CN113355423B - Egfr基因l858r突变检测的引物探针、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种EGFR基因L858R突变检测的引物探针，属于基因检测技术领域，所述L858R突变的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；所述L858R突变的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；所述L858R突变的探针为金标探针，其序列如SEQ ID NO:3所示。本发明所使用的引物探针特异性、准确度和灵敏度高。本发明首次采用RPA扩增技术结合侧流层析试纸条检测EGFR基因L858R突变，检测时间短、操作简便、成本低廉。

Description

EGFR基因L858R突变检测的引物探针、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种EGFR基因L858R突变检测的引物探针、试剂条及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因的表达产物，定位于细胞膜上，为一种跨膜受体酪氨酸激酶。EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(TKI)的18～21外显子上，其中外显子21点突变，约占所有突变的40～45％，外显子21的点突变主要是位于第858位密码子出现T～G转换，引起蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸，即L858R。

目前EGFR基因突变检测主要分为组织活检技术和液体活检技术。组织活检技术具有侵入性，存在患者安全风险，且由于无法捕捉瘤内和转移间的遗传异质性，准确性不高。而新兴的液体活检技术克服了组织活检技术的检测弊端，液体活检是对以血液为主的非固体生物组织中的生物标志物进行检测来确定病情的一种检测方法。目前，临床主要以检测样本中循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、外泌体等生物标志物为主。对于这些生物标志物的检测除了可以用于癌症早期的筛查和患者分级以外，还可以用来判断疾病进展和预后情况，从而优化治疗方案。相较于传统方法，液体活检具有以下特点：(1)无侵入性，副作用小；(2)无需影像学支持，操作简单；(3)一般只需5-10mL血液，可重复取样；(4)实时检测，有效应对肿瘤异质性；(5)可在癌症早期检测，提前预测；(6)成本低。

ctDNA是液体活检中的肿瘤标志物，是癌症患者循环游离DNA(ccfDNA)总量的一部分，是肿瘤细胞释放到外周血中的核酸小片段，它在血液中浓度主要取决于癌症患者的肿瘤负荷和残留病变。一般来说，癌症患者血浆中每毫升平均含有ctDNA的数量从几个拷贝到10⁴个拷贝不等。由肿瘤细胞释放的ctDNA长度约145～180bp，而肿瘤细胞坏死产生的ctDNA长度可达10kbp。研究已证实，在膀胱癌、乳腺癌和结直肠癌患者中ctDNA比其他循环肿瘤标志物(如CTCs)更早在血液中出现。一些存在突变的基因如鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤抑制基因(APC)等，都可以通过血液中ctDNA检测到。此外，以ctDNA作为液体活检中的肿瘤标志物能更早的实时、动态反应肿瘤的发生、发展情况，这为癌症患者的治疗带来了极大的便利。

目前，针对ctDNA的检测，目前大多采用基于PCR的方法或二代测序技术。传统的PCR方法，如实时定量PCR，由于不能检测到20％以下水平的微小突变，因此不能用于ctDNA的检测。近年来，出现了各式各样的基于PCR的ctDNA突变检测技术，如等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)、低温变性共扩增PCR(COLD-PCR、数字PCR(dPCR)、微滴式数字PCR(ddPCR)等，其中ARMS-PCR已被我国批准用于ctDNA突变的检测。虽然二代测序技术和基于PCR的方法是检测ctDNA突变的“金标准”，但是这两类技术缺点也很显著。二代测序技术检测周期长(2-3周)且成本高，难以满足临床实际需求。基于PCR的方法操作要求高，易引入溶胶污染，导致出现假阴性或假阳性的结果。此外，这两种方法都需要训练有素的专业人员以及昂贵的仪器设备。因此，对于ctDNA突变的检测，临床迫切需要一种低成本、易操作、无需昂贵仪器，能直接能从血浆或血液中检出突变ctDNA的技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、准确、可视化地检测EGFR基因L858R突变的引物探针。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种EGFR基因L858R突变检测的引物探针，所述L858R突变的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；所述L858R突变的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；所述L858R突变的探针为金标探针，其序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述金标探针序列3’端修饰18～20nm胶体金。

