型MYL3的探针为突变型MYL3的特异性探针。
本发明中，同时使用野生型MYL3的探针和突变型MYL3的探针进行检测，可以在一次检测反应中确认样本的基因型，确认是否发生了突变及突变的类型，耗时更短，成本更低。
优选地，所述探针为Taqman探针。
优选地，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团包括FAM和/或HEX。
优选地，所述淬灭基团包括MGB。
优选地，所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团与所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团不同。
优选地，所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团包括FAM。
优选地，所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团包括HEX。
第二方面，本发明提供了一种检测MYL3基因突变的试剂盒，所述检测MYL3基因突变的试剂盒包括第一方面所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物。
本发明中，将所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物与检测试剂相结合，制成的检测MYL3基因突变的试剂盒可以实现MYL3基因c.374位点突变的快速检测，特异性好，准确性高。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料。
优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水。
优选地，所述染料包括Rox校正染料。
优选地，所述检测MYL3基因突变的试剂盒还包括质控品。
优选地，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品或杂合突变型质控品中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是野生型质控品、纯合突变型质控品、杂合突变型质控品、野生型质控品与纯合突变型质控品的组合、野生型质控品与杂合突变型质控品的组合、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品的组合或野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品的组合。
本发明中，所述质控品通过如下方法进行制备：
以野生型和/或纯合突变型的基因组作为模板，使用SEQ ID No.5～6所示的核苷酸序列进行PCR扩增。
SEQ ID No.5：5'-TGTGAATAGCAAAGGGCTATGG-3'；
SEQ ID No.6：5'-AGGATGTCCCTGGAAGGAGTTG-3'。
所述PCR扩增的程序包括：
预变性：
93～98℃，2.5～3.5min，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是2.5min、3min或3.5min；
循环扩增：
93～98℃，20～40s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
55～57℃，20～40s，温度例如可以是55℃、55.5℃、56℃、56.5℃或57℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
70～75℃，1.5～2.5min，温度例如可以是70℃、70.5℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃、74℃、74.5℃或75℃，时间例如可以是1.5min、2min或2.5min；
延伸：
70～75℃，2～4min，温度例如可以是70℃、70.5℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃、74℃、74.5℃或75℃，时间例如可以是2min、2.5min、3min、3.5min或4min；
所述循环扩增的次数为35～45次，例如可以是35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次或45次；
再对扩增产物进行纯化，将纯化后的扩增产物连接到PMD-18T克隆载体上，再转化至大肠杆菌JM109中，经过挑选单克隆、提取质粒和测序验证，得到所述野生型质控品和/或纯合突变型质控品；
将所述野生型质控品和纯合突变型质控品按摩尔比为1:1混合，得到所述杂合突变型质控品。
第三方面，本发明提供了一种第二方面所述的检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：
提取待测样本的基因组，使用所述检测MYL3基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，检测荧光信号，再进行分析。
本发明中，将质控品与待测样本一同进行扩增检测的作用包括以下两方面，一方面，可以根据质控品是否可以检测到荧光信号以及扩增曲线是否正常进而判断反应的体系及检测的过程是否正确；另一方面，可以根据不同质控品中FAM和HEX的相对荧光强度进而直接确认样本的基因型，迅速高效，准确性高，特异性好。
优选地，所述待测样品包括外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓、肝脏或人工合成样本中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述扩增的程序包括：
预变性：93～98℃，20～40s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
循环扩增：
93～98℃，3～7s，温度例如可以是93℃、93.5℃、94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃、96.5℃、97℃、97.5℃或98℃，时间例如可以是3s、3.5s、4s、4.5s、5s、5.5s、6s、6.5s或7s；
55～57℃，30～40s，温度例如可以是55℃、55.5℃、56℃、56.5℃或57℃，时间例如可以是30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s或40s；
延伸：70～74℃，1.5～2.5min，温度例如可以是70℃、70.5℃、71℃、71.5℃、72℃、72.5℃、73℃、73.5℃或74℃，时间例如可以是1.5min、2min或2.5min；
优选地，所述循环扩增的次数为35～45次，例如可以是35次、36次、37次、38次、39次、40次、41次、42次、43次、44次或45次。
优选地，所述分析包括：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
本发明中，根据待测样本的FAM和HEX的相对的荧光强度来判断待测样本的基因型：
FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱或无荧光信号，且与野生型质控品的检测结果一致，判定待测样本为野生型；
HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱或无荧光信号，且与纯合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为纯合突变型；
FAM与HEX的荧光信号强度相近，且与杂合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为杂合突变型。
作为优选技术方案，本发明所述检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)使用检测MYL3基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增的程序包括：
预变性：93～98℃，20～40s；
循环扩增：93～98℃，3～7s；55～57℃，30～40s；
延伸：70～74℃，1.5～2.5min；
所述循环扩增的次数为35～45次；
(3)检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物、第二方面所述的检测MYL3基因突变的试剂盒或第三方面所述的检测MYL3基因突变的试剂盒中的任意一种或至少两种的组合在制备检测MYL3基因突变的产品中的应用。
本发明中，所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物具有良好的特异性；所述检测MYL3基因突变的试剂盒灵敏度高，重复性好；所述检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法操作简单，准确性高，检测成本低，制成检测MYL3基因突变的相关产品，具有极高的应用价值。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物特异性良好，扩增效率高，可以对待测样本的MYL3基因新突变位点c.374A>C进行快速检测，结果准确，可信度高；
(2)本发明所述检测MYL3基因突变的试剂盒的扩增曲线形状正常，具有良好的扩增效率；标准曲线的R2值均不低于0.994，线性关系好，灵敏度高，可以检测的样本的浓度范围较广；批间变异系数不大于1.3％，批内变异系数不大于1.1％，重复性好，稳定性高，满足试剂盒的相关标准，具有实际应用的价值；
(3)所述检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法可以对大量样本同时进行检测，耗时较短，效率较高，成本较低，结果准确，可信度高，具有极高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中样本的基因组模板的扩增结果，图中，泳道M为DNA分子量marker，泳道1～3为样本的基因组模板的扩增结果，泳道4为体系中未添加模板的阴性对照组的扩增结果；
图2A为本发明实施例2中含有野生型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果图片；
图2B为本发明实施例2中含有突变型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果图片；
图3A为本发明实施例3中野生型质控品的扩增曲线图片，图中，从左至右依次为稀释了10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍和10-7倍的野生型质控品作为模板的扩增结果；
图3B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的扩增曲线图片，图中，从左至右依次为稀释了10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍、10-6倍和10-7倍的纯合突变型质控品作为模板的扩增结果；
图4A为本发明实施例3中野生型质控品的标准曲线图片；
图4B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的标准曲线图片；
图5A为本发明实施例3中野生型质控品的特异性验证的结果图片；
图5B为本发明实施例3中纯合突变型质控品的特异性验证的结果图片；
图5C为本发明实施例3中杂合突变型质控品的特异性验证的结果图片；
图5D为本发明实施例3中特异性验证的基因分型散点图的结果图片；
图6为本发明实施例4中26例临床样本的基因分型散点图的结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
样品：
杂合突变型MYL3基因组样本来自大理大学第一附属医院心血管内科临床确诊的1例家族性肥厚型心肌病患者，患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准；
临床样本来自肥厚型心肌病患者，患者签订知情同意书，且通过大理大学医学伦理委员会批准；
小量基因组提取试剂盒购自Axygen；
Ex Taq PCR反应液购自大连宝生物；
DNA纯化试剂盒购自上海生工；
PCR反应液购自大连宝生物；
Rox校正染料购自大连宝生物。
实施例1
本实施例提供一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物，所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物包括检测MYL3基因新突变位点c.374A>C的实时荧光PCR引物和探针；
所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：5'-TGCAGAGCTCAATACCAAGATG-3'；
SEQ ID No.2：5'-CATTGCCCTCCTTGTCGAAGAC-3'。
所述探针包括野生型MYL3的探针和突变型MYL3的探针；
所述野生型MYL3的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型MYL3的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.3：TCCAAGAACAAGGACACAGGC；
SEQ ID No.4：CCAAGAACACGGACACAGGCA。
所述探针为Taqman探针，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团；
所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团与所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团不同，所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团包括FAM，所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团包括HEX。
实施例2
本实施例提供一种检测MYL3基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中的检测MYL3基因突变的引物探针组合物、PCR反应液、染料和质控品，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水，所述染料包括Rox校正染料，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品。
本发明中，所述质控品通过如下方法进行制备：
(1)提取基因组：使用小量基因组提取试剂盒提取样本的全基因组，琼脂糖电泳检测后测定浓度与OD值，当OD260/280为1.8～2.0之间时，可以用作扩增模板；
(2)以提取的基因组作为模板，同时设置未添加模板的阴性对照组，使用SEQ IDNo.5～6所示的核苷酸序列进行PCR扩增。
SEQ ID No.5：5'-TGTGAATAGCAAAGGGCTATGG-3'；
SEQ ID No.6：5'-AGGATGTCCCTGGAAGGAGTTG-3'。
所述PCR扩增的反应体系如下：
Figure BDA0003020893930000121
预变性：95℃，3min；
循环扩增：95℃，30s；56℃，30s；72℃，2min，循环45次；
延伸：72℃，3min。
对所得PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。由图可知，以基因组为模板成功扩增出目的条带，且条带的大小与预期大小450bp相符，可应用于后续质控品的相应的制备中；阴性对照组无条带，与预期相符，也表明了扩增体系未被污染，结果可信。
(3)对扩增产物分别使用DNA纯化试剂盒进行纯化，将纯化后的扩增产物连接到PMD-18T克隆载体上，再转化至大肠杆菌JM109中，挑选单克隆，提取质粒，使用ABI3130毛细管电泳仪对克隆片段进行测序，结果如图2A和图2B所示。
图2A为含有野生型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果，图2B为含有突变型序列的质粒的毛细管电泳的测序结果，可以看出相应位点上，由A突变为C，序列正确。
至此，野生型质控品和纯合突变型质控品构建成功。
(4)将所述野生型质控品和纯合突变型质控品按摩尔比为1:1混合，得到所述杂合突变型质控品。
本发明所述检测MYL3基因突变的试剂盒含有检测MYL3基因突变的引物探针组合物及相关的反应试剂，可对样本的MYL3基因新突变位点c.374A>C的突变情况进行快速检测，结果准确，效率很高。
实施例3
本实施例对实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒进行性能检测，包括构建扩增曲线、构建标准曲线、重复性验证和特异性验证，具体的实验步骤及结果如下。
构建扩增曲线
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，对模板进行10倍梯度稀释后，使用实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒，扩建扩增曲线。
扩增的体系如下：
Figure BDA0003020893930000131
Figure BDA0003020893930000141
扩增的程序如下：
预变性：95℃，30s；
循环扩增：95℃，5s；56℃，34s；循环45次；
延伸：72℃，2min。
野生型质控品的扩增曲线如图3A所示，纯合突变型质控品的扩增曲线如图3B所示。可以看出，野生型质控品和纯合突变型质控品的扩增曲线的形状均正常，且随着模板拷贝数的降低，扩增反应的Ct值随之增加，表明扩增反应正常，扩增效率良好，引物探针组合物的特异性与灵敏度均较好，可应用于相关的检测实验中。
构建标准曲线
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，对模板进行10倍梯度稀释后，使用实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒，构建标准曲线，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同。
野生型质控品的标准曲线如图4A所示，纯合突变型质控品的标准曲线如图4B所示。由图可知，标准曲线的R2值均不低于0.994，符合标准曲线R2值大于0.98的要求，表明Ct值与模板起始拷贝数的线性关系较好，同时也表明试剂盒具有良好的灵敏度，可以检测的样本的浓度范围广，应用价值更高。
重复性验证
分别以野生型质控品和纯合突变型质控品作为模板，使用实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒，分别进行3次批间重复和批内重复，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同，统计模板的Ct值，并计算变异系数。
变异系数(p)＝标准偏差(SD)/平均数(X)×100％
批间重复的统计结果如表1所示，批内重复的统计结果如表2所示。
表1
Figure BDA0003020893930000151
表2
Figure BDA0003020893930000152
由表1和表2可知，所述检测MYL3基因突变的试剂盒的批间变异系数不大于1.3％，批内变异系数不大于1.1％，均符合变异系数小于2％的要求，表明所述试剂盒的重复性与稳定性均较好，保证了检测的稳定性与准确性，应用价值更高。
特异性验证
分别以野生型质控品、纯合突变型质控品和杂合突变型质控品作为模板，使用实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒，进行特异性验证，扩增反应的体系及程序与构建扩增曲线实验中的相同。
图5A为野生型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱；图5B为纯合突变型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱；图5C为杂合突变型质控品的特异性验证的结果图片，可以看出FAM与HEX的荧光信号强度相近，上述实验结果均与预期相符。
将上述检测结果使用检测仪器进行基因分型散点图分析，如图5D所示。由图可以看出，不同基因型样本单独成簇。
综合上述结果，本发明实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒扩增效率高，灵敏性高，特异性、重复性及稳定性良好，结果准确，可以通过一次检测直接确认样本的基因型，操作简便，效率较高。
实施例4
本实施例使用实施例2构建的检测MYL3基因突变的试剂盒，对26例肥厚型心肌病临床样本(经过毛细管电泳测序已知c.374位点的基因型)的MYL3基因的c.374位点进行检测，同时设置野生型质控品、纯合突变性质控品和杂合突变型质控品作为对照，包括以下步骤：
(1)提取待测样本的基因组：与实施例2步骤(1)中的方法相同；
(2)使用检测MYL3基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增反应的体系及程序与实施例3中构建扩增曲线实验中的相同；
(3)检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号，确定所述待测样本的基因型。根据待测样本的FAM和HEX的相对的荧光强度来判断待测样本的基因型：
FAM的荧光信号较强，HEX的荧光信号较弱或无荧光信号，且与野生型质控品的检测结果一致，判定待测样本为野生型；
HEX的荧光信号较强，FAM的荧光信号较弱或无荧光信号，且与纯合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为纯合突变型；
FAM与HEX的荧光信号强度相近，且与杂合突变型质控品的检测结果一致，判定待测样本为杂合突变型。
统计结果制作基因分型散点图，结果如图6所示。
由图可以看出，在26例临床样本中，c.374位点为野生型序列的有20例，发生了杂合c.374A>C突变的有4例，发生了纯合c.374A>C突变的有2例，并且与毛细管电泳的测序结果完全一致，进一步证明了所述检测MYL3基因突变的试剂盒具有良好的特异性与重复性，检测结果准确，并且具有传统检测方法所不具备的耗时短、成本低、大批量样本可同时检测的优点。
综上所述，本发明提供了一种特异性良好的检测MYL3基因突变的引物探针组合物，与检测试剂组成的检测MYL3基因突变的试剂盒具有很好的扩增效率、灵敏度、平行性、重复性及特异性，可以对样本的MYL3基因新突变位点c.374A>C进行快速检测，检测效率高，操作简便，成本较低，应用前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 大理大学
<120> 一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物及其应用
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgcagagctc aataccaaga tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattgccctc cttgtcgaag ac 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccaagaaca aggacacagg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaagaacac ggacacaggc a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtgaatagc aaagggctat gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggatgtccc tggaaggagt tg 22

Claims (10)

1.一种检测MYL3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述检测MYL3基因突变的引物探针组合物包括检测MYL3基因突变位点c.374A>C的实时荧光PCR引物和探针。
2.根据权利要求1所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述实时荧光PCR引物包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列；
优选地，所述探针包括野生型MYL3的探针和突变型MYL3的探针；
优选地，所述野生型MYL3的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变型MYL3的探针包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物，其特征在于，所述探针为Taqman探针；
优选地，所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团包括FAM和/或HEX；
优选地，所述淬灭基团包括MGB；
优选地，所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团与所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团不同；
优选地，所述野生型MYL3的探针的荧光报告基团包括FAM；
优选地，所述突变型MYL3的探针的荧光报告基团包括HEX。
4.一种检测MYL3基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测MYL3基因突变的试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液和/或染料；
优选地，所述PCR反应液包括DNA聚合酶、Mg2+缓冲液、dNTPs和水；
优选地，所述染料包括Rox校正染料。
5.根据权利要求4所述的检测MYL3基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测MYL3基因突变的试剂盒还包括质控品；
优选地，所述质控品包括野生型质控品、纯合突变型质控品或杂合突变型质控品中的任意一种或至少两种的组合。
6.一种权利要求4或5所述的检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
提取待测样本的基因组，使用所述检测MYL3基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，检测荧光信号，再进行分析。
7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：
预变性：93～98℃，20～40s；
循环扩增：93～98℃，3～7s；55～57℃，30～40s；
延伸：70～74℃，1.5～2.5min；
优选地，所述循环扩增的次数为35～45次。
8.根据权利要求6或7所述的使用方法，其特征在于，所述分析包括：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
9.根据权利要求6～8任一项所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)使用检测MYL3基因突变的试剂盒，对所述待测样本的基因组与质控品一同进行扩增，所述扩增的程序包括：
预变性：93～98℃，20～40s；
循环扩增：93～98℃，3～7s；55～57℃，30～40s；
延伸：70～74℃，1.5～2.5min；
所述循环扩增的次数为35～45次；
(3)检测荧光信号，再进行分析：
比较所述待测样本与质控品的荧光信号及散点图，确定所述待测样本的基因型。
10.权利要求1～3任一项所述的检测MYL3基因突变的引物探针组合物、权利要求4或5所述的检测MYL3基因突变的试剂盒或权利要求6～9任一项所述的检测MYL3基因突变的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法中的任意一种或至少两种的组合在制备检测MYL3基因突变的产品中的应用。
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