CN117965700A - 一种单核苷酸变异的即时检测方法 - Google Patents
一种单核苷酸变异的即时检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117965700A CN117965700A CN202410127326.4A CN202410127326A CN117965700A CN 117965700 A CN117965700 A CN 117965700A CN 202410127326 A CN202410127326 A CN 202410127326A CN 117965700 A CN117965700 A CN 117965700A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strand
- primer
- strand displacement
- single nucleotide
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 122
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 102
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 102
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims abstract description 166
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 96
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 76
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims abstract description 30
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 16
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 133
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 31
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 21
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005954 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 5
- 208000025499 G6PD deficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 claims description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018444 Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 208000008605 glucosephosphate dehydrogenase deficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 claims description 2
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 claims description 2
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- 102100035172 Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200055464 rs113488022 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种单核苷酸变异的即时检测方法，涉及生物检测技术领域。制备5’端荧光素标记的链置换引物和5’端生物素标记的反向扩增引物；向重组酶聚合酶扩增体系中加入链置换引物、靶单核苷酸变异DNA、反向扩增引物，反应得到5’端分别标记荧光素和生物素的扩增产物，配制重组酶聚合酶扩增体系，将引物与重组酶聚合酶扩增体系混合，使得链置换引物识别单核苷酸变异后选择性诱发链置换反应，链置换反应后的引物链转而激发对靶DNA的重组酶聚合酶扩增，得反应液；测定反应液的侧流试纸层析结果。将SDR与LF‑RPA相结合，通过单碱基差异对链置换反应效率的影响，实现对单核苷酸变异的有效甄别，提高检测方法的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种单核苷酸变异的即时检测方法。
背景技术
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近年来迅速发展的等温扩增技术，它能够利用重组酶协助特异性引物识别靶序列，并在室温条件下打开目标区域的双链结构，将引物结合靶序列诱发扩增反应，目前广泛用于基因编辑技术与新冠病毒等病原体快速检测。
当前以RPA技术为基础的SNV检测方法主要通过为引物增加错配碱基、设计封闭探针、利用特殊的限制性内切酶和与CRISPR技术结合的方式来实现。
为引物增加错配碱基的方法(B.Y.C.Ng,E.J.H.Wee,et al.,Isothermal PointMutation Detection:Toward a First-Pass Screening Strategy for Multidrug-Resistant Tuberculosis,Anal.Chem.89(2017)9017-9022)是通过在扩增引物的突变识别位点相邻碱基的位置额外设计一个错配碱基，为突变碱基的识别增加特异性，用于弥补突变识别碱基单个碱基特异性不足的缺陷。
