CN108374038B - 在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法 - Google Patents

在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法。特别是涉及在体外使用一搭载包裹具有碱基突出区段的分子信目标脂质复合体纳米粒的生物芯片侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法。其次，本发明所提供的方法对于单点变异的基因分子具有非常好的辨识专一性和信号灵敏度，可以广泛应用在检测判断早期病变的生物样本。

Description

在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核 酸的方法
技术领域
本发明涉及一种在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法，更具体涉及利用一种具有碱基突出区段的分子信标应用在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸，特别是侦测单点变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸。
背景技术
传统的生物分子芯片和连锁聚合酶反应法等分析技术通常缺乏辨识生物样本中仅具有微小结构变化差异的生物信息分子的特性，对于检测判断生物样本是否是早期病变的生物样本常产生假阴性的问题，而无法提供正确可信赖的检测结果。
其次，各种生物样本中的mRNA和microRNA虽然可以通过qRT-PCR、微阵列和RNA测序技术来实现定量测定。通过收集生物样本中所有细胞分泌的外泌体来定量其中的目标RNA，然而癌细胞样本分泌的外泌体只占所有外泌体的一小部分，所以其检测灵敏度不高。更无法有效地用来检测变异的基因，信息核醣核酸或是微核醣核酸等RNA分子，另外，这些方法需要繁琐的样品制备和检测步骤，价格昂贵
美国专利公开号US 20140094383公开了一种生物芯片，然而该生物芯片并没有解决能侦测分析变异的基因分子的问题，因而限制了其使用的领域。
基于前述的原因，涉及变异的基因分子的检测应用领域亟需新的检测方法和相关的芯片设计以克服解决先前技术所遭遇的困难和问题，因此，本发明的技术方案是为了突破先前技术的限制所做的新颖设计。
发明内容
基于以上的背景技术说明，本发明的第一目的在于提供一种在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸(mRNAs)或微核醣核酸(microRNAs)的方法。所述的方法特别是在体外使用具有碱基突出区段(overhang section)设计的分子信标(molecularbeacons)侦测生物样本中所含有的单点变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子，上述的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MBs)是新颖结构设计的人工合成的寡核酸(polynucleotide)，其对于生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸具有优异的辨识专一性和灵敏性，因此，本发明所述的方法能广泛应用在体外进行各种生物样本中所含有的变异的基因、信息核醣核酸(mRNAs)或微核醣核酸(microRNAs)的侦测。
上述第一目的是通过以下的技术方案来实现的。
于代表技术方案，所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法，其特征在于该方法包括下述步骤。
提供生物样本，该生物样本中含有细胞、肿瘤循环细胞(CTCs)和外泌体(EVs)；和使用装配具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MBs)的分析器在体外测量上述的生物样本和该具有碱基突出区段的分子信标进行交互作用所产生的荧光信号，借此侦测存在于上述生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸，其中上述的具有碱基突出区段的分子信标是人工合成的寡核酸(polynucleotide)，该寡核酸是由至少包含9个碱基对的骨干区(stem)、至少包含4个碱基的回路(loop)、至少包含5个互补碱基的碱基突出区段，该互补碱基是互补于上述的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸、荧光分子基团和荧光淬灭基团所构成，其中上述的碱基突出区段的最后一个互补碱基或上述骨干区的第一个碱基是对应于上述的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的单点变异的碱基。
优选地，上述的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MBs)还可以包裹在各种脂质复合体纳米粒(Lipoplex nanoparticles；LN)中，例如阳离子型脂质复合体纳米粒(CLN)。然后再将上述包裹有Oh-MBs的CLN和基材制备成生物芯片，并使用该生物芯片在体外侦测各种细胞样本或体液样本中所含有的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子。
具体地，上述的技术方案所提供的是具有独特结构设计的Oh-MBs，该Oh-MBs能够停止其和变异基因的杂化反应(hybridization)，且不需要再经过荧光信号增幅的处理程序就能辨识区别野生型(wild type)基因和变异基因的差异，借此达到辨识侦测生物样本中所含有的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子的目的。由于上述的Oh-MBs的结构特征，本技术方案对于生物样本中的单点变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子具有非常高的辨识专一性和灵敏度，特别适合应用在体外分析判断待测的生物样本是否为具有早期/癌前病变或前期癌症的生物样本。
本发明的第一目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术方案来实现的。
于一技术方案，所述的具有碱基突出区段的分子信标是选自下列群组之一及其组合：SEQ ID No 2，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 9，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12和SEQ ID No 13。
具体地，所述的SEQ ID No 2，SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ IDNo 7，SEQ ID No 9，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12和SEQ ID No 13如表1所示，序列中符号[a]，[c]，[g]，和[t]分别表示该碱基是A，C，G和T的锁核酸(locked nucleic acid：LNA)；6FAM是荧光分子基团，iCy3是内标记荧光分子基团，BHQ1和BHQ2是荧光焠灭基团。
表1
Figure BSA0000159331590000041
Figure BSA0000159331590000051
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6或其组合是用于侦测生物样本中变异的KRAS基因。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 7，SEQ ID No 9或其组合是用于侦测生物样本中变异的EGFR基因。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 11，SEQ ID No 12或其组合是用于侦测生物样本中EML4-ALK的基因融合。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 13是用于侦测生物样本中miR-411微核醣核酸编辑。
