CN115605610A - 用于检测不同丰度的分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度，所述方法包括：(i)提供来自所述样品的多个等分试样；和(ii)在每个等分试样中，通过对每个等分试样进行单独的多重测定来检测不同亚组的分析物，其中每个亚组中的所述分析物基于它们在所述样品中的预测丰度来选择。

Description

用于检测不同丰度的分析物的方法
技术领域
本发明提供了检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度。在所述方法中，提供了样品的多个等分试样，并且在每个等分试样中检测一个亚组的分析物，所述亚组的分析物基于它们在样品中的预测丰度来进行选择。还提供了检测样品中的分析物的方法，其中所述分析物通过检测对分析物具有特异性的报告核酸分子来检测。在该方法中，进行PCR反应以扩增报告核酸分子，在所述PCR中使用内部对照。本发明的方法在邻近延伸测定(PEA)的背景下发现特别有用。
背景技术
现代蛋白质组学方法需要在小的样品量中检测到大量不同的蛋白质(或蛋白质复合物)的能力。为了实现这个目的，必须进行多重分析。可以实现对样品中的蛋白质进行多重检测的常用方法包括邻近延伸测定(proximity extension assay，PEA)和邻近连接测定(proximity ligation assay，PLA)。PEA和PLA在WO 01/61037中有所描述；PEA进一步描述于WO 03/044231、WO 2004/094456、WO2005/123963、WO 2006/137932和WO 2013/113699中。然而，当感兴趣的蛋白质通常以较宽的浓度范围存在时，这就带来了挑战，因为来自高浓度蛋白质的信号可能会覆盖来自低浓度蛋白质的信号，导致无法检测到以较低浓度存在的蛋白质。
本发明提供了检测方法，通过所述检测方法可以可靠地检测样品中存在的宽浓度范围的分析物(例如蛋白质)，从而提高多重检测方法的准确性。本发明的方法可以应用于如上所述的PEA或PLA，但也可以应用于多重分析物检测中使用的任何其他技术。
PEA和PLA是邻近测定，它们依赖于“邻近探测”的原理。在这些方法中，通过结合多个(即两个或更多个，通常两个或三个)探针来检测分析物，所述探针当通过与分析物(因此“邻近探针”)结合使其邻近时允许产生信号。通常，至少一个邻近探针包含与探针的分析物结合结构域(或部分)连接的核酸结构域(或部分)，并且信号的产生涉及在核酸部分和/或由其他探针携带的另外的功能部分之间的相互作用。因此信号产生依赖于探针之间(更特别是在核酸或由它们携带的其他功能部分/结构域之间)的相互作用，因此仅在必要的探针与分析物结合时才发生，从而导致检测系统的特异性提高。
在PEA中，与探针对的分析物结合结构域连接的核酸部分在探针非常邻近时(即当与目标结合时)彼此杂交，然后使用核酸聚合酶进行延伸。延伸产物形成报告核酸，对其的检测表明感兴趣的样品中存在特定的分析物(由相关探针对结合的分析物)。在PLA中，当探针对的探针结合其目标时，与探针对的分析物结合结构域连接的核酸部分变得邻近，并且可以连接在一起，或者可替代地，它们可以一起为单独添加的寡核苷酸的连接提供模板，所述单独添加的寡核苷酸当它们处于邻近时能够与所述核酸结构域杂交。然后连接产物被扩增，充当报告核酸。使用PEA或PLA的多重分析物检测可以通过在每个探针的核酸部分中包含独特的条形码序列来实现。与特定分析物对应的报告核酸分子可以通过其所含的条形码序列来鉴定。本发明的方法在多重PEA和PLA方法中发现特别有用。
本发明的方法可以在至少任何使用蛋白质组学的领域中有用，特别是在生物标志物鉴定和定量背景下的诊断中有用。现代个性化医学需要评估大量生物标志物的能力，例如在肿瘤学领域中。随着个性化医学变得越来越普遍，准确鉴定和定量样品中的大量生物标志物(跨浓度范围)的能力越来越重要。本发明解决了这种需求。
发明内容
为此，在第一方面，本发明提供了一种检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度，所述方法包括：
(i)提供来自所述样品的多个等分试样；和
(ii)在每个等分试样中，通过对每个等分试样进行单独的多重测定来检测不同亚组的分析物，其中每个亚组中的所述分析物基于它们在所述样品中的预测丰度来选择。
在第二方面，本发明提供了一种检测样品中的分析物的方法，其中所述分析物通过检测对分析物具有特异性的报告核酸分子来检测，所述方法包括进行PCR反应以产生报告核酸分子的PCR产物并检测所述PCR产物；
其中为所述PCR反应提供内部对照，所述内部对照为：
(i)以预定量存在的单独组分，并且其是或包含对照核酸分子或导致对照核酸分子的产生，所述对照核酸分子通过与报告核酸分子相同的引物被扩增；和/或
(ii)在每个报告核酸分子中和/或每个对照核酸分子中存在的独特分子标识符(UMI)序列，其对于每个分子是独特的。
在第三方面，本发明提供了一种检测样品中的分析物的方法，其中所述分析物通过检测分析物的报告核酸分子来检测，所述方法包括进行PCR反应以产生报告核酸分子的PCR产物和检测所述PCR产物，其中在所述PCR反应中包括内部对照，并且所述内部对照以预定的量存在并且是或包含对照核酸分子或导致对照核酸分子的产生，其中所述对照核酸分子包含作为报告核酸分子的反向序列的序列。
具体实施方式
如上文所详述，本发明的第一方面提供了一种用于检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度。所述方法依赖于执行根据待测定分析物的丰度分组的单独的分析组。
因此，换一种说法，如本文所公开的方法可以被定义为检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度，所述方法包括：
对来自所述样品的单独的多个等分试样中的每个等分试样执行单独的测定块，以在每个单独的等分试样中检测一个亚组的分析物，其中每个亚组中的分析物基于它们在所述样品中的预测丰度来选择。
因此，对单个等分试样进行的每个测定块都是多重测定。用于检测分析物亚组中(即指定在任何一个特定等分试样中检测的分析物亚组)中的多种分析物的多重测定因此可以被视为“丰度块(abundance block)”。因此，如本文所用的术语“丰度块”是指为检测样品中待检测(即测定)的分析物的特定组或亚组而执行的测定块(或测定组)，其中所述分析物基于它们在样品中的丰度(即它们的预期或预测丰度)或在样品中的相对丰度被分配给每个测定块(或组)。换句话说，测定是根据丰度分组或“分块”的。因此，基于例如低、高或不同程度的中间水平的丰度等，可以指定不同等分试样或不同丰度块以检测特定亚组的分析物。这并不意味着测定块或组中的每种分析物的丰度相同或大致相同；丰度可能在所述块或组中的不同分析物/测定之间和/或在不同样品之间有所不同。
如本文所用的术语“分析物”(就本发明的所有方面而言)意指希望通过本发明的方法检测的任何物质(例如分子)或实体。因此，分析物是本发明的测定方法的“目标”，即使用本发明的方法检测或筛选的物质。
分析物因此可以是任何希望检测的生物分子或化学化合物，例如肽或蛋白质或核酸分子或小分子，包括有机和无机分子。分析物可以是细胞或微生物，包括病毒或其片段或产物。因此可以看出，分析物可以是任何物质或实体，可以为其开发特异性结合配偶体(例如亲和结合配偶体)。所需要的只是分析物能够同时结合至少两个结合配偶体(更具体地说，至少两个邻近探针的分析物结合结构域)。
已发现基于邻近探针的测定在检测蛋白质或多肽方面特别有用。因此，特别感兴趣的分析物包括蛋白质分子，诸如肽、多肽、蛋白质或朊病毒或任何包括蛋白质或多肽组分等的分子或它们的片段。在本发明的特别优选的实施方案中，分析物是全部或部分蛋白质分子，最特别是蛋白质。也就是说，优选的是分析物是或包含蛋白质。
分析物可以是单个分子或含有两个或更多个分子亚基的复合物，所述分子亚基彼此可以共价结合，也可以不共价结合，并且所述分子亚基可以是相同或不同的。因此，除了细胞或微生物之外，这样的复合分析物还可以是蛋白质复合物或包含蛋白质和一种或多种其他类型的生物分子的生物分子复合物。这种复合物因此可以是同多聚体或异多聚体。分子(例如蛋白质)的聚集体也可以是目标分析物，例如相同蛋白质或不同蛋白质的聚集体。分析物也可以是诸蛋白质或肽与核酸分子诸如DNA或RNA之间的复合物。特别感兴趣的可能是在蛋白质与核酸(例如调节因子(诸如转录因子)和DNA或RNA)之间的相互作用。因此，在特定实施方案中，分析物是蛋白质-核酸复合物(例如蛋白质-DNA复合物或蛋白质-RNA复合物)。在另一个实施方案中，分析物是非核酸分析物，其意指不包含核酸分子的分析物。非核酸分析物包括如上所述的蛋白质和蛋白质复合物、小分子和脂质。
本发明的方法涉及检测样品中的多种分析物。多种分析物可以是相同类型(例如所有分析物都可以是蛋白质或蛋白质复合物)或不同类型(例如一些分析物可以是蛋白质、其他蛋白质复合物、其他脂质、其他蛋白质-DNA或蛋白质-RNA复合物等、或此类分析物类型的任何组合)。
如本公开中所用的术语“多个/种”意指多于一个/种(即两个/种或更多个/种)，符合其标准定义。然而，本发明第一方面的方法需要对样品的多个(即至少两个)等分试样进行单独的多重反应。如本文所用，术语“多重”用于指同时(以及更具体地，在样品的同一等分试样中或在同一反应混合物中)测定的多种(即至少两种)不同分析物的测定。因此，很明显，待根据本发明第一方面的方法检测的分析物的最小数量是四种(在样品的两个等分试样的每个等分试样中检测的两种分析物)。然而，优选的是根据本发明方法检测比四种多得多的分析物。优选地，根据本发明方法检测至少10种、20种、50种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、1100种、1200种、1300种、1400种或1500种或更多种分析物。
本文中广泛使用的术语“检测”(“detecting”或“detected”)包括确定分析物的存在或不存在(即确定目标分析物是否存在于感兴趣的样品中)的任何手段。因此，如果执行本发明的方法并尝试检测样品中的特定感兴趣的分析物，但由于样品中不存在分析物而未检测到该分析物，则“检测分析物”的步骤具有仍然被执行，因为其在样品中的存在或不存在已经被评估。“检测”分析物的步骤不依赖于该检测的成功，即不依赖于实际检测到的分析物。
检测分析物还可以包括对样品中分析物的浓度或丰度的任何形式的测量。可以确定目标分析物的绝对浓度或分析物的相对浓度，为此目的，可以将目标分析物的浓度与样品或其他样品中的另一种目标分析物(或其他目标分析物)的浓度进行比较。
因此，“检测”可以包括以任何方式确定、测量、评估或测定分析物的存在或不存在或量。包括定量和定性确定、测量或评估，包括半定量确定。此类确定、测量或评估可以是相对的(例如当正在检测样品中的两种或更多种不同分析物时)，或者是绝对的。因此，术语“定量”当用于定量样品中的目标分析物时可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包含一种或多种对照分析物的已知浓度和/或用已知对照分析物参考检测到的目标分析物水平来完成(例如，通过生成标准曲线)。可替代地，可以通过比较在两种或更多种不同目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中的每种分析物的相对定量，即相对于彼此。下面进一步讨论在本发明的方法中可以实现定量的方法。
本发明的方法是用于检测样品中的多种分析物。根据本发明可以测定任何感兴趣的样品。也就是说，含有或可能含有感兴趣的分析物的任何样品、以及人们希望对其进行分析以确定其是否含有感兴趣的分析物和/或确定其中的感兴趣的分析物的浓度的任何样品。
因此可以根据本发明分析任何生物或临床样品，例如生物体的或来自生物体的任何细胞或组织样品、或任何体液或衍生自其的制剂、以及诸如细胞培养物、细胞制剂、细胞裂解物等样品。环境样品(例如土壤和水样品)或食物样品也可以根据本发明进行分析。样品可以是新鲜制备的，或者其可以以任何方便的方式进行预先处理，例如以供储存。
因此，代表性样品包括可能含有生物分子或任何其他所需或目标分析物的任何材料，包括例如食品和相关产品、临床和环境样品。样品可以是生物样品，其可以包含任何病毒或细胞材料，包括原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。此类生物材料因此可以包括任何类型的哺乳动物和/或非哺乳动物的动物细胞、植物细胞、包括蓝绿藻等藻类、真菌、细菌、原生动物等。
优选的是，样品是临床样品，例如全血和血液衍生产品(诸如血浆、血清、血沉棕黄层和血细胞)、尿液、粪便、脑脊液或任何其他体液(例如呼吸道分泌物、唾液、奶等)、组织和活组织检查。特别优选的是，样品是血浆或血清样品。因此，本发明的方法可以用于例如生物标志物的检测，或用于测定样品中的病原体衍生的分析物。样品尤其可以来源于人，尽管本发明的方法同样可以应用于来源于非人动物的样品(即兽医样品)。可以以任何方便或期望的方式对样品进行预处理以制备其用于本发明方法，例如通过细胞裂解或去除等。