设计封闭探针(L.Zhang,et al.,Highly Sensitive Detection of Low-Abundance BRAF V600E Mutation in Fine-Needle Aspiration Samples by ZipRecombinase Polymerase Amplification,Anal.Chem.93(2021)5621-5628)是通过设计一条与普通引物相比，与靶链亲和力强的封闭引物(如拉链核酸(Zip Nucleic Acid))对突变位点进行封闭，当突变碱基存在时，形成的错配碱基带来更大的链结合不稳定性，有利于链置换活性的聚合酶将封闭探针置换下来进行靶突变DNA的扩增；而突变碱基不存在时封闭引物与靶链结合稳定，聚合酶的聚合作用被阻断，由此实现对突变DNA的特异扩增。
利用特殊的限制性内切酶(Y.Ma,et al.,FEN1-aided recombinase polymeraseamplification(FARPA)for one-pot and multiplex detection of nucleic acids withan ultra-high specificity and sensitivity,Biosens.Bioelectron.237(2023)115456)则是利用FEN1酶的特殊酶切活性，以单碱基变异位点作为酶切识别位点，根据RPA产物的基因型选择性剪切引物链产生信号，实现对单核苷酸变异的甄别。
RPA与CRISPR技术结合(H.Liu,et al.,A rapid and high-throughputHelicobacter pylori RPA-CRISPR/Cas12a-based nucleic acid detection system,Clin.Chim.Acta.540(2023)117201)，即通过Cas12a蛋白特异识别包含突变碱基的PAM序列，对体系内的荧光探针进行剪切产生信号，而未突变的靶DNA上不具备相应的PAM序列，无法诱发后续的剪切反应产生信号，由此实现突变的甄别。
上述四种基于RPA技术的SNV检测策略各有缺点。首先，增加错配碱基的引物只能在一定程度上减少背景信号，而不能完全消除，这会限制RPA的灵敏度并导致假阳性结果。其次，尽管封闭探针可以通过选择性地封闭突变位点来提高RPA的特异性并消除背景信号，但封闭的作用会不可避免地削弱扩增效率，使方法的实验时间难以缩短。此外，尽管使用特殊限制性内切酶和CRISPR技术对SNV位点进行靶向切割具备良好的SNV分析性能，但它们通常需要两步实验反应，增加实验程序的复杂性和气溶胶污染的风险。因此，上述四种方法不足以满足具有超灵敏、高特异和快速检测速度的一步SNV检测的临床需求。
当前临床所采用的单核苷酸变异(SNV)检测方法，在实验周期和实验条件上都存在不足。首先是实验周期过长，当前的临床方法如实时荧光PCR和高通量测序，很难在一小时内实现对单核苷酸变异的高灵敏检测；其次是苛刻实验条件，在成本方面，仪器和实验室构建的成本过于昂贵使单核苷酸变异的检测无法普及至社区医院和乡镇卫生院；在人员方面，复杂实验操作使得相关变异的检测都需要专门的人员培训。
当前已开发的用于科研或者临床的单核苷酸变异快速检测方法，在灵敏度和特异性上都存在相应的局限性，无法达到灵敏、特异且快速的对突变进行甄别和检测。
外显子17突变(CD 17mutation)是β-地中海贫血最常见的单核苷酸变异之一，是目前临床上检测β-地中海贫血常用的重要指标，可用于β-地中海贫血的诊断。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近年来迅速发展的等温扩增技术，它能够利用重组酶协助特异性引物识别靶序列，并在室温条件下打开目标区域的双链结构，将引物结合靶序列诱发扩增反应，目前广泛用于基因编辑技术与新冠病毒等病原体快速检测，能够在短时间内完成检测，极具即时诊断应用价值。
链置换反应(strand displacement reaction，SDR)是一种特殊的DNA反应，在DNA分子纳米技术领域应用广泛。链置换反应可以通过单个碱基的差异来区分较小的热力学变化，因此在单碱基变异的甄别上具有极高的应用价值和潜力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的实验周期长、成本较高、实验条件有限等问题，提供一种单核苷酸变异的即时检测方法，能够以一步反应的方式，快速、灵敏且特异地一种单核苷酸变异的即时检测方法。
本发明包括如下步骤：
1)制备5’端荧光素标记的链置换引物和5’端生物素标记的反向扩增引物；
2)向重组酶聚合酶扩增体系中加入链置换引物、靶单核苷酸变异DNA、反向扩增引物，反应得到5’端分别标记荧光素和生物素的扩增产物，配制含有步骤1)所得引物的重组酶聚合酶扩增体系，将所述引物与重组酶聚合酶扩增体系混合，使得链置换引物识别单核苷酸变异后选择性诱发链置换反应，链置换反应后的引物链转而激发对靶DNA的重组酶聚合酶扩增，得反应液；
3)测定步骤2)所得反应液的侧流试纸层析结果。
在步骤1)中，所述链置换引物包含链置换引物结构链1和链置换引物结构链2，链置换引物结构链1为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；链置换引物结构链2为3’端磷酸化且DNA链中间修饰C3 Spacer基团的DNA探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
在步骤1)中，为了更好地提高链置换引物的产出效率，利用过量的链置换引物结构链2与链置换引物结构链1结合，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合进行杂交反应，将两条链置换引物的结构链经95℃变性3min后于12℃杂交反应5min，得到链置换引物，所述链置换引物结构链1为5’标记荧光素的DNA探针，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述链置换引物结构链2为3’磷酸化的DNA探针，其序列如SEQ ID NO.2所示；根据检测方法的需要，可以设计不同的链置换引物结构链1(如SEQ ID NO4，6，8)和链置换引物结构链2(如SEQ ID NO5，7，9)，进而得到不同的链置换引物。
