CN117969833A - 一种sers生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
一种sers生物传感器及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117969833A CN117969833A CN202410130731.1A CN202410130731A CN117969833A CN 117969833 A CN117969833 A CN 117969833A CN 202410130731 A CN202410130731 A CN 202410130731A CN 117969833 A CN117969833 A CN 117969833A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sers
- solution
- reagent
- hours
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 title claims abstract description 156
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 33
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 19
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000002073 nanorod Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 14
- XHSSRBLTUVPKQU-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylbutanimidamide Chemical compound NC(=N)CCCS XHSSRBLTUVPKQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 8
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 8
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims description 6
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims description 6
- LMJXSOYPAOSIPZ-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(S)C=C1 LMJXSOYPAOSIPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 238000000479 surface-enhanced Raman spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- HATKUFQZJPLPGN-UHFFFAOYSA-N 2-phosphanylethane-1,1,1-tricarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C(CP)(C(O)=O)C(O)=O HATKUFQZJPLPGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- -1 Polydimethylsiloxane Polymers 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 238000005566 electron beam evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 201000011591 microinvasive gastric cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 101150086731 ges-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000006855 networking Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002699 Ag–S Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001089723 Metaphycus omega Species 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 241000519996 Teucrium chamaedrys Species 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010267 cellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001861 endoscopic biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 238000001782 photodegradation Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于光谱学检测领域,具体涉及一种SERS生物传感器及其制备方法与其在制备胃癌外泌体检测试剂盒中的应用,SERS生物传感器包括SERS传感芯片、第一试剂和第二试剂;所述SERS传感芯片为修饰有四面体NTH探针的银纳米棒阵列基片;第一试剂含SERS探针1;第二试剂含SERS探针2,SERS传感芯片通过在银纳米棒阵列基片表面修饰带有巯基的四面体探针制备而成。SERS探针则是通过在金纳米颗粒表面修饰核酸链和4MBA制备而成;检测时,样品与第一、第二试剂混合后孵育于SERS传感芯片上,通过检测4‑MBA的SERS信号实现外泌体检测,传感器检测灵敏度高、特异性好、稳定性强,检测限低。
Description
技术领域
本发明属于光谱学检测领域,具体涉及一种SERS生物传感器及其制备方法与其在制备胃癌外泌体检测试剂盒中的应用。