本发明还提供了一种上述引物探针用于制备检测EGFR基因L858R突变试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测EGFR基因L858R突变的试剂盒，包括上述引物以及侧流层析试纸条，所述试纸条上的结合垫喷涂有上述探针。

优选地，上述试剂盒中还包括RPA扩增试剂。

优选地，所述试剂盒中还包括侧流层析缓冲溶液，所述缓冲溶液包括5xSSC、2％BSA和2％PVP，所述的5xSSC为pH7.0的4.4％氯化钠和2.2％柠檬酸钠溶液。

优选地，所述引物的浓度为4μM，所述金标探针的浓度为15nM。

优选地，所述试纸条的检测线划有链霉亲和素，质控线上划有生物素修饰的质控探针，所述质控探针序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，所述试纸条上的样品垫在使用前用处理缓冲液浸泡处理，所述的处理缓冲液包括0.05M Tris-HCl、0.15mM NaCl、0.25％Triton X-100和2.5％Tween-20。

本发明还提供了一种非诊断目的的根据所述试剂盒检测EGFR基因L858R突变的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测血液样本的ctDNA；

(2)用所述引物以ctDNA为模板进行RPA扩增，RPA扩增反应的条件为：37℃水浴30min；

(3)采用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的EGFR基因L858R突变检测的引物探针和试剂盒，采用尾引物的RPA等温扩增及侧流层析检测技术，检测过程操作简便、检测时间短，整个检测过程可以在半小时内完成，极大地缩短了检测时间。

本发明提供的EGFR基因L858R突变检测的试剂盒检测EGFR基因L858R突变特异性、准确度和灵敏度高，灵敏度达到0.78％。采用本发明的试剂盒对45例临床样本进行盲测，检测结果与测序结果一致，准确率为100％。

另外，在检测设备方面，目前无论是ARMS-PCR还是数字PCR都是采用荧光信号检测和常规的PCR反应程序，检测设备需配备昂贵的荧光检测系统和PCR扩增仪，对仪器、设备的要求高，操作程序复杂，而本发明无需复杂精密仪器，检测过程利用37℃恒温反应槽和试纸条即可进行可视化检测，操作简便、快捷，成本低廉，结果易判读。

本发明可以直接以非小细胞肺癌(NSCLC)患者血液为检测样本，较临床常采用的组织活检技术而言，样本的获取更容易，检测更简便。

附图说明

图1为尾引物的RPA扩增原理图；

图2为检测EGFR基因L858R的6对引物的PCR电泳图，其中MT为突变型，WT为野生型；

图3为检测EGFR基因L858R的引物浓度优化的侧流层析试纸条结果图；

图4为检测EGFR基因L858R的引物时间优化的侧流层析试纸条结果图；

图5为检测EGFR基因L858R的引物温度优化的侧流层析试纸条结果图；

图6为侧流层析核酸试纸条检测原理图；

图7为检测EGFR基因L858R突变的方法的等温扩增后，侧流层析检测灵敏度检测图；

图8为检测EGFR基因L858R突变的方法的检测不同比例的突变质粒标准品的灵敏度检测图；

图9为实施例2所述方法对45例临床样本检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种EGFR基因L858R突变检测的引物探针，所述的L858R突变的上游引物序列5’-ATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTG-3’(SEQ ID NO:1)，所述上游引物序列的5’端修饰有生物素，即5’-biotin-ATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTG-3’；所述L858R突变的下游引物序列5’-CAATACAGCTAGTGGGAAGGCAG-3’(SEQ ID NO:2)，所述下游引物序列的5’端修饰有TTTTTTTTTT-C3，即5’-TTTTTTTTTT-C3-CAATACAGCTAGTGGGAAGGCAG-3’；所述金标探针序列5-AAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO:3)，所述的探针序列修饰有巯基，即5’-AAAAAAAAAAAAAAA-SH-3’。