于一技术方案，所述的荧光分子基团包括位置在5’末端的FAM，Cy3和
Cy5，和位置接近上述的荧光淬灭基团的内标记荧光分子基团，该内标记荧光分子基团包含iFluorT，iCy3和iCy5。
于一技术方案，所述的具有碱基突出区段的分子信标是包裹在脂质复合体纳米粒的内层，该脂质复合体纳米粒包括阳离子表面修饰化的脂质复合体纳米粒和可借由抗体捕捉外泌体的脂质复合体纳米粒。
具体地，所述的脂质复合体纳米粒是由脂质所构成，所述的脂质包括，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷(DOTMA)，1，2-二油酰-3-三甲基-丙烷(DOTAP)，1，2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基丙烷(DODMA)，1，2-二油酰-3-二甲基-丙烷(DODAP)，1，2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE)，1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1-1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-Biotin)；和所述的聚合物包括聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸和聚乳酸-乙醇酸共聚物。
于一优选的技术方案，所述的脂质复合体纳米粒还可以固定在芯片上，上述的芯片所侦测到的目标分子的含量是借由内标准物进行比对计算，上述的内标准物是包裹有信息核醣核酸或微核醣核酸的通用标准囊泡。
于一技术方案，本方法所使用的分析器还含有下述组件：多数个微流体通道、包裹有Oh-MBs的脂质复合体纳米粒和一侦测器，该侦测器包括全内反射荧光显微镜、荧光显微镜、碱基标定仪和荧光测量仪。优选地，上述的侦测器是全内反射荧光显微镜(TIRF)。
于一技术方案，本发明的方法是用于在体外侦测恶性肿瘤样本中的变异信息核醣核酸，上述的恶性肿瘤样本中的变异信息核醣核酸包含胰腺恶性肿瘤样本的KRAS变异、非小细胞肺恶性肿瘤样本的EGFR变异和非小细胞肺恶性肿瘤样本的EML4-ALK的融合。
于一技术方案，本发明的方法所使用的生物样本包含血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、肠胃道组织分泌物样本、呼吸道分泌物样本和唾液样本。
本发明的第二目的在于提供一种用于侦测变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的生物芯片，所述的生物芯片搭载有多数个装配有碱基突出区段设计的分子信标(Oh-MBs)的脂质复合体纳米粒(LN)，上述的具有碱基突出区段的分子信标是新颖结构设计的人工合成的寡核酸(polynucleotide)，其对于生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸具有优异的辨识专一性和灵敏性，因此，本发明所述的生物芯片能广泛应用在体外进行各种生物样本中所含有的变异的基因、信息核醣核酸(mRNAs)或微核醣核酸(microRNAs)的侦测。
上述第二目的是通过以下的技术方案来实现的。
于一代表技术方案，所述的用于侦测变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的生物芯片其特征在于该生物芯片包含基板和脂质复合体纳米粒，所述的脂质复合体纳米粒固定在该基板上并且包裹具有碱基突出区段的分子信标，该具有碱基突出区段的分子信标是由至少包含9个碱基对的骨干区、至少包含4个碱基的回路、至少包含5个互补碱基的碱基突出区段，该互补碱基是互补于上述的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸、荧光分子基团和位于3’末端的荧光淬灭基团所构成，其中上述的碱基突出区段的最后一个互补碱基或上述的骨干区的第一个碱基是对应于上述的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的单点突变的碱基。
具体地，上述的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)是由具有12个碱基对的骨干区、具有6个碱基的回路、具有6个互补碱基的碱基突出区段，该互补碱基是互补于待测目标的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸、荧光分子基团和位于3’末端的荧光淬灭基团所构成，其中所述的荧光分子基团包括FAM和Cy3，所述的位于3’末端的荧光淬灭基团包括BHQ1和BHQ2。该Oh-MB的自由能是-10.31kcal/mol，所以包裹在脂质复合体奈米粒中的Oh-MB仍能维持非常安定的状态。更重要的是，上述具有6个互补碱基的碱基突出区段能够加快Oh-MB和待测目标(如变异基因)的杂化反应(反应速率106-107M-1s-1)，借此达到辨识区别正常基因和单点变异基因的差异。因此本技术方案所提供的搭载有装配Oh-MB的脂质复合体纳米粒的生物芯片可快速灵敏地侦测各种生物样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸。
本发明的第一目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术方案来实现的。
于一优选技术方案，搭载有装配具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)的脂质复合体纳米粒的生物芯片中的Oh-MB是选自下列群组之一或其组合：SEQ ID No 2，SEQ ID No4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6，SEQ ID No 7，SEQ ID No 9，SEQ ID No 11，SEQ ID No 12和SEQ ID No 13。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 4，SEQ ID No 5，SEQ ID No 6或其组合是用于侦测变异的KRAS基因。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 7，SEQ ID No 9或其组合是用于侦测变异的EGFR基因。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 11，SEQ ID No 12或其组合是用于侦测EML4-ALK的基因融合。
于一具体技术方案，所述的SEQ ID No 13是用于侦测miR-411微核醣核酸编辑。
于一技术方案，所述的用于侦测变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的生物芯片，其特征在于所述的荧光分子基团包括位置在5’末端的FAM，Cy3和Cy5，和位置接近上述的荧光淬灭分子的内标记荧光分子基团，该内标记荧光分子基团包含iFluorT，iCy3和iCy5。
于一技术方案，所述的用于侦测变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的生物芯片，其特征在于位置在3’末段的荧光淬灭分子包含BHQ-1和BHQ-2。
综上所述，本发明所提供的在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法和所使用的生物芯片具有以下的优点。第一、与传统的连锁聚合酶反应法(PCR)或是荧光免疫分析法相比，本发明所提供的在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法能借由新颖结构设计的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)辨识侦测生物样本中的单点变异的基因，信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子，同时具有高度的辨识专一性和侦测灵敏度。第二，与传统的生物芯片相比，本发明的生物芯片中所包裹的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)的脂质复合体纳米粒对于单点变异的基因具有辨识专一性，同时也具有良好的安定性，所以当本发明的生物芯片应用于于检测生物样本中的变异的基因，信息核醣核酸或微核醣核酸等基因分子，具有非常高的选择性和灵敏性。同时，本发明的生物芯片还可借由装配对应于各种不同变异的基因的Oh-MBs，用于检测各种疾病早期的细胞、病毒和细胞分泌的其它囊泡的样本中的变异的生物信息分子。