背景技术
传统的胃癌诊断主要依赖内镜活检和医学影像技术,但由于肿瘤的分子和表型异质性,组织采样困难,影像技术的限制致使早期诊断困难,导致生存率偏低。胃癌在早期阶段的组织采样通常需要通过内镜活检,这对患者而言极其痛苦;此外,早期胃癌的肿瘤体积通常较小,常规医学影像技术如X射线、CT扫描等可能无法准确检测到病变,加剧了诊断的困难。因此,迫切需要更准确的检测策略,以实现早期胃癌的及时治疗,降低死亡率。
外泌体是一种由多种细胞分泌的纳米级囊泡,在血液、尿液等体液中广泛存在。这些囊泡携带丰富的生物分子,如蛋白质、脂质以及mRNA、microRNA和DNA片段。外泌体在细胞通讯和疾病发展中发挥关键作用,被认为是癌症的重要生物标志物。最近的研究表明,胃癌细胞分泌的外泌体可能参与病理过程,推动肿瘤生长、迁移、侵袭和耐药性的形成。因此,外泌体的检测对于早期胃癌筛查至关重要。
随着对癌症的研究不断深入,人们意识到在病变的早期,生物标志物的含量较低。然而,现有的检测技术灵敏度有限,容易漏检,尤其在复杂的体液中,“假阳性”或“假阴性”现象常常发生,严重影响结果可靠性。因此,急需开发一种既可靠又高灵敏的传感器,以实现早期癌症检测。
为解决这一问题,已经研发了多种用于外泌体检测的生物传感器,包括电化学、荧光发光、比色、SPR、SERS等技术。表面增强拉曼光谱技术(SERS)作为一种超灵敏的无损分析技术,具有抗光漂白和光降解能力,近年来在外泌体检测中表现出良好性能。与传统的免疫分析法相比,所设计的SERS传感器无需酶催化,具有更高的灵敏度与特异性,更短的反应时间,以及多元检测的优势,为外泌体检测提供了新思路与方法。
在外泌体检测中,通常采用三明治方法,即构建三层结构的检测策略,例如在Su等人公开的方案中(Xiaoming Su Xinyu Liu,Yangcenzi Xie,Mingyang Chen,Chao Zheng,Hong Zhong,andMing Li,Integrated SERS-Vertical Flow Biosensor EnablingMultiplexed Quantitative Profiling ofSerological Exosomal Proteins inPatients forAccurate Breast Cancer Subtyping,ACS Nano 202317(4),4077-4088),采用三明治结构同时定量分析多种外泌体蛋白,用于乳腺癌的个性化诊断和精确管理。传统的捕获部分常使用单链DNA,但由于单链DNA的灵活性,其容易倒伏于基底表面,从而自组装形成单分子层,阻碍目标外泌体的捕获;而传统的三明治结构由于没有信号放大策略的参与,其产生的信号强度较低,并不能实现高灵敏的检测。
发明内容
针对当前外泌体检测对于快速灵敏测定的重大需求,为了克服低丰度外泌体检测灵敏度低、SERS技术在低纯度检测体系中抗杂质干扰性能较差等方面的不足,本发明设计了基于适配体靶向外泌体并触发CHA反应形成网络化纳米结构的策略,提供一种用于SERS生物传感器及其制备方法与其在制备胃癌外泌体检测试剂盒中的应用,所述的SERS生物传感器制备简单、检测无需扩增和专业技术人员操作,灵敏度高如检测限低至103量级、特异性好如能明显区分非特异性外泌体、在复杂血液背景中具有可靠的回收率,能够实现胃癌外泌体生物标志物高灵敏检测,为早期胃癌的诊断提供了一种创新且可行的解决方案。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
第一方面,本发明提供了一种SERS生物传感器,包括SERS传感芯片、第一试剂和第二试剂;如图1b所示,所述SERS传感芯片为修饰有四面体NTH探针的银纳米棒阵列基片;所述第一试剂为SERS探针1及其缓冲液;所述第二试剂为SERS探针2及其缓冲液;
如图1a所示,所述四面体NTH探针是由碱基序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7所示的DNA单链组装而成,SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7所示的DNA单链分别记为DNA单链A、B、C、D、E、F和Capture CD63;
如图1a所示,所述SERS探针1(SERS Tag1)是通过金纳米颗粒AuNPs表面修饰双链结合物MP、发夹型核酸链H2和拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4MBA)制备得到;双链结合物MP是由核酸适配体链Apt MUC1与其锁核酸链P1的结合物,其中,Apt MUC1、P1、H2的碱基序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11所示;MP与H2的组装物质的量比范围为1:1~1:8且优选为1:4。
如图1a所示,所述SERS探针2(SERS Tag2)是通过金纳米颗粒表面修饰发夹型核酸链H1和拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4MBA)制备得到,核酸链H1的碱基序列如SEQ ID NO.10所示;
优选的,所述金纳米颗粒的粒径为15nm。
优选的,所述SERS传感芯片由NTH探针与银纳米棒阵列基片共培养2.5小时制备得到,NTH探针通过巯基与银纳米棒形成Ag-S共价键连接在基片表面;
所述NTH探针是将7种DNA链即A、B、C、D、E、F和Capture CD63混合后退火处理形成NTH探针,所述退火处理步骤包括:加热至95℃持续5分钟,冷却至4℃并保持30分钟;所述银纳米棒阵列基片采用真空电子束蒸发镀膜方法制备而成且所述银纳米棒阵列基片覆盖了一层开有小孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层,所述小孔的孔径为4mm,高度为1mm;
优选的,所述第一试剂的制备步骤包括:
1)将适配体核酸链Apt MUC1与三羧乙基膦溶液(TCEP)按1:1000的物质的量的比例混合以去除二硫键,定容至25μM,25℃反应4小时;将反应后的25μM的Apt MUC1与25μM的锁核酸链P1混合后退火处理,形成Apt MUC1-P1杂交产物,命名为MP;
2)将发夹型核酸链H2与TCEP按1:1000的物质的量的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