所述金标探针序列3’端修饰18～20nm胶体金。本发明对胶体金的制备方法没有特殊限定，作为一种可选的实施方式，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。具体操作方法如下：取100mL 0.01％的HAuCl₄水溶液，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，剧烈搅动下，准确加入一定量的新鲜配制的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，继续加热煮沸15min，此时可观察到金黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，全过程约2～3min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，4℃保存备用，采用透射电子显微镜(TEM)、zeta电位分析仪、紫外可见光谱(UV-Vis)对胶体金进行形态、粒径、及所带电荷等方面进行表征，得到18～20nm胶体金。所述金标探针的制备方法没有特殊限定，采用本领域公知的方法即可，本发明金标探针的制备方法包括，取1mL浓缩10倍的胶体金溶液，加入10μL lmM的dATP，在室温下用振荡器振荡20min，接着加入15μL 1％SDS，震荡培养10min后，缓慢加入50μL2M的NaCl溶液，然后加入1.0OD巯基修饰的检测探针，在60℃下反应3h，冷冻离心机，于转速12000rpm离心10min，去除上清液，用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，最后将沉淀溶于1.0mL纳米粒子存储液中，所述的纳米粒子存储液为20mMNaPO₄·12H₂O，5％BSA，0.25％Twen20，10％蔗糖，即得胶体金通用DNA检测探针，放在4℃冰箱保存待用。

本发明还提供了一种上述引物探针用于制备检测EGFR基因L858R突变试剂中的应用。

本发明还提供了一种检测EGFR基因L858R突变的试剂盒，包括上述引物以及侧流层析试纸条，所述试纸条上的结合垫喷涂有上述探针。

在本发明中，所述的试剂盒成本低廉，特异性、准确度和灵敏度高，灵敏度达到0.78％，准确率为100％，同时操作简便、检测时间短，整个检测过程可以在半小时内完成，极大地缩短了检测时间，结果易判读。

在本发明中，上述试剂盒中还包括RPA扩增试剂。

在本发明中，所述的RPA扩增试剂包括等温扩增时的反应液、等温扩增时的启动液和反应所需的酶。所述的等温扩增试剂购自安普未来生物科技有限公司，产品名称为DNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)，该试剂盒中含有反应所需A液、B液以及干粉反应管，其中A液为等温扩增时的反应液，B液为等温扩增时的启动液，干粉反应管是反应所需的酶，包括重组酶、聚合酶、单链结合蛋白。所述试剂盒中还包括侧流层析缓冲溶液，所述缓冲溶液包括5xSSC、2％BSA和2％PVP，所述的5xSSC为pH7.0的4.4％氯化钠和2.2％柠檬酸钠溶液。本发明对所述缓冲溶液的制备方法没有特殊限定。

在本发明中，所述侧流层析试纸条包括背衬底板，所述的背衬底板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述样品垫与所述结合垫部分重叠，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述结合垫的一侧边位于所述样品垫的下方，所述的结合垫的另一侧边位于所述硝酸纤维素膜的一侧边的上方；所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫部分重叠，所述硝酸纤维素膜的另一侧边位于所述吸样垫的下方；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述的质控线靠近所述吸水垫。所述硝酸纤维素膜上的检测线和质控线之间的间隔为0.5cm。

在本发明中，所述试纸条上的样品垫在使用前用处理缓冲液浸泡处理，所述的处理缓冲液包括0.05M Tris-HCl、0.15mM NaCl、0.25％Triton X-100和2.5％Tween-20，所述处理缓冲液的制备方法为称取上述浓度质量的Tris-HCl、NaCl、Triton X-100和Tween-20溶于双蒸水中，搅拌至充分溶解，即得。本发明用处理缓冲液浸泡处理后，在干燥箱中37℃下干燥4h，置于干燥器中保存备用。在本发明中，所述处理缓冲液浸泡30min，能够降低背景信号。

在本发明中，所述试纸条的检测线划有1mg/mL的链霉亲和素，质控线上划有生物素修饰的质控探针，所述质控探针序列如SEQ ID NO:4所示。所述的链霉亲和素的浓度优选为1mg/mL，所述的质控探针序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO:4)，所述的质控探针序列3’端修饰有生物素，即5’-TTTTTTTTTTTTTTT-Biotin-3’。

