CN109402225B

CN109402225B - 一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109402225B
Application number: CN201811174683.7A
Authority: CN
Inventors: 段文军; 翟玲燕; 陈云; 潘玮伦; 黎敏湘; 陈金香; 孙斌; 谢宝平; 谢扬
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2018-10-09
Filing date: 2018-10-09
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2038-10-09
Also published as: CN109402225A

Abstract

本发明公开了一种检测外泌体中miRNA‑1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用，其由纳米金、5'‑CCT GCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA SH‑3'和带有荧光基团的5'‑AAT GGA TTT TTG‑3'制成。本发明探针能直接进入外泌体中进行miR‑1246表达水平的检测，获得了100％的准确率和92.3％的特异性；说明利用本发明建立的基于纳米金核酸探针的检验方法具有临床诊断乳腺癌的应用前景，其优点是准确，结果重现性好，简单，快速，经济，无创。可用于乳腺癌转移的早期诊断、转移风险评估、治疗疗效评估和调整治疗方案、基因测试筛选精准治疗候选病人等。

Description

一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用。

背景技术

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性健康和生命，且近10年乳腺癌发病率和死亡率都呈上升趋势。早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。外泌体是细胞分泌的直径为30-100nm的囊泡，多项研究发现[参考文献:Zhu,J.；Zheng,Z.；Wang,J.；Sun,J.；Wang,P.；Cheng,X.Y.；Fu,L.；Zhang,L.M.；Wang,Z.J.；Li,Z.Y.Different MiRNAExpression Profiles Between Human Breast Cancer Tumors andSerum.Front.Genet.2014,5,149-156.Pigati,L.；Yaddanapudi,S.C.S.；Iyengar,R.；Kim,D.J.；Hearn,S.A.；Danforth,D.；Hastings,M.L.；Duelli,M.D.Selective Release ofMicroRNA Species from Normal and Malignant Mammary Epithelial Cells.PlosOne.2010,5,e13515.Hannafon,B.N.；Trigoso,Y.D.；Calloway,C.L.；Zhao,Y.D.；Lum,D.H.；Welm,A.L.；Zhao,Z.Z.；Blick,K.E.；Dooley,W.C.；Ding,W.Q.Plasma ExosomeMicroRNAs are Indicative of Breast Cancer.Breast Cancer Res.2016,18,90-104Li,X.J.；Ren,Z.J.；Tang,J.H.；Yu,Q.Exosomal MicroRNA MiR-1246Promotes CellProliferation,Invasion and Drug Resistance by Targeting CCNG2in BreastCancer.Cell Physiol.Biochem.2017,44,1741-1748.]，乳腺癌细胞MCF-7分泌的外泌体有选择性富集其亲本细胞中miR-1246，且量远远高于正常乳腺细胞外泌体相应的miRNA含量。由于外泌体可以相对较好地保护其内的miRNA免受体液中核酸酶的降解，比传统的肿瘤标志物更加稳定可靠，同时外泌体在外周血中具有很高的丰度，且血样较传统的侵入式取样方便易得，因此，通过直接检测外周血外泌体中与乳腺癌相关的特征miRNA如miR-1246的异常表达，将有望成为一种简便无创、灵敏准确的癌症早期筛选的辅助手段。

现有的外泌体中核酸的定量检测方法主要有：原位杂交技术、实时定量PCR、电化学传感方法等等。这些方法各有局限，如原位杂交技术虽然特异性好但灵敏度较低，需要较多的样本；实时定量PCR法操作繁琐，需要一系列程序，即外泌体裂解，miRNA分离，cDNA合成和miRNA分析，准确度和精密度较差。所以开发能直接进入外泌体内部进行核酸检测的探针用于疾病诊断，将具有简单、经济、准确等优点，具有很好的临床应用前景。但是，由于外泌体的粒径只有30-100nm，限制了很多探针直接进入其中，因此最有可能直接进入外泌体的探针候选者是一些纳米级别探针。纳米金核酸探针由于其表面连接的寡核苷酸链密度高，使探针不易凝聚、稳定性好、灵敏高，并且多篇文献报到纳米金核酸探针可以不用特殊处理即可进入到细胞系。但是迄今我们未发现有不借助转染工具而直接进入外泌体中进行核酸检测的探针报道。而仅有一篇文献(Alhasan A H,Patel P C,Choi C H J,Mirkin CA.Exosome Encased Spherical Nucleic Acid Gold Nanoparticle Conjugates AsPotent MicroRNA Regulation Agents[J].Small,2014,10(1):186-192.)报导纳米金探针可以通过间接方法进入外泌体，但方法操作繁琐且耗时：该实验方法是首先需要通过纳米金探针和细胞共孵2h，使其进入尺寸较大的细胞，然后通过细胞自主形成外泌体的过程中随机地将纳米金探针包裹在外泌体中。为了尽可能的使得纳米金探针进入外泌体中，这个自主包裹过程需24h。尽管如此，由于纳米金探针在细胞中被包裹进入外泌体具有随机性，所以会大大降低纳米金核酸探针进入外泌体的进入率，该文献中纳米金探针进入率<1％。