3)将12.5μM的步骤1)反应得到的MP溶液与25μM的步骤2)反应得到的H2溶液与2.3nM的AuNPs溶液在5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时,其中,MP溶液、H2溶液、AuNPs溶液和5×TBE缓冲液的配置体积比为2:3:100:10;
4)向步骤3)得到的混合物中每0.5小时依次加入体积量为MP溶液加入量的0.5倍、1倍、1.5倍和2倍且浓度为2M的NaCl溶液,振荡反应5小时;
5)向步骤4)得到的混合物中添加体积量为MP溶液加入量的2.5倍的浓度为100μM的4-MBA、在25℃和40rpm的条件下振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心12000rpm,20分钟,离心洗涤三次;最后,在体积量为MP溶液加入量的5倍的0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERS Tag1,并在4℃下保存以备将来使用。
优选的,所述第二试剂的制备步骤包括:
1)将发夹型核酸链H1与TCEP按1:1000的物质的量的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
2)将25μM的步骤1)反应得到的H1与2.3nM的AuNPs在5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时,其中,H1溶液、AuNPs溶液和5×TBE缓冲液的配置体积比为4:100:10;
3)向步骤2)得到的混合物中每0.5小时依次加入体积量为上述H1溶液加入量的0.25倍、0.5倍、0.75倍和1倍且浓度为2M的NaCl溶液,振荡反应5小时。
4)向步骤3)得到的混合物中添加体积量为H1溶液加入量的1.25倍的100μM 4-MBA,25℃40rpm振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心12000rpm,20分钟,离心洗涤三次;最后,在体积量为上述H1溶液加入量的2.5倍的0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERSTag2,并在4℃下保存以备将来使用。
第二方面,本发明提供了上述SERS生物传感器在制备胃癌细胞外泌体检测试剂盒中的应用,所述应用步骤包括:
1)在4℃的1×PBS缓冲液中加入胃癌细胞分泌的外泌体标准化样品溶液,备用,样品溶液中外泌体的浓度范围为7×103~7×107particles mL-1;
2)将第一试剂、第二试剂与不同浓度的外泌体标准化样品溶液混合后,与SERS传感芯片共培育,培育温度为37℃,培育时间为2.5小时;
3)将经过步骤2)中培育后的SERS传感芯片用超纯水清洗多次后进行SERS测试,得到不同浓度的外泌体的SERS光谱,以目标外泌体浓度的对数为横坐标,分别以4-MBA的特征峰的SERS强度为纵坐标,绘制SERS传感的工作曲线,并根据工作曲线确定传感器的SERS传感检测限。
反应原理:如图1c所示,当靶标外泌体存在时,由于适配体和CD63蛋白的特异性结合,它可以与NTH上结合的三条Capture CD63结合,从而实现外泌体的捕获。随后,SERSTag1上的Apt MUC1识别已被捕获的外泌体,并与之相结合,同时释放P1,触发H1与H2之间的CHA反应。具体而言,P1通过碱基互补配对与H1杂交,形成H1-P1,并打开H1的环结构。然后,在H1的3’端,SERS Tag2上的H2与H1-P1通过互补碱基结合,形成杂交H1-P1-H2,P1被H2以更高的结合力替换下来,从而触发下一轮CHA反应循环。这样,在传感芯片中形成大量的H1-H2复合物,即形成大量SERS Tag1与SERS Tag2的结合产物,生成网络化结构。检测4-MBA的SERS信号,从而实现对样品溶液中外泌体的定性、定量分析。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:本发明提供的SERS生物传感器针对检测对象外泌体的尺寸大小,引入了四面体连接适体作为捕获基底,其稳定的结构和高结合效率有望提高外泌体的捕获效果,可以极大改善由于单链DNA的自组装而形成的单分子层对外泌体有效捕获的阻碍效应;同时,引入催化发夹组装(CHA)信号放大策略,进而实现纳米金颗粒自组装形成网络化结构,产生信号放大。而传统的信号放大策略需要酶的参与,例如Zhang的工作中,参见文献:Ahomogeneous electrochemical sensingplatform basedon DNAzyme walker for accurate detection ofbreast cancer exosomes,SensorsandActuators B:Chemical,Volume 404,2024,135252),构建了一种基于DNAzyme诱导的DNA walker和酶催化扩增策略的电化学生物传感器;而本发明基于CHA无需酶的参与,稳健且有效,可以在最大程度上实现外泌体的高灵敏检测,可以用于胃癌外泌体生物标志物的高灵敏检测。本发明适用于胃癌高危人群筛查,可以实现早期胃癌患者的高灵敏检出。
附图说明
图1a为本发明所述四面体NTH探针、SERS探针1和SERS探针2的组装过程示意图;
图1b为本发明所述SERS传感芯片组装过程示意图;
图1c为本发明所述SERS生物传感器用于检测外泌体的原理图;
图2a为本发明实施例1中所述组成NTH的7条不同DNA的凝胶电泳表征;
与2b为本发明实施例1中所述的NTH探针组装过程的凝胶电泳表征;
图2c为本发明实施例1中所述CHA机制的PAGE凝胶电泳表征;
图3为本发明实施例1中所述的靶标外泌体触发CHA形成SERS探针网络状结构的可行性的TEM表征;
图4a本发明实施例3中两种带有不同信号分子的SERS Tag1’与SERS Tag2的示意图;
图4b为本发明实施例3中SERS Tag1’与SERS Tag2的CHA形成示意图;
图4c为本发明实施例3中靶标外泌体触发CHA形成SERS探针网络状结构的可行性的SERS表征;
图5a为本发明实施例3中所述不同信号分子的优选时构建的SERS探针示意图;
图5b为本发明实施例3中不同信号分子的优选实验结果;
图6a为本发明实施例4中所述MP复合物与H2序列之间的不同用量比条件下的SERS信号强度对比;
图6b为图6a对应的浓度对数的校准曲线;
图6c为图6a对应的相对信号强度;
图6d为不同孵育时间对检测结果的影响;