本发明的第一方面的方法是用于检测样品中的多种分析物，其中所述分析物在样品中具有不同水平的丰度。也就是说，所述分析物以不同的浓度或以一系列浓度存在于样品中。不要求样品中的每种分析物都以与每种其他分析物明显不同的浓度存在，而是要求并非所有分析物都以基本相同的浓度存在。尽管样品中的分析物以一系列浓度存在，但某些分析物可能以非常相似的浓度存在。
样品中存在的分析物的浓度范围可能跨越了几个数量级。例如，样品中以最高浓度存在(或预期存在)的分析物的存在(或预期存在)浓度可能比样品中以最低浓度(预期)存在的分析物的(预期)浓度高了约1000倍。例如，样品中的分析物的浓度可以相对于彼此变化约10倍、约100倍、约1000倍或更多倍、当然还有介于两者之间的任何值。在临床样品中，分析物可能存在于几个数量级的范围内，例如3个、4个、5个或6个或更多个数量级。
用于将不同分析物分块或分组在一起的丰度水平或值或更具体地用于不同分析物的测定可能不仅仅取决于存在(或预期存在)于样品中的分析物的绝对水平或浓度。可以考虑其他因素，包括测定方法的性质、用于不同分析物的测定的性能差异等。例如，在基于抗体或其他结合剂的检测测定的情况下，这可能取决于抗体对分析物的亲和力或亲合力等。可以考虑用于不同分析物的测定之间的这种可变性。例如，就测定输出值或测量值而言，丰度可以反映在测定中检测到的分析物的丰度。因此，选择亚组中的分析物所依据的预测丰度可能至少取决于样品中分析物的预测水平或浓度，但其也可能或可替代地取决于在特定检测测定中确定的预测丰度水平或值。换句话说，样品中的分析物的丰度可以是其表观丰度、或取决于检测测定的理论丰度。分析物的表观丰度可能取决于所使用的测定(以及特别是该测定的灵敏度)而变化。
所述方法包括提供来自样品的多个(也就是说，至少两个)等分试样。也就是说，提供了样品的多个单独部分。可以将样品分成多个等分试样(使得整个样品被等分)，或者可以以等分试样的形式提供一些样品，而不使用整个样品。等分试样可以具有相同的大小或体积，或者具有不同的大小或体积，或者一些等分试样可以具有相同的大小而其他等分试样具有不同的大小。
可以稀释至少一些等分试样。例如，样品可以按1:2、1:4、1:5、1:10等进行稀释。具体而言，等分试样可以进行10倍稀释，即一个或多个等分试样可以被稀释10倍(或1:10)，一个或多个等分试样可以被稀释100倍(1:100)，并且一个或多个等分试样可以被稀释1000倍(1:1000)。如果需要，可以进行进一步稀释(例如1:10,000或1:100,000)，但按照惯例可以预期最大稀释度为1:1000就足够了。一个或多个等分试样可以是未稀释的(在本文中称为1:1)。
在特定实施方案中，进行一系列10倍稀释，提供具有以下稀释度的等分试样：1:1、1:10、1:100和1:1000。在该实施方案中，通过将未稀释的样品进行10倍稀释来产生1:10稀释。1:100和1:1000稀释可以通过对未稀释的样品进行直接100倍和1000倍稀释(分别)来进行，或通过对1:10稀释的等分试样进行系列10倍稀释来进行(即可以将1:10稀释的等分试样稀释10倍以产生1:100稀释的等分试样，并且可以将1:100稀释的等分试样稀释10倍以产生1:1000稀释的等分试样)。样品稀释(以及实际上贯穿本发明方法的所有移液步骤)可以手动进行，或者可替代地使用自动移液机器人(诸如SPT Labtech Mosquito)进行。
可以使用任何合适的稀释剂进行样品的稀释，这可能取决于待测定样品的类型。例如，稀释剂可以是水或盐水溶液，或缓冲溶液，特别是包含生物相容性缓冲化合物的缓冲溶液(即与所使用的检测测定相容的缓冲液，例如与PEA或PLA相容的缓冲液)。合适的缓冲剂化合物的实例包括HEPES、Tris(即三(羟甲基)氨基甲烷)、磷酸氢二钠等。用作稀释剂的合适的缓冲液包括PBS(磷酸盐缓冲盐水)、TBS(Tris缓冲盐水)、HBS(HEPES缓冲盐水)等。所使用的缓冲液(或其他稀释剂)必须在纯化的溶剂(例如水)中配制，使得其不含有污染物分析物。因此，稀释剂应该是无菌的，并且如果使用水作为稀释剂或稀释剂的基质，则所使用的水优选地是超纯水(例如Milli-Q水)。
可以从样品中提供任何合适数量的等分试样。如上所述，提供至少两个等分试样，但在大多数实施方案中将提供多于两个等分试样。在特定实施方案中，如上文所详述，可以提供四个等分试样：未稀释的样品等分试样和样品以1:10、1:100和1:1000稀释的等分试样。如果需要更多或更少的样品稀释，可以提供比这更多或更少的等分试样。此外，根据所进行的特定测定的期望/要求，可以提供每个稀释因子的一个或多个等分试样。
一旦从样品中提供多个等分试样后，就对每个等分试样进行单独的多重测定，以便检测每个等分试样中的一个亚组的目标分析物。对每个等分试样进行单独的多重测定，使得单独分析每个等分试样(即在多重反应期间不混合多个等分试样)。在提供所有等分试样并对其进行多重测定后，检测了所有目标分析物。也就是说，在所有等分试样中，进行测定以确定每种目标分析物是否存在于感兴趣的样品中。然而，检测特定分析物的每个单独的测定可以仅在一个等分试样中进行。因此，在每个等分试样中检测到不同亚组的分析物，换句话说，在每个等分试样中检测到不同的分析物。优选地，在每个等分试样中检测到的亚组是完全不同的，即每种目标分析物仅在一个等分试样中被检测到，使得分析物亚组之间没有重叠。然而，在一些实施方案中，如果认为合适，可以在多个等分试样中检测特定分析物。在这种情形中，在亚组之间会有一些分析物重叠，因为一些分析物将存在于多个分析物亚组中，而其他分析物将仅存在于一个亚组中。
每个亚组中的分析物是基于它们在样品中的预测丰度(即浓度)来选择的。也就是说，可以预期以相似浓度存在于样品中的分析物可以包含在同一亚组中，并在同一多重反应中进行分析。相反，预期以不同浓度存在于样品中的分析物可能包含在不同的亚组中，并在不同的多重反应中进行分析。每种分析物都被分配到预期以相似浓度(例如，特定数量级内的浓度)存在于样品中的分析物亚组。然后在样品等分试样中检测分析物的每个亚组，所述等分试样鉴于分析物的预期浓度而以适当的因子进行稀释。因此，可以在未稀释的等分试样或具有低稀释因子的等分试样中检测到预期以最低浓度存在的分析物；在最稀释的等分试样中检测到预期以最高浓度存在的分析物；并且预期以介于这些极端值之间的浓度存在的分析物在具有“中间”稀释因子的等分试样中检测到。
如上所述，在一些实施方案中，某些分析物可以包括在多个亚组中。例如，如果分析物的预期浓度基本上介于两个亚组的预期浓度之间，使得它不明确“属于”它们中的任一个亚组，则可能会出现这种情况。在这种情形中，分析物可以包含在两个亚组中。如果已知分析物可能以异常宽泛的浓度范围存在于样品中，则所述分析物也可能包含在两个(或更多个)亚组中。
应当理解，鉴于每个亚组中的分析物是基于它们在样品中的预测丰度来选择的，在每个亚组中可能存在不同数量的分析物。可替代地，视情况而定，在每个亚组中可能存在相同数量的分析物。
样品中的每种分析物的丰度/浓度可以基于关于待分析的样品类型中每种分析物的正常水平的已知事实来预测。例如，如果样品是血浆或血清样品(或任何其他体液的样品)，则其中的分析物浓度可以基于这些流体中物质的已知浓度来预测。广泛的潜在感兴趣的分析物的正常血浆浓度可从以下网站获得：https://www.olink.com/resources-support/document-download-center/。然而，如上所述，用于将分析物分配到特定亚组(块)的丰度值可能取决于测定以及可从该测定获得的结果(例如测量值)。
如上文所详述，对每个等分试样进行多重反应，以检测所述等分试样中待分析的亚组中的所有分析物。如上所述，术语“多重”意指同时测定至少两种不同分析物的测定。然而，优选地，在每个多重反应中测定大大多于两种的分析物。例如，每个多重反应可以测定至少5种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种或更多种分析物。某些多重反应可能会测定超过此数量的分析物，例如至少70种、80种、90种、100种、110种、120种、130种、140种或150种或更多种分析物。
在本发明的这方面的特定实施方案中，在每个等分试样中，通过检测对每种分析物具有特异性的报告核酸分子来检测分析物。在该实施方案中，样品中的特定分析物的存在导致在检测测定期间产生具有特定核苷酸序列的核酸分子，所述特定核苷酸序列已知对应于所述特定分析物。特定核苷酸序列的检测表明该序列所对应的分析物存在于样品中。“报告核酸分子”因此是在检测测定期间其合成表明样品中存在特定分析物的核酸分子。报告核酸分子可以是RNA分子或DNA分子。优选地其是DNA分子。
报告核酸分子可以通过在本领域检测测定中已知的任何手段产生。例如，其可以通过两个(或更多个)核酸彼此连接而产生，形成指示样品中存在分析物的独特核苷酸序列。可替代地，报告核酸分子可以通过沿模板核酸分子延伸所提供的核酸分子来产生。也可以使用延伸和连接的组合。
因此，在对每个等分试样进行的多重检测测定期间产生报告核酸分子。为了产生报告核酸分子，可以使用通过产生此类核酸分子起作用的任何检测测定。在特定实施方案中，报告核酸分子是在邻近延伸测定(PEA)的背景下产生的。也就是说，可以执行多重PEA以检测每个等分试样中以及因而样品中的分析物。在另一个实施方案中，报告核酸分子是在邻近连接测定(PLA)的背景下产生的，即可以执行多重PLA以便检测每个等分试样中的分析物。如上所述，用于执行PEA和PLA的方法是本领域已知的。特别优选的是所执行的检测测定是PEA。
在报告核酸分子产生后，优选地对其进行扩增为以便于检测。报告核酸分子的扩增优选地通过PCR进行，但可以使用任何其他的核酸扩增方法，例如环介导的等温扩增(LAMP)。
如上所述，每种报告核酸分子对特定分析物具有特异性。因此，报告核酸分子鉴定给定的分析物，或更具体地，可以含有用作鉴定(ID)序列或标签的序列或结构域，通过所述ID序列或标签可以检测到分析物。所述ID序列可以例如通过用作探针或引物等的结合位点来检测，如下文进一步详述，或者更直接地通过测序来检测。因此，可替代地表述，这种特异性可以通过在报告核酸分子中存在一个或多个条形码序列来实现。从广义上讲，条形码序列可以被定义为在报告核酸分子内鉴定报告物以及因而检测的分析物的核苷酸序列。有可能在检测测定中产生的每个报告核酸分子的全部是独特的，在这种情况下，整个报告核酸分子可以被认为是条形码序列。更常见的是，报告核酸分子的一个或多个较小部分充当条形码序列。
通过检测在多重检测测定期间产生的报告核酸分子内的特定条形码序列来检测样品中的分析物。这可以通过多种方式来实现。首先，可以通过对在多重检测测定期间产生的所有报告核酸分子进行测序来检测具体的条形码序列。通过对所产生的所有报告核酸分子进行测序，所产生的所有不同报告核酸分子可以通过它们的条形码序列来鉴定，并且因此可以鉴定在样品中存在的所有分析物(基于是否检测到已知与每种目标分析物对应的报告核酸分子)。核酸测序是报告核酸检测/分析的优选方法。
用于检测报告核酸分子的其他合适方法包括基于PCR的方法。例如，可以利用“TaqMan”探针进行定量PCR。在这种情形中，扩增报告核酸分子(或包含条形码序列的每个报告核酸分子的至少一部分)，并提供与每个条形码序列互补的探针，其中每个不同的探针与不同的可区分的荧光团缀合。然后可以基于特定条形码是否被扩增来确定每个条形码(以及因此报告核酸分子和因此分析物)的存在或不存在。然而，很明显，诸如上文所述的基于PCR的方法仅适合用于同时分析相对少量的不同序列，但是使用用于解码条形码序列的探针的组合方法是已知的并且可以用于在一定程度上扩展多重能力。核酸测序对在任何一次尝试中可以鉴定的序列数量没有任何实际限制，使得能够实现比使用PCR的检测更高水平的多重反应，因此测序是报告核酸分子检测的优选方法。
优选地，将一种形式的高通量DNA测序用于检测报告核酸分子。通过合成测序是优选的DNA测序方法。通过合成测序技术的实例包括焦磷酸测序、可逆染料终止子测序和离子激流测序，其中任何一种都可以用于本发明的方法中。优选地，使用大规模并行DNA测序对报告核酸进行测序。大规模并行DNA测序尤其可以应用于通过合成测序(例如，如上所述的可逆染料终止子测序、焦磷酸测序或离子激流测序)。使用可逆染料终止子方法的大规模并行DNA测序是优选的测序方法。可以例如使用
Figure BDA0003942296460000081
NovaSeqTM系统来执行使用可逆染料终止子方法的大规模并行DNA测序。
如本领域已知的，大规模并行DNA测序是其中多条(例如数千条或数百万条或更多条)DNA链被并行(即同时)测序的一种技术。大规模并行DNA测序需要将目标DNA分子固定到固体表面上，例如固定到流动池的表面上或固定到珠上。然后对每个固定的DNA分子进行单独测序。通常，采用可逆染料终止子测序的大规模并行DNA测序利用流动池作为固定表面，而采用焦磷酸测序或离子激流测序的大规模并行DNA测序利用珠作为固定表面。
如本领域技术人员所已知的，在大规模并行测序的背景下将DNA分子固定到表面上通常通过将一个或多个测序适配体连接到分子末端来实现。因此，本发明的方法可以包括将一个或多个用于测序的适配体(测序适配体)添加到报告核酸分子中。
通常，测序适配体是核酸分子(特别是DNA分子)。在这种情形中，与适配体序列互补的短寡核苷酸与固定表面(例如珠或流动池的表面)缀合，使得靶DNA分子能够通过适配体序列与表面退火。可替代地，任何其他的结合配偶体对都可以用于将靶DNA分子缀合到固定表面上，例如生物素和抗生物素蛋白/链霉亲和素。在这种情况下，生物素可以用作测序适配体，并且抗生物素蛋白或链霉亲和素与固定表面缀合以结合生物素测序适配体，反之亦然。