在步骤1)中，过量的链置换引物结构链2使链置换引物结构链1能够充分杂交形成链置换引物，可通过调整链置换引物结构链1和链置换引物结构链2的终浓度比例，使链置换引物结构链1得到充分杂交。
参与杂交反应的链置换引物结构链1在体系中的终浓度为100nM；参与杂交反应的链置换引物结构链2在体系中的终浓度为300nM。
在步骤1)中，所述反向扩增引物为为5’端生物素标记的DNA链，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
在步骤2)中，所述配制含有步骤1)所得引物的重组酶聚合酶扩增体系的具体步骤包括：
(1)配置RPA反应体系包括加入RPA缓冲液溶解干粉试剂并混匀；
(2)将配置好的链置换引物加入RPA反应体系，使链置换引物结构链1的终浓度为100nM，链置换引物结构链2的终浓度为300nM；
(3)将反向扩增引物加入RPA反应体系，使反向扩增引物的终浓度为100nM；
(4)加入1μL的靶单核苷酸变异DNA和2μL浓度为14nM的硫酸镁溶液，并用超纯水将体系体积补足至50μL；
(5)将配置好的反应体系置于37℃孵育30min。
在步骤2)中，所述靶单核苷酸变异DNA选自单基因遗传病；
所述靶单核苷酸变异DNA选自β-地中海贫血、遗传性耳聋、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变和葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)。
在步骤3)中，所述测定步骤2)所得反应液的侧流试纸层析结果，具体步骤可为：从反应后的扩增产物中吸取5μL至195μL超纯水中，将扩增产物稀释40倍，通过调整扩增产物的稀释倍数，达到理想的侧流试纸分析效果。
在步骤3)中，将侧流试纸的样本区浸入200μL稀释后的产物溶液30s。
在步骤3)中，通过肉眼观察条带显色情况判读试纸条层析结果。
本发明成功构建可用于检测实际样本中单核苷酸变异的等温扩增侧流分析法，应用本发明对单基因遗传病进行检测，具有灵敏度高、特异性好、检测速度快、结果判读等特点。
本发明的一种单核苷酸变异即时检测方法，具有以下有益效果：
本发明通过将链置换反应(SDR)与基于侧流的重组酶聚合酶扩增(LF-RPA)相结合，通过单碱基差异对链置换反应效率的影响，实现对单核苷酸变异的有效甄别，提高检测方法的特异性；同时链置换反应能够与重组酶聚合酶扩增技术完美兼容，在链置换反应发生后能够诱发后续的重组酶聚合酶扩增，对变异信号高效放大，保证单核苷酸变异检测的灵敏度，使本方法能够在30min内完成检测，实现对单核苷酸变异的快速检测。另外，本发明实验操作仅需几次加样即可完成，且实验结果将通过侧流试纸条的方式直接可视化读取，省略繁杂的结果分析步骤，降低了操作难度，所以本方法无复杂的实验操作，对实验人员的要求不高；而且，本发明的实验试剂成本低，可控制在50元人民币以下，对实验仪器的要求低，基础的实验室条件即可满足要求。
本发明能够克服当前方法在实验周期和实验条件的不足，在保证灵敏度、特异性的基础上实现对单核苷酸变异的简便、快捷、且低成本的检测，本发明的成本低，操作简单方便，特异性好，灵敏度高，不需要昂贵的仪器，适用于各层级单位临床实际样本的检测，为临床单基因病的普筛提供新的方法。
附图说明
图1显示为本发明实施例中发明原理示意图。
图2显示为本发明实施例中RPA技术原理表征的侧流层析结果图。
图3显示为本发明实施例中链置换引物结构链1和链置换引物结构链2互补杂交区域长度对单核苷酸变异分析结果的影响图。
图4显示为本发明实施例中链置换引物立足点(Teohold)部分序列长度对单核苷酸变异分析结果的影响图。
图5显示为本发明实施例中扩增反应温度对检测结果的影响图。
图6显示为本发明实施例中β-地中海贫血外显子17(CD17)突变的不同靶DNA浓度对实时荧光检测结果的影响图。在图6中，横坐纵为时间，纵坐标为相对荧光强度。
图7显示为本发明实施例中检测结果标准曲线图。在图7中，横坐纵为浓度，纵坐标为检测时间。
图8显示为本发明实施例中β-地中海贫血外显子17(CD17)突变的不同靶DNA浓度对侧流层析检测结果的影响图。
图9显示为本发明实施例中不同遗传病相关突变对的检测结果的影响图。
图10显示为本发明实施例中反应时间对检测结果的影响图。
图11显示为本发明实施例34中临床实验样本的检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。
图1给出本发明原理示意图，本发明将toehold介导的链置换反应与RPA相结合，链置换引物通过甄别突变位点选择性启动toehold介导的链置换反应进而诱发RPA反应，该设计既用链置换反应弥补RPA反应在单核苷酸变异甄别上的不足，又通过链置换反应诱发后续的RPA反应，弥补链置换反应在信号放大上的不足，通过对突变信息的特异甄别和高效的选择性放大，实现本技术对单核苷酸变异的快速精准检测。而侧流试纸的应用实现对检测结果的可视化读取，使该技术具备成为临床即时诊断(point-of-care test)方法的潜力。
实施例1
构建比色生物传感器并检测肿瘤细胞
1、材料与方法
(1)材料
Basic RPA kit,Lateral flow dipsticks购于先达基因科技有限公司(中国，苏州)。SYBR Green I购买于索莱宝科技有限公司(中国,北京)。HPLC纯化的DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成修饰。实验中所用到的临床标本来源于厦门市妇幼保健院。
(2)检测仪器
荧光扩增信号由实时荧光PCR(Bio-Rad，美国)检测。琼脂糖凝胶电泳由Horizontal Electrophoresis Systems(伯乐,美国)完成。琼脂糖凝胶成像由Tanon2500Imaging System(Tanon，中国)完成。DNA浓度定量由NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer(赛默飞，中国)完成。