图6e为图6d中1077cm-1特征峰信号强度结果的直方图;
图7a为本发明实施例5中所述的SERS生物传感器检测不同浓度外泌体对应的SERS光谱图;
图7b为图7a的各谱线中4-MBA在1077cm-1特征峰信号强度与外泌体浓度对数的工作曲线;
图8a为本发明实施例6中所述的SERS生物传感器的均一性测试结果;
图8b为本发明实施例6中所述的SERS生物传感器的可重复性表征;
图9为本发明实施例7中所述的SERS生物传感器回收率验证表;
图10a为本发明实施例8中所述的SERS生物传感器检测不同种类外泌体的特异性表征;
图10b为图10a中检测结果差异显著性分析。
具体实施方式
为了相关技术领域人员更好的理解本发明专利的内容,下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的内容不限于下述的实例。
5×TBE缓冲液(445mM Tris,10mM EDTA-2Na,450mM H3BO3)、氯化镁(MgCl2·6H2O,≥98%)和三羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3,Tris,≥98%)购自国药有限公司化学试剂有限公司,用于制备TM缓冲液(10mM tris-HCl和1mM MgCl2,pH 8.0)。所有溶液均用超纯Millipore水(18.2MΩ·cm)配制。SGC-7901、GES-1、HepG2细胞、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)干粉、胎牛血清(FBS)、和不完全高糖培养液DMEM培养液试剂购买于江苏凯基生物技术股份有限公司,三(2-羧乙基)膦(TCEP)、4-巯基苯甲酸(4MBA,99%)和5,5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB,99%)从Sigma-Aldrich(中国上海)购得。
本发明所使用的DNA碱基序列片段均为人工合成得到,均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以下实施例中所用到的用于NTH组装的ssDNA:A、B、C、D、E、F和CaptureCD63、核酸适配体链Apt MUC1、封闭链P1、发夹型核酸链H1、发夹型核酸链H2的碱基序列依次如序列表中SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:11所示,且具体序列如下:
A:5’-(SH)-GTCTGAGGCAGTTGAGA
GATCTCGAACATTCCATCGTACGATCATAGATCAAT-3’;
B:5’-TAAGTCTGAAGATCCATTTATCACCAGCTGCTGCACGCCATAGTAG ACGTATCACCTGTCC-3’;
C:5’-AGCTACTTGCTACACGA
GGATCTTCAGACTTAGGAATGTTCGAGATCA
CATGCGAGGACTCGGTCCAATACCGTACTAACGATTACAGATCAA ATCGTACGATCATAGATCAAT-3’;
D:5’-CAGCTGGTGATAAAACGTGTAGCAAGTAGCTTTGATCTGTAATCGA CTCTACGGGAAGAGC-3’;
E:5’-(SH)-ATGCCCATCCGGCTCACTACTATGGCGTGCAGATCGTACG ATCATAGATCAAT-3’;
F:5’-(SH)-CGAGTCCTCGCATGA
CTCAACTGCCTCAGACGGACAGGTGATACGA GAGCCGGATGGGCATGCTCTTCCCGTAGAGATAGTACGGTATTGGAC-3’;
Capture CD63:5’-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTAAATTGATCTATGATCGTACGAT-3’;Apt MUC1:5’-(SH)-TTTTTTGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’;P1:5’-CCAGGGTATCCAAAGGAT-3’;
H1:5’-ATCCTTTGGATACCCTGGAAGGATGAATTCCCAGGGTATCCA TTTTTT-(SH)-3’;
H2:5’-CCCTGGGAATTCATCCTTCCAGGGTATCGTAAGGATGAATTC TTTTTT-(SH)-3’;
实施例1:胃癌外泌体的SERS生物传感器的制备
一、制备SERS传感芯片:
银纳米棒阵列基片的制备:参照文献Song C,Chen J,Zhao Y,et al.Gold-modified silver nanorod arrays for SERS-based immunoassays with improvedsensitivity.Journal ofMaterials Chemistry B,2014,2(43):7488-7494.中第二节记载的真空电子束蒸发镀膜方法制备本银纳米棒阵列基片,然后在制备的银纳米棒阵列基片覆盖一层开有小孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层,所述小孔的孔径为4mm,高度为1mm;
NTH探针的制备:将上述A、B、C、D、E、F序列的DNA单链和Capture CD63按物质的量1:1:1:1:1:1:3的比例在1×TM缓冲液(20mM Tris-HCl、50mM氯化镁,pH 8.0)中混合,加热至95℃持续5分钟,冷却至4℃并保持30分钟,获得NTH探针溶液,并定容至1μM;
用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征NTH探针组装可行性:用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳表征组装NTH的7种不同DNA,5%聚丙烯酰胺凝胶电泳表征NTH的组装。如图2a所示为组成NTH的7条不同DNA,该凝胶电泳条件为:80V,100分钟,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE);如图2b所示为NTH的组装过程,该凝胶电泳条件为:100V,90分钟,5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。通过分析图2b可以观察到,随着每条链的加入,NTH逐步组装。从泳道2到7观察到明显的移,表明了NTH的高产率形成(泳道7)。
