JPH09168400A - 核酸の定量方法 - Google Patents
核酸の定量方法Info
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- JPH09168400A JPH09168400A JP33179795A JP33179795A JPH09168400A JP H09168400 A JPH09168400 A JP H09168400A JP 33179795 A JP33179795 A JP 33179795A JP 33179795 A JP33179795 A JP 33179795A JP H09168400 A JPH09168400 A JP H09168400A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、かつ
正確な定量が行える核酸の定量方法を提供する。 【解決手段】 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要
な、特定配列領域の両端に相補的な２種のプライマーの
存在下で核酸試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増
幅された核酸の量を測定する核酸の定量方法であって、
該２種のプライマーの５’末端側がそれぞれ高分子担体
（例、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス）に
結合されており、該高分子担体結合プライマーを用いて
核酸の増幅反応を行った後に、高分子担体の凝集反応に
よって増幅された核酸の量を測定することを特徴とす
る。
正確な定量が行える核酸の定量方法を提供する。 【解決手段】 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要
な、特定配列領域の両端に相補的な２種のプライマーの
存在下で核酸試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増
幅された核酸の量を測定する核酸の定量方法であって、
該２種のプライマーの５’末端側がそれぞれ高分子担体
（例、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス）に
結合されており、該高分子担体結合プライマーを用いて
核酸の増幅反応を行った後に、高分子担体の凝集反応に
よって増幅された核酸の量を測定することを特徴とす
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸の定量方法に関
する。
する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の増幅法は、２種のプライマーによ
って規定された特定配列を鋳型（テンペレート）とし
て、酵素的にこの特定配列を増幅する方法であり、核酸
の検出にも利用されるようになってきている。即ち、検
出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特
定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を
鋳型として核酸の増幅反応を行い、増幅された特定配列
を検出することにより、標的核酸の検出が可能となる。
このように核酸の増幅反応を用いた核酸の検出方法で
は、検出対象の特徴的部分である特定配列が増幅されて
検出され、しかもその増幅率も大きいので、試料中にお
ける標的核酸の量が微量であっても、その検出が可能と
なる。例えば、数時間の反応で１００万倍程度の増幅率
を得ることも可能であり、核酸の増幅法を用いることで
１分子の核酸が存在すればこの核酸の検出が可能となる
場合もある。この増幅反応は鋳型核酸と２種のプライマ
ーとの間に相補的配列がある場合のみ進行し、相補的配
列がない場合には増幅産物は得られない。
って規定された特定配列を鋳型（テンペレート）とし
て、酵素的にこの特定配列を増幅する方法であり、核酸
の検出にも利用されるようになってきている。即ち、検
出対象としての標的核酸中の特定配列を選定し、この特
定配列の増幅に必要なプライマーを用意し、標的核酸を
鋳型として核酸の増幅反応を行い、増幅された特定配列
を検出することにより、標的核酸の検出が可能となる。
このように核酸の増幅反応を用いた核酸の検出方法で
は、検出対象の特徴的部分である特定配列が増幅されて
検出され、しかもその増幅率も大きいので、試料中にお
ける標的核酸の量が微量であっても、その検出が可能と
なる。例えば、数時間の反応で１００万倍程度の増幅率
を得ることも可能であり、核酸の増幅法を用いることで
１分子の核酸が存在すればこの核酸の検出が可能となる
場合もある。この増幅反応は鋳型核酸と２種のプライマ
ーとの間に相補的配列がある場合のみ進行し、相補的配
列がない場合には増幅産物は得られない。
【０００３】核酸の増幅法を用いることで核酸の検出感
度は飛躍的に向上し、最近ではハイブリダイゼーション
法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の
検出に利用されるに至っている。特に、ウイルス、細菌
等による感染症の臨床検査等の分野における病原体の同
定、あるいは遺伝子疾患における遺伝子の解析、癌等の
診断における遺伝子マーカーの検出などに広く利用され
るようになってきている。
度は飛躍的に向上し、最近ではハイブリダイゼーション
法を用いる核酸検出法に代わって種々の分野での核酸の
検出に利用されるに至っている。特に、ウイルス、細菌
等による感染症の臨床検査等の分野における病原体の同
定、あるいは遺伝子疾患における遺伝子の解析、癌等の
診断における遺伝子マーカーの検出などに広く利用され
るようになってきている。
【０００４】また、抗原の超高感度測定法に核酸の増幅
法が用いられている。例えば、細胞工学，Ｖｏｌ．１
３，Ｎｏ．１，７７〜８０頁（１９９４）に、イムノ・
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
（以下、ＰＣＲという。）法による抗原測定法が挙げら
れているが、この方法は、抗原を固定化して、固定化し
た抗原に抗体を結合させて抗原−抗体複合体を形成さ
せ、ビオチン化したＤＮＡ断片を結合したストレプトア
ビジンープロテインＡキメラを抗原ー抗体複合体に結合
させて、結合したＤＮＡ断片の一断片をＰＣＲ法により
増幅させてＤＮＡの量を測定する方法である。
法が用いられている。例えば、細胞工学，Ｖｏｌ．１
３，Ｎｏ．１，７７〜８０頁（１９９４）に、イムノ・
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
（以下、ＰＣＲという。）法による抗原測定法が挙げら
れているが、この方法は、抗原を固定化して、固定化し
た抗原に抗体を結合させて抗原−抗体複合体を形成さ
せ、ビオチン化したＤＮＡ断片を結合したストレプトア
ビジンープロテインＡキメラを抗原ー抗体複合体に結合
させて、結合したＤＮＡ断片の一断片をＰＣＲ法により
増幅させてＤＮＡの量を測定する方法である。
【０００５】これらの核酸の増幅法によって得られた増
幅産物の検出は、核酸反応混合物をゲル電気泳動で展開
し、増幅産物と、鋳型核酸やプライマー等の非検出対象
成分とを分離した状態で、蛍光染色によって増幅産物の
バンドをその分子量などから判断して特定してから、そ
のバンドの蛍光強度を測定することにより行われてき
た。
幅産物の検出は、核酸反応混合物をゲル電気泳動で展開
し、増幅産物と、鋳型核酸やプライマー等の非検出対象
成分とを分離した状態で、蛍光染色によって増幅産物の
バンドをその分子量などから判断して特定してから、そ
のバンドの蛍光強度を測定することにより行われてき
た。
【０００６】しかしながら、核酸の増幅法を用いた核酸
の検出においては、反応溶液中に鋳型核酸と大過剰なプ