附图说明
图1A是本发明的脂质复合体纳米粒(CLN)和全内反射荧光分析技术(TIRF)的示意图；
图1B是本发明的含有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)、脂质复合体纳米粒(CLN)和外泌体(EV)中的目标RNA的示意图；
图1C是传统分子信标(Co-MB)和本发明的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)的结构示意图；
图1D是CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB在PBS中以37℃孵化不同时间的TIRF的影像图
图1E是CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB的荧光强度和时间的长方图；
图2A是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析浓度是0(PBS)，1.2％，2.5％，5％，10％，20％和40％的含有miR-21_oligo的通用标准囊泡(SVs)得到的TIRF影像图；
图2B是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析浓度含有miR-21_oligo的通用标准囊泡(SVs)所得到的SVs浓度、miR-21_oligo的含量和荧光强度的校正曲线图；
图2C是CLN-Oh-MB芯片和CLN-Co-MB芯片的miR-21 DNA侦测极限的长方图；
图2D是CLN-Oh-MB芯片和CLN-Co-MB芯片在不同SVs浓度下的荧光强度增幅比值的长方图；
图2E是新鲜制备的CLN-Oh-MB和CLN-Co-MB和经过冻干后的CLN-Oh-MB和CLN-Co-MB的标准化荧光比的长方图；
图2F是新鲜制备的CLN-Oh-MB和CLN-Co-MB和经过冻干后的CLN-Oh-MB和CLN-Co-MB的标准化荧光比的长方图；
图2G是通用标准囊泡(SVs)侦测信号强度和通用标准囊泡(SVs)中的GAPDH浓度的校正曲线图
图3A是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析细胞株A549得到的TIRF影像图；内插图是单一A549细胞的影像图；
图3B是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析细胞株HBEC得到的TIRF影像图；内插图是单一HBEC细胞的影像图；
图3C是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析A549细胞株(圆点)和HBEC细胞株(方点)得到的荧光强度关系图；
图3D是CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片的信号背景值比的长方图；
图3E是CLN-Oh-MB芯片相对于CLN-Co-MB芯片的荧光强度增幅比的长方图；
图3F是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析细胞株A549所分泌的外泌体(Exos)的TIRF影像图；
图3G是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片分析细胞株HBEC所分泌的外泌体(Exos)的TIRF影像图；
图3H是使用CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片侦测A549细胞株和HBEC细胞株所含有的外泌体的荧光强度图；
图3I是CLN-Co-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片的信号背景值比的长方图；
图3J是CLN-Oh-MB芯片相对于CLN-Co-MB芯片的外泌体的荧光强度增幅比的长方图；
图4A是使用CLN-Co-MB芯片分析包裹野生型(wild type)miR-21 oligo的SVs、包裹单点变异(1-mismatch)的miR-21 oligo的SVs、包裹双点变异(2-mismatch)的miR-21oligo的SVs和包裹三点变异(3-mismatch)的miR-21 oligo的SVs的TIRF影像图；
图4B是使用CLN-Co-MB芯片分析包裹野生型miR-21 oligo的SVs、包裹单点变异的miR-21 oligo的SVs、包裹双点变异的miR-21 oligo的SVs和包裹三点变异的miR-21 oligo的SVs的标准化的荧光强度的长方图；
图4C是Co-MB和miR-21的杂化示意图；
图4D是Oh-MB和miR-21的杂化示意图；
图4E是使用CLN-Oh-MB芯片分析包裹野生型(wild type)miR-21 oligo的SVs、包裹单点变异(1-mismatch)的miR-21 oligo的SVs、包裹双点变异(2-mismatch)的miR-21oligo的SVs和包裹三点变异(3-mismatch)的miR-21oligo的SVs的TIRF影像图；
图4F是使用CLN-Oh-MB芯片分析包裹野生型miR-21 oligo的SVs、包裹单点变异的miR-21 oligo的SVs、包裹双点变异的miR-21 oligo的SVs和包裹三点变异的miR-21 oligo的SVs的标准化的荧光强度的长方图；
图4G是使用CLN-Co-MBWT芯片分析细胞株HUT78，PaCa-2，AsPC-1和Panc03.27的外泌体的TIRF影像和对应的标准化的荧光强度的长方图；
图4H是使用CLN-Co-MBG12C芯片分析细胞株HUT78，PaCa-2，AsPC-1和Panc03.27的外泌体的TIRF影像和对应的标准化的荧光强度的长方图
图4I是使用CLN-Co-MBG12V芯片分析细胞株HUT78，PaCa-2，AsPC-1和Panc03.27的外泌体的TIRF影像和对应的标准化的荧光强度的长方图；
图4J是使用CLN-Co-MBG12D芯片分析细胞株HUT78，PaCa-2，AsPC-1和Panc03.27的外泌体的TIRF影像和对应的标准化的荧光强度的长方图；
图5A是本发明的Oh-MB和Ohi-MB的结构示意图；
图5B是使用CLN-Ohi-MB芯片和CLN-Oh-MB芯片侦测包裹EGFR T790M变异基因的SVs的TIRF影像图；
图5C是使用CLN-Ohi-MB芯片(方形)和CLN-Oh-MB芯片(圆形)侦测浓度是0，5％，10％，20％和40％的SVs的总荧光强度(total fluorescence intensity；TFI)图；
图6A是使用CLN-Ohi-MB EGFR T790M(WT)芯片和CLN-Oh-MB EGFR T790M(Mut)芯片侦测包裹有EGFR T790M变异基因的SVs(浓度10％)的TIRF影像图；
图6B是使用CLN-Ohi-MB EGFR T790M(WT)芯片和CLN-Oh-MB EGFR T790M(Mut)芯片在体外侦测包裹有EGFR T790M变异基因的通用标准囊泡(SVs；浓度分别是5％，10％，15％和20％)的总荧光强度(total fluorescence intensity；TFI)和通用标准囊泡浓度的关系图；
图6C是使用CLN-Ohi-MB芯片在体外侦测收集自小细胞肺癌生物样本的外泌体中的EGFR L858R和T790M变异基因的总荧光强度和RNA浓度的校正曲线图；
图6D是使用CLN-Ohi-MB芯片在体外侦测A549和H1975细胞株的外泌体中的EGFRL858R和T790M变异基因浓度的长方图；
图6E是使用CLN-Ohi-MB芯片侦测细胞株H1975和A549的外泌体中的EGFR L858R和T790M变异基因的TIRF影像图；
图6F是使用CLN-Ohi-MB芯片在体外侦测收集自小细胞肺癌生物样本的外泌体中的EGFR L858R和T790M变异基因的总荧光强度的长方图；