在本发明中，所述硝酸纤维素膜为Pall vivid 170(2.5cm×50m)，购自上海捷宁生物科技有限公司，所述硝酸纤维素膜的液体爬升速率(水)：150～225秒/4cm。在本发明中，所述硝酸纤维素膜中的流体迁移速率能够与迁移期间完成DNA-DNA杂交反应所需的时间对应起来。

本发明还提供了一种非诊断目的的根据所述试剂盒检测EGFR基因L858R突变的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测血液样本的ctDNA；

(2)用所述引物以ctDNA为模板进行RPA扩增，RPA扩增反应的条件为：37℃水浴30min；

(3)采用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。

在本发明的上述方法中，步骤(2)中，所述引物的浓度为4μM，所述金标探针的浓度为15nM；所述RPA扩增的反应体系为50μL：A液29.5μL，B液2.5μL，模板2μL，上述的上游引物和下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL；步骤(3)中，所述RPA扩增反应得到的反应产物与所述的缓冲溶液混匀，滴加于侧流层析试纸条样品垫处进行检测，上样体积优选为100μL，所述反应产物与缓冲溶液的体积比优选为5:95；步骤(3)中采用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，当试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区内，则结果为阳性，表明血液样本中含有EGFR基因L858R突变，当试纸条只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有EGFR基因L858R突变。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、检测EGFR基因L858R引物与探针

与常规RPA扩增引物不同，本实施例是基于尾引物的RPA扩增，由于尾引物特异性延伸序列与检测序列之间C3间臂的修饰，保证了检测序列不会被对面延伸过来的引物延伸形成双链，在进行RPA扩增时只需要经过两轮扩增就能形成双尾结构DNA扩增产物(参见图1)，随后双尾的扩增产物将作为下一轮扩增的模板以指数形式扩增得到更多的双尾结构DNA产物。

本实施例针对EGFR基因L858R的保守区设计了3对引物，其中按照本发明的等温扩增过程，对所有引物进行等温扩增后，取10μL产物进行丙烯酰胺凝胶电泳，最后拍胶分析，结果如图2所示。

由图2的结果表明，本发明设计的3对引物经扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，2号引物对扩增的效果最好，条带特异性好，无非特异性扩增，而其他引物对组虽然也具有一定的特异性，但本发明所述的引物对对于MT的扩增效果最好，且对于WT的条带较弱，其中2号引物对的上游引物为5’-biotin-ATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTG-3’，下游引物为5’-TTTTTTTTTT-C3-CAATACAGCTAGTGGGAAGGCAG-3’。

2、RPA扩增反应的条件优化

按表1所示的反应体系，分别对扩增反应所用引物浓度(10μM、8μM、6μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM)、温度(30℃、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、42℃)、时间(10min、20min、30min、40min、50min)进行优化，其中所述的C液为上游引物和下游引物的混合液，等温扩增反应结束后，将反应管中液体震荡混匀，取5μL反应产物与95μL缓冲溶液混匀，滴加于侧流层析试纸条样品垫上，5分钟后，观察侧流层析试纸条显色情况。

表1 RPA扩增试剂反应体系

由图3中的A和B图可知，通过不同浓度的引物对野生型(阴性)与突变型(阳性)进行扩增，发现当引物浓度为4μM时，阳性扩增后检测条带，阴性无条带，当引物浓度提高后，阴性出现了背景信号。