(3)检测方法概述
设计链置换引物探针，用于靶单核苷酸变异的识别和诱发后续RPA反应。设计反向引物，并在链置换引物和反向引物的5’端分别标记FITC荧光素和生物素。将RPA缓冲液、靶DNA、链置换引物、反向引物、硫酸镁溶液和超纯水加入至Basic RPA kit反应管中溶解干粉试剂并配置成50μL的反应体系。在均相反应体系中，37℃温度下反应30min。随后将反应产物用超纯水进行40倍稀释。用预先准备好的检测线包被抗荧光素抗体，质控线包被抗鼠抗体，结合垫包被金标抗生物素抗体的侧流层析试纸条，将样本垫浸入稀释后的扩增产物溶液中30s；最后，待条带显色清晰后用肉眼对检测结果进行分析判断。
2、链置换引物的制备
制备链置换引物的杂交反应：
为了更好地提高链置换引物的产出效率，利用过量的链置换引物结构链2与链置换引物结构链1结合，首先将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；
所述链置换引物结构链1为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，具体序列为：
5’-FITC-CTGCCCTGTGGGGCTAGGTAAACG-3’(SEQ ID NO.1)；
所述链置换引物结构链2为3’端磷酸化且DNA链中间修饰C3 Spacer基团的DNA探针，具体序列为：
引物链序列为：5’-CCA-C3-CGTTTACCT-P-3’(SEQ ID NO.2)。
3、利用链置换引物识别突变并触发重组酶聚合酶扩增
表1改良重组酶聚合酶扩增体系组成表
| 组分 | 用量 |
| 链置换引物 | 2.5μL |
| 反向引物 | 1μL |
| MgSO4溶液 | 2μL |
| RPA缓冲液 | 20μL |
| 超纯水+靶DNA | 24.5μL |
| 总体积 | 50μL |
将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应30min。所述反向引物为5’端生物素标记的DNA链，具体序列为：
5’-Biotin-TCACCACCATCTTCA-3’(SEQ ID NO.3)。
(3)RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例2验证单核苷酸变异即时检测方法的可行性
1、对未改良的常规RPA方法检测单核苷酸变异的可行性验证
通过对常规RPA方法进行检测单核苷酸变异的分析验证，可以对比验证当前发明的优越性。将链置换引物结构链1作为正向扩增引物加入至RPA反应体系中，具体扩增体系组成如表2所示。将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。如图2中第1、2、3条带显示，常规RPA反应能够对靶DNA进行扩增，但是未变异的靶DNA也会产生非特异扩增从而产生假阳性信号，说明常规RPA缺乏足够的特异性用于单核苷酸变异的检测。
表2常规重组酶聚合酶扩增体系组成表
| 组分 | 用量 |
| 链置换引物结构链1 | 1μL |
| 反向引物 | 1μL |
| MgSO4溶液 | 2μL |
| RPA缓冲液 | 20μL |
| 超纯水+靶DNA | 26μL |
| 总体积 | 50μL |
如图2所示为侧流层析结果图，该结果是在室温下检测得到：
试纸条1为常规RPA反应检测包含靶单核苷酸变异的DNA；
试纸条2为常规RPA反应检测不含靶单核苷酸变异的DNA；
试纸条3为常规RPA反应检测超纯水(空白)；
2、对本发明检测单核苷酸变异的可行性验证
通过对本发明进行检测单核苷酸变异的分析验证，可与改良前方法对比验证当前发明的优越性，具体扩增体系组成如表1所示。将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。如图2中第4、5、6条带显示，本发明能够根据靶DNA基因型，进行选择性扩增包含靶单核苷酸变异的靶DNA；图2中也可以证明，常规本发明拥有足够的突变甄别能力用于单核苷酸变异的检测。
如图2所示为侧流层析结果图，该结果是在室温下检测得到：
试纸条4为本方法检测包含靶单核苷酸变异的DNA；
试纸条5为本方法检测不含靶单核苷酸变异的DNA；
试纸条6为本方法检测超纯水(空白)；
实施例3
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计互补区域为8个碱基对的链置换引物结构链3和链置换引物结构链4，将链置换引物结构链3和链置换引物结构链4混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
所述链置换引物结构链3为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，具体序列为：
5’-FITC-CTGCCCTGTGGGGCTAGGTAAACG-3’(SEQ ID NO.4)；
所述链置换引物结构链4为3’端磷酸化且DNA链中间修饰C3 Spacer基团的DNA探针，具体序列为：
引物链序列为：5’-CCAC-C3-GTTTACCT-P-3’(SEQ ID NO.5)。
实施例4
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计互补区域为9个碱基对的链置换引物结构链1和链置换引物结构链2，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例5
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计互补区域为10个碱基对的链置换引物结构链5和链置换引物结构链6，将链置换引物结构链5和链置换引物结构链6混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
所述链置换引物结构链5为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，具体序列为：
5’-FITC-CTGCCCTGTGGGGCTAGGTAAACGT-3’(SEQ ID NO.6)；