ライマー等が含まれており、増幅対象の核酸配列の種類
によっては、非検出対象成分と増幅産物とのゲル電気泳
動による分離操作が困難な場合も多い。また、検体数が
多くなると、煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労
力と時間の浪費を伴うことになり、効率良い検出操作を
行う上での障害となっていた。特に臨床等における遺伝
子解析においては、多くの検体をより短時間で効率良く
処理できることが要求され、従来の方法ではこのような
要求には十分対応できるものではないという問題があっ
た。
の検出においては、反応溶液中に鋳型核酸と大過剰なプ
ライマー等が含まれており、増幅対象の核酸配列の種類
によっては、非検出対象成分と増幅産物とのゲル電気泳
動による分離操作が困難な場合も多い。また、検体数が
多くなると、煩雑なゲル電気泳動を行うことが多大な労
力と時間の浪費を伴うことになり、効率良い検出操作を
行う上での障害となっていた。特に臨床等における遺伝
子解析においては、多くの検体をより短時間で効率良く
処理できることが要求され、従来の方法ではこのような
要求には十分対応できるものではないという問題があっ
た。
【０００７】上記問題を解決する方法として特開平７−
１６３３９９号公報では、核酸反応液に、遊離時には蛍
光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する
色素化合物を直接添加して核酸増幅産物の検出を行う方
法が記載されている。この方法は、特殊な蛍光物質を用
いているので、蛍光物質の安定供給が困難であり、ま
た、各サンプルに蛍光物質を添加しなければならず、操
作が複雑である。更に、蛍光によって測定するので、バ
ックグランドが高く、サンプル間のコンタミネーション
も生じやすく、しかも高価な蛍光測定装置を用いなくて
はならず、自動化には適していない、という問題点もあ
った。
１６３３９９号公報では、核酸反応液に、遊離時には蛍
光を発せず、２本鎖核酸と反応することで蛍光を発する
色素化合物を直接添加して核酸増幅産物の検出を行う方
法が記載されている。この方法は、特殊な蛍光物質を用
いているので、蛍光物質の安定供給が困難であり、ま
た、各サンプルに蛍光物質を添加しなければならず、操
作が複雑である。更に、蛍光によって測定するので、バ
ックグランドが高く、サンプル間のコンタミネーション
も生じやすく、しかも高価な蛍光測定装置を用いなくて
はならず、自動化には適していない、という問題点もあ
った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
に鑑み、核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、かつ正
確な定量が行える核酸の定量方法を提供することを目的
とする。
に鑑み、核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、かつ正
確な定量が行える核酸の定量方法を提供することを目的
とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】請求項１記載の核酸の定
量方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）
は、標的核酸の特定配列領域の増幅に必要な、特定配列
領域の両端に相補的な２種のプライマーの存在下で核酸
試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増幅された核酸
の量を測定する核酸の定量方法であって、該２種のプラ
イマーの５’末端側がそれぞれ高分子担体に結合されて
おり、該高分子担体結合プライマーを用いて核酸の増幅
反応を行った後に、高分子担体の凝集反応によって増幅
された核酸の量を測定することを特徴とする。
量方法（以下、請求項１記載の発明を本発明１という）
は、標的核酸の特定配列領域の増幅に必要な、特定配列
領域の両端に相補的な２種のプライマーの存在下で核酸
試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増幅された核酸
の量を測定する核酸の定量方法であって、該２種のプラ
イマーの５’末端側がそれぞれ高分子担体に結合されて
おり、該高分子担体結合プライマーを用いて核酸の増幅
反応を行った後に、高分子担体の凝集反応によって増幅
された核酸の量を測定することを特徴とする。
【００１０】本発明１で用いられる、核酸の増幅反応
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
【００１１】本発明１で使用されるプライマーは、核酸
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
【００１２】本発明１で使用される高分子担体は、生化
学分野で、通常、使用される高分子担体でよく、例え
ば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラ
ン等の天然高分子担体、ポリスチレン、スチレンースチ
レンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エス
テル共重合体等の合成高分子担体などが挙げられ、特に
合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス
が好ましい。
学分野で、通常、使用される高分子担体でよく、例え
ば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラ
ン等の天然高分子担体、ポリスチレン、スチレンースチ
レンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エス
テル共重合体等の合成高分子担体などが挙げられ、特に
合成高分子担体が水などに均一に分散されたラテックス
が好ましい。
【００１３】本発明１で使用される、高分子担体結合プ
ライマーは、上述のようなプライマーが上記のような高
分子担体に結合されたものである。高分子担体に結合さ
れるプライマーとしては、標的核酸の特定配列領域の両
端に相補的な２種のプライマーが使用され、そのうち、
１個の高分子担体には１種類のプライマーのみが結合さ
れている。上記高分子担体結合プライマーは、プライマ
ーの５’末端側が高分子担体に結合されたものであり、
好ましくはプライマーの５’末端がグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリジ
ル・ジスルフィド基を有する化合物などのスぺーサを介
して高分子担体に結合されたものである。
ライマーは、上述のようなプライマーが上記のような高
分子担体に結合されたものである。高分子担体に結合さ
れるプライマーとしては、標的核酸の特定配列領域の両
端に相補的な２種のプライマーが使用され、そのうち、
１個の高分子担体には１種類のプライマーのみが結合さ
れている。上記高分子担体結合プライマーは、プライマ
ーの５’末端側が高分子担体に結合されたものであり、
好ましくはプライマーの５’末端がグルタルアルデヒ
ド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリジ
ル・ジスルフィド基を有する化合物などのスぺーサを介
して高分子担体に結合されたものである。
【００１４】本発明１の増幅された核酸とは、上記高分
子担体に結合した２種のプライマーをテンペレートにア
ニールさせて酵素反応によって増幅されたものであり、
好ましくはＰＣＲ反応によって増幅されたものである。
子担体に結合した２種のプライマーをテンペレートにア
ニールさせて酵素反応によって増幅されたものであり、
好ましくはＰＣＲ反応によって増幅されたものである。
【００１５】本発明１の定量方法の具体的手順は、ま
ず、標的核酸の特定配列領域核酸を加温して一本鎖にし