因此，测序适配体可以是短的寡核苷酸(优选DNA)，一般为10-30个核苷酸长(例如15-25或20-25个核苷酸长)。如上文所详述，测序适配体的目的是使得靶DNA分子能够与固定表面退火，因此核酸适配体的核苷酸序列由其与固定表面缀合的结合配偶体的序列确定。除此之外，对核酸测序适配体的核苷酸序列没有特别的限制。
可以在PCR扩增期间将测序适配体添加到本发明的报告核酸分子中。在核酸测序适配体的情况下，这可以通过在一个或两个引物中包含测序适配体核苷酸来实现。可替代地，如果测序适配体是非核酸测序适配体(例如蛋白质/肽或小分子)，则适配体可以与一个或两个PCR引物缀合。可替代地，可以通过将测序适配体直接与报告核酸分子连接或缀合将测序适配体连接至报告核酸分子。优选地，本发明的方法中使用的一个或多个测序适配体是核酸测序适配体。
可以在一个或多个连接和/或扩增步骤中将一个或多个核酸测序适配体添加至报告分子。因此，例如，如果将两个测序适配体添加至报告核酸分子(在每个末端一个)，则可以在单个步骤中(例如，通过使用一对都包含测序适配体的引物进行PCR扩增)或在两个步骤中添加这些适配体。所述两个步骤可以使用相同或不同的方法来执行，例如第一测序适配体可以通过连接添加至报告核酸分子，第二测序适配体通过PCR扩增添加至报告核酸分子，反之亦然；或者可以进行第一扩增反应以将第一测序适配体添加至报告核酸分子，随后进行第二扩增反应以将第二测序适配体添加至报告核酸分子。
如上所述，可以将一个或多个测序适配体添加至报告核酸分子。这意指一个或两个测序适配体—因为测序适配体被添加到DNA分子的末端，所以可以添加至单个DNA分子(例如报告核酸)的最大测序适配体数量是两个。因此，可以将单个测序适配体添加至报告核酸分子的一个末端，或者可以将两个测序适配体添加至报告核酸分子，每个末端添加一个。在特定实施方案中，使用Illumina P5和P7适配体，即P5适配体被添加到报告核酸分子的一个末端并且P7适配体被添加到另一个末端。P5适配体的序列如SEQ ID NO:1(AAT GATACG GCG ACC ACC GA)所示，并且P7适配体的序列如SEQ ID NO:2(CAA GCA GAA GAC GGCATA CGA GAT)所示。
因此，在本发明的特定实施方案中，报告核酸分子进行至少第一(即至少一次)PCR扩增，以便添加至少第一(即添加至少一个)测序适配体至报告核酸分子。如上所述，响应于报告核酸分子所对应的目标分析物(即，其存在由报告核酸分子的产生指示的分析物)的存在，在检测反应期间产生报告核酸分子。如上进一步所述，优选地扩增报告核酸分子以实现或改进其检测。
这种扩增因此可以与将一个或多个测序适配体添加至报告核酸分子相结合。这可以通过使用包含至少一个测序适配体的引物对扩增报告核酸分子来实现。在这种情形中，引物对中的至少一个引物包含在结合报告核酸分子的序列上游的测序适配体。因此，测序适配体通常位于包含它的任何引物的5'末端。
在特定实施方案中，使用包含含有测序适配体的一个引物的引物对进行扩增步骤，使得单个测序适配体被添加到报告核酸分子的一个末端。
在另一个实施方案中，使用其中两个引物都包含测序适配体的引物对进行扩增步骤，使得在单个扩增步骤中将测序适配体添加至报告核酸分子的每个末端。
在另一个实施方案中，进行两个单独的扩增反应以将测序适配体添加到报告核酸分子的每个末端，其中每个扩增步骤将不同的测序适配体添加到所述分子的不同末端。
在另一个实施方案中，使用不包含测序适配体的引物进行初始扩增步骤。然后使扩增的报告核酸分子经历一个或多个另外的扩增反应以将测序适配体添加到所述分子的每个末端，如上所述。
如上文所详述，在检测测定期间产生的每个报告核酸分子可以包含与特定分析物对应的条形码序列。因此，响应于样品中不同分析物的存在，产生具有不同序列的报告核酸分子。尽管如此，为了便于进行多重，优选的是在检测测定中产生的所有报告核酸分子共享共同的引物结合位点，使得相同的引物对可以用于扩增所有不同的报告核酸分子。
如果对报告核酸分子进行第一PCR扩增，其中仅向分子中添加单个测序适配体，则所扩增的报告核酸分子(也就是说第一PCR扩增的产物)可以进行第二PCR扩增以添加第二测序适配体。因此，在该实施方案中，使用引物对进行第一PCR扩增，其中一个引物包含测序适配体，因此将第一测序适配体添加到报告核酸分子的一个末端。然后使用不同的引物对进行第二PCR扩增。第二引物对包含一个引物，所述引物包含第二测序适配体。第二测序适配体不同于第一测序适配体，即其具有不同的序列。包含第二测序适配体的引物在与包含第一测序适配体的末端的相反末端结合报告核酸分子，使得所述第二测序适配体在与所述第一测序适配体的相反末端添加至报告核酸分子。
根据第一PCR扩增产物的扩增需要，第二引物对的第二引物可以包含第一测序适配体的序列，以便其可以与在第一PCR扩增期间添加了第一测序适配体的报告核酸分子的末端结合。在特定实施方案中，包含在第一PCR扩增中用于将第一测序适配体添加至报告核酸分子的第一测序适配体的引物也被用于第二PCR扩增。也就是说，相同的引物(包含第一测序适配体)可以被用于第一和第二PCR扩增两者。
在进行连续两次PCR扩增以将测序适配体添加到报告核酸分子的两个末端的实施方案中，可以在对其进行第二PCR之前纯化第一PCR的产物。用于纯化PCR产物的标准方法是本领域已知的。
如上所述，Illumina P5和P7测序适配体是用于本发明的优选的测序适配体对。在特定实施方案中，在第一PCR扩增中将P5测序适配体添加至报告核酸分子，并且在第二PCR扩增中将P7测序适配体添加至报告核酸分子。在另一个实施方案中，在第一PCR扩增中将P7测序适配体添加至报告核酸分子，并且在第二PCR扩增中将P5测序适配体添加至报告核酸分子。
优选的是，为了将测序适配体添加至报告核酸分子而进行的一次或两次PCR扩增中的至少一次运行至饱和。如本领域所熟知的，PCR扩增产物的量相对于循环数采取“S”形。在扩增子浓度缓慢初始增加后，达到指数扩增阶段，在此期间，每个扩增循环的产物量(大约)翻倍。在指数阶段后达到线性阶段，其中产物的量以线性而不是指数的方式增加。最后，达到一个平台(plateau)，其中给定反应设置和所用组分的浓度等，产物的量已达到其最大可能水平。
在本发明中，饱和PCR可以广义地认为是已经进行超出指数期的任何PCR，即线性期的PCR或者已达到平台期的PCR。在特定实施方案中，如本文所用的“饱和”意指运行反应直到获得最大可能产物，使得即使进行更多个扩增循环也不会产生更多的产物(即运行反应直到达到产物平台的量)。在反应组分耗尽时(例如在引物耗尽或dNTP耗尽时)可能达到饱和。反应组分的耗尽导致反应减慢然后进入平台期。不太常见的是，聚合酶耗竭时(即如果聚合酶失去其活性的话)可能会达到饱和。如果扩增子的浓度达到如此高的水平，以至于DNA聚合酶的浓度不足以维持指数扩增，即如果扩增子分子多于聚合酶分子，也可能达到饱和。在这种情形中，只要反应混合物中保留有充足的引物和dNTP，扩增就会进入并保持在线性阶段。
在特定实施方案中，进行两次PCR扩增以将测序适配体添加至报告核酸分子，并且这两次反应都运行至饱和。在另一个实施方案中，两次PCR扩增中的仅第一次运行至饱和。可替代地，两次PCR扩增中的仅第二次运行至饱和。特别优选的是两次PCR扩增中的仅第一次运行至饱和。
PCR扩增可以通过运行大量的循环数来运行至饱和，使得可以假设饱和。例如，可以假设PCR扩增运行至少25、30、35或更多个扩增循环，以便到终点时已达到饱和，因为指数扩增阶段将在该阶段结束。可替代地，可以通过定量PCR(qPCR)测量饱和。例如，可以使用结合所有报告核酸分子中的共同序列的探针进行TaqMan PCR，或者可以使用与双链DNA结合后改变颜色的染料(诸如SYBR Green)进行qPCR。因此可以跟踪反应并确定达到饱和所需的最小扩增循环数。无论哪种方式，鉴于需要对扩增的报告核酸分子进行进一步处理(直至并包括测序)，有必要执行任何此类实验性qPCR以鉴定在实验性地用于产生用于测序的报告核酸分子的单独等分试样中的饱和点，因为TaqMan探针或嵌入染料可能会干扰所述方法的进一步步骤。
如上文所详述，对感兴趣的样品的每个等分试样进行单独的多重反应。每个等分试样用于检测样品中以不同水平存在的分析物。最初产生的报告核酸分子的量对应于样品中每种分析物的量。因此，对于以高浓度存在的分析物，可以预期会产生高浓度的报告核酸分子；对于以低浓度存在的分析物，可以预期低浓度的报告核酸分子。可以预期所产生的报告核酸分子的量将与样品中存在的对应分析物的量成比例，例如对于以十倍于第二分析物的浓度存在于样品中的第一分析物，可以预期第一分析物产生的报告核酸分子是第二分析物产生的报告核酸分子的十倍。因此，与用于检测预期以低浓度存在于样品中的分析物的等分试样中相比，在用于检测预期以高浓度存在于样品中的分析物的等分试样中将产生多得多的量的报告核酸分子。
如果将报告核酸量的这种差异带到鉴定报告核酸分子的分析步骤(例如测序步骤)，则以最高量存在的报告核酸分子可能会“淹没”来自以少量存在的报告核酸分子的信号，导致对以少量存在于样品中的分析物的检测不佳。
将来自PCR运行中的每个多重反应的报告核酸分子扩增至饱和意味着将消除等分试样之间报告核酸浓度的这些差异。一旦达到饱和，在每个等分试样中将存在基本上相同量的报告核酸分子。这意味着对于样品中存在的每种分析物存在相似量的报告核酸分子，这进而又意味着在分析报告核酸分子时应该检测到所有报告核酸分子(以及因此它们的对应分析物)。
如上所述，本发明的方法中使用的多重检测测定是对感兴趣样品的多个单独等分试样进行的。然后使用多重检测测定的产物来鉴定样品中存在哪些目标分析物。如上文所详述，这可以使用对应于不同分析物并且被例如通过测序分析以确定存在哪些报告核酸分子(以及因而确定样品中存在哪些分析物)的报告核酸分子来实现。有可能对每个样品等分试样进行的每个多重反应进行单独分析。然而，在本发明的优选实施方案中，来自每个等分试样的反应产物(即多重检测测定的产物)被合并(也就是说混合在一起)。换句话说，在这样的合并步骤中，可以看到单独的“丰度块”被合并。这通过能够对来自样品的所有等分试样进行单个分析反应(例如测序反应)，从而使得能够更有效地分析反应产物。
如果多重检测测定的产物是报告核酸分子，优选的是首先(例如通过PCR)扩增报告核酸分子，然后合并扩增产物。任选地，可以在合并中发生另外的扩增步骤。
特别优选的是，由每个单独的多重检测测定产生的报告核酸分子进行如上所述的其中第一测序适配体被添加至核酸分子的单独第一PCR扩增，其产物被合并。换句话说，在每个单独的等分试样中，进行检测测定并产生报告核酸分子，并且报告核酸分子经历第一PCR反应，该反应既扩增报告核酸分子又将第一测序适配体添加至报告核酸分子的一个末端。合并该第一扩增反应的产物。如果需要，每个单独的第一PCR反应的产物可以在合并之前进行纯化。可替代地，可以将单独的第一PCR反应的产物合并，然后将合并中的所有PCR产物一起纯化。然而，不要求在进行第二PCR扩增之前纯化第一PCR扩增的产物。
合并后，对第一PCR扩增的合并产物进行第二PCR扩增。第二PCR既用于扩增第一PCR的产物，又用于将第二测序适配体添加至报告核酸分子，如上文所详述。当合并第一PCR的产物时，重要的是使第一PCR运行至饱和，以便在合并时每个等分试样中存在大致相同量的扩增报告核酸分子。对第一PCR扩增的合并产物进行的第二PCR扩增是否也运行至饱和并不重要，尽管如果需要也可以。在优选的实施方案中，第一和第二PCR扩增两者都运行至饱和。
在替代性实施方案中，对每个单独的等分试样进行单独的多重检测测定。然后对每个等分试样中产生的报告核酸分子进行单一PCR反应，运行至饱和并针对每个等分试样单独进行，其中将测序适配体添加至报告核酸分子的每个末端(一个测序适配体添加至每个报告核酸分子的每个末端)。然后将该PCR反应的产物合并和测序。
在又另一个实施方案中，对每个单独的等分试样进行单独的多重检测测定。然后对每个等分试样中产生的报告核酸分子进行两次PCR扩增，对每个等分试样单独进行两次PCR扩增。第一PCR用于将第一测序适配体添加至报告核酸分子，第二PCR用于将第二测序适配体添加至报告核酸分子(在与第一测序适配体相反的报告核酸分子末端)。然后将第二PCR的产物合并和测序。在该实施方案中，重要的是对于每个等分试样将至少一次PCR扩增运行至饱和。第一PCR或第二PCR或两次PCR都可以运行至饱和，只要相同的反应在每个等分试样中运行至饱和即可。
当合并来自每个单独的多重反应的扩增的报告核酸分子时，可以将来自每个单独多重反应的相同或不同量的扩增产物添加到池中。可能将从每个单独的多重反应中获得的相同量的扩增产物添加到池中。这可以通过将来自每个多重反应的完整扩增反应混合物添加到池中来实现，或者可替代地可以从每个扩增反应混合物中取出相同的限定体积并添加到池中。在这种情形中，如果例如从样品中提供三个等分试样，对每个等分试样进行单独的多重检测测定，并将来自每个等分试样的扩增的报告核酸分子合并，则池的三分之一将来源于每个等分试样。等效地，如果从样品中提供四个等分试样，则池的四分之一将来源于每个等分试样。
可替代地，可以将从每个单独的多重反应中获得的不同量的扩增产物添加到池中。“不同量的扩增产物”仅仅意味着添加到池中的扩增产物的量在所有等分试样/多重检测测定中都不相同。因此，有可能存在将来自每个多重检测测定的不同量的扩增产物添加到池中的情况，或者可替代地可以从一些但不是所有等分试样中添加相同量的扩增产物，使得从一些等分试样中添加不同量的扩增产物。例如，如果从样品中提供三个等分试样，对每个等分试样进行单独的多重检测测定，并且合并来自每个等分试样的扩增的报告核酸分子，则有可能从所有三个等分试样中将不同量的扩增产物添加到池中。可替代地，可以从两个等分试样中将相同量的扩增产物添加到池中，而从第三个等分试样中添加不同量的扩增产物。同样，如果例如从样品中提供四个等分试样，则有可能从所有四个等分试样中将不同量的扩增产物添加到池中。可替代地，可以从三个等分试样中将相同量的扩增产物添加到池中，而从第四个等分试样中添加不同量的扩增产物。如果从两个等分试样中将相同量的扩增产物添加到池中，则有可能从其他两个等分试样的每个等分试样中将不同量的扩增产物添加到池中，或者有可能从两个等分试样中将第一相同量的扩增产物添加到池中，并且从其他两个等分试样中将不同于第一相同量的第二相同量添加到池中。
如果从各个等分试样中将不同量的扩增产物添加到池中，则添加的每个等分试样的量优选地与在每个相应等分试样中检测到的分析物的数量成比例。因此，例如，如果在第一等分试样中检测到的分析物是在第二等分试样中检测到的分析物的两倍，则第一等分试样向池中的添加量是第二等分试样的两倍。这可以看作是在等分试样中对于样品中检测到的每种分析物添加相同体积的扩增产物到池中。例如，如果在三个等分试样中检测到100种分析物，在第一等分试样中检测到50种，在第二等分试样中检测到30种，并且在第三等分试样中检测到20种，则将三个等分试样的量按5:3:2的比率添加到池中，使得池的50％将来源于第一等分试样，30％来源于第二等分试样，并且20％来源于第三等分试样。
本发明的第一方面的方法可以用于并行分析多个样品。当并行分析多个样品时，样品可以是相同类型或不同类型。优选地，所有样品都是相同类型的，例如所有都是血浆样品，或所有都是唾液样品等。在每个样品中检测到的分析物组也可以是相同或不同的。优选地，在每个样品中检测同一组的分析物，并且使用相同的报告核酸分子来鉴定所有样品中的每种特定分析物。并行分析多个样品意指同时分析多个样品，其中基本上同时对每个样品执行所述方法的每个步骤。
当并行分析多个样品时，从每个样品中提供多个等分试样，并且在每个等分试样中检测分析物的亚组，如上文所详述。优选地，从每个样品提供相同数量的等分试样，例如可以从每个样品提供3个等分试样，或者可以从每个样品提供4个等分试样。然而，这不是必需的，并且有可能存在以下情况：从不同的样品提供不同数量的等分试样，例如可以从一些样品提供2个等分试样，可以从其他样品提供3个等分试样，可以从其他样品提供4个等分试样，并且可以从其他样品提供5个等分试样。
如上所述，优选的是在每个样品中检测相同的分析物组，并且从每个样品提供相同数量的等分试样。进一步优选的是，对于每个样品，分析物以相同的方式在等分试样之间分开，使得在每个对应的样品等分试样(即，来自每个样品的具有相同稀释因子的等分试样)中检测到相同的分析物亚组。
当将本发明的第一方面的方法用于并行分析多个样品时，报告核酸分子如上所述被扩增，并且每个特定样品的扩增产物可以如所述被合并，以产生第一池。因此可以为每个样品产生单独的第一池，并且每个第一池含有来自对其样品进行的所有多重检测测定的扩增产物(即来自为该样品提供的所有等分试样的扩增产物)。
在实施方案中，为每个样品产生的单独的第一池可以进一步合并，以促进后续分析。在这样的实施方案中，在第一合并步骤之后，向每个第一池中的扩增产物添加样品索引。样品索引是一种核苷酸序列，其鉴定扩增产物所来源的源样品。因此，不同的核苷酸序列被用作来源于每个样品的扩增产物的样品索引序列。当随后对扩增产物进行测序时，样品索引将指示每个单独的报告核酸分子来自哪个样品。任何核苷酸序列都可以用作样品索引。样品索引序列可以是任何长度，但优选是相对较短的，例如3-12个、4-10个或4-8个核苷酸。
因此，使用不同的样品索引序列来标记每个单独的第一池中的扩增产物。然而，在每个单独的第一池内，样品索引序列是相同的。可以通过任何合适的方法将样品索引序列添加至扩增产物，例如可以在扩增反应(例如通过PCR)或连接反应中添加样品索引。值得注意的是，如果扩增的报告核酸分子要通过大规模并行DNA测序进行分析，并且在两个末端都需要测序适配体，则样品索引序列不能被添加成使得其最终位于报告核酸分子的末端。
如上所述，优选的是报告核酸分子进行第一PCR扩增，其包括将第一测序适配体添加至报告分子，然后合并以形成第一池。当并行分析多个样品时，情况仍然如此。优选的是，如上所述，对每个样品的每个等分试样单独进行第一PCR扩增，将第一测序适配体添加至报告核酸分子的一个末端。如上所述，来自每个样品的等分试样被单独合并，以产生每个样品的单独的第一池。
一旦获得单独的第一池，就添加样品索引。如上所述，这可以通过扩增或连接来实现。然而，样品索引被添加，其被添加到报告核酸分子的与包含第一测序适配体的末端相反的末端。可以进行连接步骤以将样品索引添加到每个报告核酸分子的末端，但优选地通过扩增(通常通过PCR)来实现样品索引的添加。在扩增期间通过使用包含含有样品索引序列的一个引物的引物对添加样品索引，使得将样品索引掺入扩增产物中。
样品索引的添加可以在专门的扩增步骤中进行，所述专门的扩增步骤专门进行以将样品索引添加至报告核酸分子。此后，如果需要，可以进行另外的扩增步骤，以将第二测序适配体添加至报告核酸分子。在这种情形中，将第二测序适配体添加至报告核酸分子的与样品索引所存在的相同的末端。因此，这通常会导致样品索引紧邻第二测序适配体定位在扩增的和带有适配体标签的报告核酸分子的测序适配体内侧。
然而，优选地，在合并第一PCR扩增的产物以产生第一池之后，如上文所详述，对所述第一池(即，对第一PCR扩增的产物)进行第二PCR扩增产物，其将样品索引和第二测序适配体两者都添加至报告核酸分子。因此，对每个第一池进行单独的第二PCR扩增，即对所分析的每个样品进行单独的第二PCR。
在该实施方案中，使用包含含有样品索引序列和第二测序适配体两者的一个引物的引物对进行第二PCR扩增，使得所述样品索引序列和第二测序适配体两者同时添加至报告核酸分子。包含第二测序适配体和样品索引序列的引物在其5'末端具有第二测序适配体。样品索引序列位于第二测序适配体的下游，通常紧邻下游，使得其与第二测序适配体相邻，尽管不需要相邻。因此，第二PCR扩增的产物包含两个测序适配体(每个末端一个)和一个位于第二测序适配体内侧的样品索引。
第二PCR可以使用共同的第一引物和独特的第二引物，所述独特的第二引物在所分析的多个样品之间不同。换句话说，在所有样品中使用一个引物(相同的引物)来结合在第一PCR扩增中添加了第一测序适配体的报告核酸分子的末端。每个样品使用不同的第二引物，因为第二引物包含对每个样品独特的样品索引序列。
在第二PCR扩增之后，为每个样品产生的带索引的第一池它们本身被合并(即相互添加，或混合在一起)以形成第二池。所述第二池用于DNA测序。因此，可以进行单个DNA测序反应以鉴定为每个样品产生的报告核酸分子。添加至报告核酸分子的样品索引允许每个核酸分子追踪到其样品，使得其可以确定每个样品中存在哪些分析物。在DNA测序之前，优选地纯化第二PCR的扩增产物，以去除扩增反应中剩余的过量引物等。无论在所述方法中是分析一个样品还是多个样品，都可以进行该纯化步骤。如果正在分析多个样品，并且在测序之前合并第二PCR扩增的产物，则可以在合并之前或之后进行第二PCR产物的纯化。也就是说，可以对每个第一池进行第二PCR，将产物合并以产生第二池，然后在单个纯化反应中将第二池中的PCR产物一起纯化。可替代地，可以对每个第一池进行第二PCR，单独纯化每个第二PCR的产物，然后将第二PCR扩增的纯化产物合并。
如上所述，每个报告核酸分子包含至少一个条形码序列，其与特定分析物相关。因此，通过检测其条形码序列(通常通过测序)来检测每个特定的报告核酸分子。当本发明的第一方面的方法用于分析单个样品时，检测在多重检测测定中产生的所有报告核酸分子只需要检测它们的条形码。每个特定条形码的检测表明样品中存在其对应的分析物。当所述方法用于并行分析多个样品时，扩增后每个报告核酸分子包含条形码序列和样品索引两者。在该实施方案中，每个报告核酸分子的检测包括条形码序列和样品索引两者的检测：样品索引的检测表明报告核酸分子来自哪个样品，并且条形码的检测表明特定分析物的存在于那个样品中。因此，报告核酸分子检测能够鉴定所分析的每个样品中存在的分析物。
如上所述，用于本发明方法的测序通常通过大规模并行DNA测序进行。为此，将第二PCR扩增的纯化产物(或其等分试样)例如使用氢氧化钠变性，以获得单链DNA分子。如有必要，可以使用合适的缓冲液稀释变性的(单链的)DNA。合适的稀释缓冲液通常与DNA测序平台一起提供或由DNA测序平台的制造商提供。然后通过将其测序适配体与从支持物突出的互补序列杂交将变性的DNA加载到固体支持物(例如珠或流动池)上。一旦将DNA加载到固体支持物上，就可以使用所选方法进行DNA测序。
上述方法能够检测样品中的每种分析物。所述方法还允许比较每个样品的每个亚组中的分析物水平，即它允许比较所分析的每个特定样品等分试样中的分析物水平。在每个单独的等分试样内，所产生的每个不同报告核酸分子的水平与它们相应的分析物的水平成比例(例如，如果特定等分试样中存在的第一分析物的水平是第二等分试样的两倍，则产生的与第一分析物对应的报告核酸分子将是产生的与第二分析物对应的报告核酸分子的两倍。报告分子水平的这种差异将在报告分子的检测期间(例如在测序期间)被检测到，使得能够在样品中存在的分析物的相对量之间进行比较，但仅限于在同一等分试样中检测到的分析物。
如果可以比较样品中存在的所有分析物的相对量(即，如果可以在不同等分试样中检测到的分析物之间进行比较)，则这是有利的。如果可以比较不同样品中存在的分析物的相对量，则这是另一个优势。这可以通过包括每个等分试样的内部对照来实现。每个样品的每个等分试样中都包含相同的内部对照。取决于等分试样的稀释系数，内部对照以不同的浓度包含在样品的每个等分试样中。内部对照的浓度与等分试样的稀释系数成比例。因此，例如，如果在未稀释的样品等分试样中以特定给定浓度使用内部对照，则在1:10稀释样品等分试样中，内部对照以在未稀释样品中使用的浓度的十分之一浓度使用，等等。这使得能够直接比较等分试样之间的分析物的相对浓度，同时确保来自内部对照的信号不会淹没，也不会被来自等分试样中检测到的分析物的信号淹没，因为内部对照以适合于其中检测到的分析物的浓度存在于每个等分试样中。
内部对照是或导致对照报告核酸分子的产生。通过比较每个报告核酸分子与对照报告分子的量，可以比较在不同等分试样中分析的和/或来自不同样品的分析物的相对量。这是可实现的，因为每个报告核酸分子与对照报告分子之间的相对差异是可比较的。
例如，如果来自不同样品的两个不同报告核酸分子以与对照报告分子相同的相对水平(例如，少2或3倍或多2或3倍)存在，这表明由两个报告核酸分子指示的分析物在两个样品中以基本相同的浓度存在。类似地，如果特定报告核酸分子与对照报告分子的比率是来自不同样品的相同报告核酸分子与对照报告分子的比率的两倍(例如，如果报告分子以两倍于对照报告分子的水平存在于第一样品中，并且报告分子以与对照报告分子基本相同的水平存在于第二样品中)，这表明由特定报告核酸分子指示的分析物存在于第一样品中的水平是存在于第二样品中的水平的大约两倍。
有多种可以用作内部对照的备选方案。合适的对照可能取决于所使用的检测技术。对于任何检测测定，内部对照可以是加标分析物，即以确定的浓度分析的添加到每个等分试样中的对照分析物。将对照分析物在多重检测测定之前添加到等分试样中，并且以与样品中的其他分析物相同的方式在每个等分试样中检测。特别地，对照分析物的检测可以导致对对照分析物具有特异性的对照报告核酸分子的产生，如上所述。如果使用对照分析物，则对照分析物是不能存在于感兴趣的样品中的分析物。例如，其可以是人工分析物，或者如果样品来源于动物(例如人)，则对照分析物可以是来源于不同物种的生物分子，其不存在于感兴趣的动物中。特别地，对照分析物可以是非人蛋白质。示例性对照分析物包括荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和青色荧光蛋白(CFP)。
内部对照的另一个实例是双链DNA分子，其具有与多重检测测定中产生的报告核酸分子相同的一般结构。也就是说，所述DNA分子包含将其鉴定为对照报告核酸分子的条形码序列，以及与响应于分析物检测产生的所有其他报告核酸共享的共同引物结合位点，以使得能够结合在扩增反应中使用的引物。值得注意的是，对照DNA分子不包括测序适配体或样品索引—这些在它们被添加至响应于分析物检测产生的报告核酸分子的同时被添加至对照DNA分子中，如上所述(例如在PCR扩增中)。
以这种方式用作对照的双链DNA分子在本文中被称为检测对照，因为它不仅可用于基准分析物浓度(通过比较它们相对于对照的浓度，如上所述)，而且还提供在分析物检测期间产生的报告核酸分子被扩增、标记和检测(例如通过测序)的证明，如上所述。如果在分析(例如测序)报告核酸分子时未检测到检测对照，则这表明检测方法失败。例如，扩增步骤可能失败，或者测序反应可能失败。在进行多重检测测定之前，优选地将检测对照添加至每个等分试样。
在所述方法的特定实施方案中，对照分析物和检测对照两者都被添加到每个等分试样中。在这种情形中，很明显，对照分析物的条形码序列与检测对照的条形码序列不同，因此可以单独鉴定两个内部对照。
如上所述，优选的是多重检测测定是多重邻近延伸测定或多重邻近连接测定，最优选是多重邻近延伸测定。上面简要描述了这些。如上所述，这两种技术都依赖于使用邻近探针对。
本文中邻近探针被定义为包含对分析物具有特异性的分析物结合结构域和核酸结构域的实体。“对分析物具有特异性的”意指分析物结合结构域特异性地识别并结合特定的目标分析物，即其以比结合其他分析物或部分更高的亲和力结合其目标分析物。分析物结合结构域优选地是抗体，特别是单克隆抗体。包含抗原结合结构域的抗体片段或抗体衍生物也适合用作分析物结合结构域。此类抗体片段或衍生物的实例包括Fab、Fab'、F(ab’)2和scFv分子。
Fab片段由抗体的抗原结合结构域组成。可以看到单个抗体含有两个Fab片段，每个Fab片段由一条轻链及其连接的重链N末端部分组成。因此，Fab片段含有一条完整的轻链和与其结合的重链的VH和CH1结构域。可以通过用木瓜蛋白酶消化抗体来获得Fab片段。
F(ab’)2片段由抗体的两个Fab片段加上重链结构域的铰链区(包括将两个重链结构域连接在一起的二硫键)组成。换句话说，F(ab’)2片段可以看作两个共价连接的Fab片段。F(ab’)2片段可以通过用胃蛋白酶消化抗体来获得。F(ab’)2片段的还原产生两个Fab'片段，可以将其看作含有额外的巯基基团的Fab片段，所述额外的巯基基团可用于将片段与其他分子缀合。ScFv分子是通过将抗体轻链和重链的可变结构域融合在一起而产生的合成构建体。通常，这种融合是通过将抗体基因工程化以产生包含重链和轻链可变结构域两者的融合蛋白而重组实现的。
邻近探针的核酸结构域可以是DNA结构域或RNA结构域。优选地其是DNA结构域。每对中的邻近探针的核酸结构域通常被设计为与彼此杂交，或与一个或多个共同的寡核苷酸分子(一对的两个邻近探针的核酸结构域都可以与之杂交)杂交。因此，核酸结构域必须至少部分是单链的。在某些实施方案中，邻近探针的核酸结构域是完全单链的。在其他实施方案中，邻近探针的核酸结构域是部分单链的，包含单链部分和双链部分两者。
邻近探针通常成对提供，每个探针都对目标分析物具有特异性。如上所述，目标分析物可以是单个实体，特别是单个蛋白质。在该实施方案中，邻近对中的两个探针结合目标分析物(例如蛋白质)，但在不同的表位结合。表位不重叠，使得所述对中的一个探针与其表位的结合不会干扰或阻止所述对中的另一个探针与其表位的结合。可替代地，如上所述，目标分析物可以是复合物，例如蛋白质复合物，在这种情况下，所述对中的一个探针结合复合物的一个成员，而所述对中的另一个探针结合复合物的另一个成员。探针在与蛋白质相互作用位点(即，蛋白质中的它们彼此相互作用的位点)不同的位点结合复合物中的蛋白质。
如上所述，邻近探针是成对提供的，每个探针都对目标分析物具有特异性。这意味着在每个邻近探针对内，两个探针都包含对同一分析物具有特异性的分析物结合结构域。由于所使用的检测测定是多重测定，因此在每个检测测定中使用多个不同的探针对，每个探针对都对不同的分析物具有特异性。也就是说，每个不同探针对的分析物结合结构域对不同的目标分析物具有特异性。
每个邻近探针的核酸结构域的设计取决于使用探针的方法。图1中示意性地示出了邻近延伸测定形式的代表性样品，并且这些实施方案在下文中详细描述。通常，在邻近延伸测定中，在一对邻近探针与其目标分析物结合后，两个探针的核酸结构域彼此邻近并相互作用(即直接或间接地与彼此杂交)。诸两个核酸结构域之间的相互作用产生包含至少一个游离的3'末端的核酸双链体(即双链体内的至少一个核酸结构域具有可以延伸的3'末端)。在测定混合物中添加或激活核酸聚合酶会导致至少一个游离3'末端的延伸。因此，使用其配对的核酸结构域作为模板，双链体中的至少一个核酸结构域被延伸。获得的延伸产物是如本文所用的报告核酸分子，其包含指示存在由产生延伸产物的邻近探针对结合的分析物的条形码序列。
图1的版本1描绘了“传统的”邻近延伸测定，其中每个邻近探针的核酸结构域(显示为箭头)通过其5'末端连接到分析物结合结构域(显示为倒“Y”)，从而留下两个游离3'末端。当所述邻近探针与它们相应的分析物(图中未显示分析物)结合时，探针的核酸结构(其在它们的3'末端互补)能够通过杂交发生相互作用，即形成双链体。在测定混合物中添加或激活核酸聚合酶允许使用另一个邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸每个核酸结构域。如上文所详述，所得延伸产物是被检测的报告核酸分子，从而检测由探针对结合的分析物。
图1的版本2描绘了替代性邻近延伸测定，其中第一邻近探针的核酸结构域通过其5'末端连接到分析物结合结构域，并且第二邻近探针的核酸结构域通过其3'末端连接到分析物结合结构域。第二邻近探针的核酸结构域因此具有游离5'末端(显示为钝箭头)，其无法使用典型的核酸聚合酶(其仅延伸3'末端)进行延伸。第二邻近探针的3'末端被有效地“阻断”，即它不是“游离的”，并且它不能被延伸，因为它与分析物结合结构域缀合并因此被分析物结合结构域阻断。在该实施方案中，当邻近探针与分析物上它们相应的分析物结合目标结合时，在它们的3'末端共享互补区域的探针核酸结构域能够通过杂交发生相互作用，即形成双链体。然而，与版本1对比，使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板，只有第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以被延伸，产生延伸产物(即报告核酸分子)。
在图1的版本3中，与版本2一样，第一邻近探针的核酸结构域通过其5'末端连接到分析物结合结构域，并且第二邻近探针的核酸结构域通过其3'末端连接到分析物结合结构域。第二邻近探针的核酸结构域因此具有游离5'末端(显示为钝箭头)，其无法被延伸。然而，在该实施方案中，与相应邻近探针的分析物结合结构域连接的核酸结构域不具有互补性区域，因此不能直接形成双链体。相反，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域。该第三核酸分子充当核酸结构域之间的“分子桥”或“夹板(splint)”。这个“夹板”寡核苷酸桥接在核酸结构域之间的间隙，允许它们间接与彼此相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。
因此，当邻近探针与分析物上它们相应的分析物结合目标结合时，探针的核酸结构域各自通过与夹板寡核苷酸杂交相互作用，即形成双链体。因此可以看出，第三核酸分子或夹板可以被视为提供在邻近探针之一上的部分双链核酸结构域的第二链。例如，可以向邻近探针之一提供部分双链核酸结构域，其通过一条链的3'末端连接到分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离3'末端。因此，这样的核酸结构域具有一个带有游离3'末端的末端单链区。在该实施方案中，第一邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以使用“夹板寡核苷酸”(或其他核酸结构域的单链3'末端区域)作为模板进行延伸。可替代地或另外，可以使用第一邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸夹板寡核苷酸(即未连接的链，或3'单链区)的游离3'末端。
从以上描述中显而易见，在一个实施方案中，夹板寡核苷酸可以作为测定的单独组分提供。换句话说，其可以单独添加到反应混合物中(即单独添加到邻近探针中，以添加到含有分析物的样品中)。尽管如此，由于其与作为邻近探针一部分的核酸分子杂交，并且在与这种核酸分子接触时将会杂交，所以其可以仍被视为部分双链核酸结构域的链，尽管它是单独添加的。可替代地，夹板可以与邻近探针的核酸结构域之一预杂交，即在邻近探针与样品接触之前杂交。在该实施方案中，夹板寡核苷酸可以直接被视为邻近探针的核酸结构域的一部分，即其中所述核酸结构域是部分双链核酸分子，例如邻近探针可以通过以下方式来制备：将双链核酸分子与分析物结合结构域连接(优选地核酸结构域通过单链与分析物结合结构域缀合)并且修饰所述核酸分子以产生部分双链核酸结构域(具有能够与另一个邻近探针的核酸结构域杂交的单链突出端)。
因此，如本文所定义的邻近探针的核酸结构域的延伸也涵盖“夹板”寡核苷酸的延伸。有利地，当延伸产物起于夹板寡核苷酸的延伸时，所得的延伸核酸链仅通过核酸分子的两条链之间的相互作用(通过两条核酸链之间的杂交)与邻近探针对偶联。因此，在这些实施方案中，延伸产物可以使用变性条件(例如，增加温度、降低盐浓度等)从邻近探针对解离。
虽然图1的版本3中描绘的夹板寡核苷酸显示为与第二邻近探针的全长核酸结构域互补，但这仅是一个实例，并且这足够使夹板能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体，即在两个探针的核酸结构域之间形成桥。
在另一个实施方案中，夹板寡核苷酸可以作为第三邻近探针的核酸结构域提供，如WO2007/107743中所述，其通过引用并入本文，这表明这可以进一步改善邻近探针测定的灵敏度和特异性。
图1的版本4是版本1的修改，其中第一邻近探针的核酸结构域在其3'末端包含与第二邻近探针的核酸结构域不完全互补的序列。因此，当所述邻近探针与它们相应的分析物结合时，探针的核酸结构域能够通过杂交相互作用，即形成双链体，但第一邻近探针的核酸结构域的最3'末端(包含游离3'羟基基团的核酸分子部分)不能与第二邻近探针的核酸结构域杂交，因此以单链的未杂交的“副翼(flap)”存在。在添加或激活核酸聚合酶时，可以使用第一邻近探针的核酸结构域作为模板仅延伸第二邻近探针的核酸结构域。
图1的版本5可以看作是版本3的修改。然而，与版本3对比，两个邻近探针的核酸结构域通过它们的5'末端连接至它们相应的分析物结合结构域。在该实施方案中，核酸结构域的3'末端不互补，因此邻近探针的核酸结构域不能直接相互作用或形成双链体。相反，提供了第三核酸分子，其具有与每个邻近探针的核酸结构域同源的区域。该第三核酸分子充当核酸结构域之间的“分子桥”或“夹板(splint)”。这个“夹板”寡核苷酸桥接在核酸结构域之间的间隙，允许它们间接与彼此相互作用，即每个核酸结构域与夹板寡核苷酸形成双链体。因此，当邻近探针与它们相应的分析物结合时，探针的核酸结构域各自通过与夹板寡核苷酸杂交相互作用，即形成双链体。
根据版本3，因此可以看出，第三核酸分子或夹板可以被视为提供在邻近探针之一上的部分双链核酸结构域的第二链。在优选的实例中，可以向邻近探针之一提供部分双链核酸结构域，其通过一条链的5'末端连接到分析物结合结构域，并且其中另一条(未连接的)链具有游离3'末端。因此，这样的核酸结构域具有一个带有至少一个游离3'末端的末端单链区。在该实施方案中，第二邻近探针的核酸结构域(其具有游离3'末端)可以使用“夹板寡核苷酸”作为模板进行延伸。可替代地或另外，可以使用第二邻近探针的核酸结构域作为模板来延伸夹板寡核苷酸(即未连接的链，或第一邻近探针的3'单链区)的游离3'末端。
如上文结合版本3所讨论的，夹板寡核苷酸可以作为测定的单独组分提供。另一方面，由于其与作为邻近探针一部分的核酸分子杂交，并且在与这种核酸分子接触时将会杂交，因此其可以被视为部分双链核酸结构域的链，尽管它是单独添加的。可替代地，夹板可以与邻近探针的核酸结构域之一预杂交，即在邻近探针与样品接触之前杂交。在该实施方案中，夹板寡核苷酸可以直接被视为邻近探针的核酸结构域的一部分，即其中所述核酸结构域是部分双链核酸分子，例如邻近探针可以通过以下方式来制备：将双链核酸分子与分析物结合结构域连接(优选地核酸结构域通过单链与分析物结合结构域缀合)并且修饰所述核酸分子以产生部分双链核酸结构域(具有能够与另一个邻近探针的核酸结构域杂交的单链突出端)。
因此，如本文所定义的邻近探针的核酸结构域的延伸也涵盖“夹板”寡核苷酸的延伸。有利地，当延伸产物起于夹板寡核苷酸的延伸时，所得的延伸核酸链仅通过核酸分子的两条链之间的相互作用(通过两条核酸链之间的杂交)与邻近探针对偶联。因此，在这些实施方案中，延伸产物可以使用变性条件(例如，增加温度、降低盐浓度等)从邻近探针对解离。
虽然图1的版本5中描绘的夹板寡核苷酸显示为与第一邻近探针的全长核酸结构域互补，但这仅是一个实例，并且这足够使夹板能够与邻近探针的核酸结构域的末端(或在末端附近)形成双链体，即在邻近探针的核酸结构域之间形成桥。
在另一个实施方案中，夹板寡核苷酸可以作为第三邻近探针的核酸结构域提供，如WO2007/107743中所述，其通过引用并入本文，这表明这可以进一步改善邻近探针测定的灵敏度和特异性。
图1的版本6是本发明的最优选实施方案。如图所描绘，一对中的两个探针都与部分单链核酸分子缀合。一条短核酸链通过其5'末端与分析物结合结构域缀合。与分析物结合结构域缀合的短核酸链不与彼此杂交。相反，每条短核酸链都与较长的核酸链杂交，所述较长的核酸链在其3'末端具有单链突出端(也就是说，所述较长核酸链的3'末端延伸超过与分析物结合结构域缀合的较短链的5'末端。两条较长核酸链的突出端与彼此杂交，形成双链体。如果两个较长核酸分子的3'末端与彼此完全杂交，如图所示，则双链体包含两个游离3'末端，尽管较长核酸分子的3'末端可以如版本4那样设计，使得较长核酸分子之一的最3'末端与另一个不互补，形成一个副翼，这意味着双链体仅含有一个游离3'末端。可以将与彼此相互作用的两个较长核酸分子视为夹板寡核苷酸，因为它们一起在直接与分析物结合结构域缀合的两个短寡核苷酸之间形成桥。
核酸聚合酶的添加或激活导致夹板寡核苷酸的一个或多个游离3'末端的延伸。值得注意的是，任一夹板寡核苷酸的延伸使用另一个夹板寡核苷酸作为模板。因此，当一个夹板寡核苷酸被延伸时，另一个“模板”夹板寡核苷酸从与分析物结合结构域缀合的较短链中置换出来。
在优选的实施方案中，直接与分析物结合结构域缀合的短核酸链是“通用链”。也就是说，同一条链直接与多重检测测定中使用的每个邻近探针缀合。因此，每个夹板寡核苷酸包含“通用位点”和“独特位点”，“通用位点”由与通用链杂交的序列组成，“独特位点”包含对探针独特的条形码序列。此类邻近探针及其制造方法在WO 2017/068116中有所描述。
在所有邻近检测测定技术中，优选的是每个单独邻近探针的核酸结构域包含独特的条形码序列，其鉴定特定探针(如上文针对PEA版本6所述)。在这种情况下，报告核酸分子(其在邻近延伸测定的背景下是延伸产物)包含每个邻近探针的独特条形码序列。这两个独特的条形码序列因此一起形成报告核酸分子的条形码序列。换句话说，报告核酸分子条形码序列是或包含来自组合以产生报告核酸分子的邻近探针的两个探针条形码序列的组合。因此，通过检测两个探针条形码序列的特定组合来实现对特定报告核酸分子的检测。
当使用多重邻近延伸检测进行分析物检测时，优选的是使用另外的内部对照：延伸对照。延伸对照是包含与核酸结构域缀合的分析物结合结构域的单个探针，所述核酸结构域包含含有可以延伸的游离3'末端的双链体。延伸对照优选地具有基本上与在两个实验探针结合目标分析物时在两个实验探针之间形成的双链体等同的结构，除了其仅包含单个分析物结合结构域。延伸对照中使用的分析物结合结构域不能识别可能存在于感兴趣的样品中的分析物。合适的分析物结合结构域是可商购获得的多克隆同种型对照抗体，诸如山羊IgG、小鼠IgG、兔IgG等。
图2显示了可以在本发明中使用的延伸对照的实例。部分A-F分别对应于可以用于图1的PEA测定版本1-6中的延伸对照。延伸对照用于确认延伸步骤是否按预期发生。延伸对照的延伸产生包含独特条形码的报告核酸分子，使得其可以被鉴定为延伸对照报告核酸分子。当在本发明第一方面的方法中使用多重PEA时，优选的是对照分析物、延伸对照和检测对照全部用于测定中(即添加到每个等分试样中)。在其他实施方案中，仅使用内部对照中的两个，例如，对照分析物和延伸对照、对照分析物和检测对照、或延伸对照和检测对照。
如上文所详述，在邻近延伸测定中，报告核酸分子是通过使用另一个邻近探针的核酸结构域作为模板延伸一个或两个邻近探针的核酸结构域而产生的。在优选的实施方案中，在PCR扩增的背景下进行延伸反应，或者换句话说，进行包括PCR扩增的单个反应以实现以下两者：邻近探针核酸结构域的延伸，因而产生报告核酸分子，以及所产生的报告核酸分子的扩增，包括将第一测序适配体添加至报告分子。在该实施方案中，反应不是从变性步骤开始(如PCR中通常的情况)，而是从延伸步骤开始，在此期间产生报告核酸分子。此后，从报告分子的变性开始，进行标准PCR以扩增报告核酸分子。如上文所详述，使用与报告核酸分子末端的共同序列结合的共同引物进行PCR，并且引物之一包含测序适配体。可替代地，可以使用均包含测序适配体的引物进行PCR，以便在一次尝试中将测序适配体添加至报告核酸分子的每个末端，如上文所详述。
可能希望在样品中检测比可用的不同报告核酸条形码序列更多的分析物。在这种情况下，可以使用多个小组(即至少2个小组)的邻近探针对。每个小组包括不同组的邻近探针对。也就是说，每个小组中的邻近探针对结合不同组的分析物。通常，每个小组中的邻近探针对结合完全不同组的分析物，即由不同小组中的邻近探针对结合的分析物没有重叠。因此可以看出，邻近探针的每个小组用于检测不同组的分析物。
如上所述，邻近探针的每个小组包含不同组的邻近探针对。在每个单独的小组中，每个探针包含不同的核酸结构域(即每个探针包含具有不同序列的核酸结构域)。因此，每个探针对都包含不同对的核酸结构域，因此针对小组内的每个探针对产生独特的报告核酸分子。然而，在每个不同小组中的探针对中使用相同的核酸结构域(并且通常相同的核酸结构域配对)。也就是说，在不同小组中，探针对包含相同对的核酸结构域。这意味着在每个小组中产生相同的报告核酸分子。然而，因为报告核酸分子由每个小组使用不同的探针对产生，所以相同的报告核酸分子表示在每个探针小组中存在不同的分析物。
由于由每个小组的探针产生相同的报告核酸分子，因此必须为使用每个探针小组的多重检测测定提供单独的样品等分试样。也就是说，使用每个探针小组进行多重检测测定，并且在样品的不同等分试样中进行使用不同探针小组的多重检测测定。如上文针对单个探针小组所详述的，对于每个探针小组，以不同稀释因子提供多个样品等分试样，并且在每个等分试样中检测来自每个小组的不同分析物亚组。如上文所详述，在每个等分试样中检测到的分析物亚组是基于它们在样品中的预测浓度确定的。
将使用每个单独的探针小组产生的报告核酸分子进行处理(即扩增并可能用测序适配体等标记)并如上文所详述进行检测。在特定实施方案中，报告核酸分子通过PCR扩增，将测序适配体添加至报告核酸分子的两个末端，并且将样品索引添加至每个报告核酸分子，如上文所详述。在该实施方案中，优选的是，如上所述，在每个等分试样中进行单独的第一PCR，从而扩增报告核酸分子并将第一测序适配体添加至报告核酸分子的一个末端。此后，如上所述，合并利用特定探针小组产生的来自每个样品的扩增报告核酸分子，从而产生多个单独的第一池。每个单独的第一池包含用特定探针小组测定的、特定样品的所有等分试样的第一PCR扩增的产物。
然后在每个单独的第一池中进行第二PCR扩增，其中将第二测序适配体和样品索引添加至每个报告核酸分子。在第二PCR之后，从不同样品产生但使用相同探针小组的PCR产物它们本身被合并到第二池(称为小组池)中。有可能将每个第一池的全部组合以产生小组池，或者可替换地，可以仅组合每个第一池的一部分。因此，每个小组池包含用特定探针小组从所有测定样品产生的报告核酸分子。
然后如上所述对包含测序适配体和样品索引的扩增报告核酸分子进行测序。单独测序每个小组池。这是因为，如上所述，为每个探针小组产生相同的报告核酸分子，但在每个探针小组中表示不同的分析物。不可能在序列水平上区分使用不同探针小组产生因而表示不同的分析物的相同报告核酸分子。因此，在该实施方案中，单独测序每个小组池是必要的。
在所述方法的另一个实施方案中，在PCR扩增之一期间将小组索引序列添加至报告核酸分子。相同的小组索引序列将用于鉴定使用特定邻近探针小组产生的所有报告核酸分子(跨越所有样品)。小组索引和样品索引的组合使得能够在检测测定中使用的所有探针小组中准确鉴定每个样品中存在哪些分析物。因此，一旦将小组索引和样品索引两者都添加至每个报告核酸分子，在所有样品和探针小组中在检测测定中产生的所有PCR产物就可以合并在一起并测序。
可替代地，可以使用不同的样品索引来标记使用每个探针小组产生的报告核酸分子。对每个不同的样品使用样品索引序列的不同选择，使得所使用的每个样品索引都对特定样品具有特异性。然而，对于任何给定样品，使用每个不同的探针小组产生的报告核酸分子都用不同的样品索引进行标记。在该实施方案中，样品索引因此具有双重功能，从而鉴定每个报告核酸分子的样品和探针小组两者。报告核酸分子中存在的特定样品索引因此将该报告分子与特定探针小组联系起来，并且样品索引和报告核酸分子的条形码序列的组合用于鉴定导致产生所讨论的报告核酸分子的分析物。
在所述方法的另一个实施方案中，如上所述，在每个探针小组中，探针中使用相同的核酸结构域。然而，核酸结构域在每个小组中配对不同，使得每个小组产生不同的报告核酸分子。如上所述，每个探针的核酸结构域包含独特的条形码序列。通过在每个小组中不同地配对核酸结构域，条形码序列的不同组合在检测测定中产生的报告核酸分子中配对，这意味着为每个小组产生不同的报告核酸分子。该方法的优点是由每个探针小组产生不同的报告核酸分子，因此可以在序列水平上进行区分，而无需任何小组索引序列。在该实施方案中，如上文所详述合并来自每个样品的所有PCR产物，并且添加样品索引，并且将来自所有样品和探针小组的所有带索引的PCR产物然后组合在单个池中，该池被测序。
如上所述，该实施方案的优点是来自所有样品和小组的所有报告核酸分子可以合并在一起并测序，而无需小组索引来鉴定哪些报告核酸分子来源于每个小组。然而，对于每个小组使用具有相同核酸结构域对的探针对以使得由每个小组产生相同的报告核酸分子的优势在于，由于两个未配对核酸分子的杂交而产生的任何核酸分子可以被鉴定为非特异性背景。如果使用每个探针小组产生不同的报告核酸分子，则不再可能准确地确定哪些所产生的核酸分子是背景。
如上所述，在第二方面，本发明提供了一种检测样品中的分析物的方法，其中所述分析物通过检测对分析物具有特异性的报告核酸分子来检测，所述方法包括进行PCR反应以产生报告核酸分子的PCR产物并检测所述PCR产物；
其中为所述PCR反应提供内部对照，所述内部对照为：
(i)以预定量存在的单独组分，并且其是或包含对照核酸分子或导致对照核酸分子的产生，所述对照核酸分子通过与报告核酸分子相同的引物被扩增；或
(ii)在每个报告核酸分子中存在的独特分子标识符(UMI)序列，其对于每个分子是独特的。
本发明的第二方面的所有细节可以与第一方面相同(例如，分析物、样品、报告核酸分子和用于产生其的技术、报告核酸分子的检测等)。
在该第二方面中，内部对照是存在于为产生报告核酸分子的PCR产物而进行的PCR中的组分或序列。如上所述，内部对照可以是以预定量存在的单独组分，并且其是或包含对照核酸分子或导致对照核酸分子的产生，所述对照核酸分子通过与报告核酸分子相同的引物被扩增。
当内部对照是以预定量存在于反应中的单独组分时，内部对照具体地可以是对照分析物、延伸对照或检测对照，如上所述。如上文所详述，对照分析物是添加到样品中并通过检测特异于对照分析物的对照报告核酸分子来检测的分析物。
在本发明第二方面的方法中，优选地使用邻近探针检测分析物，例如在如上文所详述的PEA或PLA(最优选地PEA)中。因此，当对照分析物用作内部对照时，必须包括用于检测对照分析物的邻近探针。对照特异性邻近探针与对照分析物的结合导致对照报告核酸分子的产生。
如前所述，可以使用延伸对照。如上文所详述，延伸对照是单个对照探针，在PEA的延伸阶段从其产生对照报告核酸分子。
一般来说，内部对照可以是一个或多个分子，所述一个或多个分子被添加到样品中并导致产生对照报告核酸分子，所述对照报告核酸分子然后在PCR反应中进行扩增。
还如前所述，可以使用检测对照。如上文所详述，检测对照是添加到样品中并在PCR反应中扩增的对照报告核酸分子。检测对照是具有与响应于分析物的存在而产生的报告核酸分子相同的一般结构的双链DNA分子。对于本发明的第一方面，优选的是对照分析物、延伸对照和检测对照全部用于所述方法中。在特定的实施方案中，可以使用两种类型的内部对照，其选项如上所述。
如上文所详述，对照分析物、延伸对照和检测对照中的全部都导致产生对照报告核酸分子或是对照报告核酸分子。在本发明的特定实施方案中，对照报告核酸分子具有的序列是响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列。值得注意的是，对照报告核酸分子具有响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列，而不是反向互补序列。由于对照报告核酸分子仅具有响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列，因此对照报告核酸分子不能与所讨论的报告核酸分子杂交。这允许维持对照报告核酸分子与响应于分析物的检测而产生的反向序列报告核酸分子之间的最大相似性水平，这有利于PCR扩增，同时避免对照报告核酸分子与响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子之间的不想要的杂交相互作用。在本发明第一方面的方法中也优选地使用对照报告核酸分子，该对照报告核酸分子具有的序列是响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列。
如上所述，优选的是本发明的这一方面的方法使用对照分析物、延伸对照和检测对照作为内部对照。为了使这三个对照一起发挥作用，显然由所述对照产生/提供的对照报告核酸分子必须彼此可区分，即必须全部都具有不同的序列。优选地，本发明方法中使用的每个对照报告核酸分子都具有如下序列，所述序列是响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列。在这种情况下，显然每个对照报告核酸分子都具有响应于分析物的检测而产生的不同报告核酸分子的反向序列。
代替扩增反应的单独组分，内部对照可替代地可以是存在于每个报告核酸分子中的独特分子标识符(UMI)序列，其对于每个分子都是独特的。这意味着在分析物检测期间产生的每个单独的报告核酸分子都包含UMI序列。更具体地，应理解每个单独的报告核酸分子将具有不同的UMI。UMI将附加到任何序列，例如条形码，其作为检测或鉴定分析物的手段而存在于报告核酸分子中。如上文所详述，优选的是根据本发明的第二方面的方法通过邻近延伸测定来检测分析物。上文描述了PEA，包括可以用于它的探针。如上所详述，使用一对邻近探针检测分析物，每个邻近探针都结合分析物。一对中的两个探针都包含核酸结构域，其包含对由探针识别的分析物具有特异性的条形码序列。
通常在执行PEA时，将用于每种待检测的分析物的多个相同的探针对应用于样品。“相同的”探针对意指多个探针对全部都包含相同的分析物结合分子对和相同的核酸结构域对，使得结合目标分析物的每个相同的探针对导致产生相同的报告核酸分子，其指示样品中该分析物的存在。
当使用UMI序列作为内部对照时，用于检测每种特定分析物的探针并不相同。虽然使用了一对特定的分析物结合分子，但每个单独的探针或包含该对中的两个分析物结合分子中的特定一个分析物结合分子的至少每个单独的探针都包含不同的、独特的核酸结构域。每个核酸结构域都因其中存在UMI序列而变得独特。这意味着与特定分析物分子结合的每对具体的探针都会导致产生独特的报告核酸分子。为由邻近探针对结合的每个单独的分析物分子产生独特的报告核酸分子。这允许对样品中存在的分析物的量进行绝对定量，因为检测到的分析物分子的精确数量可以基于为该特定分析物产生的独特报告核酸分子的数量来计数。
除了允许定量外，通过允许向后对检测测定中产生的报告核酸分子的数量进行计数，UMI可能是有利的，因为它们增加了读数的分辨率。UMI允许其看到报告核酸分子(例如PEA的延伸产物)被扩增了多少次。因此，可以检测同一分析物的报告分子的UMI水平差异。例如，同一分析物的每个单独的报告核酸分子可能具有相同的条形码序列，但不同的UMI。通过检测不同UMI水平的这些差异，可以检测和解释PCR反应中任何可能的偏差。
改进的分辨率在对照核酸分子的背景下也可能有用或有益。因此，可替代地或另外地可以将UMI包括在对照核酸分子中。因此，在添加到每个单独的对照报告核酸分子(例如，如上文所讨论的检测对照分子)的意义上，可以包括UMI(应理解，每个单独的对照核酸分子将具有不同的UMI)。可替代地，对于不同的IC对照格式(例如延伸对照或对照分析物)，可以酌情包括UMI，使得将它们包括在产生的对照报告核酸分子中。例如，可以将UMI包括在充当延伸反应模板的延伸对照的核酸结构域中的核酸序列内，或被包括在充当延伸反应引物的结构域部分中的序列中。类似地，在对照分析物的情况下，可以将UMI以使其掺入对照报告核酸中的方式包括在用于检测对照分析物的邻近探针的一个或两个核酸结构域中。
如果将UMI包括在对照核酸中，则它们可以用于增加归一化的分辨率。例如，它们允许解释任何PCR偏差，如上文所讨论。这可以允许将非常严格的值用于归一化。因此，UMI可以用作改进或确保数据质量的工具。
在一个示例性实施方案中，对照报告核酸分子包含作为响应于分析物的检测而产生的报告核酸分子的反向序列的序列和UMI。
UMI序列也可以用于本发明第一方面的方法中使用的邻近探针。
本发明第二方面的方法可以应用于检测同一样品中的多种分析物(实际上这是优选的)。如上文所详述，可以在多重检测测定中检测多种分析物。基于对该分析物具有特异性的报告核酸分子的检测来检测每种不同的分析物。如上文所详述，尽管针对每种不同分析物的报告核酸具有独特的条形码序列，从而提供针对分析物的特异性，但优选的是所有报告核酸都包含共同的引物结合位点，使得可以使用相同的引物来扩增单个PCR中的所有报告核酸分子。报告核酸分子的PCR扩增可以包括将至少一个(即，一个或两个)测序适配体添加到报告核酸分子的末端，如上文所详述。
如上文所详述，当检测到同一样品中的多种分析物时，根据样品中分析物的预测丰度，可以在样品的不同等分试样中检测到分析物的不同亚组，如上文所详述。在该实施方案中，对每个等分试样进行单独的PCR。如上文所详述，随后可以合并PCR产物。
本发明第二方面的方法还可以用于检测多个样品中的一种分析物或多种分析物。在该实施方案中，进行单独的PCR以扩增从每个样品产生的报告核酸分子。在每个样品的单独等分试样中检测到分析物的不同亚组的情况下，对每个样品的每个等分试样进行单独的PCR。将相同的引物用于扩增为所有样品中的所有分析物产生的报告核酸分子。
在针对多个不同样品和/或多个不同样品等分试样进行多个单独PCR扩增的情况下，当内部对照是在PCR混合物中存在的单独组分时，该组分存在于每个等分试样中浓度与等分试样的稀释因子成比例，如上所述。虽然内部对照的浓度在不同稀释因子的等分试样之间变化，但在来自不同样品的相同稀释因子的等分试样中内部对照的浓度是相同的(在本发明的第一方面也是如此)。这使得能够比较每个样品/等分试样中存在的每种分析物的相对量，如上文所详述。
优选的是在本发明第二方面的方法中，PCR反应运行至饱和。PCR反应的饱和如上所述。当所述方法用于检测一个或多个样品中不同丰度水平的多种分析物时，这是特别有利的，其中对每个样品的多个等分试样进行检测测定，在每个等分试样中检测分析物的亚组，如上所述。将PCR运行至饱和以及使用PCR混合物的单独组分作为内部对照的组合是本发明特别优选的实施方案。如上文所详述，将PCR运行至饱和允许去除在不同样品等分试样之间的报告核酸分子浓度的差异：一旦达到饱和，则基本上相同的报告核酸分子总浓度将存在于每个反应中。在反应中包含内部对照确保比较在不同等分试样或不同样品中检测到的分析物的相对水平的能力得以保留。
如上所述，特别优选的是在本发明的第二方面中，使用分析物特异性探针检测一种或多种分析物。当此类探针用于分析物检测时，通常在将探针添加到样品之前或在将探针添加到样品的同时将内部对照(如果是PCR混合物的单独组分)添加到样品中。可替代地，如上所述，内部对照可以构成每个探针中存在的UMI序列。
优选地，一种或多种分析物通过邻近测定(例如PEA或PLA，特别是PEA)检测，所述邻近测定产生对每种分析物具有特异性的报告核酸分子。在该实施方案中，优选的是至少包括延伸对照。如上所述，最优选的是对照分析物、延伸对照和检测对照全部都包括在内。
在本发明第二方面的优选实施方案中，所述方法用于检测样品中的多种分析物，其中分析物在样品中具有不同水平的丰度，并且所述方法包括：
(i)提供来自所述样品的多个等分试样；和
(ii)在每个等分试样中，通过对每个等分试样进行单独的多重测定来检测分析物的亚组，其中每个亚组中的分析物基于它们在所述样品中的预测丰度来选择，并且
其中每个等分试样包含至少一个内部对照。
该实施方案的所有部分可以如上文关于本发明的第一方面所定义。内部对照可以是如上文所定义的任何内部对照。
如上所述，在多个等分试样中检测到分析物的亚组，所述等分试样相对于原始样品具有不同的稀释因子的情况下，添加不同量的内部对照。添加到每个等分试样中的内部对照的量通过在该等分试样中检测到的分析物亚组的预测丰度来确定。如上文所详述，这实际上意味着在每个等分试样中使用的内部对照的量与等分试样的稀释因子成比例。
优选的是通过DNA测序检测在本发明第二方面的方法中产生的报告核酸分子(或更准确地说，由报告核酸分子扩增产生的PCR产物)。最优选地，使用大规模并行DNA测序，如上文所详述。
本发明的第三方面提供了一种检测样品中的分析物的方法，其中所述分析物通过检测分析物的报告核酸分子来检测，所述方法包括进行PCR反应以产生报告核酸分子的PCR产物和检测所述PCR产物，其中在所述PCR反应中包括内部对照，并且所述内部对照以预定的量存在并且是或包含对照核酸分子或导致对照核酸分子的产生，其中所述对照核酸分子包含作为报告核酸分子的反向序列的序列。
本发明的第三方面的所有特征可以如关于本发明的第一和/或第二方面所描述。
参考以下非限制性实施例和附图可以进一步理解本发明。
附图说明
图1示出了六种不同版本的邻近延伸测定的示意性图示，如上文所详述。倒“Y”形状代表抗体，作为示例性邻近探针分析物结合结构域。
图2示出了可以用于邻近延伸测定的延伸对照的实例的示意性图示。部分A-F分别示出了用于图1的版本1-6的延伸对照。在部分B-E中，用于图1的版本2-5的不同的可能延伸对照分别显示在选项(i)和(ii)中。图1的图例也适用于图2。
图3示出了在一个血浆样品中进行367个测定的在Log10刻度上的结果计数(正确配对的条形码)。在将样品与包含所有367个测定的探针池接触和将样品与分成四个丰度块的同一组探针接触之间进行比较。与不使用丰度块时计数较低的测定相比，在A和B块中的测定的计数显著增加，从而允许对应测定的更高检测。与不使用丰度块时计数较高的测定相比，D块的计数相应地减少，从而减轻了流动池空间的损失。
图4示出了在一个血浆样品中进行367个测定的在线性刻度上的结果计数(正确配对的条形码)。在将样品与包含所有367个测定的探针池接触和将样品与分成四个丰度块的同一组探针接触之间进行比较。与不使用丰度块时计数较低的测定相比，在A和B块中的测定的计数显著增加，从而允许对应测定的更高检测。与不使用丰度块时计数较高的测定相比，D块的计数相应地减少，从而减轻了流动池空间的损失。
图5示出了在与分为四个丰度块并按块内的中值排序的372个测定的探针池接触的54个血浆样品中的结果的箱式图。丰度块允许检测在样品之间的宽范围的蛋白质丰度而不牺牲检测或者冒在样品之间具有高变异性的测定的较低范围低于稳健的计数检测的风险。虚线表示100个计数作为足够计数检测的阈值。
实施例
实施例1示例性实验协议
步骤1-样品制备和孵育
在96孔或384孔孵育板中将来自48至96个血浆样品中的每个样品的16个等分试样与至多16个邻近探针池(四个384个探针对小组中的每个小组的四个丰度块)中的每个邻近探针池一起孵育。
Figure BDA0003942296460000281
对于包含需要它的测定的那些探针池，样品可以按1:10、1:100、1:1000和1:2000进行预稀释。
Figure BDA0003942296460000282
可以手动或通过移液机器人(例如LabTech的
Figure BDA0003942296460000283
HTS)将血浆样品稀释并分配到孵育溶液中。将孵育溶液分配到板的各个孔中。
Figure BDA0003942296460000284
将1μl样品添加到每个孔底部的3μl孵育混合物中，用粘性膜密封板，以400x g在室温下旋转1分钟并在4℃下孵育过夜。
Figure BDA0003942296460000285
如果使用上述移液机器人，体积可能会减少到0.2μl样品和0.6μl孵育混合物(减少5倍)。
下表给出了示例性的试剂配制品。可以包括其他组分，例如探针溶液中的其他阻断剂。
表1样品稀释剂和阴性对照溶液
组分 浓度
NaCl 8.01g/l
KCl 0.2g/l
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.44g/l
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g/l
BSA 1g/l
表2孵育混合物
4μl孵育体积 0.8μl孵育体积
试剂 体积(μl) 体积(μl)
孵育溶液 2.40 0.48
正向探针溶液 0.30 0.06
反向探针溶液 0.30 0.06
样品 1.00 0.20
总计 4.0 0.8
表3孵育溶液
组分 浓度
Triton X-100 1.70g/l
NaCl 8.01g/l
KCl 0.2g/l
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.44g/l
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g/l
EDTA钠盐 1.24g/l
BSA 8.80g/l
阻断探针混合物 0.199g/l
GFP 1-5pM
表4正向探针溶液
Figure BDA0003942296460000291
Figure BDA0003942296460000301
表5反向探针溶液
组分 浓度
NaCl 8.01g/l
KCl 0.2g/l
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 1.44g/l
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.2g/l
EDTA钠盐 1.24g/l
Triton X-100 1g/l
BSA 1g/l
探针 每个探针1-100nM
检测对照 6.4-1188fM
延伸对照 75-10686fM
步骤2-邻近延伸和PCR1扩增
使用Pwo DNA聚合酶进行延伸和扩增。使用通用引物进行PCR1，以扩增所有延伸产物。
将孵育板(来自步骤1)置于室温并以400x g离心1分钟。将延伸混合物(包含超纯水、DMSO、Pwo DNA聚合酶和PCR1溶液)添加到板中，然后将板密封，短暂涡旋并以400x g离心1分钟，然后置于热循环仪中进行PEA反应和预扩增(50℃ 20分钟，95℃ 5分钟，(95℃ 30秒、54℃ 1分钟、60℃ 1分钟)x 25个循环，10℃保持)。优选地，可以使用分配机器人将延伸混合物分配到板中，所述分配机器人例如Thermo ScientificTM MultidropTM Combi试剂分配器。正向通用引物包含Illumina P5测序适配体序列(SEQ ID NO:1)。
表6 PCR1反应混合物
4μl孵育体积 0.8μl孵育体积
试剂 体积(μl) 体积(μl)
MilliQ水 75.0 15.00
DMSO(100％) 10.0 2.00
PCR1溶液 10.0 2.0
DNA聚合酶(1-10U/μl) 1.0 0.2
孵育混合物 4.0 0.8
总计 100.0 20.0
表7 PCR1溶液
Figure BDA0003942296460000302
Figure BDA0003942296460000311
步骤3-合并丰度块
将来自384个探针对小组的四个丰度块中的每个丰度块的PCR1产物合并在一起。这导致每个样品有至多四个PCR1池，每个384个探针对小组一个。
可以从每个块中取出不同的体积，以平衡在块之间的相对测定水平。PCR1产物的合并可以手动进行或通过移液机器人进行。
步骤4-PCR2索引
提供含有48至96个反向引物的引物板(一般在96孔板的每个孔中一个引物)。每个反向引物包含“Illumina P7”测序适配体序列(SEQ ID NO:2)和样品索引条形码。对于来自每个不同样品的PCR1产物使用一个独特的条形码序列。优选地，包含相同血浆样品的至多四个PCR1池(每个384个探针对小组一个)中的每个池接收相同的样品索引，以便于鉴定和数据处理。在PCR2溶液中提供了包含“Illumina P5”测序适配体序列的正向通用引物(与PCR1中使用的正向引物相同)。
每个PCR1池都与PCR2溶液接触，所述PCR2溶液含有正向通用引物、来自引物板的单个反向(样品索引)引物和DNA聚合酶(Taq或Pwo DNA聚合酶)。通过PCR进行扩增，直到引物耗尽(95℃ 3分钟，(95℃ 30秒，68℃ 1分钟)x 10个循环，10℃保持)。
合并PCR1产物的理论终浓度为1μM(所有引物均使用)。给定每个PCR2反应中的起始浓度为50nM，将PCR1扩增子按1:20稀释度稀释用于PCR2。每个PCR2引物的浓度为500nM。因此，PCR2引物耗尽应发生在3.3个循环(10倍扩增)之后。
表8 PCR2反应混合物
试剂 体积(μl)
MilliQ水 14.96
PCR2溶液 2.0
DNA聚合酶(1-10U/μl) 0.04
样品索引引物溶液 2.0
合并的PCR1反应 1.0
总计 20.0
表9 PCR2溶液
组分 浓度
Tris碱 168.40mM
Tris-HCl 31.47mM
MgCl<sub>2</sub>六水合物 10.00mM
dATP 2.00mM
dCTP 2.00mM
dGTP 2.00mM
dTTP 2.00mM
正向“P5”引物 5.00μM
表10样品索引引物溶液
组分 浓度
Tris碱 1.948mM
Tris-HCl 8.052mM
EDTA 1mM
样品索引“P7”引物 5.00μM
步骤5-终末池
将属于同一个384个探针对小组的所有48至96个带索引的样品池合并在一起，从每个样品中添加相同的体积。这产生至多四个最终池(或文库)，每个384个探针对小组一个。
步骤6-纯化和定量(可选)
使用磁珠单独纯化文库，并且使用qPCR和DNA标准曲线确定纯化文库的总DNA浓度。可以根据制造商的方案使用优先结合较长的DNA片段的AMPure XP珠(BeckmanCoulter，美国)。AMPure XP珠结合长PCR产物，但不结合短引物，从而能够从任何剩余的引物中纯化PCR产物。
PCR2引物的耗尽意味着这个纯化步骤可能不是必需的。
步骤7-质量控制(可选)
根据制造商的说明，在Agilent生物分析仪(Agilent，美国)上分析每个(纯化的)文库的小等分试样，以确认成功的DNA扩增。
步骤8-测序
文库使用Illumina平台(例如NoveSeq平台)进行测序。所述至多四个文库(来自每个384个探针对小组)中的每个文库在流动池的单独“通道”中运行。根据所使用的流动池和测序仪的大小和型号，所述至多四个文库可以在不同的流动池中并行或依次(一个接一个)进行测序。
步骤9–数据输出
根据已知的条形码-测定-样品密钥在数据中鉴定、计数、求和并比对/标记条形码(来自每个报告核酸分子)和样品索引(来自样品索引引物)序列。
Figure BDA0003942296460000331
“匹配条形码”代表两个配对的PEA探针之间的相互作用。所述计数是相对于PEA中的相互作用的数量。
Figure BDA0003942296460000332
必须使用内部参考对照对每个测定和样品的计数进行归一化，以便能够在样品之间进行比较。
Figure BDA0003942296460000333
四个丰度块中的每个丰度块都具有其自身的内部参考对照。
每个384个探针对小组根据其读取的通道进行分离。每个小组包含相同的96个样品索引和相同的384个条形码组合和内部参考对照。
实施例2带和不带丰度块的PEA
在血浆样品中(使用包含与具有上文版本6中所述的结构的核酸结构域缀合的抗体的探针)进行多重PEA以检测367种蛋白质。每个探针包含一个独特的条形码序列。将包含所有367个测定的邻近探针池与样品一起孵育，并且作为比较，在96孔或384孔孵育板中将来自每个血浆样品的4个等分试样与4个邻近探针池(包含367个测定的四个丰度块)一起孵育。
如上所述进行PEA，除了对于没有丰度块的邻近探针池省略了步骤3。在延伸产物的扩增期间，连同来自每个不同样品的报告核酸的独特样品索引，P5和P7测序适配体被添加到产物的每个末端，并且采用使用Illumina NovaSeq平台的可逆染料终止子测序技术，将所有延伸产物通过大规模并行DNA测序进行测序。由具有367个测定的探针池产生的延伸产物和由总计367个测定的合并丰度块产生的延伸产物在单独的流动池中在单独的时间进行测序。
可以在图3和图4中看到血浆样品之一的结果。下表显示了在同一血浆样品中使用和不使用丰度模块的最高测定(计数)与最低测定(计数)之间的比率。丰度块中的比率显著低于367个测定的完整池的比率，这意味着这些测定的读数以更优化的方式使用流动池空间(低丰度测定有更多计数，高丰度测定有更少计数)。
Figure BDA0003942296460000334
实施例3对具有不同丰度的测定的样品进行具有丰度块的PEA
在54个血浆样品中(使用包含与具有上文版本6中所述的结构的核酸结构域缀合的抗体的探针)进行多重PEA以检测372种蛋白质。每个探针包含一个独特的条形码序列。在96孔或384孔孵育板中将来自每个血浆样品的4个等分试样与4个邻近探针池(包含372个测定的四个丰度块)一起孵育。
如上所述进行PEA。在延伸产物的扩增期间，连同来自每个不同样品的报告核酸的独特样品索引，P5和P7测序适配体被添加到产物的每个末端，并且采用使用IlluminaNovaSeq平台的可逆染料终止子测序技术，将所有延伸产物通过大规模并行DNA测序进行测序。
图5中的结果表明，可以在样品中检测到具有宽丰度范围的蛋白质目标，而不会因为信号降低而牺牲样品中较低范围的具有高变异性的蛋白质或在所有54个样品中丰度相对较低的测定(计数低于稳健的量，例如100个计数)。
SEQUENCE LISTING
<110> 欧凌科蛋白质公司
<120> 用于检测不同丰度的分析物的方法
<130> P22116654WP
<150> GB2004484.8
<151> 2020-03-27
<150> GB2004472.3
<151> 2020-03-27
<150> GB2004474.9
<151> 2020-03-27
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P5适配体
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P7适配体
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agat 24

Claims (23)

1.一种检测样品中的多种分析物的方法，其中所述分析物在所述样品中具有不同水平的丰度，所述方法包括：
(i)提供来自所述样品的多个等分试样；和
(ii)在每个等分试样中，通过对每个等分试样进行单独的多重测定来检测不同亚组的分析物，其中每个亚组中的所述分析物基于它们在所述样品中的预测丰度来选择。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物是非核酸分析物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分析物是或包含蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在每个等分试样中，通过检测对每种分析物具有特异性的报告核酸分子来检测所述分析物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述报告核酸分子是在对每个等分试样进行的多重检测测定中产生的。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述报告核酸分子通过PCR进行扩增，并且优选地通过核酸测序进行检测。
7.如权利要求6所述的方法，其中在一个或多个扩增和/或连接步骤中将一个或多个用于测序的适配体添加至所述报告核酸分子。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中对所述报告核酸分子进行至少第一PCR反应，以添加至少第一适配体用于核酸测序。
9.如权利要求8所述的方法，其中来自所述第一PCR反应的PCR产物经受第二PCR反应以添加第二适配体用于核酸测序。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中至少一个PCR反应运行至饱和。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将所述单独的多重测定的反应产物或在所述反应产物是核酸分子的情况下其扩增产物合并以形成第一池，并在所述第一池中进行扩增。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述多重测定的反应产物是报告核酸分子，并且所述方法包括：
对每个单独的等分试样单独进行的第一PCR反应中扩增所述报告核酸分子以产生第一PCR产物，合并来自单个等分试样的所述第一PCR产物以形成第一池，并对所述第一池进行第二PCR反应。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中将不同量的所述反应产物或其扩增产物添加至所述第一池。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述方法单独对多个不同的样品并行地进行，以产生每个样品的反应产物或其扩增产物，并且其中对于每个样品形成单独的第一池，并且通过扩增和/或连接反应将样品索引添加至所述第一池中的所述产物。
15.如权利要求14所述的方法，其中为每个样品形成的所述单独的第一池包含第一PCR产物，并且其中在对每个样品的所述第一池进行的第二PCR反应中将样品索引添加至所述第一PCR产物。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中将为每个样品产生的带索引的第一池合并在一起以形成用于执行核酸测序的第二池。
17.如权利要求6至16中任一项所述的方法，其中所述PCR反应包括用于每个等分试样的内部对照。
18.如权利要求4至17中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子在邻近探针检测测定、特别是邻近延伸测定(PEA)中产生。
19.如权利要求4至16中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子包含至少一个条形码序列，并且所述报告核酸分子的检测包括检测所述至少一个条形码序列，任选地结合样品索引，
优选地其中所述报告核酸分子包含来自一对邻近探针的核酸结构域的条形码序列的组合，并且所述报告核酸分子的检测包括检测条形码序列的组合。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述样品是血浆或血清样品。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中使用邻近探针对检测所述分析物，每个邻近探针包含：
(i)对分析物具有特异性的分析物结合结构域；和
(ii)核酸结构域，
其中每对中的两个探针都包含对同一分析物具有特异性的分析物结合结构域，并且每个探针对对不同分析物具有特异性，并且其中每个探针对被设计成使得在邻近探针对与它们相应分析物近端结合时所述邻近探针的所述核酸结构域相互作用以产生报告核酸分子；
其中使用至少2个小组的邻近探针对，每个小组用于检测不同组的分析物，并且对于每个小组提供单独的样品等分试样，用于检测所述组中不同亚组的分析物；并且
其中(a)在每个小组内，每个探针对包含不同的核酸结构域对；和(b)在不同的小组中，所述探针对包含相同的核酸结构域对。
22.如权利要求21所述的方法，用于检测来自不同样品的分析物，其中通过扩增为每个样品产生的报告核酸分子而产生的PCR产物提供有样品索引；
并且其中使用同一小组的邻近探针对从每个不同样品产生的PCR产物合并到小组池中用于核酸测序，使用每个小组产生的PCR产物合并到单独的小组池中；
并且其中每个小组池被单独测序。
23.如权利要求7至22中任一项所述的方法，其中所述核酸测序是大规模并行DNA测序。
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