所述链置换引物结构链6为3’端磷酸化且DNA链中间修饰C3 Spacer基团的DNA探针，具体序列为：
引物链序列为：5’-CC-C3-ACGTTTACCT-P-3’(SEQ ID NO.7)。
实施例3-5的侧流层析结果图如图3所示。
实施例6
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计Teohold区域为17个碱基的链置换引物结构链7，将链置换引物结构链7和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
所述链置换引物结构链7为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，具体序列为：
5’-FITC-TACTGCCCTGTGGGGCTAGGTAAACG-3’(SEQ ID NO.8)；
实施例7
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计Teohold区域为15个碱基的链置换引物结构链1，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例8
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，设计Teohold区域为13个碱基的链置换引物结构链8，将链置换引物结构链8和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
所述链置换引物结构链8为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，具体序列为：
5’-FITC-GCCCTGTGGGGCTAGGTAAACG-3’(SEQ ID NO.9)；
实施例6-8的侧流层析结果图如图4所示。
实施例9
按实施例1方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在35℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例10
按实施例1方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例11
按实施例1方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在39℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例12
按实施例1方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，再12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在41℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例9-12的侧流层析结果图如图5所示。
实施例13单核苷酸即时检测方法的性能分析
为了更好的评估本发明在复杂生物学环境中的检测性能，将检测不同浓度的CD17突变阳性的靶DNA。在最优实验条件下，对不同浓度的靶DNA进行分析。具体的，所述最优实验条件如下：
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，选择链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表3所示；将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为2ng/μL，在实时荧光PCR中，选择SYBR Green I信号采集通道，在37℃条件下，以1min为一个循环设置60个反应循环。RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
表3实时荧光改良重组酶聚合酶扩增体系组成表
| 组分 | 用量 |
| 链置换引物 | 2.5μL |
| 反向引物 | 1μL |
| MgSO4溶液 | 2μL |
| RPA缓冲液 | 20μL |
| 超纯水+靶DNA | 23.5μL |
| SYBR Green I | 1μL |
| 总体积 | 50μL |
实施例14
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为1ng/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例15
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为200pg/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例16
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为100pg/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例17
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为20pg/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例18
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为10pg/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例19
按实施例13的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为4pg/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例20
按实施例13的方法，将野生型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为2ng/μL，RPA反应结束后，直接读取实时荧光数据得到检测结果。
实施例13-20的实时荧光结果图如图6所示，从上向下的曲线依次表示实施例13-20的检测结果。检测实验结果显示，随着靶DNA的浓度增加，得到的荧光信号强度也随之增加。如图7所示，依据实际检测得到的最低检测线为4pg/μL的靶突变DNA，且对野生型靶DNA的检测无非特异扩增信号产生。
实施例21单核苷酸即时检测方法的性能分析
为了进一步的评估验证本发明在复杂生物学环境中的检测性能，将检测不同浓度的CD17突变阳性的靶DNA。在最优实验条件下，对不同浓度的靶DNA进行分析。具体的，所述最优实验条件如下：
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，选择链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中，在39℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例22
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为1ng/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例23
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为200pg/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例24
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为100pg/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例25
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为20pg/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例26
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为10pg/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例27
按实施例21的方法，将突变型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为4pg/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例28
按实施例21的方法，将野生型靶DNA加入至RPA体系中使靶DNA的终浓度为2ng/μL，RPA反应结束后，待条带清晰后用肉眼判读检测结果。
实施例21-28的侧流层析结果图如图8所示，从左至右的试纸条依次表示实施例21-28的检测结果。检测实验结果显示，随着靶DNA的浓度增加，得到的试纸条条带强度也随之增加。如图8所示，依据实际检测得到的最低检测线为4pg/μL的靶突变DNA，且对野生型靶DNA的检测无非特异扩增条带产生，与实时荧光结果相印证。
实施例29单核苷酸即时检测方法的特异性分析
采用CD17突变型靶DNA，G6PD c.1388突变型靶DNA,MTHFR C677T突变型靶DNA，SLC26A c.919-2突变型靶DNA，分别运用本方法按实施例1的方法进行特异性分析。
特异性分析结果图如图9所示，实验结果证明本发明有良好的特异性，可区分检测CD17突变阳性的靶DNA。图9中，从左至右依次表示CD17突变型靶DNA、G6PD c.1388突变型靶DNA、MTHFR C677T突变型靶DNA、SLC26A c.919-2突变型靶DNA的侧流层析检测结果，每一种突变型靶DNA均进行3次平行实验检测。
实施例30单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应60min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例31单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应50min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例32单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应40min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例33单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应30min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例34单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应30min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例35单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应20min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例36单核苷酸即时检测方法的最短检测时间评估
按实施例1的方法构建单核苷酸变异分析传感器并检测包含单核苷酸变异的基因组DNA。其中，制备链置换引物时，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合，在95℃变性3min，然后12℃杂交5min；具体扩增体系组成如表1所示；将靶DNA加入至RPA体系中至终浓度为20pg/μL，在37℃条件下反应10min。RPA反应后，向5μL扩增产物加入195μL超纯水中稀释，在室温下将侧流试纸条的样本垫浸入稀释后的产物溶液中30s，待条带清晰后用肉眼判读检测结果，每个温度条件下均进行了3次平行实验检测。