发明内容

本申请的技术正好能够突破上述局限性。本申请的技术可以不借助转染工具而直接进入外泌体中进行核酸检测，进入方法简单且进入率高，平均进入率达2个探针/外泌体以上。由于本申请技术合成的纳米金探针比文献探针的结构上更具优势，使其检测灵敏度更高。

本发明的目的在于提供一种直接检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针

本发明的另一目的在于提供上述外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法和应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针，其由纳米金、5'-CCT GCT CCA AAA ATCCAT TAAAAAAA SH-3'和5'-AAT GGA TTT TTG-3'制成，其中5'-AAT GGA TTT TTG-3'的序列上标记有荧光基团。

优选的，所述荧光基团包括Cy5、Cy7、Cy3、5-TAMRA、Texas Red、Rox、CAL FluroRed590、CAL Fluro Red 610、CAL Fluro Red 635、Quasar 670、Quasar705、Alexa 700。

优选的，所述纳米金的粒径不超过14nm，更优选为12.2～13.8nm。

一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法，将5'-CCT GCT CCA AAA ATCCAT TAAAAAAA-SH-3'(该序列3'端的“-SH”表示巯基)和5'-AAT GGA TTT TTG-3'混合，杂交形成DNA双链后，再加入纳米金溶胶，于低温下结冰冷冻，取出得到的冰体，加入氯化钠溶液，在12～22℃条件下解冻，离心取沉淀，并将沉淀用缓冲液清洗干净，得纳米金核酸探针。

优选的，所述低温下结冰的温度为-80～-20℃。

优选的，所述冷冻时间为1～3h。

优选的，所述解冻时间为0.5～1.5h。

优选的，所述缓冲液为HEPES缓冲液。

优选的，所述5'-AAT GGA TTT TTG-3'的序列上标记有荧光基团。

优选的，所述5'-CCT GCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA SH-3'、5'-AAT GGA TTTTTG-3'、纳米金、氯化钠的摩尔用量比为150～250：150～250：1：3.8×10⁷～4.5×10⁷。

优选的，所述纳米金溶胶中纳米金的粒径不超过14nm，优选12.2～13.8nm。

优选的，所述纳米金溶胶的制备方法为：将氯金酸溶液和水混合加热至沸后加入柠檬酸钠溶液，避光继续加热至沸反应15～25min，搅拌冷却至室温即可。

上述任一项所述的纳米金核酸探针在制备检测外泌体中miR-1246的试剂中的应用。

上述任一项所述的纳米金核酸探针在制备检测、筛查乳腺癌试剂中的应用。

一种检测外泌体中miRNA-1246的方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述任一项所述的纳米金核酸探针和外泌体共孵后作为样品液，检测该样品液荧光信号，根据荧光信号判定样品中miRNA-1246的含量。

本发明的有益效果是：

本发明合成了一种核酸修饰的纳米金核酸探针，用于检测miR-1246的表达水平。经试验证明，该探针能直接进入外泌体中进行miR-1246表达水平的检测；可实现以血浆外泌体中miR-1246的表达水平作为标志物进行乳腺癌诊断，获得了100％的准确率和92.3％的特异性；说明利用本发明建立的基于纳米金核酸探针的检验方法具有临床诊断乳腺癌的应用前景，其优点是准确，结果重现性好，简单，快速，经济，无创。该检验方法仅需抽取患者少量静脉血(单次检测只需40微升血浆)即可进行，相比于活体组织取样等侵入式取样方式，对患者造成的痛苦和损害小，患者易于接受和配合，方便临床中反复取样监测分析等优点。可用于乳腺癌转移的早期诊断、转移风险评估、治疗疗效评估和调整治疗方案、基因测试筛选精准治疗候选病人等。

附图说明

图1.纳米金和纳米金核酸探针的结构表征图。(A)纳米金和纳米金核酸探针紫外可见分光光谱；(B)动态光散射仪测定的纳米金和纳米金核酸探针粒度分布图。纳米金(C)和纳米金核酸探针(D)透射电子显微镜表征图。图中，AuNPs表示纳米金，miR-1246Probe表示纳米金核酸探针。

图2.外泌体的表征。(A)纳米颗粒跟踪分析仪测量的MCF-7外泌体粒径分布图；(B)根据透射电子显微镜结果得到的外泌体的粒径分布图；(C)外泌体的透射电子显微镜成像；(D)免疫印迹法获取的外泌体特异性膜蛋白CD63和腔内蛋白TSG 101的条带。

图3.本发明纳米金核酸探针进入外泌体内进行检测产生信号(A)本发明探针(1nM)和不同浓度的合成miR-1246及错配短链DNA 序列在25℃下孵育30min后测其荧光。(B)本发明探针(1nM)和不同浓度的合成miR-1246及错配长链DNA 序列在25℃下孵育30min后测其荧光。(C)本发明探针(1nM)和MCF-7及MCF-10a细胞上清液中获取的不同浓度外泌体在25℃下孵育4h后测其荧光。(D)实时荧光定量PCR检测MCF-7及MCF-10a细胞分泌的外泌体中miR-1246的表达量的相对值。(E)透射电子显微镜(TEM)下观察本发明探针进入外泌体内情况。

图4.本发明miR-1246纳米金核酸探针对乳腺癌患者和正常对照组进行血浆诊断检测。(A)散点图显示乳腺癌患者血浆外体miR-1246水平比正常对照组高，***P<0.0001；(B)ROC曲线评价本发明检测的血浆外泌体miR-1246表达水平在预测乳腺癌与健康状态的准确性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备

一、miR-1246纳米金核酸探针探针的制备

(1)将反应所需的玻璃仪器用王水浸泡一晚，再依次用清水、蒸馏水和超纯水均冲洗三遍以上，放入烘箱烘干以备使用。精密量取17.00mL 0.1％氯金酸溶液和33.0mL的超纯水加入100mL圆底烧瓶中，安装好冷凝装置，设置油浴锅温度为125℃进行加热。加热至沸后迅速加入5mL 38.8mM柠檬酸钠溶液，避光继续加热反应20min，此时液体呈酒红色，即为直径约13nm(电镜下的裸直径)的纳米金溶胶。关闭热源，继续搅拌冷却至室温，4℃避光保存。用紫外分光光度法测定合成的纳米金溶胶浓度，在最大吸收波长520nm处测定纳米金溶胶的吸收度，以摩尔吸光系数ε＝2.7×10⁸进行计算。

(2)取2μL 100μM事先经生物公司合成好的捕获DNA：5'-CCT GCT CCA AAA ATCCAT T-AAAAAAA-SH-3'(SEQ ID NO:1)和2μL 100μM事先合成好的报告DNA：5'-Cy5-AAT GGATTT TTG-3'(SEQ ID NO:2)在18℃水浴反应15min使其杂交形成DNA双链，加入上述100μL10nM纳米金溶胶后迅速放入-20℃冰箱冷冻2h，取出得到的冰体，在解冻之前迅速加入43μL1M氯化钠溶液，最后在18℃条件下解冻1h。通过三次离心(13000rpm，13min)并用100μL25mM HEPES(含300mM NaCl,pH＝7.6)重悬去除多余的游离DNA序列，最后重悬于25mMHEPES(含300mM NaCl,pH＝7.6)。此时得到的即为miR-1246的纳米金核酸探针。其浓度用紫外分光光度法测定，取最大吸收波长523nm处测定纳米金核酸探针的吸收度，以摩尔吸光系数ε＝2.4×10⁸进行计算。

上述捕获DNA：5'-CCT GCT CCA AAA ATC CAT T-AAAAAAA-SH-3'(SEQ ID NO:1)中的-SH表示巯基，连在该序列的3'端。