SERS传感芯片的制备:取20μL的NTH探针溶液滴加在上述银纳米棒阵列基片上,37℃,60~80%湿度环境中共培养2.5小时,使用超纯水冲洗后获得表面修饰有NTH探针的银纳米棒阵列基片即本发明所述的SERS传感芯片,在上述培养过程中,NTH探针是通过巯基与银纳米棒形成Ag-S共价键连接在基片表面的;
二、含SERS Tag1的第一试剂的制备
1)将适配体核酸链Apt MUC1与三羧乙基膦溶液(TCEP)按1:1000的物质的量的比例混合以去除二硫键,并定容至25μM,25℃反应4小时;将上述反应后的25μM的Apt MUC1与25μM的锁核酸链P1混合后退火处理,形成Apt MUC1-P1杂交产物,命名为MP;
2)将发夹型核酸链H2与TCEP按1:1000的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
3)将20μL 12.5μM的步骤1)反应得到的MP与30μL 25μM的步骤2)反应得到的H2与1000μL 2.3nM的AuNPs在100μL 5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时。
4)向步骤3)得到的混合物中每0.5小时依次加入10、20、30和40μL的2M NaCl溶液,振荡反应5小时。
5)向步骤4)得到的混合物中添加50μL的100μM 4-MBA,25℃40rpm振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心(12000rpm,20分钟)离心洗涤三次。最后,在100μL 0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERS Tag1,并在4℃下保存以备将来使用。
三、含SERS Tag2的第二试剂的制备
1)将发夹型核酸链H1与TCEP按1:1000的物质的量的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
2)将40μL 25μM的步骤1)反应得到的H2与1000μL 2.3nM的AuNPs在100μL 5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时。
3)向步骤2)得到的混合物中每0.5小时依次加入10、20、30和40μL的2M NaCl溶液,振荡反应5小时。
4)向步骤3)得到的混合物中添加50μL的100μM 4-MBA,25℃40rpm振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心(12000rpm,20分钟)离心洗涤三次。最后,在100μL 0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERS Tag2,并在4℃下保存以备将来使用。
本实施例1所述的外泌体的SERS生物传感器即包括上述SERS传感芯片、含SERSTag1的第一试剂和含SERS Tag2的第二试剂。
用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳表征靶标外泌体触发CHA形成H1-H2双链结构,即SERS探针网络状结构的DNA杂交可行性:如图2c所示为用于表征CHA机制的PAGE凝胶电泳图。该凝胶电泳条件为:80V,90分钟,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。图中泳道2、3、4和5分别代表不同核酸链:MUC1、P1、H1和H2,exo为对应外泌体MUC1蛋白的模拟DNA序列,其序列如SEQID NO.12所示。泳道6为Apt MUC1与P1的混合物,与泳道2、3相比其条带位置上移,表明AptMUC1+P1复合物(MP)已经成功形成。在泳道7(Apt MUC1+P1+exo)中,条带位置相较泳道6有所上移,且出现一条与P1对应的条带,表明Apt MUC1与exo成功结合,P1成功脱落。在泳道8中,混合了两条单独的发夹结构的H1与H2,两条分开的条带成功说明了无靶标时不易组装形成H1+H2复合物。泳道9中混合了MP与单独的发夹结构的H1与H2,其中对应条带说明了无靶标时无法触发CHA,而在泳道10(MP+exo+H1+H2)中,新生成的条带位置上移,为CHA产物:H1+H2双链结构,说明脱落的P1成功催化了CHA反应的产生,形成了大量的CHA产物,验证了CHA放大策略可行性。
进一步用TEM图像对靶标外泌体触发CHA形成H1-H2双链结构,即SERS探针网络状结构的可行性进行了表征:如图3所示,利用TEM表征了AuNPs、SERS Tag1、SERS Tag2、在没有靶标外泌体存在时SERS Tag1+SERS Tag2以及在有靶标外泌体存在时SERS Tag1+SERSTag2的分布及其形貌特征。使用的AuNPs形貌如图3中的a图所示;SERS Tag1与SERS Tag2的形貌分别如图3中的b图与c图所示,可以观察到其分散良好;对SERS Tag1与SERS Tag2混合后进行形貌表征,如图3中的d图所示,可以观察到并没有网络化结构生成,分散良好,因此在无外泌体靶标存在时,CHA无法被触发;而将SERS Tag1、SERS Tag2与外泌体共同混合反应60min后,对其进行形貌表征,如图3中的e图所示,可以观察到探针发生了聚集,形成了大片网络化结构,因此成功验证了CHA放大策略的可行性。
以上结果表明,所设计的基于适配体靶向特异性触发网络状结构的CHA策略可用于靶标外泌体的检测。
实施例2:SERS传感器用于胃癌外泌体检测的可行性验证
验证步骤如下:
1)使用梯度超速离心法从SGC-7901细胞培养基中分离出外泌体:通过离心去除上清液中的完整细胞(500g,10min,4℃),接着通过离心去除上清液中的细胞碎片与凋亡小体(10000g,90min,4℃),最后通过离心(100000g,120min,4℃)去除上清液并将离心产物分散于1×PBS(1mM,pH=7.0,4℃)制得样品溶液,备用;其中,所得到的样品溶液中外泌体的浓度范围为7×103~7×107particles mL-1;
2)分别取9μL实施例1中制备的第一试剂、9μL实施例1中制备的第二试剂和上述2μL 7×103、105、107particles mL-1的浓度的待检测外泌体的样品溶液混合,于37℃条件下在SERS传感芯片上孵育,40rpm振荡反应40分钟;以添加1×PBS代替待检测外泌体的样品溶液作为空白对照。
3)将步骤2)反应得到的样品用超纯水清洗多次后进行SERS测试,得到不同浓度目标外泌体的SERS光谱,以目标外泌体浓度的对数为横坐标,分别以4-MBA的特征峰的SERS强度为纵坐标,绘制SERS传感的工作曲线,根据工作曲线计算传感器的SERS传感检测限。
实施例3:SERS生物传感器信号分子优选实验
用SERS对靶标外泌体触发CHA形成SERS探针网络状结构的可行性进行了表征,如图4a所示为两种带有不同信号分子的SERS Tag1’与SERS Tag2的示意图,图4b为检测示意图,利用两种不同的信号分子对CHA的可行性进行验证。最终结果如图4c所示,可以检测出两种不同信号分子的输出信号,证明最终产物包含两种不同的探针,CHA成功触发;虽然两种信号分子在CHA的可行性方面无明显的差异,但是本申请发明人发现:实施例1中制备的SERS传感芯片本身存在特征峰,且该峰位置接近于DTNB(1331cm-1)的特征峰位置;为了减少其对最终信号输出的影响,进行不同信号分子的优选:实验中所使用的不同的SERS探针示意图如图5a所示,其中SERS Tag1'与SERS Tag2'上的均修饰有DTNB信号分子,筛选的结果如图5b所示,图中指数代表外泌体的浓度,结果表明,相比于DTNB,使用4-MBA作为信号分子可以避开由于四面体基底特征峰的影响,同时其对检测结果几乎无影响。因此,选择4-MBA作为信号输出分子。
实施例4:SERS生物传感器制备条件优化和测试条件优化
在SERS生物传感器的构建过程中,申请人发现在SERS Tag1制备过程中,MP复合物与H2序列之间的用量比会直接影响SERS生物传感器对样本溶液的检测信号输出效果,并设置了验证性试验:
参见本申请实施例1中的含SERS Tag1的第一试剂的制备过程,保持MP与H2的DNA的总物质的量为1000mol,固定DNA总量不变,通过改变二者之间的比例关系,设置5组不同的比例,其余制备条件均于实施例1中的第一试剂的制备过程相同,具体的,试验组4-1中,MP物质的量为500mol,H2的物质的量为500mol;即MP与H2的物质的量比为1:1;试验组4-2中,MP物质的量为333mol,H2的物质的量为666mol;即MP与H2的物质的量比为1:2;试验组4-3中,MP物质的量为200mol,H2的物质的量为800mol;即MP与H2的物质的量比为1:4;试验组4-4中,MP物质的量为143mol,H2的物质的量为858mol;即MP与H2的物质的量比为1:6;试验组4-5中,MP物质的量为111mol,H2的物质的量为888mol;即MP与H2的物质的量比为1:8。
不同比例组合下检测不同浓度外泌体1077cm-1的SERS信号强度结果如图6a所示,其对应的浓度对数的校准曲线如图6b所示。为了对比其性能表现,计算了不同比例下的相对信号强度(Relative Signal Intensity RSI),同时计算相邻浓度信噪比的差值来对比区分度,如图6c所示。结果表明,1:4比例组拥有最高的信噪比与最大的区分度,对应检测灵敏度最好。
此外,在NTH捕获基底上第一试剂、第二试剂与靶标外泌体的孵育时间对检测效果具有重要意义。调控孵育时间从0min~90min,外泌体浓度为7×106particles mL-1,结果如图6d与图6e所示,当t<40时,SERS强度几乎呈线性增加;当t>40时,强度几乎到达饱和值,这表明,CHA反应的较佳时间为40min,此时反应达到平衡。
实施例5:SERS生物传感器检测胃癌外泌体的工作曲线及检测限
按照实施例3中的最优条件即MP与H2的物质的量比为1:4代替实施例1中的相应制备条件,其余制备步骤与实施例1相同,制备获得的SERS生物传感器用于外泌体样本的检测,孵育时间按照实施例3中的较佳孵育时间即40min;测试结果如图7a和图7b所示:SERS强度同样随靶标浓度增大而增大,线性校准曲线如下:I1077=1180×LgCexo-1411,检测限LOD达到:7.9×103particles mL-1。
实施例6:SERS生物传感器检测胃癌外泌体的均一性表征
照实施例3中的最优条件和实施例1中的制备步骤进行传感器的制备与检测,如图8a展示了SERS传感芯片检测7×103、7×105、7×107particles mL-1外泌体的30个随机点在1077cm-1处的SERS强度,结果表明,SERS强度的相对标准偏差(RSD)均小于4.23%,SERS芯片具有较好的均一性。此外,图8b显示了5组不同批次的SERS传感芯片检测相同浓度7×106particles mL-1外泌体的SERS强度,RSD为6.2%,从检测结果分析,可以非常直观地看出不同批次的SERS测试结果无明显差异,证明了提出的SERS传感器具有良好的可重复性,检测结果较为可靠。
实施例7:SERS生物传感器在人血清中检测胃癌外泌体的回收率验证
在50%人血清环境中配置了4种不同浓度的靶标样本,样本配置时,先使用PBS缓冲液配置50%浓度的混合型人血清,再使用配置后的溶液作为缓冲液配置外泌体样本,混合型人血清购自北京中科晨宇科技有限公司,分别为3.85×104、3.85×105、3.85×106和3.85×107particles mL-1,并进行回收率验证。如图9的表格所示,SERS传感的回收率在87.7%~99.5%之间,表明所提出SERS模传感器对复杂真实样品中的靶标外泌体检测具有较好的可靠性。
实施例8:SERS生物传感器检测不同种类外泌体的特异性表征
对不同来源外泌体进行相同SERS测试,其中,GES-1为人正常胃黏膜细胞,HepG2为人肝癌细胞。实验结果表明,所设计的SERS传感器对胃癌来源外泌体检测具有特异性,其检测结果如图10a所示,SERS传感器对相同浓度的外泌体进行检测,其中胃癌外泌体的1077cm-1的SERS信号强度达到6500a.u.,而HepG2与GES-1则分别为3500a.u.与2800a.u.。如图10b所示,胃癌来源外泌体与其他来源外泌体的检测结果有显著差异,表明SERS传感器对胃癌来源外泌体具有良好的特异性。
Claims (9)
1.一种SERS生物传感器,其特征在于,包括SERS传感芯片、第一试剂和第二试剂;所述SERS传感芯片为修饰有四面体NTH探针的银纳米棒阵列基片;所述第一试剂为SERS探针1及其缓冲液;所述第二试剂为SERS探针2及其缓冲液;