实施例30-35的侧流层析结果图如图10所示，从左至右的侧流层析试纸条依次表示实施例30-35的检测结果。检测实验结果显示，随着检测时间的降低，得到的侧流层析条带强度也随之变弱，在检测时间为10min时条带消失。如图10所示，20pg/μL靶突变DNA能够在20min内被检出，且30min后稳定呈现明显的结果条带。
实施例37单核苷酸即时检测方法的临床标本分析
为评价本方法的临床实用性，对临床血液标本进行检测。具体的，取临床上收集25例CD17突变阳性标本和25例突变阴性标本，快速提取血液中DNA后，然后分别采用与实施例34相同的方法构建基于Teohold介导链置换反应诱发的RPA单核苷酸变异检测方法并进行测定。检测结果如图11所示，试纸条1-25为突变阳性标本结果，试纸条25-50为野生型标本结果，检测结果与临床结果完全一致，证明基于Teohold介导链置换反应诱发的RPA单核苷酸变异检测方法可应用于临床实际样本的检测，有良好的适用性。
实验证明，本发明：(1)研制一种基于Teohold介导链置换反应诱发的RPA单核苷酸变异检测方法，利用侧流试纸可实现对单核苷酸变异的灵敏、快速、特异地检测；(2)特异性好且灵敏度高：本发明依靠特异性的链置换引物，可识别区分靶DNA中的单碱基变异，通过链置换引物高特异性的识别靶DNA基因型并触发重组酶聚合酶扩增，将识别事件通过侧流试纸高效地转化为肉眼可见的光学信号进行输出，极大地提高了检测的灵敏度、特异性，依据实际检测得出本方法的最低检测线为4pg/μL靶DNA；(3)良好的检测速度：本发明提供一种快速的单核苷酸变异检测方法，可实现30min内稳定检出至终浓度为20pg/μL的突变靶DNA。
综上，本发明成功构建可用于检测实际样本中单核苷酸变异的等温扩增侧流分析法，应用本发明对单基因病相关单核苷酸变异进行检测，具有灵敏度高、特异性好、检测速度快等特点。本发明提供单核苷酸变异的即时检测试剂或试剂盒，可包含上述筛选的SEQID NO.1～9序列，优选SEQ ID NO.1～3。本发明的成本低，操作简单方便，实验周期短，特异性好，灵敏度高，不需要昂贵的仪器，适用于临床实际样本的检测，为临床单核苷酸变异的检测提供新的方法。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)制备5’端荧光素标记的链置换引物和5’端生物素标记的反向扩增引物；
2)向重组酶聚合酶扩增体系中加入链置换引物、靶单核苷酸变异DNA、反向扩增引物，反应得到5’端分别标记荧光素和生物素的扩增产物，配制含有步骤1)所得引物的重组酶聚合酶扩增体系，将所述引物与重组酶聚合酶扩增体系混合，使得链置换引物识别单核苷酸变异后选择性诱发链置换反应，链置换反应后的引物链转而激发对靶DNA的重组酶聚合酶扩增，得反应液；
3)测定步骤2)所得反应液的侧流试纸层析结果。
2.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述链置换引物包含链置换引物结构链1和链置换引物结构链2，链置换引物结构链1为5’端标记FITC荧光素的DNA探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；链置换引物结构链2为3’端磷酸化且DNA链中间修饰C3 Spacer基团的DNA探针，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。
3.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤1)中，为了更好地提高链置换引物的产出效率，利用过量的链置换引物结构链2与链置换引物结构链1结合，将链置换引物结构链1和链置换引物结构链2混合进行杂交反应，将两条链置换引物的结构链经95℃变性3min后于12℃杂交反应5min，得到链置换引物。
4.如权利要求3所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于通过调整链置换引物结构链1和链置换引物结构链2的终浓度比例，使链置换引物结构链1得到充分杂交。
5.如权利要求4所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于参与杂交反应的链置换引物结构链1在体系中的终浓度为100nM；参与杂交反应的链置换引物结构链2在体系中的终浓度为300nM。
6.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述反向扩增引物为5’端生物素标记的DNA链，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述配制含有步骤1)所得引物的重组酶聚合酶扩增体系的具体步骤包括：
(1)配置RPA反应体系包括加入RPA缓冲液溶解干粉试剂并混匀；
(2)将配置好的链置换引物加入RPA反应体系，使链置换引物结构链1的终浓度为100nM，链置换引物结构链2的终浓度为300nM；
(3)将反向扩增引物加入RPA反应体系，使反向扩增引物的终浓度为100nM；
(4)加入1μL的靶单核苷酸变异DNA和2μL浓度为14nM的硫酸镁溶液，并用超纯水将体系体积补足至50μL；
(5)将配置好的反应体系置于37℃孵育30min。
8.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述靶单核苷酸变异DNA选自单基因遗传病；
所述靶单核苷酸变异DNA选自β-地中海贫血、遗传性耳聋、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因突变和葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)。
9.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述测定步骤2)所得反应液的侧流试纸层析结果，具体步骤为：从反应后的扩增产物中吸取5μL至195μL超纯水中，将扩增产物稀释40倍，通过调整扩增产物的稀释倍数，达到理想的侧流试纸分析效果。