图6G是使用CLN-Ohi-MB芯片在体外侦测收集自小细胞肺癌生物样本的外泌体中的EGFR L858R和T790M变异基因的TIRF影像图；
图7A是使用CLN芯片分析正常细胞样本和多发性骨髓瘤(MM)细胞样本中外泌体的miR-29b和miR-16表现的总荧光强度的长方图；
图7B是分别使用ILN(CD38+EVs)抗体芯片和CLN芯片(Total EVs)分析正常血浆样本(N13和N17)多发性骨髓瘤(MM)的血浆(MM1～5)样本中的miR-29b和miR-16表现的信号强度倍数的长方图；
图7C分别使用ILN(CD20+EVs)抗体芯片、ILN(CD37+EVs)抗体芯片和CLN芯片(Total EVs)分析正常血浆样本(N13，14，17和20)慢性淋巴性白血病(CLL)的血浆样本中的miR-150表现的信号强度倍数的长方图；
图8A是通用标准囊泡(SV)的穿透式点子显微镜影像图；
图8B是包裹有miR-150的通用标准囊泡的正常生物样本和CLL生物样本的侦测信号强度和miR-150浓度的校正曲线图；
图8C是包裹有肝脏恶性肿瘤样本的通用标准囊泡的长方图；
图9A是使用CLN-Oh-MB芯片侦测正常生物样本(C1和C2)和取自非小细胞肺癌的生物样本(NYU-850和NYU-84)的miR 411编辑的总荧光强度的长方图；和
图9B是使用CLN-Oh-MB芯片侦测正常生物样本(C1和C2)和取自非小细胞肺癌的生物样本(NYU-850和NYU-84)的TIRF影像图。
具体实施方式
有关本发明的前述及其它技术内容、特点与功效，在以下配合参考图式的实验例的详细说明中，将可清楚的呈现。为了能彻底地了解本发明，将在下列的描述中提出详尽的步骤及其组成。显然地，本发明的施行并未限定于该领域的技艺者所熟习的特殊细节。另一方面，众所周知的组成或步骤并未描述于细节中，以避免造成本发明不必要的限制。
本说明书内容中所使用的一些术语的解释和范围如下所述。
本说明书中所述的『抗体』，其结构包括两个重链和两个轻链。所述的轻链和重链之间通常以双硫键连接。所述的抗体包括单株抗体、多重抗体和抗体的片断。所述的抗体又称免疫球蛋白(immunoglobulin，简称Ig)，其型态包括IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY，所述抗体的型态可再进行细分类，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。上述的抗体来源是取自人类或是哺乳动物的样本，该样本包括体液样本、细胞样本、组织切片和器官切片。
本说明书中所述的『寡核苷酸』或『寡核酸』是指核苷酸序列，该核苷酸序列包括但不限于5～200个核苷酸或核酸；所述的寡核苷酸包括但不限于脱氧核醣核酸DNA、核醣核酸RNA、信息核醣核酸mRNA、微核醣核酸miRNA和含有修饰化碱基(modified base)所构成的寡核苷酸等。所述的核苷酸或核酸结构所具有的碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)；所述的寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对相连结。
本说明书中所述的『锁核酸』(Locked Nucleic Acid；LNA)是指一种特殊的双环状核苷酸衍生物；其结构中含有2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核醣核酸单体，其结构中的2’-O位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃醣C3’-内型的N构型，降低了核醣结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性.由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力，因此LNA包括以下的优点：LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；抗3’脱氧核苷酸酶降解的稳定性；和LNA-DNA杂交物能激活RNase H。
所述的鎖核酸(Locked Nucleic Acid；LNA)的通用结构式如式(1)所示，其中碱基(Base)包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
式(1)
Figure BSA0000159331590000161
本说明书中所述的『荧光分子基团』(Fluorophore)是能发射荧光的物质。本发明使用该荧光分子基团共价结合在所述寡核酸序列上，利用它的荧光特性来实施本发明的技术方案，其中上述的荧光基团包括羧基荧光素(FAM)和荧光染料(Cyanide dyes)。
本说明书中的荧光淬灭基团(Quencher)是一个能导致荧光团荧光的强度降低的分子基团。本发明在所述寡核酸序列的3’末端上利用共价结合上述的荧光淬灭基团，同时在降低荧光强度的过程中没有荧光团被破坏。其中上述的荧光淬灭基团包括BHQ-1和BHQ-2。
范例一、搭载包裹分子信目标脂质复合体纳米粒的芯片和全内反射荧光分析技术
本范例是本发明技术方案的通用解说，根据图1A和1B，本发明所设计的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)使用一脂质复合体纳米粒进行包覆后，上述包裹有Oh-MB的脂质复合体纳米粒(CLN-Oh-MB)可以借由物理吸附、化学键结或是生物素和抗生物素蛋白的交互作用而锚定在芯片上，该芯片用来侦测分析生物样本中的特定生物信息分子，如变异的基因、微核醣核酸或信息核醣核酸。当上述的芯片所搭载的CLN-Oh-MB和生物样本中的外泌体接触时，外泌体和CLN-Oh-MB产生融合作用(fusion)，使得外泌体中的特定生物信息分子，如微核醣核酸或信息核醣核酸能够和CLN-Oh-MB混合并发生交互作用而产生荧光信号，然后再使用荧光分析技术进行分析。本发明特别是使用具有高灵敏性的全内反射荧光分析技术来侦测周围300纳米内的生物信息分子的荧光信号。
具体地，上述的Oh-MB是一新颖结构设计的寡核酸序列，如图1C所示，上述的Oh-MB比传统的分子信标(ΔG～-7.32kcal/mol)具有更低的自由能(ΔG～-10.31kcal/mol)，因此结构非常稳定不容易被破坏。该新颖结构设计的寡核酸序列通常是由具有12个碱基对的骨干区、具有6个碱基的回路、具有6个互补碱基的碱基突出区段，该互补碱基是互补于待测目标的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸、荧光分子基团和位于3’末端的荧光淬灭基团所构成，其中所述的荧光分子基团包括FAM和Cy3，所述的位于3’末端的荧光淬灭基团包括BHQ1和BHQ2。上述可借由图1D和1E证明。当CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB同时在PBS中以37℃孵化2～4个小时，并分析其荧光强度的变化，明显的，CLN-Co-MB在4小时的荧光强度是2小时的2倍，但是CLN-Oh-MB的荧光信号没有随着孵化时间的增加而增加，据此证明本发明的CLN-Oh-MB相较于传统的CLN-Co-MB具有非常好的稳定性，由于本发明的CLN-Oh-MB具有非常好的稳定性，因此可以降低侦测时的噪声产生，而提高信号背景比值，借此达到提升侦测灵敏度的目的。
范例2、搭载CLN-Co-MB的生物芯片和本发明搭载CLN-Oh-MB的生物芯片在侦测通用标准囊泡(SVs)上的比较
本范例的目的是利用通用标准囊泡(SVs)的技术建立各种不同生物芯片之间所测量的信号强度校正和标准规格化的方法，上述的SVs是一种模拟真实外泌体(EVs)的含有miR-21_oligo DNAs的阴离子型脂质复合体纳米粒，其粒径约在50～150nm，同时表面带有负电荷(约为-8.7mV)，详细的数据如表2。由于外泌体中的目标RNA分子有一小部分数量是复制其他的RNA分子，因此本范例所设计制备的SVs是仅含有1％的单股miR-21_oligo DNA，其他99％是作为争夺DNA(Scramble DNA)用途的miR-54_oligo DNA。
表2
Figure BSA0000159331590000181
All values indicate mean±S.D.for n＝3 independent experiments.
借由所设计的SVs测试包裹有分子探针的脂质复合体纳米粒(LN-MB)的生物芯片和样本中的目标RNA(miR-21_oligo)的杂化效率(hybridization efficacy)。使用的SVs的浓度是3×1010/mL，同时每个SV中含有约50-200股的miR-21寡核酸(miR-21_oligo)，搭载含有传统分子探针的脂质复合体纳米粒(CLN-Co-MB)的生物芯片和本发明搭载含有突出碱基区段分子探针的脂质复合体纳米粒(CLN-Oh-MB)的生物芯片在侦测通用标准囊泡(SVs)上的比较实验结果如图2所示。图2A是利用CLN-Co-MB的生物芯片和CLN-Oh-MB的生物芯片侦测SVs的全内反射荧光镜影像图，图2B是SVs中miR-21_oligo的荧光信号和SVs浓度的校正曲线，该校正曲线显示miR-21_oligo的荧光信号强度和SVs的浓度(实验的稀释浓度是1.2％～40％，30～1200×107SVs/mL)成比例关系。当SVs中含有100％的争夺DNA时，使用搭载CLN-Co-MB的生物芯片和CLN-Oh-MB的生物芯片所分别侦测到的荧光信号和空白对照组(PBS)相同，其信号强度几乎可以忽略，据此证明上述的分子探针Co-MB和Oh-MB对于miR-21具有选择专一性。同时搭载CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB的生物芯片所测量到的miR-21寡聚物的荧光强度和SVs的浓度呈现线性比例关系，当SVs的浓度增加时，所侦测到的miR-21寡聚物的荧光强度也随着增加，因此可以确认上述的CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB用于生物芯片荧光分析技术时是一精确可信赖的分析技术。
其次，利用外插法分别计算搭载CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB的生物芯片对于SVs中的miR-21_oligo的侦测浓度极限(LOD)，其结果如图2C和表2所示，搭载CLN-Co-MB的生物芯片对于SVs中的miR-21_oligo的侦测浓度极限是3fmol，而搭载CLN-Oh-MB的生物芯片对于SVs中的miR-21_o1igo的侦测浓度极限则是0.3fmol。
根据以上的实验数据，明确证实搭载CLN-Oh-MB的生物芯片相较于CLN-Co-MB的生物芯片，在不同的SVs的浓度下都能有效提升侦测的荧光强度，其中如图2D所示，当SVs的浓度是1.2％时，CLN-Oh-MB的生物芯片侦测的荧光强度是CLN-Co-MB的生物芯片的3倍，当SVs的浓度是40％时，CLN-Oh-MB的生物芯片侦测的荧光强度则是CLN-Co-MB的生物芯片的12倍。其原因包括Oh-MB对于目标RNA(i.e.miR-21_oligo)具有较佳的辨识度以及Oh-MB和目标RNA的杂化反应速率较快，而使得CLN-Oh-MB的生物芯片相较于CLN-Co-MB的生物芯片具有特别突出的侦测效果。
为了能广泛应用上述CLN-MB的技术在体外侦测目标基因的技术上，本发明使用冷冻干燥法制备CLN-MB。图2E和2F是比较冷冻干燥法前后所得到的CLN-Co-MB或CLN-Oh-MB的试验结果，其中当CLN-Co-MB在浓度40％的SVs，37℃的条件下孵化2小时之后，经过冷冻干燥法后得到的CLN-Co-MB相较于新鲜制备未经冷冻干燥法的CLN-Co-MB仅能维持60％的荧光信号强度。然而，本发明的CLN-Co-MB在相同的实验条件进行测试，经过冷冻干燥法得到的CLN-Co-MB相较于新鲜制备未经冷冻干燥法的CLN-Co-MB仍能维持83％以上的荧光信号强度，据此证明本发明的CLN-Co-MB具有良好的保存安定性，可以广泛应用在体外侦测目标基因。
范例3、搭载CLN-Co-MB的生物芯片和本发明搭载CLN-Oh-MB的生物芯片在侦测癌症细胞样本的比较
本范例所使用的是肺癌细胞株A549，该细胞株带有过度表现的miR-21微核醣核酸，用于比对的正常细胞株是HBEC(人类支气管上皮细胞human bronchial epitheliaicell)。本范例将上述的细胞株分别加在搭载CLN-Co-MB的生物芯片和本发明搭载CLN-Oh-MB的生物芯片上，上述的生物芯片中所含有的分子探针会侦测到细胞株内的目标RNA(miR-21)。具体实验结果如图3A和3B所示，本发明搭载CLN-Oh-MB的生物芯片的荧光信号明显比较强，因此相较于搭载CLN-Co-MB的生物芯片对于癌症细胞株具有更好的辨识度。更进一步对荧光影像进行定量分析，CLN-Oh-MB的生物芯片所侦测到的A549的荧光强度明显高于CLN-Co-MB的生物芯片所侦测到的A549的荧光强度，且CLN-Oh-MB的生物芯片具有优异的信号背景比(S/B ratio)，相较于CLN-Co-MB的生物芯片，CLN-Oh-MB的生物芯片能够提升4倍的荧光强度，因此搭载CLN-Oh-MB的生物芯片对于癌症细胞样本具有优异的侦测灵敏度，上述结果如图3C、3D和3E所示。
范例4、搭载CLN-Co-MB的生物芯片和本发明的CLN-Oh-MB的生物芯片在侦测癌症生物样本外泌体的比较
本范例使用A549或HBEC细胞株，并且利用搭载可侦测miR-21的分子信目标脂质复合体纳米粒CLN-Co-MBs或CLN-Oh-MBs的生物芯片对A549或HBEC细胞株所分泌的外泌体(EVs)进行分析，外泌体在细胞培养皿中的浓度约为107/mL(2×105EVs in 20μL)。实验结果如图3F和3G所示，A549的外泌体的荧光强度明显高于HBEC的外泌体的荧光强度。以荧光信号定量分析miR-21在A549的外泌体的表现也大幅高于miR-21在HBEC的外泌体的表现，结果如图3H所示。根据图3I，该图显示使用搭载CLN-Co-MB和CLN-Oh-MB的生物芯片分别侦测A549的外泌体的miR-21表现的荧光强度时，其荧光强度相较于HBEC外泌体的miR-21表现的荧光强度分别达到5和14倍。如图3J所示，利用统计分析方法对荧光影像数据进行分析，可得到CLN-Oh-MB分析的A549外泌体的荧光强度是CLN-Co-MB的4.5倍，因此本发明的Oh-MB相较于传统的分子信标(Co-MB)可以有效地大幅提高待测基因分子的含量侦测灵敏度，也就是可以侦测到传统分子信标无法侦测到的待测基因分子的浓度。
范例5、搭载CLN-Co-MB的生物芯片和本发明的CLN-Oh-MB的生物芯片在侦测单点突变基因的比较