所述四面体NTH探针是由碱基序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7所示的DNA单链组装而成,SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:7所示的DNA单链分别记为DNA单链A、B、C、D、E、F和Capture CD63;
所述SERS探针1即SERS Tag1是通过金纳米颗粒AuNPs表面修饰双链结合物MP、发夹型核酸链H2和拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4MBA)制备得到;双链结合物MP是由核酸适配体链Apt MUC1与其锁核酸链P1的结合物,其中,Apt MUC1、P1、H2的碱基序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11所示;MP与H2的组装物质的量比范围为1:1~1:8;
所述SERS探针2即SERS Tag2是通过金纳米颗粒表面修饰发夹型核酸链H1和拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4MBA)制备得到,核酸链H1的碱基序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的一种SERS生物传感器,其特征在于:MP与H2的组装物质的量比为1:4。
3.根据权利要求1所述的一种SERS生物传感器,其特征在于:所述金纳米颗粒的粒径为15nm。
4.根据权利要求1所述的一种SERS生物传感器,其特征在于,所述SERS传感芯片由NTH探针与银纳米棒阵列基片共培养2.5小时制备得到。
5.根据权利要求4所述的一种SERS生物传感器,其特征在于,所述NTH探针是将A、B、C、D、E、F和Capture CD63混合后退火处理形成NTH探针,所述退火处理步骤包括:加热至95℃持续5分钟,冷却至4℃并保持30分钟。
6.根据权利要求4所述的一种SERS生物传感器,其特征在于,所述银纳米棒阵列基片采用真空电子束蒸发镀膜方法制备而成且所述银纳米棒阵列基片覆盖了一层开有小孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层,所述小孔的孔径为4mm,高度为1mm。
7.根据权利要求1所述的一种SERS生物传感器,其特征在于:所述第一试剂的制备步骤包括:
1)将适配体核酸链Apt MUC1与三羧乙基膦溶液(TCEP)按1:1000的物质的量的比例混合以去除二硫键,定容至25μM,25℃反应4小时;将反应后的25μM的Apt MUC1与25μM的锁核酸链P1混合后退火处理,形成Apt MUC1-P1杂交产物,命名为MP;
2)将发夹型核酸链H2与TCEP按1:1000的物质的量的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
3)将12.5μM的步骤1)反应得到的MP溶液与25μM的步骤2)反应得到的H2溶液与2.3nM的AuNPs溶液在5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时,其中,MP溶液、H2溶液、AuNPs溶液和5×TBE缓冲液的配置体积比为2:3:100:10;
4)向步骤3)得到的混合物中每0.5小时依次加入体积量为MP溶液加入量的0.5倍、1倍、1.5倍和2倍且浓度为2M的NaCl溶液,振荡反应5小时;
5)向步骤4)得到的混合物中添加体积量为MP溶液加入量的2.5倍的浓度为100μM的4-MBA、在25℃和40rpm的条件下振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心12000rpm,20分钟,离心洗涤三次;最后,在体积量为MP溶液加入量的5倍的0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERS Tag1,并在4℃下保存以备将来使用。
8.根据权利要求1所述的一种SERS生物传感器,其特征在于,所述第二试剂的制备步骤包括:
1)将发夹型核酸链H1与TCEP按1:1000的物质的量的比例混合后,定容至25μM,25℃反应4小时后进行退火处理;
2)将25μM的步骤1)反应得到的H1与2.3nM的AuNPs在5×TBE缓冲液中混合,25℃40rpm振荡孵育5小时,其中,H1溶液、AuNPs溶液和5×TBE缓冲液的配置体积比为4:100:10;
3)向步骤2)得到的混合物中每0.5小时依次加入体积量为H1溶液加入量的0.25倍、0.5倍、0.75倍和1倍且浓度为2M的NaCl溶液,振荡反应5小时;
4)向步骤3)得到的混合物中添加体积量为H1溶液加入量的1.25倍的100μM 4-MBA,25℃40rpm振荡反应3小时后,用0.5×PBS缓冲液离心12000rpm,20分钟,离心洗涤三次;最后,在体积量为H1溶液加入量的2.5倍的0.5×PBS缓冲液中获得重新分散的SERS Tag2,并在4℃下保存以备将来使用。
9.权利要求1~8中任意一项权利要求所述SERS生物传感器在制备胃癌细胞外泌体检测试剂盒中的应用,所述应用步骤包括:
1)在4℃的1×PBS缓冲液中加入胃癌细胞分泌的外泌体标准化样品溶液,备用,样品溶液中外泌体的浓度范围为7×103~7×107particles mL-1;
2)将第一试剂、第二试剂与不同浓度的外泌体标准化样品溶液混合后,与SERS传感芯片共培育,培育温度为37℃,培育时间为2.5小时;
3)将经过步骤2)中培育后的SERS传感芯片用超纯水清洗多次后进行SERS测试,得到不同浓度的外泌体的SERS光谱,以目标外泌体浓度的对数为横坐标,分别以4-MBA的特征峰的SERS强度为纵坐标,绘制SERS传感的工作曲线,并根据工作曲线确定传感器的SERS传感检测限。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410130731.1A CN117969833A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种sers生物传感器及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410130731.1A CN117969833A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种sers生物传感器及其制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117969833A true CN117969833A (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90852931