た後、温度を下げて、該特定配列領域の両端に高分子担
体に結合された２種のプライマーをアニーリングし、酵
素反応により核酸の増幅反応を行う。次いで、このサイ
クルを必要回数繰り返す。それにより、高分子担体に結
合した２種のプライマーから増幅した核酸同士が相補し
て、高分子担体間で結合を生じ、高分子担体が凝集す
る。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱光強
度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定量す
る。
ず、標的核酸の特定配列領域核酸を加温して一本鎖にし
た後、温度を下げて、該特定配列領域の両端に高分子担
体に結合された２種のプライマーをアニーリングし、酵
素反応により核酸の増幅反応を行う。次いで、このサイ
クルを必要回数繰り返す。それにより、高分子担体に結
合した２種のプライマーから増幅した核酸同士が相補し
て、高分子担体間で結合を生じ、高分子担体が凝集す
る。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱光強
度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定量す
る。
【００１６】上記の光学的定量に際しては、測定の波長
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
【００１７】請求項２記載の核酸の定量方法（以下、請
求項２記載の発明を本発明２という）は、標的核酸の特
定配列領域の増幅に必要な、特定配列領域の両端に相補
的な２種のプライマーの存在下で核酸試料に対して核酸
の増幅反応を行い、該増幅された核酸の量を測定する核
酸の定量方法であって、該２種のプライマーの５’末端
側にビオチンが結合されており、該ビオチン結合プライ
マーを用いて核酸の増幅反応を行った後に、アビジン結
合高分子担体を反応させ、該高分子担体の凝集反応によ
って増幅された核酸の量を測定することを特徴とする。
求項２記載の発明を本発明２という）は、標的核酸の特
定配列領域の増幅に必要な、特定配列領域の両端に相補
的な２種のプライマーの存在下で核酸試料に対して核酸
の増幅反応を行い、該増幅された核酸の量を測定する核
酸の定量方法であって、該２種のプライマーの５’末端
側にビオチンが結合されており、該ビオチン結合プライ
マーを用いて核酸の増幅反応を行った後に、アビジン結
合高分子担体を反応させ、該高分子担体の凝集反応によ
って増幅された核酸の量を測定することを特徴とする。
【００１８】本発明２で用いられる、核酸の増幅反応
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
【００１９】本発明２で使用されるプライマーは、核酸
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
【００２０】本発明２で使用されるビオチン結合プライ
マーは、上記プライマーの５’末端にビオチンが結合さ
れたものである。
マーは、上記プライマーの５’末端にビオチンが結合さ
れたものである。
【００２１】本発明２で使用される高分子担体として
は、本発明１の説明で述べた高分子担体が挙げられる。
は、本発明１の説明で述べた高分子担体が挙げられる。
【００２２】本発明２で使用されるアビジン結合高分子
担体は、上記高分子担体にアビジンが結合されたもので
あり、例えば、アビジンが高分子担体に、物理的に結合
されたもの；化学的に結合されたもの；グルタルアルデ
ヒド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリ
ジル・ジスルフィド基を有する化合物などの架橋剤を用
いて結合されたものが挙げられる。
担体は、上記高分子担体にアビジンが結合されたもので
あり、例えば、アビジンが高分子担体に、物理的に結合
されたもの；化学的に結合されたもの；グルタルアルデ
ヒド、過ヨウ素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリ
ジル・ジスルフィド基を有する化合物などの架橋剤を用
いて結合されたものが挙げられる。
【００２３】上記アビジンとしては、卵白のアビジン、
Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来のスト
レプトアビジンなどが挙げられる。
Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ由来のスト
レプトアビジンなどが挙げられる。
【００２４】本発明２の増幅された核酸とは、上記２種
のビオチン結合プライマーをテンペレートにアニールさ
せて酵素反応によって増幅されたものであり、好ましく
はＰＣＲ反応によって増幅されたものである。
のビオチン結合プライマーをテンペレートにアニールさ
せて酵素反応によって増幅されたものであり、好ましく
はＰＣＲ反応によって増幅されたものである。
【００２５】本発明２の定量方法の具体的手順は、ま
ず、標的核酸の特定配列領域を加温して一本鎖にした
後、温度を下げて、該特定配列領域の両端にビオチン結
合プライマーをアニーリングし、酵素反応により核酸の
増幅反応を行う。次いで、このサイクルを必要サイクル
繰り返す。それにより、ビオチン結合プライマーから増
幅した核酸同士が相補して、ビオチン間が結合する。次
いで、アビジン結合高分子担体を加え、ビオチン−アビ
ジン反応により、高分子担体間をアビジン−ビオチン−
核酸−ビオチン−アビジンで結合させ、高分子担体を凝
集させる。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱
光強度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定
量する。
ず、標的核酸の特定配列領域を加温して一本鎖にした
後、温度を下げて、該特定配列領域の両端にビオチン結
合プライマーをアニーリングし、酵素反応により核酸の
増幅反応を行う。次いで、このサイクルを必要サイクル
繰り返す。それにより、ビオチン結合プライマーから増
幅した核酸同士が相補して、ビオチン間が結合する。次
いで、アビジン結合高分子担体を加え、ビオチン−アビ
ジン反応により、高分子担体間をアビジン−ビオチン−
核酸−ビオチン−アビジンで結合させ、高分子担体を凝
集させる。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱
光強度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定
量する。
【００２６】上記の光学的定量に際しては、測定の波長
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
【００２７】請求項３記載の核酸の定量方法（以下、請
求項３記載の発明を本発明３という）は、標的核酸の特
定配列領域の増幅に必要な、特定配列領域の両端に相補
的な２種のプライマーの存在下で核酸試料に対して核酸
の増幅反応を行い、該増幅された核酸の量を測定する核
酸の定量方法であって、該核酸の増幅反応後に、該核酸
を一本鎖にし、高分子担体に結合されたプローブを結合
させ、該高分子担体の凝集反応によって増幅された核酸
の量を測定することを特徴とする。
求項３記載の発明を本発明３という）は、標的核酸の特
定配列領域の増幅に必要な、特定配列領域の両端に相補
的な２種のプライマーの存在下で核酸試料に対して核酸
の増幅反応を行い、該増幅された核酸の量を測定する核
酸の定量方法であって、該核酸の増幅反応後に、該核酸
を一本鎖にし、高分子担体に結合されたプローブを結合
させ、該高分子担体の凝集反応によって増幅された核酸
の量を測定することを特徴とする。
【００２８】本発明３で用いられる、核酸の増幅反応
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
は、標的核酸の特定配列領域の両端に相補的な２種のプ
ライマーによって規定された特定配列を鋳型（テンペレ
ート）として、このテンペレートに上記プライマーをア
ニールさせて酵素反応によりＤＮＡの増幅を行うもので
あり、好ましくはＰＣＲ反応が挙げられる。
【００２９】本発明３で使用されるプライマーは、核酸
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
の複製の際に用いられる短鎖の一本鎖核酸であり、好ま
しくは５０塩基以下の一本鎖核酸であり、更に好ましく
は３０塩基以下の一本鎖核酸である。
【００３０】本発明３で使用される高分子担体として
は、本発明１の説明で述べた高分子担体が挙げられる。
は、本発明１の説明で述べた高分子担体が挙げられる。
【００３１】本発明３で使用されるプローブは、核酸の
ハイブリダイゼーションの際に用いられる短鎖の一本鎖
核酸であり、好ましくは５０塩基以下の一本鎖核酸であ
り、更に好ましくは３０塩基以下の一本鎖核酸である。
ハイブリダイゼーションの際に用いられる短鎖の一本鎖
核酸であり、好ましくは５０塩基以下の一本鎖核酸であ
り、更に好ましくは３０塩基以下の一本鎖核酸である。
【００３２】本発明３で使用される高分子担体に結合さ
れたプローブとしては、上記プローブが上述の高分子担
体に結合されたものであり、好ましくは１個の高分子担
体に１種類のプローブが結合されたものである。
れたプローブとしては、上記プローブが上述の高分子担
体に結合されたものであり、好ましくは１個の高分子担
体に１種類のプローブが結合されたものである。
【００３３】上記高分子担体にプローブが結合されたも
のとしては、高分子担体とプローブが通常の物理的に結
合されたもの、化学的に結合されたものなどであり、好
ましくはプローブの５’末端側又は３’末端側が高分子
担体に結合されたものであり、更に好ましくはプローブ
の５’末端又は３’末端がグルタルアルデヒド、過ヨウ
素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリジル・ジスル
フィド基を有する化合物などのスぺーサを介して高分子
担体に結合されたものである。
のとしては、高分子担体とプローブが通常の物理的に結
合されたもの、化学的に結合されたものなどであり、好
ましくはプローブの５’末端側又は３’末端側が高分子
担体に結合されたものであり、更に好ましくはプローブ
の５’末端又は３’末端がグルタルアルデヒド、過ヨウ
素酸、マレイミド基を有する化合物、ピリジル・ジスル
フィド基を有する化合物などのスぺーサを介して高分子
担体に結合されたものである。
【００３４】本発明３の増幅された核酸とは、２種のプ
ライマーをテンペレートにアニールさせて酵素反応によ
って増幅されたものであり、好ましくはＰＣＲ反応によ
って増幅されたものである。
ライマーをテンペレートにアニールさせて酵素反応によ
って増幅されたものであり、好ましくはＰＣＲ反応によ
って増幅されたものである。
【００３５】本発明３の増幅された核酸と高分子担体に
結合されたプローブの結合とは、増幅された核酸を熱処
理などにより一本鎖変性させ、この一本鎖の少なくとも
二ヶ所にプローブを結合させることであり、この場合、
一本鎖に変性された核酸の上記二ヶ所が同じ配列の場合
はプローブは１種類でも良く、上記二ヶ所が違う配列の
場合は２種以上のプローブが必要である。
結合されたプローブの結合とは、増幅された核酸を熱処
理などにより一本鎖変性させ、この一本鎖の少なくとも
二ヶ所にプローブを結合させることであり、この場合、
一本鎖に変性された核酸の上記二ヶ所が同じ配列の場合
はプローブは１種類でも良く、上記二ヶ所が違う配列の
場合は２種以上のプローブが必要である。
【００３６】本発明３の定量方法の具体的手順は、ま
ず、標的核酸の特定配列領域を加温して一本鎖にした
後、温度を下げて、該特定配列領域の両端にプライマー
をアニーリングし、酵素反応により核酸の増幅反応を行
う。次いで、このサイクルを必要サイクル繰り返す。そ
れにより、プライマーから増幅した核酸同士が相補す
る。次いで、この増幅した核酸を熱などにより一本鎖に
した後、一本鎖にした核酸の二ヶ所に結合する前記高分
子担体に結合されたプローブを加え、該プローブと一本
鎖核酸を結合させる。それにより、高分子担体間がプロ
ーブ−一本鎖核酸−プローブで結合し、高分子担体が凝
集する。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱光
強度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定量
する。
ず、標的核酸の特定配列領域を加温して一本鎖にした
後、温度を下げて、該特定配列領域の両端にプライマー
をアニーリングし、酵素反応により核酸の増幅反応を行
う。次いで、このサイクルを必要サイクル繰り返す。そ
れにより、プライマーから増幅した核酸同士が相補す
る。次いで、この増幅した核酸を熱などにより一本鎖に
した後、一本鎖にした核酸の二ヶ所に結合する前記高分
子担体に結合されたプローブを加え、該プローブと一本
鎖核酸を結合させる。それにより、高分子担体間がプロ
ーブ−一本鎖核酸−プローブで結合し、高分子担体が凝
集する。次いで、この高分子担体の凝集の程度を散乱光
強度、吸光度または透過光強度などにより光学的に定量
する。
【００３７】上記の光学的定量に際しては、測定の波長
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
としては３００〜２４００ｎｍが用いられ、測定装置と
しては自動分析装置が用いられる。
【００３８】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施例および比
較例を示す。 （実施例１） ラテックス結合プライマー１の作成 プライマーとして、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロー
ルプライマー１の５’末端に、５位にリンカーアームを
有するウリジンを導入した。この５位にリンカーアーム
を有するウリジンは、特表昭６０−５００７１７号公報
に記載された合成法により、ウリジンから化学合成によ
り調製した。
較例を示す。 （実施例１） ラテックス結合プライマー１の作成 プライマーとして、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロー
ルプライマー１の５’末端に、５位にリンカーアームを
有するウリジンを導入した。この５位にリンカーアーム
を有するウリジンは、特表昭６０−５００７１７号公報
に記載された合成法により、ウリジンから化学合成によ
り調製した。
【００３９】平均粒径０．３５μｍのカルボキシル基含
有ポリスチレンラテックス（固形分５％（ｗ／ｗ）、積
水化学工業社製）１００μｌ及び５．８７ｎｍｏｌのＮ
Ｈ2基含有コントロールプライマー１を、５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎ
ｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＨ５．０）緩衝
液（和光純薬工業社製）中で混合（最終容量２ｍｌ）
し、３７℃で４時間反応させた後、５８７μｍｏｌのモ
ノエタノールアミン塩酸水溶液（和光純薬工業社製）を
加え、更に３７℃で３０分間反応させた。反応液を１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
得られた沈殿に１０ｍｌの水を加え混合後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し上清を除くことによ
り洗浄した。この洗浄操作を更に４回繰り返した後、得
られた沈殿を、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１
％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬工業社製）２．７１ｍｌ
に再懸濁し超音波処理（２０ＫＨｚ、５０Ｗ、２秒間）
し、４℃で保存した。
有ポリスチレンラテックス（固形分５％（ｗ／ｗ）、積
水化学工業社製）１００μｌ及び５．８７ｎｍｏｌのＮ
Ｈ2基含有コントロールプライマー１を、５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎ
ｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＨ５．０）緩衝
液（和光純薬工業社製）中で混合（最終容量２ｍｌ）
し、３７℃で４時間反応させた後、５８７μｍｏｌのモ
ノエタノールアミン塩酸水溶液（和光純薬工業社製）を
加え、更に３７℃で３０分間反応させた。反応液を１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
得られた沈殿に１０ｍｌの水を加え混合後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し上清を除くことによ
り洗浄した。この洗浄操作を更に４回繰り返した後、得
られた沈殿を、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１
％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬工業社製）２．７１ｍｌ
に再懸濁し超音波処理（２０ＫＨｚ、５０Ｗ、２秒間）
し、４℃で保存した。
【００４０】ラテックス結合プライマー２の作成 Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１に代
えてコントロールプライマー２を用いた以外は上記ラテ
ックス結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１に代
えてコントロールプライマー２を用いた以外は上記ラテ
ックス結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
【００４１】検体希釈液の調製 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）（和光純薬
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（Ｗ／Ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（Ｗ／Ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
【００４２】ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応にはＴａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御にはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
TM（宝酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶
液（０ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０
ｆｇ／ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チュー
ブに入れ、ラテックス結合プライマー１及び２を加えた
後、９２℃で一本鎖にした。次にラテックス結合プライ
マー１及び２を４５℃でアニーリングした後、７２℃で
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａ
ｑポリメラーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なっ
た。このサイクルを１サイクルとして５０サイクルの反
応を行った。
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御にはＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
TM（宝酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶
液（０ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０
ｆｇ／ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チュー
ブに入れ、ラテックス結合プライマー１及び２を加えた
後、９２℃で一本鎖にした。次にラテックス結合プライ
マー１及び２を４５℃でアニーリングした後、７２℃で
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａ
ｑポリメラーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なっ
た。このサイクルを１サイクルとして５０サイクルの反
応を行った。
【００４３】測定方法 生化学自動分析装置（日立７０５０型、日立製作所社
製）により、上記反応液２０μｌに検体希釈液を４００
μｌの割合で加えて測定した。測定条件は温度３７℃、
波長５７０ｎｍとした。結果を表１に示した。
製）により、上記反応液２０μｌに検体希釈液を４００
μｌの割合で加えて測定した。測定条件は温度３７℃、
波長５７０ｎｍとした。結果を表１に示した。
【００４４】（比較例１） ＰＣＲ反応 ラテックス結合プライマー１及び２に代えてコントロー
ルプライマー１及び２を用いた以外は上記実施例１のＰ
ＣＲ反応と同様に行った。
ルプライマー１及び２を用いた以外は上記実施例１のＰ
ＣＲ反応と同様に行った。
【００４５】測定方法 上記反応液を電気泳動装置（宝酒造社製）で電気泳動
し、泳動後のゲルフィルムをデンシトメータ（アトーＡ
ＣＤ−２５ＤＸ型、アトー社製）により目的ＤＮＡ断片
の量を測定した。尚、測定値は１ｆｇ／ｍｌのλＤＮＡ
をＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを１としたときの相対比
で表した。結果を表１に示した。
し、泳動後のゲルフィルムをデンシトメータ（アトーＡ
ＣＤ−２５ＤＸ型、アトー社製）により目的ＤＮＡ断片
の量を測定した。尚、測定値は１ｆｇ／ｍｌのλＤＮＡ
をＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを１としたときの相対比
で表した。結果を表１に示した。
【００４６】
【表１】
【００４７】（実施例２） ビオチン結合プライマー１の作成 プライマーとして、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロー
ルプライマー１の５’末端に、５位にリンカーアームを
有するウリジンを導入した。この５位にリンカーアーム
を有するウリジンは、特表昭６０−５００７１７号公報
に記載された合成法により、ウリジンから化学合成によ
り調製した。
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロー
ルプライマー１の５’末端に、５位にリンカーアームを
有するウリジンを導入した。この５位にリンカーアーム
を有するウリジンは、特表昭６０−５００７１７号公報
に記載された合成法により、ウリジンから化学合成によ
り調製した。
【００４８】５８．７μｍｏｌのＮＨ2 基含有コントロ
ールプライマー１ １００μｌに、Ｎ−メチルスクシン
イミドビオチン（シグマ社製）の４０ｍｍｏｌ／ｌジメ
チルスルホキシド（和光純薬工業社製）溶液５μｌを加
え、３０℃で３０分間反応し、更に、２Ｍグリシン−Ｎ
ａＯＨ（ｐＨ７．５）を２μｌ加え、更に３７℃で３０
分間反応して、ビオチン結合プライマーを得た。
ールプライマー１ １００μｌに、Ｎ−メチルスクシン
イミドビオチン（シグマ社製）の４０ｍｍｏｌ／ｌジメ
チルスルホキシド（和光純薬工業社製）溶液５μｌを加
え、３０℃で３０分間反応し、更に、２Ｍグリシン−Ｎ
ａＯＨ（ｐＨ７．５）を２μｌ加え、更に３７℃で３０
分間反応して、ビオチン結合プライマーを得た。
【００４９】ビオチン結合プライマー２の作成 Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１に代
えてコントロールプライマー２を用いた以外は上記ビオ
チン結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１に代
えてコントロールプライマー２を用いた以外は上記ビオ
チン結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
【００５０】ストレプトアビジン結合ラテックスの作成 ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）を１５μｇ／
ｍｌの濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）の４００μｌを、平均粒径０．４μｍのポリス
チレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｗ）、積水化学
工業社製）１００μｌに添加し、４℃で１時間撹拌し
た。次いで、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１％
（ｗ／ｖ）の濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、１．５時間撹拌した。
この液を１０℃で３０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分
離した。得られた沈澱物に、ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を０．２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加し、ラ
テックスを懸濁させ、ストレプトアビジン結合ラテック
ス液を調製した。
ｍｌの濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）の４００μｌを、平均粒径０．４μｍのポリス
チレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｗ）、積水化学
工業社製）１００μｌに添加し、４℃で１時間撹拌し
た。次いで、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１％
（ｗ／ｖ）の濃度で含有する１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、１．５時間撹拌した。
この液を１０℃で３０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分
離した。得られた沈澱物に、ウシ血清アルブミン（シグ
マ社製）を０．２５％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加し、ラ
テックスを懸濁させ、ストレプトアビジン結合ラテック
ス液を調製した。
【００５１】検体希釈液の調製 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）（和光純薬
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（ｗ／ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（ｗ／ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
【００５２】ＰＣＲ反応 ＰＣＲ反応にはＴａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒTM（宝
酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶液（０
ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／
ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チューブに入
れ、ビオチン結合プライマー１及び２を加えた後、９２
℃で一本鎖にした。次にビオチン結合プライマー１及び
２を４５℃でアニーリングした後、７２℃でｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なった。このサ
イクルを１サイクルとして５０サイクルの反応をおこな
った。
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒTM（宝
酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶液（０
ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／
ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チューブに入
れ、ビオチン結合プライマー１及び２を加えた後、９２
℃で一本鎖にした。次にビオチン結合プライマー１及び
２を４５℃でアニーリングした後、７２℃でｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なった。このサ
イクルを１サイクルとして５０サイクルの反応をおこな
った。
【００５３】測定方法 生化学自動分析装置（日立７０５０型、日立製作所社
製）により測定した。測定条件は温度３７℃、波長５７
０ｎｍとした。測定は、上記反応液２０μｌに、検体希
釈液３５０μｌ、ストレプトアビジン結合ラテックス液
５０μｌの割合で添加・混合を行ない、ラテックス液添
加後８０秒から３２０秒の間の吸光度変化量を測定し
た。結果を表２に示した。
製）により測定した。測定条件は温度３７℃、波長５７
０ｎｍとした。測定は、上記反応液２０μｌに、検体希
釈液３５０μｌ、ストレプトアビジン結合ラテックス液
５０μｌの割合で添加・混合を行ない、ラテックス液添
加後８０秒から３２０秒の間の吸光度変化量を測定し
た。結果を表２に示した。
【００５４】
【表２】
【００５５】（実施例３） ラテックス結合プローブ１の作成 プローブとして、Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロール
プライマー１の３’末端に、５位にリンカーアームを有
するデオキシウリジンを導入した。オリゴヌクレオチド
は、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプライド・バイオシス
テムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により合成
した。この５位にリンカーアームを有するデオキシウリ
ジンは、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された
合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調
製した。
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロール
プライマー１の３’末端に、５位にリンカーアームを有
するデオキシウリジンを導入した。オリゴヌクレオチド
は、ＤＮＡ合成機３８０Ａ型（アプライド・バイオシス
テムズ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により合成
した。この５位にリンカーアームを有するデオキシウリ
ジンは、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された
合成法により、デオキシウリジンから化学合成により調
製した。
【００５６】平均粒径０．３５μｍのカルボキシル基含
有ポリスチレンラテックス（固形分５％（ｗ／ｗ）、積
水化学工業社製）１００μｌ及び５．８７ｎｍｏｌのＮ
Ｈ2基含有コントロールプライマー１を、５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎ
ｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＨ５．０）緩衝
液（和光純薬工業社製）中で混合（最終容量２ｍｌ）
し、３７℃で４時間反応させた後、５８７μｍｏｌのモ
ノエタノールアミン塩酸水溶液（和光純薬工業社製）を
加え、更に３７℃で３０分間反応させた。反応液を１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
得られた沈殿に１０ｍｌの水を加え混合後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し上清を除くことによ
り洗浄した。この洗浄操作を更に４回繰り返した後、得
られた沈殿を、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１
％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬工業社製）２．７１ｍｌ
に再懸濁し超音波処理（２０ＫＨｚ、５０Ｗ、２秒間）
し、４℃で保存した。
有ポリスチレンラテックス（固形分５％（ｗ／ｗ）、積
水化学工業社製）１００μｌ及び５．８７ｎｍｏｌのＮ
Ｈ2基含有コントロールプライマー１を、５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎ
ｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ｐＨ５．０）緩衝
液（和光純薬工業社製）中で混合（最終容量２ｍｌ）
し、３７℃で４時間反応させた後、５８７μｍｏｌのモ
ノエタノールアミン塩酸水溶液（和光純薬工業社製）を
加え、更に３７℃で３０分間反応させた。反応液を１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
得られた沈殿に１０ｍｌの水を加え混合後、遠心分離
（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し上清を除くことによ
り洗浄した。この洗浄操作を更に４回繰り返した後、得
られた沈殿を、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を１
％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７．０）（和光純薬工業社製）２．７１ｍｌ
に再懸濁し超音波処理（２０ＫＨｚ、５０Ｗ、２秒間）
し、４℃で保存した。
【００５７】ラテックス結合プローブ２の作成 Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１の
３’末端に、５位にリンカーアームを有するデオキシウ
リジンを導入したオリゴヌクレオチドに代えて、コント
ロールプライマー２の相補鎖の３’末端に、５位にリン
カーアームを有するデオキシウリジンを導入したオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これを用いた以外は上記ラテッ
クス結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
Ｋｉｔ（宝酒造社製）のコントロールプライマー１の
３’末端に、５位にリンカーアームを有するデオキシウ
リジンを導入したオリゴヌクレオチドに代えて、コント
ロールプライマー２の相補鎖の３’末端に、５位にリン
カーアームを有するデオキシウリジンを導入したオリゴ
ヌクレオチドを合成し、これを用いた以外は上記ラテッ
クス結合プライマー１の作成方法と同様に行った。
【００５８】検体希釈液の調製 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）（和光純薬
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（ｗ／ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
工業社製）に、ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を
０．２５％（ｗ／ｖ）、ポリエチレングリコール６００
０（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナカライテ
スク社製）を２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、
検体希釈液を調製した。
【００５９】ＰＣＲ反応 ＲＣＲ反応にはＴａｋａｒａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒTM（宝
酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶液（０
ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／
ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チューブに入
れ、コントロールプライマー１及び２を加えた後、９２
℃で一本鎖にした。次にコントロールプライマー１及び
２を４５℃でアニーリングした後、７２℃でｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なった。このサ
イクルを１サイクルとして５０サイクルの反応を行っ
た。ＤＮＡの増幅反応終了後、９２℃で一本鎖にし、直
ちに氷冷して一本鎖のまま保持した。
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用い、反応の温
度制御はＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒTM（宝
酒造社製）を用いた。まず、各濃度のλＤＮＡ溶液（０
ｆｇ／ｍｌ、１ｆｇ／ｍｌ、５ｆｇ／ｍｌ、１０ｆｇ／
ｍｌ及び１００ｆｇ／ｍｌ）を各々の反応チューブに入
れ、コントロールプライマー１及び２を加えた後、９２
℃で一本鎖にした。次にコントロールプライマー１及び
２を４５℃でアニーリングした後、７２℃でｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社製）を加え、Ｔａｑポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）により伸長反応を行なった。このサ
イクルを１サイクルとして５０サイクルの反応を行っ
た。ＤＮＡの増幅反応終了後、９２℃で一本鎖にし、直
ちに氷冷して一本鎖のまま保持した。
【００６０】測定方法 生化学自動分析装置（日立７０５０型、日立製作所社
製）により測定した。測定条件は温度３７℃、波長５７
０ｎｍとした。測定は、上記反応液２０μｌに、４５℃
で検体希釈液３５０μｌ、ラテックス結合プローブ１液
及び２液をそれぞれ５０μｌづつの割合で添加・混合を
行ない、ラテックス液添加後８０秒から３２０秒の間の
吸光度変化量を測定した。結果を表３に示した。
製）により測定した。測定条件は温度３７℃、波長５７
０ｎｍとした。測定は、上記反応液２０μｌに、４５℃
で検体希釈液３５０μｌ、ラテックス結合プローブ１液
及び２液をそれぞれ５０μｌづつの割合で添加・混合を
行ない、ラテックス液添加後８０秒から３２０秒の間の
吸光度変化量を測定した。結果を表３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
【発明の効果】本発明１の核酸の定量方法は、高分子担
体結合プライマーを用いて核酸の増幅反応を行った後
に、高分子担体の凝集反応によって、増幅された核酸の
量を測定するので、核酸の増幅産物の検出方法を簡便に
し、かつ正確な定量ができる。本発明２の核酸の定量方
法は、ビオチン結合プライマーを用いて核酸の増幅反応
を行った後に、アビジン結合高分子担体を反応させ、該
高分子担体の凝集反応によって、増幅された核酸の量を
測定するので、核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、
かつ正確な定量ができる。本発明３の核酸の定量方法
は、核酸の増幅反応後に、該核酸を一本鎖にし、高分子
担体に結合されたプローブを結合させ、該高分子担体の
凝集反応によって増幅された核酸の量を測定するので、
核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、かつ正確な定量
ができる。
体結合プライマーを用いて核酸の増幅反応を行った後
に、高分子担体の凝集反応によって、増幅された核酸の
量を測定するので、核酸の増幅産物の検出方法を簡便に
し、かつ正確な定量ができる。本発明２の核酸の定量方
法は、ビオチン結合プライマーを用いて核酸の増幅反応
を行った後に、アビジン結合高分子担体を反応させ、該
高分子担体の凝集反応によって、増幅された核酸の量を
測定するので、核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、
かつ正確な定量ができる。本発明３の核酸の定量方法
は、核酸の増幅反応後に、該核酸を一本鎖にし、高分子
担体に結合されたプローブを結合させ、該高分子担体の
凝集反応によって増幅された核酸の量を測定するので、
核酸の増幅産物の検出方法を簡便にし、かつ正確な定量
ができる。
Claims (3)
- 【請求項１】 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要
な、特定配列領域の両端に相補的な２種のプライマーの
存在下で核酸試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増
幅された核酸の量を測定する核酸の定量方法であって、
該２種のプライマーの５’末端側がそれぞれ高分子担体
に結合されており、該高分子担体結合プライマーを用い
て核酸の増幅反応を行った後に、高分子担体の凝集反応
によって増幅された核酸の量を測定することを特徴とす
る核酸の定量方法。 - 【請求項２】 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要
な、特定配列領域の両端に相補的な２種のプライマーの
存在下で核酸試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増
幅された核酸の量を測定する核酸の定量方法であって、
該２種のプライマーの５’末端側にビオチンが結合され
ており、該ビオチン結合プライマーを用いて核酸の増幅
反応を行った後に、アビジン結合高分子担体を反応さ
せ、該高分子担体の凝集反応によって増幅された核酸の
量を測定することを特徴とする核酸の定量方法。 - 【請求項３】 標的核酸の特定配列領域の増幅に必要
な、特定配列領域の両端に相補的な２種のプライマーの
存在下で核酸試料に対して核酸の増幅反応を行い、該増
幅された核酸の量を測定する核酸の定量方法であって、
該核酸の増幅反応後に、該核酸を一本鎖にし、高分子担
体に結合されたプローブを結合させ、該高分子担体の凝
集反応によって増幅された核酸の量を測定することを特
徴とする核酸の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33179795A JPH09168400A (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | 核酸の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33179795A JPH09168400A (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | 核酸の定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09168400A true JPH09168400A (ja) | 1997-06-30 |
Family
ID=18247755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33179795A Withdrawn JPH09168400A (ja) | 1995-12-20 | 1995-12-20 | 核酸の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09168400A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3313358B2 (ja) * | 1998-11-09 | 2002-08-12 | 栄研化学株式会社 | 核酸の合成方法 |
| JP2002345499A (ja) * | 2001-05-29 | 2002-12-03 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット |
| CN100379880C (zh) * | 1999-02-03 | 2008-04-09 | 奥索临床诊断有限公司 | 通过载体核酸增强核酸扩增的特异性 |
| JP2015100332A (ja) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 東ソー株式会社 | 核酸の検出方法 |
-
1995
- 1995-12-20 JP JP33179795A patent/JPH09168400A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3313358B2 (ja) * | 1998-11-09 | 2002-08-12 | 栄研化学株式会社 | 核酸の合成方法 |
| US9909168B2 (en) | 1998-11-09 | 2018-03-06 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method of synthesizing nucleic acid |
| CN100379880C (zh) * | 1999-02-03 | 2008-04-09 | 奥索临床诊断有限公司 | 通过载体核酸增强核酸扩增的特异性 |
| JP2002345499A (ja) * | 2001-05-29 | 2002-12-03 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット |
| JP2015100332A (ja) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 東ソー株式会社 | 核酸の検出方法 |
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Effective date: 20050525 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
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