本范例是利用包裹有miR-21_oligo野生型(wide-type)、单点突变(1-basemismatch)，双点突变(2-base mismatch)和三点突变(3-base mismatch)的miR-21的通用标准囊泡作为研究模型，借此证明本发明的搭载CLN-Oh-MB的生物芯片在侦测单点突变的效果上明显优于搭载CLN-Co-MB的生物芯片。所述搭载CLN-Co-MB的生物芯片所侦测的TIRF影像图如图4A所示，经由统计分析的结果，miR-21_oligo野生型(wide-type)有最强的荧光信号，但是单点突变(1-base mismatch)，双点突变(2-base mismatch)和三点突变(3-basemismatch)的miR-21的荧光信号相较之下分别只有野生型的75％、37％和15％，其结果如图4B所示。
利用DNA/RNA股和复合体的自由能(ΔG)，可以计算反应平衡常数和杂化的机率。图4C表示突变点和传统分子信标杂化和理论计算得到的自由能，据此得知搭载CLN-Co-MB的生物芯片无法侦测小于3个突变点的基因目标。所设计的miR-21_oligo的突变点位置如图4D所示，位置以灰色标记。所使用的miR-21单点突变股(strand)首先借由TCAACA和Oh-MB接合，然后形成复合体(complex)。其中很重要的是杂化(hybridization)时的分支位移(branch migration)并不是直接程序(directed process)而是随机位移(random walk)。因此，上述的复合体的第6个碱基(A)和的5个碱基(C)杂化时的分支位移的机率是一样的。当杂化时的分支位移发生在突变点的碱基上时，该复合体的解离速率(dissociation rate(kr))远大于继续进行的杂化速率(hybridization rate(kf))，此种情况特别是发生在新形成的碱基对的数目大于原有的骨干区的碱基对的数目。如图4E所示，利用搭载CLN-Oh-MB的芯片侦测分析包裹有miR-21_oligo野生型、单点突变(1-base mismatch)，双点突变(2-base mismatch)和三点突变(3-base mismatch)的miR-21的通用标准囊泡(SVs)，其中miR-21_oligo野生型的荧光影像的亮点明显少于含有miR21突变点的SVs。如图4F所示，该图是荧光强度的分析，本发明的搭载CLN-Oh-MB的芯片可以在SVs中侦测到含量相较于野生型仅有3％的miR-21的单点突变，据此证明本发明的搭载CLN-Oh-MB的芯片可以精确且快速的区别野生型和单点突变的基因，信息核醣核酸或是微核醣核酸。主因是本发明的Oh-MB的结构设计可以在侦测到带有突变点的基因分子时，因为所形成的复合体的解离速率(dissociation rate(kr))大于杂化速率(hybridization rate(kf))，因此能够终止Oh-MB和带有突变点的基因分子的杂化反应，使得本发明的Oh-MB对于单点突变的基因分子具有优异的侦测专一性和灵敏性。
根据以上的设计和验证，本发明再设计可以侦测KRAS突变基因(G12C，G12D，G12V)的Oh-MB，其序列如表3中Oh-MBWT、Oh-MBG12C、Oh-MBG12D和Oh-MBG12V所示。分别使用细胞株HUT78，PaCa-2，AsPC-1和PANC03.27作为对应于野生型(WT)和突变基因KRAS-G12C，KRAS-G12D和KRAS-G12V的实验模型，利用装配有上述序列的Oh-MBWT、Oh-MBG12C、Oh-MBG12D和Oh-MBG12V碱基突出区段的分子信目标脂质复合体纳米粒(CLN-Oh-MB)的生物芯片对上述细胞株所分泌的外泌体分别进行分析侦测，实验结果如图4G所示，当使用搭载CLN-Oh-MBWT的芯片进行侦测时，相比于KRASWT的荧光信号强度，KRASG12C、KRASG12D和KRASG12V的荧光信号强度分别降到2％，7％和15％。当使用搭载CLN-Oh-MBG12C的芯片进行侦测时，KRASWT、KRASG12D和KRASG12V的荧光信号则分别仅有KRASG12C荧光信号的12％，11％和9％，其结果如图4H所示。而KRASG12D和KRASG22V的实验结果分别如图4I和4J所示。上述的结果都具体证实本发明搭载的CLN-Oh-MB的芯片设计是能够直接侦测到生物样本中的单点突变的基因分子，并且具有专一性和灵敏性。
表3
Figure BSA0000159331590000231
范例6、搭载CLN-Ohi-MB的芯片应用在改善单点突变基因的侦测
为了提升具有碱基突出区段的分子信标对于单点突变基因的侦测灵敏性，本范例设计具有内标记荧光分子基团的碱基突出区段的分子信标(Ohi-MB)，由于该内标记荧光分子基团的碱基位置是靠近3’末端的荧光淬灭基团，因此可以降低原先标记在5’末段的荧光分子基团的背景噪声，借此提高侦测的灵敏度，所述的内标记荧光分子基团包括iCy3和iCy5，所述的3’末端的荧光淬灭基团包括BHQ1和BHQ2。具有内标记荧光分子基团的碱基突出区段的分子信标(Ohi-MB)的示意图如图5A所示。同时在上述的Ohi-MB中导入锁核酸(Locked nucleic acid/LNA)以增加其安定性，详细的具有内标记荧光分子基团的碱基突出区段的分子信标(Ohi-MB)的序列如表1所示。
如图5B所示，Ohi-MB的荧光影像明显比Oh-MB的荧光影像清晰，进一步使用通用标准囊泡(SVs)进行测试和定量分析，搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片的SVs的荧光强度明显高于搭载CLN-Oh-MB生物芯片的荧光强度，同时搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片具有较高的信号噪声比(signal-to-noise(S/N)ratio)，如图5所示，搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片相较于搭载CLN-Oh-MB的生物芯片可以提高3倍左右的荧光强度。
范例7、搭载CLN-Ohi-MB的芯片应用在体外侦测EGFE单点突变基因和EML4-ALK融合
本范例使用具有内标记荧光分子基团iCy3的碱基突出区段的分子信标(Ohi-MB)来进行生物样本中EFGR L858R和EGFR T790M的突变基因的侦测。首先使用搭载CLN-Ohi-MBEGFR T790M(WT)和CLN-Ohi-MB EGFR T790M(Mut)的生物芯片分别侦测含有T790M寡聚物(oligos)的通用标准囊泡(SVs)，其浓度是5％，10％，15％and 20％，并使用全内反射荧光显微镜(TIRF)进行影像分析，并建立校正曲线，结果如图6A和6B所示，其荧光信号强度有明显增加。为了进行更深入的侦测效果确认，我们再使用上述的生物芯片侦测肺部恶性肿瘤细胞株H1975分泌的外泌体中的EGFR的L858R和T790M突变基因和A549未突变基因的含量，并使用通用标准囊泡的技术建立相关校正曲线和含量分析，其结果如图6C和6D所示。其中，本范例所设计的搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片对于上述的EGFR变异基因的侦测极限(LOD)可以小于1pg/L。其用于侦测外泌体中EGFR L858R和T790M的突变基因的全内反射荧光显微镜(TIRF)影像图如图6E所示。图6F和图6G则是利用本范例的生物芯片侦测小细胞肺癌血液样本中的外泌体中的EGFR L858R和T790M的突变基因所得到的全内反射荧光显微镜(TIRF)影像图和含量直方图。根据以上的实验结果，本范例搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片具有优异的单点突变基因的辨识度和专一性，同时表示上述的分子信标(Ohi-MB)和所述的单点突变基因进行杂化时，具有很高的荧光信号/噪声比(S/N ratio)。
本范例所设计的搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片还可以应用在分别侦测肺癌细胞株H1322和H2228的外泌体中的EML4-ALK的融合(fusion)，所包裹的分子信目标序列如表1所述的SEQ ID No 11和12，其中H1322是EML4-ALK fusion variant 3a，H2228则是variantv1和Calu-1但没有EML4-ALK fusion。
范例8、搭载CLN-Ohi-MB的芯片应用在多发性骨髓瘤(MM)和慢性淋巴性白血病(CLL)的生物样本的分析
本范例首先使用抗体修饰化的脂质复合体纳米粒(ILN)芯片捕捉所述生物样本中特定的外泌体，经分离程序后，再使用搭载CLN-Ohi-MB的生物芯片进一步分析所捕捉的外泌体中的特定生物分子，如mRNAs或microRNAs。具体的结果如图7A和7B所示，其中上述的抗体修饰化的脂质复合体纳米粒可以特异性地捕捉多发性骨髓瘤(MM)样本中带有CD38positive的外泌体，然后利用ILN生物芯片和CLN生物芯片分析得到上述外泌体中含有过度表现的微核醣核酸(up-regulated(miR-29b))和衰退表现的微核醣核酸(down-regulated(miR-16))目标。上述目标确认后，分别收集MM细胞样本(CD38brightCD138+)和正常B细胞样本(CD38dimCD138-CD19+)，进行细胞培养后，利用本发明的搭载CLN-Ohi-MB芯片进行微核醣核酸的含量分析实验，其实验结果如图7A所示，MM细胞样本的miR-29b的表现明显比正常B细胞样本高。如图7B所示，其miR-29b的量相较于正常的样本大于5倍(＞5fold)，同时miR-16的表现几乎是正常的样本(CD38dimCD138-CD19+)的50％.。据此证明本范例所使用的搭载CLN-Ohi-MB的芯片对于MM生物样本所含外泌体中的miR-29b和miR16具有侦测的专一性。
本范例所述的搭载CLN-Ohi-MB的芯片进一步应用于侦测慢性淋巴性白血病的生物样本或是血液样本中特定的生物目标，其结果如图7C所示，所使用的芯片是抗体修饰化的生物芯片，所使用的抗体是可以区别CLL血浆样本和正常血浆样本的CD20或CD37 mAb。根据实验结果，使用本范例搭载CLN-Ohi-MB的芯片侦测CLL血浆样本中所含有的miR-150的含量表现比正常血浆样本的miR-150的含量表现高出许多。同时，本范例的抗体修饰化生物芯片的技术还可以进一步应用到有微流体装置设计的生物芯片或是微数组上，并能借由改变抗体的种类来捕捉各种不同的外泌体，其抗体可以包含anti-tetraspanin抗体，anti-CD63，anti-CD9，anti-CD81，transferrin，folate，anti-EGFR，和anti-integrand等。
范例9、通用标准囊泡的设计和其应用在作为生物芯片侦测到的待测生物分子的含量校正和分析
本范例是使用包裹有通用标准囊泡(SVs)的脂质复合体纳米粒作为比对标准物，以设计适用于各种生物芯片、分析器和外泌体侦测技术的分析物的含量定量分析。上述的包裹有通用标准囊泡的脂质复合体纳米粒是使用阴离子性的脂质混合物制备，其组成如下：1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(DOPE)(49％)，linoleic acid(LA)(49％)和1，2-Dimyristoyl-sn-glycerol methoxypolyethylene glycol(DMG-PEG)(2％)，上述的SV可以携带大量的生物信息分子，其具体结构如图8A所示。该包裹有通用标准囊泡(SVs)的脂质复合体纳米粒在冻干后可以长期保存，同时因为其具有高稳定性使的其非常适合做为内标准物(Internal standard)，可以广泛地应用在各式生物信息分子的定量分析，如mRNAs和microRNAs。
具体的，本实验先制备包裹有浓度分别是1％，2％和4％的miR-21和争夺DNA(Scramble DNA；oligo-DNA(ODN))的SVs。上述的SVs再进一步使用包裹有100％ODN的SVs调配到1％，2％，5％，10％，20％的40％浓度，借由上述的方法，再利用荧光分析所得到的总荧光强度(total fluorescence intensity(TFI)，同时和经由qRT-PCR定量后得到已知浓度的目标物，如oligo RNA，进行比对即可建立本范例所述的含量分析所需要使用的校正曲线(calibration curve)。
于一具体范例，使用的通用标准囊泡(SVs)包裹有1％的miR-150 oligo，其含量范围是1 to 40ng/mL，使用生物芯片和全反应荧光显微镜的技术和qRT-PCR对正常的血液样本和取自慢性淋巴性白血病患者的生物样本进行分析比较，其结果如图8B所示，其具有非常好的线性关系(linear relationship)。其次，如图8C所示，上述经过冻干程序后得到的包裹SVs的脂质复合体纳米粒具有非常好的质量稳定性，可以长时间保存，同时，本设计的SVs可以包裹不同的RNA寡聚物(oligo)或片段，因此上述的SVs的设计可以应用在数以百计的RNA侦测目标的含量分析，特别是以生物芯片作为侦测方法的含量分析。
范例10、侦测微核醣核酸单点基因编辑的搭载CLN-Oh-MB的芯片设计
本范例是设计可以侦测miR-411微核醣核酸的单点基因编辑的具有碱基突出区段的分子信标(Oh-MB)，并且包裹上述的具有碱基突出区段的分子信标在阳离子表面修式化的脂质复合体纳米粒(CLN-Oh-MB)中，然后再制成所述的CLN-Oh-MB芯片，并在体外侦测miR-411微核醣核酸的单点基因编辑。具体的，本范例所述具有碱基突出区段的分子信目标寡核苷酸序列如表1中的序列号13(SEQ ID No 13)所示，其中以[n]标记的表示是对应于碱基n的锁核酸，如[c]就是表示是c的锁核酸。利用本范例的CLN-Oh-MB芯片进行实验，其结果如图9A和9B所示，其中取自非小细胞肺癌样本(NYU-850 and NYU-984)的荧光信号的总强度和荧光影像图明显比良性没有miR-411微核醣核酸的单点基因编辑的样本(C1和C2)的信号强，据此证明本范例设计的具有碱基突出区段的分子信目标寡核苷酸序列SEQ ID No13对于miR-411微核醣核酸的单点基因编辑的侦测具有辨识专一性，可以用于在体外侦测生物样本中miR-411微核醣核酸的单点基因编辑或miR-411微核醣核酸的单点变异。
以上所述，仅是本发明的范例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例和范例揭露如上，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
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Claims (15)

1.一种在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括下述步骤:
提供生物样本；和
在体外使用装配具有碱基突出区段的分子信标的分析器测量上述的生物样本和该具有碱基突出区段的分子信标进行交互作用所产生的荧光信号，借此侦测上述生物样本中存在的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸，其中上述的具有碱基突出区段的分子信标是由至少包含9个碱基对的骨干区、至少包含4个碱基的回路、至少包含5个与上述的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸互补的碱基的碱基突出区段、荧光分子基团和荧光淬灭基团所构成，其中上述的碱基突出区段的最后一个互补碱基或上述骨干区的第一个碱基是对应于上述的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的单点突变的碱基。
2.如权利要求1所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的荧光分子基团包括位置在5’末端的FAM,Cy3和Cy5。
3.如权利要求1所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的荧光分子基团为位置接近上述的荧光淬灭基团的内标记荧光分子基团，其中该内标记荧光分子基团包含iFluorT,iCy3和iCy5。
4.如权利要求1所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的具有碱基突出区段的分子信标是包裹在脂质复合体纳米粒的内层，该脂质复合体纳米粒包括阳离子表面修饰化的脂质复合体纳米粒和可借由抗体捕捉外泌体的脂质复合体纳米粒。
5.如权利要求4所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的脂质复合体纳米粒是固定在芯片上，上述的芯片所侦测到的目标分子的含量是借由内标准物进行比对计算，上述的内标准物是包裹有信息核糖核酸或微核糖核酸的通用标准囊泡。
6.如权利要求1所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的分析器还含有下述组件：多个微流体通道、包裹有如权利要求1所述的具有碱基突出区段的分子信标脂质复合体纳米粒和侦测器，该侦测器包括全内反射荧光显微镜、荧光显微镜、碱基标定仪和荧光测量仪。
7.如权利要求1所述的在体外侦测生物样本中的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的方法，其特征在于所述的生物样本包含血液样本、血清样本、血浆样本、尿液样本、胃肠道组织分泌物样本、呼吸道分泌物样本和唾液样本。
8.一种用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于该生物芯片包含基板和脂质复合体纳米粒，所述的脂质复合体纳米粒固定在该基板上并且包裹具有碱基突出区段的分子信标，该具有碱基突出区段的分子信标是由至少包含9个碱基对的骨干区、至少包含4个碱基的回路、至少包含5个与上述的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸互补的碱基的碱基突出区段、荧光分子基团和位于3’末端的荧光淬灭基团所构成，其中上述的碱基突出区段的最后一个互补碱基或上述的骨干区的第一个碱基是对应于上述的变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的单点突变的碱基，并且其中所述的具有碱基突出区段的分子信标是选自下列群组之一或其组合：SEQ ID No 2,SEQ ID No 4,SEQID No 5,SEQ ID No 6,SEQ ID No 7,SEQ ID No 9,SEQ ID No11,SEQ ID No 12和SEQ IDNo 13。
9.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的SEQ ID No 4,SEQ ID No 5,SEQ ID No 6或其组合是用于侦测变异的KRAS基因。
10.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的SEQ ID No 7,SEQ ID No 9或其组合是用于侦测变异的EGFR基因。
11.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的SEQ ID No 11,SEQ ID No 12或其组合是用于侦测EML4-ALK的基因融合。
12.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的SEQ ID No 13是用于侦测miR-411微核糖核酸编辑。
13.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的荧光分子基团包括位置在5’末端的FAM,Cy3和Cy5。
14.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于所述的荧光分子基团为位置接近上述的荧光淬灭基团的内标记荧光分子基团，其中该内标记荧光分子基团包含iFluorT,iCy3和iCy5。
15.如权利要求8所述的用于侦测变异的基因、信息核糖核酸或微核糖核酸的生物芯片，其特征在于位置在3’末端的荧光淬灭基团包含BHQ-1和BHQ-2。
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