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410130731.1A Pending CN117969833A (zh) | 2024-01-31 | 2024-01-31 | 一种sers生物传感器及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117969833A (zh) |
-
2024
- 2024-01-31 CN CN202410130731.1A patent/CN117969833A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | A versatile label-free electrochemical biosensor for circulating tumor DNA based on dual enzyme assisted multiple amplification strategy | |
Shen et al. | A novel label-free and reusable electrochemical cytosensor for highly sensitive detection and specific collection of CTCs | |
CN110095608B (zh) | 基于磁性分离和dna自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器 | |
CN107893101A (zh) | 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用 | |
CN110468190B (zh) | 一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法 | |
US20090311798A1 (en) | Se(r)rs displacement assay | |
BRPI0712897A2 (pt) | método e sistema para detectar e/ou quantificar um analito em uma amostra | |
CN108374038B (zh) | 在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法 | |
CN114397343B (zh) | 肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
WO2007135591A1 (en) | Sample control for correction of sample matrix effects in analytical detection methods | |
CN112129736B (zh) | 粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光poct检测方法 | |
CN114106978A (zh) | 同时检测外泌体内部microRNA和表面蛋白的试剂盒和方法 | |
CN113136417A (zh) | 用于检测肺癌标志物的金纳米笼sers传感器及其制备方法 | |
KR101591475B1 (ko) | 레일리 산란을 이용한 순환 종양 DNA(ctDNA)의 종양 특이적 돌연변이와 후성유전학적 변이의 동시 검출방법 | |
CN109402225B (zh) | 一种检测外泌体中miRNA-1246的纳米金核酸探针及其制备方法和应用 | |
Dizaji et al. | Combining vancomycin-modified gold nanorod arrays and colloidal nanoparticles as a sandwich model for the discrimination of Gram-positive bacteria and their detection via surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) | |
CN113293197B (zh) | 一种检测疾病核酸标志物的spr-sers双模传感器、其制备方法及其应用 | |
Ghanbari et al. | A rapid and simple method for simultaneous determination of three breast cancer related microRNAs based on magnetic nanoparticles modified with S9. 6 antibody | |
ES2317081T3 (es) | Chip de analisis con gama patron, maletines y procedimientos de analisis. | |
CN114410786B (zh) | 用于检测肿瘤微小核酸标志物的表面增强拉曼散射检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
CN111812166A (zh) | 一种检测外泌体microRNA的电化学生物传感器及其制备方法 | |
CN117969833A (zh) | 一种sers生物传感器及其制备方法与应用 | |
CN114942223A (zh) | 循环肿瘤细胞的比率式检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
KR20180081445A (ko) | 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법 | |
Paisrisarn et al. | A Method to Analyze Urinary Extracellular Vesicles |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |