CN111206100A

CN111206100A - 一种检测egfr基因t790m位点突变的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN111206100A
Application number: CN202010128392.5A
Authority: CN
Inventors: 刘一博; 金鑫浩; 任鲁风; 张未来; 于军
Original assignee: Ningbo Yinrui Biomedical Instrument Co ltd
Current assignee: Ningbo Yinrui Biomedical Instrument Co ltd
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2020-05-29

Abstract

本发明提供了一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法，属于核酸检测领域。本发明公开的试剂盒包括：用于检测T790M位点的上游引物、下游引物；用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针、反应预混液、阳性质控品、阴性质控品。该试剂盒针对人类EGFR基因T790M位点设计了特定序列的引物和探针并优化了其反应体系，通过数字PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M位点突变的高灵敏度检测并同时获得突变的丰度。本发明提供的试剂盒和方法可检测多种来源样本，包括肿瘤、血液、唾液、血清中的核酸，扩大了该试剂盒和检测方法的使用范围，为肺癌T790M突变患者治疗提供用药指导。

Description

一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法。

背景技术

肺癌是全世界发病率和死亡率均列第一的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(Non-smallcell lung cancer，NSCLC)占全部肺癌患者的80％以上，中国人群非小细胞肺癌患者最常见的致病突变来自EGFR基因(约占20％～40％)，EGFR突变中，主要集中于19号外显子缺失(约占45％)以及21号外显子L858R突变(约40％)。表皮生长因子受体(Epidermal growthfactor receptor，EGFR)T790M突变是导致TKI(酪氨酸激酶抑制剂)治疗过程中出现获得性耐药性的主要因素，在首先使用埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)或阿法替尼(Afatinib)9～13周后，约60％患者会出现该突变，因此检测该突变对于一线用药的疗效监控有着重要意义。

近年来以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。研究表明，当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测是EGFR基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等，广泛应用于肺癌早筛和治疗中耐药性监测。目前血液中基因变异的检测技术主要有直接测序法和ARMS法，但直接测序法耗时长(一般需2-3天)，且灵敏度低，仅能检测突变比例在10-20％以上的突变。ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。以上两种检测方法均为定性检测，只能给出基因变异是否存在的结论，无法测定携带基因变异的DNA量的比例，难以进行定量检测，灵敏度也较差，仅能达到1％。

当前基因定量的方法主要包括实时荧光定量PCR法、NGS法和数字PCR法，实时荧光定量PCR法基于Ct值，是一种相对定量的方法；NGS法有较好的灵敏度，同时也能检测未知突变，但是一次检测需要上万元费用，不利于单个明确的T790M目标的检测，给患者带来巨大的经济负担，而且NGS法花费的时间较长。数字PCR法基于单分子PCR方法来进行计数，是一种绝对定量的方法。数字PCR法作为第三代PCR技术，可以不依赖任何校准物或外标而是采用直接计数目标分子，即可确定目标分子的绝对数目，是对起始样品的绝对定量。但是由于血液中游离DNA含量极低，长度约70～200bp，其中突变相关游离DNA含量更少，约占总游离DNA含量的1％，普通试剂盒精度和灵敏度无法达到用于数字PCR检测血液中EGFR基因T790M位点突变的检测要求。

基于此，本发明开发了一种基于数字PCR检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，本发明提供的试剂盒不仅可以对来源于肿瘤和血液中的T790M位点突变的基因进行快速检测，其检测的高灵敏度还可以对来源于唾液和血清中T790M位点突变的基因进行检测，提供绝对定量，数据结果稳定可靠，能够更便捷地用于辅助诊断与临床治疗指导。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供了一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法，该试剂盒针对EGFR基因T790M位点设计了特定序列的引物和探针，在优化的反应体系中通过数字PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M位点突变的高灵敏度检测。本发明提供的试剂盒可检测的样本来源多样，包括肿瘤、血液、唾液、血清中的核酸，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。

本发明采用如下技术方案施行：

一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，包括用于检测EGFR基因T790M位点的特异性引物，所述特异性引物包括：

上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；

下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；

所述试剂盒还包括用于检测EGFR基因T790M位点的荧光探针，所述荧光探针包括：

与突变型DNA模板结合的突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；

与野生型DNA模板结合的野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’；

进一步地，所述检测EGFR基因T790M位点的突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团；

进一步地，所述荧光报告基团选自HEX、Texas Red、CY5、CY5.5、CY3、FAM或VIC；所述的淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3等；

进一步地，所述突变型荧光探针连接的荧光报告基因为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型荧光探针连接的荧光报告基团为CY3，淬灭基团为BHQ2；

进一步地，所述用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE缓冲液中，制成引物探针混合溶液；

在本发明所述的试剂盒中，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-1μM，下游引物的工作浓度为0.1-1μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-1μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-1μM；优选地，检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-0.7μM，下游引物的工作浓度为0.1-0.7μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM；更优选地，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.1-0.5μM，下游引物的工作浓度为0.1-0.5μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.1-0.5μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.1-0.5μM；最优选地，用于检测T790M位点的上游引物的工作浓度为0.4μM，下游引物的工作浓度为0.4μM，用于检测T790M位点的突变型荧光探针的工作浓度为0.2μM，野生型荧光探针的工作浓度为0.2μM；

试剂盒还包括反应预混液、无菌水、阳性质控品和阴性质控品；

进一步地，所述反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂；

进一步地，所述扩增强剂包括焦磷酸酶和Triton X-100；

进一步地，所述焦磷酸酶的终浓度为0.5-2U，所述Triton X-100的终浓度为0.05％-2％；

进一步地，所述阳性质控品的制备方法为：EGFR基因T790M位点野生型和突变型的序列各200bp，合成后，分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度，根据拷贝数比例1:3000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50，1:10混合两种质粒，之后通过超声将质粒混合物打断为150-210bp的片段，定量到20ng/μL，作为梯度阳性质控品。阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成，然后采用同样方法打断为150-210bp的片段，定量到20ng/μL，作为阴性质控品；

以上所述试剂盒为基于数字PCR的试剂盒；

进一步地，所述试剂盒适用于对来源于肿瘤、血液、唾液、血清样品中的核酸进行检测；

进一步地，所述试剂盒在如下任一方面中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)制备用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生T790M位点突变的产品；

(2)制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否发生耐药的产品；

进一步地，所述肺癌为非小细胞肺癌；

本发明另一方面还提供了一种用于非诊断目的检测EGFR基因T790M位点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测的DNA模板、以上所述试剂盒中的上游引物和下游引物、以上所述试剂盒中的突变型探针和野生型探针与以上所述的反应预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中的DNA模板、上游引物、下游引物、突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量如下：

a：DNA模板的含量为0.25-2ng/μL；优选为0.5-1ng/μL；更优选为1ng/μL；

b：上游引物和下游引物的含量均为0.3-0.7μM；优选为0.3-0.5μM；更优选为0.4μM；

c：突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量均为0.1-0.4μM；优选为0.2-0.3μM；更优选为0.2μM；

(2)用数字PCR混合液制作PCR微反应单元，再进行PCR扩增反应，PCR扩增条件为：93-97℃预变性3-15min；93-97℃变性5-50s，60-70℃退火5-50s，55-65℃延伸10-65s，共进行20-60个循环；2-10℃终止反应；

PCR扩增条件优选为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火15s，60℃延伸30s，共进行40个循环；10℃终止反应；

(3)PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因T790M位点突变的DNA模板及其数量和含量；

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，该试剂盒针对EGFR基因T790M位点设计了特定序列的引物和探针，在优化的反应体系中通过数字PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M位点突变的高灵敏度检测，灵敏度达到1:3000。本发明提供的试剂盒可检测的样本来源多样，包括肿瘤、血液、唾液、血清中的核酸，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围，数据结果稳定可靠。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步地说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得，本发明中使用的数字PCR仪为专利CN201911061352.7中的核酸扩增仪；本发明中的上游引物、下游引物及探针序列具体见序列表。

实施例1用于检测肺癌EGFR基因T790M位点突变的引物、探针的设计与合成

根据EGFR 20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变)，设计并合成本发明基于数字PCR技术用于检测肺癌EGFR基因T790M位点突变的引物和探针，具体序列如下：

引物序列：

上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；

下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；

探针序列：

突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；

野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’；

引物和探针的合成均由上海生工公司进行合成，使用HPLC级纯化。突变型荧光探针5’端连接有荧光报告基团FAM；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ1；野生型荧光探针5’端连接的荧光报告基团CY3；3’端连接有荧光淬灭基团BHQ2。荧光报告基团和淬灭基团还可以根据具体的平台进行合理选择。

其中，用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE溶液中，制成引物探针混合溶液。上游引物、下游引物、突变型荧光探针、野生型荧光探针在引物探针混合液中的浓度均为10μM。引物探针混合液的配制方法为：将上游引物、下游引物、突变型荧光探针、野生型荧光探针四种成分的干粉分别用TE缓冲液稀释至100μM。

试剂盒还包括反应预混液、阳性质控品和阴性质控品。阳性质控品的制备方法为：EGFR基因T790M位点野生型和突变型的序列各200bp，合成后，分别装入质粒载体pET-23d(+)(Promega)。使用Qubit 3.0进行定量，计算两种类型质粒的拷贝数浓度，根据拷贝数比例1:3000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50，1:10混合两种质粒，之后通过超声将质粒混合物打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为梯度阳性质控品。阴性质控品由上述含有野生型的质粒单独构成，然后采用同样方法打断为约180bp的片段，定量到20ng/μL，作为阴性质控品。

实施例2检测人类肺癌EGFR基因T790M位点突变的方法

采用实施例1中的试剂盒，按照表1配制PCR反应体系，其中，PCR Mix购买自NEB，并加入终浓度0.1％的Triton-X-100，1U热稳定焦磷酸酶，5μg/μL的BSA，按照ddH₂O、PCR mix、探针、引物、模板DNA的顺序，将上述样品按照表1中反应体系中20μL的添加量加入0.2mLPCR管中，使用轻柔涡旋将混合体系混匀15s，并通过短时离心将溶液收集到试管底部。将配制好的不同比例的反应体系上样到PCR芯片上，形成微反应单元。将芯片放入数字PCR仪中，按照表2中PCR反应条件进行PCR反应，选择FAM和CY3作为荧光检测的通道。

表1反应体系

表2 PCR反应条件

扩增结束后，通过电脑分析，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，并对结果进行分析。

实施例3标准品的检测

含突变的标准品的制备方式为：将EGFR基因T790M位点突变基因组DNA与野生型基因组DNA分别进行合成并构建质粒，然后按照T790M位点突变基因组DNA：野生型基因组DNA比例1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000进行混合，再将所得混合质粒打断为与ctDNA片段接近的180bp的片段化DNA；野生型标准品的制备方式为：将EGFR基因T790M野生型的DNA质粒打断为与ctDNA片段接近的180bp的片段化DNA。

按照上述方法获得的8个突变标准品，用实施例2中的方式进行检测，实验重复3次。实验结果如表3所述，表3是8种不同突变比例的标准品(0.033％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％和10％)，以及野生型样本对照(Wild type)和无模板样本对照(NTC)进行3次平行实验的结果统计表。

表3标准品的检测结果

实验结果表明，本发明提供的试剂盒的检测精准度能达到1:3000，稳定性高，准确性符合预期且优于现有技术。综上，本发明提供的试剂盒能够有效检测DNA终浓度仅为1ng/μL的样本，并且能够有效分辨低至1:3000的突变，能够顺利完成液体活检的要求，可以广泛应用于非小细胞肺癌EGFR突变型的早筛和治疗过程中的耐药检测。

实施例4实际样品的检测

使用实施例2中的方法对实际样血液品中的ctDNA进行检测，采样量为10mL，样品为6例临床确诊非小细胞肺癌的患者，并经过EGFR-TKI治疗6-7个月的血液，该样本在使用本发明的方法检测的同时，还有一部分血液(9mL左右)，送去专业检测公司使用NGS方法进行检测。NGS方法检测目前是该项检测项目的金标准，可以直接同本发明的方法进行结果对比。

样本中ctDNA的提取方法为：使用Aline Biosciences公司IsopurectDNA/RNAIsolation Kit(CFD-6001-50)试剂盒，从采血管中吸取1mL血液样本，按照使用说明书对样本中的ctDNA进行提取，基于磁珠法，样本经蛋白酶消化后，经DNA结合，洗涤，ctDNA片段的选择及洗脱，就提取好高质量的循环ctDNA。ctDNA经质检及Qubit进行定量后确认总量不低于20ng，采用实施例1中的试剂盒按照实施例2中的方法进行检测，检测结果如下：6例样本中，检测出带有EGFR T790M突变型的有4例，比例分别为1.6％，5.8％，9.2％，0.6％。2例为突变型阴性。上述结果与NGS检测结果相符。实验结果说明，本发明提供的试剂盒能够满足临床液体活检要求，相对于NGS的检测方法，大大降低检测时间和成本。

本申请的发明人还对血清、血浆、外周血、胸腔积液、体液或者组织来源的DNA进行EGFR基因T790M位点突变的检测，其检测限也能达到1:3000，且重复性良好。

对比例1使用不同浓度的引物和探针

1、采用实施例1中的试剂盒，实施例2和实施例3中的方法，区别在于，数字PCR混合液中上游和下游引物的浓度均为0.05μM。此时仅当突变含量为1:100时能检测出突变，突变样本含量为1:2000和1:3000时均不能检测出准确的突变率。

2、采用实施例1中的试剂盒，实施例2和实施例3中的方法，区别在于，数字PCR混合液中上游和下游引物的浓度均为0.05μM，两种探针的浓度分别为0.05μM，此时仅当突变含量为1:100时能检测出突变，突变样本含量为1:2000和1:3000时均不能检测出准确的突变率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司

<120> 一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒和方法

<130> 2020

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ggcatctgcc tcacctcca 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gacatagtcc aggaggcagc 20

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gagctgcatg atgag 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gagctgcgtg atgag 15

Claims

1.一种检测EGFR基因T790M位点突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质：

(A)用于检测T790M位点的上游引物、下游引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCCA-3’；

下游引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’；

(B)用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，所述荧光探针的序列为：

突变型荧光探针：5’-GAGCTGCATGATGAG-3’；

野生型荧光探针：5’-GAGCTGCGTGATGAG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变型荧光探针和野生型荧光探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基团选自HEX、TexasRed、CY5、CY5.5、CY3、FAM或VIC；所述的淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述突变型荧光探针连接的荧光报告基因为FAM，淬灭基团为BHQ1；所述野生型荧光探针连接的荧光报告基团为CY3，淬灭基团为BHQ2。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测T790M位点的上游引物、下游引物和用于检测T790M位点的突变型荧光探针、野生型荧光探针，以引物探针混合液的形式存在，共同溶解于TE缓冲液中，制成引物探针混合溶液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应预混液、阳性质控品和阴性质控品，所述反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增增强剂包括焦磷酸酶和TritonX-100。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的试剂盒在如下任一项中的应用：

(2)制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否发生耐药的产品。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。

10.一种用于非诊断目的检测EGFR基因T790M位点突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测的DNA模板、权利要求1所述试剂盒中的上游引物和下游引物、

突变型探针和野生型探针与权利要求6所述的反应预混液混合，制备得到数字PCR混合液；其中的DNA模板、上游引物、下游引物、突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量如下：

a：DNA模板的含量为0.25-2ng/μL；

b：上游引物和下游引物的含量均为0.3-0.7μM；

c：突变型荧光探针和野生型荧光探针的含量均为0.2-0.4μM；

(3)PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断待测样品中是否含有EGFR基因T790M位点突变的DNA模板及其数量和含量。