二、miR-1246纳米金核酸探针探针的表征

对上述制备的纳米金核酸探针采用以下三种常用表征方式进行表征。

(1)紫外可见分光光度法(UV-vis)：将上述制备的纳米金溶胶和纳米金核酸探针用纯水稀释成1mL于微量比色皿中，在400-700nm测定其紫外可见光谱。

检测结果表明纳米金溶胶在518nm处有最大吸收值2.77，浓度为14nM。而纳米金核酸探针由于接上了核酸，粒径增大，紫外可见光谱发现其最大吸收峰红移至523nm处(如图1A)。

(2)动态光散射(DLS)：将上述制备的纳米金溶胶和纳米金核酸探针用纯水稀释成1mL于比色皿中，设置为Size模式，用动态光散射仪测定纳米金溶胶和纳米金核酸探针的水合粒径。

检测结果表明纳米金溶胶和纳米金核酸探针粒径分布均匀，且粒径分别为17.06nm(17.06nm为水合粒径，要比电镜下看到的裸直径13nm大)、41.12nm(水合粒径)，进一步证明合成了纳米金核酸探针(如图1B)。

(3)透射电镜(TEM)：在两铜网上各滴一滴上述制备的纳米金溶胶和纳米金核酸探针溶液，2min后用滤纸吸干多余的溶液，放置30min，使样品干燥，然后在透射电子显微镜下观察。

观察结果显示纳米金呈现球形，且粒径大小为13.0±0.8(nm)(n＝115)。纳米金核酸探针粒径也分布均匀(如图1C和图1D)。

实施例2外泌体的提取及表征

为验证探针可以进入外泌体检测miR-1246，首先从乳腺癌细胞MCF-7和正常乳腺细胞MCF-10a的细胞培养上清液中提取分离外泌体并进行表征。

一、外泌体的提取

MCF-7细胞在含10％胎牛血清和1％双抗的高糖培养基、5％CO₂、37℃条件下培养。当细胞密度至50％-60％时，更换培养液(成分组成同上，但胎牛血清需经过超高速离心去除其中的外泌体)，继续培养24h–48h长至90％左右后收取其上清液，至少收集250mL上清液后将其进行差速离心获取外泌体，方法如下：

(1)去除残留的细胞：4℃，300×g，离心10min后吸取上清液进入下步操作；

(2)去除残留的死细胞：4℃，2000×g，离心20min后吸取上清液进入下步操作；

(3)去除残留的细胞碎片：4℃，10000×g，离心30min后吸取上清液进入下步操作；

(4)获取高纯度外泌体：4℃，135000×g，离心70min，弃去上清液保留沉淀，并将其收集于同一根离心管内。为了防止外泌体损失，用PBS清洗原离心管三次以上，并将洗液一并收集于离心管，继续在4℃，135000×g，80min条件下离心，离心后弃去上清液保留沉淀，即为外泌体，将它重悬于100μL PBS(pH＝7.4)中，-20℃保存。

二、外泌体的表征

(1)纳米粒径跟踪分析(NTA)：将提取的外泌体用PBS稀释1000倍后在NanosightNS300(Malvern Instruments,UK)检测颗粒浓度。设置采集样品颗粒的布朗运动60秒，重复测量3次，得到具有代表性的粒径分布和准确浓度分布范围。

实验结果如图2A，结果表明97％外泌体都分布在0–200nm之内，并且平均粒径为97.8nm。

(2)透射电镜(TEM)：在铜网上滴一滴外泌体溶液样品(原液稀释5倍)，2min后用滤纸吸干多余的外泌体溶液，再滴一滴3％磷钨酸进行复染，2min后用滤纸吸干，最后滴一滴双蒸馏水洗去多余的磷钨酸染色液，并且立即用滤纸吸干，自然放置约30min样品干燥后，在JM-1010电子显微镜(HITACHI H-7650,Japan)下观察样品的粒径大小和形貌。

结果如图2B和图2C,外泌体呈圆形囊泡结构，并且可以看到清晰的膜结构，平均粒径大小为67.7±15.8nm。

(3)蛋白质免疫印迹(Western-Blot)：检测外泌体特异性标记蛋白CD63和TSG101。向15μL外泌体样品中加入RIPA 细胞裂解液，冰上裂解10分钟，然后加入上样缓冲液(FUDE,China)，将其放入100℃恒温金属浴，5min使蛋白变性。待混合物用10％的SDS-PAGE分离胶分离后转移到PVDF膜(Bio-Rad,US)上，然后加入5％脱脂牛奶，放入摇床常温摇晃1h，进行封闭。接下来将敷CD63一抗(1:1000稀释；EPR5702,UK)和TGS 101(1:1000稀释；EPR7130(B)，英国)4℃摇床过夜，待第二天后将膜洗干净，加入二抗，摇床室温敷1h((1:2000稀释，EPR7130(B),UK)。最后，用ECL检测试剂(Yeasen，中国)检测条带，并曝光于多功能成像分析系统(FluorChem R,USA)。

结果如图2D所示，所提取的外泌体检测到明显的特征蛋白CD63和TSG 101条带，验证了我们所提取到的外泌体是合格的，以上所有的数据都证明了我们提取到的外泌体有很高的纯度，并且可以用于后面的miRNA 检测实验。

实施例3.本发明纳米金核酸探针检测miR-1246

一、纳米金核酸探针检测miR-1246的灵敏度及特异性研究

将1nM miR-1246纳米金探针分别和0-50 nM的合成miRNA-1246、miRNA-122、miRNA-21、及三种与miR-1246核苷酸长度相等但分别有2，7,12个不同碱基的DNA序列(Random DNA 1～3)、5种模拟mRNA的长序列DNA(Random DNA4～8)反应，在HEPES的缓冲液、室温条件下避光孵化(总体积50μL)30 min，在384孔酶标板中以630 nm为激发波长，于670nm处测定荧光强度，以信噪比S/B(样品荧光强度/探针空白荧光)对核酸浓度作图。上述Random DNA 1～8的具体序列分别为：

Random DNA 1：5'-AAT GGA TTT TTG GAG CAA T-3'(SEQ ID NO:3)；

Random DNA 2：5'-AAT GGA TTT TTG TCA AGA T-3'(SEQ ID NO:4)

Random DNA 3：5'-GCG CCT CCG ACA GAG CAG G-3'(SEQ ID NO:5)

Random DNA 4：5'-GCG CCT CCG ACA TCA AGA TAA ATG GAT TTT TGG AGC AGGGCG CCT CCG ACA TCA AGA TA-3'(SEQ ID NO:6)

Random DNA 5：5'-GCG CCT CCG ACA TCA AGA TCA CAT CAA GAT AAT GGA TTT TTG GAG CAG GGC GCC TCC GAC ATC AAG ATC ACA TCA AGA T-3'(SEQ ID NO:7)

Random DNA 6：

Random DNA 7：

Random DNA 8：5'-GGA GGT CGC GTA TGC CTC CGA CAT CAA GAT CAC ATC AAGATC CTG CTC CAA AAA TCC ATT GCG CCT CCG ACA TCA AGA TCA CAA ATA ACT AAA AAAAAA AAA AAA AAA AA-3'(SEQ ID NO:10)。

检测结果如图3A,3 B所示。实验结果表明，在1-30 nM范围内，miR-1246探针可以线性响应miR-1246，相关系数为0.993，检测限为0.68nM，显示了很好的灵敏度。同时也具备很好的选择性，当非目标核酸与目标核酸miR-1246碱基序列仅有2个以下相差时才会产生轻微的干扰信号，但不影响目标核酸miR-1246的辨别。

二、纳米金核酸探针对外泌体中miR-1246的测定

为了测试探针是否可以定量检测MCF-7细胞和MCF-10a细胞分泌的外泌体中的miR-1246表达水平。本发明将1M纳米金核酸探针和不同浓度的MCF-7外泌体及MCF-10a(正常乳腺细胞，作为阴性对照)外泌体(0.2×10⁸、1.0×10⁸、3.0×10⁸、5.0×10⁷particles/μL)在PBS缓冲液中386孔板避光孵化，反应4h后，设置激发波长为630nm，发射波长为670nm，测其荧光值，用S/B值表示反应结果。

检测结果如图3C所示。结果表明本发明探针信号与外泌体浓度存在明显正相关，并且对MCF-7的响应信号在同浓度情况下高于对MCF-10a细胞外泌体的响应，这点与用实时定量PCR测定的结果(图3D)非常相似，说明探针信号是来源于其与外泌体中miR-1246的结合。

上述实时定量PCR方法如下：用exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit(QIAGEN，USA)提取MCF-7细胞和MCF-10a细胞的外泌体中总RNA。测定RNA样品的浓度后用All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA试剂盒(GeneCopoeia，QP013，USA)将1μg总RNA逆转录成cDNA。最后用在GoTaq qPCR Master Mix(Promega，US)条件下进行RT-PCR分析，实验做3个复孔，miRNA-1246特异性引物为：Forward primer:AATGGATTTTTGGAGCAGG(SEQ ID NO:11)，Reverse primer:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO:12)。最后RNA表达水平用U6RNA作为内参进行数据标准化及相对基因表达水平计算(2^-ΔΔCt)，结果如图3D，上述U6RNA的引物为：Forward primer:CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID NO:13)，Reverse primer:AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQ ID NO:14)。

三、通过透射电镜观察本发明纳米金核酸探针进入外泌体情况

将5nM本发明纳米金核酸探针和1.0×10⁸particles/μL MCF-7细胞分泌的外泌体共孵反应4h后作为样品液。在铜网上滴一滴样品液，2min后用滤纸吸干多余的外泌体溶液，再滴一滴3％磷钨酸进行负染，2min后用滤纸吸干，最后滴一滴双蒸馏水进行洗去多余的磷钨酸染色液，并且立即用滤纸吸干，自然放置约30min样品干燥后，在JM-1010电子显微镜(HITACHI H-7650,Japan)下观察纳米金探针与外泌体的位置情况。

检测结果如图3E所示，从中可以看出，本发明探针纳米金核酸探针确实进入到了外泌体的内部。从电镜观察结果，结合纳米颗粒追踪分析进行的定量测定，平均进入率约2个探针/外泌体以上。

四、本发明纳米金核酸探针用于临床样本的检测

上述实验结果证明了miR-1246探针不仅可以直接穿透外泌体测量miR-1246表达水平，并且具有高灵敏度和高特异性，接下来我们应用我们的检测方法来研究它是否能区分乳腺癌患者和健康人。实验方法如下：首先对需要检测的46例乳腺癌病人组和28例正常人对照组的血浆样本进行蛋白酶和RNA酶预处理，即取血浆样本40微升，加入蛋白酶K(Solarbio，China)至64μg/mL于37℃温育30分钟后，加入苯甲基磺酰氟(PMSF；BeyotimeBiotechnology，China)至5mM孵化20分钟以终止蛋白酶K的作用，之后加入RNase A(BioFROXX，Germany)至4U/mL，25℃温育20分钟，以降解血浆中非外泌体里的miRNA(游离或与蛋白结合)，最后在25℃下加入本发明制备的miR-1246纳米金核酸探针至1nM孵化4小时，630nm激发，670nm处检测荧光强度。

检测结果如图4所示，从中可以看出，健康对照组血浆(n＝28)平均S/B＝5.27±2.61，而乳腺癌患者(n＝46)的信号为17.73±7.33，所有的信号高于9.5。t检验显示乳腺癌组与正常对照组的平均信号水平有显著差异(p<0.0001)，见图4A。通过受试者工作特征曲线(ROC)分析以确定该方法灵敏度和特异性，结果表明，曲线下面积(AUC)为0.9821，非常接近1(见图4B)，说明本发明miR-1246纳米金核酸探针检测到的血浆外泌体miR-1246水平是诊断乳腺癌的一个很好的指标。从ROC曲线上获得最佳的截断值为8.9(S/B)，以此截断值进行乳腺癌的诊断，灵敏度和特异性分别为100％和92.9％(见图4B)。

上述结果说明，本发明纳米金核酸探针能直接进入外泌体中进行miR-1246表达水平的检测；可实现以血浆外泌体中miR-1246的表达水平作为标志物进行乳腺癌诊断，获得了100％的准确率和92.3％的特异性(46例乳腺癌病人血浆样本和28例健康人样本)；说明利用本发明建立的基于纳米金核酸探针的检验方法具有临床诊断乳腺癌的应用前景，其优点是准确，结果重现性好，简单，快速，经济，无创。该检验方法仅需抽取患者少量静脉血(单次检测只需40微升血浆)即可进行，相比于活体组织取样等侵入式取样方式，对患者造成的痛苦和损害小，患者易于接受和配合，方便临床中反复取样监测分析。可用于乳腺癌转移的早期诊断、转移风险评估、治疗疗效评估和调整治疗方案、基因测试筛选精准治疗候选病人等。

综上所述，本发明纳米金核酸探针可以不需借助转染，直接进入乳腺癌细胞MCF-7分泌的外泌体，并通过荧光信号定量检测其中microRNA-1246(miR-1246)表达。应用于血浆外泌体的分析时，可以不需分离血浆外泌体，仅需探针与血浆样品简单孵化4小时，探针即可进入血浆外泌体检测其中miR-1246水平。通过对28个健康人对照血浆样本和46个乳腺癌患者血浆样本进行检测分析，两组样本信号的平均值有显著性差异(p<0.0001)，散点图显示28个健康人血浆样本的检测信号(样本荧光强度/探针空白荧光强度，S/B)仅有2例高于9，而乳腺癌患者的血浆样本信号值均高于9.5。以此两组数据绘制的受试者特征工作曲线(ROC曲线)显示,若以本探针检测的血浆外泌体中miR-1246的表达水平的荧光信号(S/B)作为诊断乳腺癌的指标，得到S/B＝8.9，为区分乳腺癌阴性与阳性的最佳截断点，以此最佳截断点进行的诊断准确率为100％，特异性92.9％，曲线下面积为0.9821。本发明提供的检测血浆外泌体中mircroRNA-1246的方法可以准确用于辅助筛查诊断女性群体中乳腺癌患者,灵敏度高,特异性强。该液体活检的无创诊断，使病人免收组织活检的侵入式损害，或X射线影像检查的放射损害，适合于需要多次取样的治疗疗效评估、肿瘤转移风险监测、或复发风险分析等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cctgctccaa aaatccatta aaaaaa 26

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<212> DNA

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<212> DNA

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gcgcctccga catcaagatc acatcaagat aatggatttt tggagcaggg cgcctccgac 60

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gtgcagggtc cgaggt 16

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aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims

1.一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针，其特征在于，其由纳米金、5'-CCTGCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA-SH-3'和5'-AAT GGA TTT TTG-3'制成，其中5'-AAT GGATTT TTG-3'的序列上标记有荧光基团，其中5'-CCT GCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA-SH-3'和5'-AAT GGA TTT TTG-3'杂交形成DNA双链；其中所述纳米金的粒径大小为13.0±0.8nm。

2.一种检测miRNA-1246的纳米金核酸探针的制备方法，其特征在于，将5'-CCT GCTCCA AAA ATC CAT TAAAAAAA SH-3'和5'-AAT GGA TTT TTG-3'混合在18℃反应15min杂交形成DNA双链后，再加入纳米金溶胶，于-20℃下结冰冷冻2h，取出得到的冰体，加入氯化钠溶液，在18°C条件下解冻1h，13000rpm离心13min取沉淀，并将沉淀用缓冲液清洗干净，得纳米金核酸探针；其中，所述5'-AAT GGA TTT TTG-3'的序列上标记有荧光基团；所述5'-CCTGCT CCA AAA ATC CAT TAAAAAAA SH-3'、5'-AAT GGA TTT TTG-3'、纳米金、氯化钠的摩尔用量比为200：200：1：4.3×10⁷；所述纳米金溶胶的制备方法为：将氯金酸溶液和水混合125℃加热至沸后加入柠檬酸钠溶液，避光继续加热反应20min，搅拌冷却至室温，4℃避光保存；所述纳米金溶胶在518nm处有最大吸收值2.77，所述纳米金核酸探针紫外可见光谱其最大吸收峰红移至523nm处，所述纳米金溶胶和纳米金核酸探针粒径分布均匀，且粒径分别为17.6nm、41.12nm；纳米金呈现球形，粒径大小为13.0±0.8nm，纳米金核酸探针粒径分布均匀。

3.权利要求1所述的纳米金核酸探针或由权利要求2所述方法制备的纳米金核酸探针在制备检测外泌体中miR-1246的试剂中的应用。

4.权利要求1所述的纳米金核酸探针或由权利要求2所述方法制备的纳米金核酸探针在制备检测、筛查乳腺癌试剂中的应用。