由图4可知，当反应时间到30min时，信号达到了平台期，因此反应时间为30min效果最佳。

由图5可知，在反应温度为37℃时，反应的条带颜色最深，因此反应温度为37℃时效果最佳。

因此，RPA扩增反应的条件为37℃水浴30min。

实施例2

一种非诊断目的的根据所述试剂盒检测EGFR基因L858R突变的方法，具体步骤如下：

(1)提取待测血液样本的ctDNA；

(2)根据所述的引物，以ctDNA为模板，进行RPA扩增；

(3)提前30min将试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀；

(4)每个干粉管中加入10μL A液，即为反应管；

(5)每个反应管分别加入6μL C液；

(6)向反应管中加入2μL模板；

(7)向反应管中加入2μL B液并充分混匀；

(8)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温反应槽中37℃孵育30min；

(9)反应结束后，将反应管中液体震荡混匀，取5μL反应产物与95μL缓冲溶液混匀，滴加于侧流层析试纸条样品垫处；

(10)5分钟后，观察侧流层析试纸条显色情况，当试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区内，则结果为阳性，表明血液样本中含有EGFR基因L858R突变，当试纸条只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带，则结果为阴性，表明样本中不含有EGFR基因L858R突变。

可视化侧流层析试纸条检测原理如图6所示，先在侧流层析试纸条的结合垫上喷有能够与L858R扩增产物一端尾部结合的金标探针，在硝酸纤维素膜检测区划有浓度为1mg/mL的链霉亲和素，链霉亲和素能够与L858R扩增产物的另一端的生物素(Biotin)结合，质控区划有质控探针，它能够与金标检测探针结合，这样当等温扩增产物到达侧流式生物传感器的检测区时，就会被特异性的捕获显色，检测区颜色的深浅与捕获的胶体金的量呈正比，即与等温扩增产物的浓度呈正比。

实施例3

对上述检测EGFR基因L858R突变的方法的灵敏度进行了检测，采用突变型标准品(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)进行灵敏度检测。

由图7可知，经过RPA等温扩增后使用试纸条进行检测，发现灵敏度可达600copies。为了进一步验证该检测方法灵敏度，在野生型标准品(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)中加入不同比例的突变型标准品并进行扩增检测，发现该方法检测灵敏度可达0.78％，其中存在细微背景信号加标阴性造成(参见图8)。

实施例4

根据实施例2的检测EGFR基因L858R突变的方法，对45例临床样本进行盲测，同时对45例临床样本进行了测序，所述的测序为使用PCR技术对45例临床样本进行扩增，将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果见表2。

表2 45例临床样本不同检测方法的结果对比

由图9和表2可知，本发明的检测结果和测序结果一致，准确率达100％，与测序方法相比本发明的检测方法操作更加简便，检测速度更快。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽科技学院

<120> EGFR基因L858R突变检测的引物探针、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 1

atgtcaagat cacagatttt gggtg 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 2

caatacagct agtgggaagg cag 23

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaa 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列)

<400> 4

tttttttttt ttttt 15

Claims (10)

1.EGFR基因L858R突变检测的引物探针，其特征在于，所述L858R突变的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示；所述L858R突变的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；所述L858R突变的探针为金标探针，其序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针，其特征在于，所述金标探针序列3’端修饰18~20nm胶体金。

3.权利要求1或2所述引物探针用于制备检测EGFR基因L858R突变试剂中的应用。

4.一种检测EGFR基因L858R突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物以及侧流层析试纸条，所述试纸条上的结合垫喷涂有权利要求1所述探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RPA扩增试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括侧流层析缓冲溶液，所述缓冲溶液包括5x SSC、2%BSA和2%PVP，所述的5x SSC为pH7.0的4.4%氯化钠和2.2%柠檬酸钠溶液。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为4μM，所述金标探针的浓度为15nM。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条的检测线划有链霉亲和素，质控线上划有生物素修饰的质控探针，所述质控探针序列如SEQ ID NO:4所示。

9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条上的样品垫用处理缓冲液浸泡处理，所述的处理缓冲液包括0.05 M Tris-HCl、0.15 mM NaCl、0.25％Triton X-100和2.5% Tween-20。

10.一种非诊断目的的根据权利要求1或2所述的引物探针或权利要求4~9任意一项所述试剂盒检测EGFR基因L858R突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）提取待测血液样本的ctDNA；

（2）用所述引物以ctDNA为模板进行RPA扩增，RPA扩增反应的条件为：37℃水浴30min；

（3）采用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。

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