10.如权利要求1所述一种单核苷酸变异的即时检测方法，其特征在于在步骤3)中，将侧流试纸的样本区浸入200μL稀释后的产物溶液30s；通过肉眼观察条带显色情况判读试纸条层析结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410127326.4A CN117965700A (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种单核苷酸变异的即时检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410127326.4A CN117965700A (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种单核苷酸变异的即时检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117965700A true CN117965700A (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90845336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410127326.4A Pending CN117965700A (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种单核苷酸变异的即时检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117965700A (zh) |
-
2024
- 2024-01-30 CN CN202410127326.4A patent/CN117965700A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5688643A (en) | Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid differentiation | |
| EP2305807A1 (en) | Method for detecting or quantifying dna | |
| JP2018530347A (ja) | インサイチュ増幅により無細胞核酸分子を調製する方法 | |
| JP2003530860A (ja) | 新生又は非新生細胞の検出方法 | |
| KR20110061572A (ko) | Ｄｎａ를 정량 또는 검출하는 방법 | |
| CN108374038B (zh) | 在体外侦测样本中的变异的基因、信息核醣核酸或微核醣核酸的方法 | |
| WO2010021394A1 (ja) | Ｄｎａを定量又は検出する方法 | |
| CN113481286B (zh) | 基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒 | |
| CN111850101A (zh) | 一种单细胞dna表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法 | |
| JP2022145606A (ja) | 核酸の正確な並行定量のための高感度な方法 | |
| CN105567808B (zh) | 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用 | |
| US20230107654A1 (en) | Controls for proximity detection assays | |
| CN110218772A (zh) | 一种检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN114507706B (zh) | 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用 | |
| CN117965700A (zh) | 一种单核苷酸变异的即时检测方法 | |
| Zhang et al. | A point-of-care single nucleotide variation assay based on strand-displacement-triggered recombinase polymerase amplification | |
| TWM419106U (en) | Gene group test structure | |
| CN115605610A (zh) | 用于检测不同丰度的分析物的方法 | |
| CN110616261A (zh) | 一种用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒及检测方法 | |
| KR20190131380A (ko) | 표면-증강 라만 산란 기반의 감염 질환 진단용 마커 검출 방법 | |
| WO2019224731A1 (en) | Kit and method for the colorimetric detection of a target nucleic acid in a sample | |
| US20230088664A1 (en) | Method of Detecting Analytes in a Sample | |
| KR101188433B1 (ko) | 과산화효소 활성을 가지는 핵산효소를 이용한 핵산의 검출방법 | |
| WO2023170152A1 (en) | Method for detecting nucleic acid amplification products using blocking agents | |
| TW202411431A (zh) | 準確地平行定量變體核酸的高靈敏度方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |