CN116500273A - 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法 - Google Patents

一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116500273A
CN116500273A CN202310407291.5A CN202310407291A CN116500273A CN 116500273 A CN116500273 A CN 116500273A CN 202310407291 A CN202310407291 A CN 202310407291A CN 116500273 A CN116500273 A CN 116500273A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
dna
antibody
protein
dna3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310407291.5A
Other languages
English (en)
Inventor
邱彩玲
陈祥云
苏伟雄
陈艳婷
陈凯妮
宣春
任燕飞
黄俊威
梁沛玲
刘伟强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dongguan Dalang Hospital
Original Assignee
Dongguan Dalang Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dongguan Dalang Hospital filed Critical Dongguan Dalang Hospital
Priority to CN202310407291.5A priority Critical patent/CN116500273A/zh
Publication of CN116500273A publication Critical patent/CN116500273A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7‑H3蛋白检测方法。本发明的检测方法为：将待测样品、抗B7‑H3抗体‑DNA1/DNA3复合物、抗B7‑H3抗体‑DNA2偶联物、发夹探针组、脱氧核糖核苷酸三磷酸、切刻内切酶、DNA聚合酶和荧光染料加入到检测体系缓冲液中反应后，进行荧光检测。本发明的B7‑H3蛋白检测方法能够实现对B7‑H3蛋白的快速检测，该检测方法以荧光为检测信号，特异性好，灵敏度高，实现了单管一步法检测，一次加样，中途无需开盖清洗。

Description

一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法。
背景技术
B7-H3作为B7家族新发现的成员之一，是由Chapvol等人(Chapoval A I,Ni J,LauJS,et al.B7-H3:a costimulatory molecule for T cell activation and IFN-gammaproduction[J].Nat Immunol,2001,2(3):269-274.)在2001年于树突状细胞中发现，它广泛表达于活化的T细胞、B细胞、单核细胞、DC细胞以及一些肿瘤细胞上。B7-H3作为共刺激/共抑制免疫检查点分子具有双重作用。现有研究表明B7-H3可以通过与T细胞上的未知受体结合，促进CD4+和CD8+T细胞的活化，增加IFN-γ等细胞因子的表达，同时也有抑制T细胞活化功能的报道。B7-H3分子同时存在膜型及可溶性两种形式。既往研究证实膜型B7-H3在炎症状态下异常高表达，随后实验也发现sB7-H3在脓毒症患者体内水平显著增高。因此无论膜型还是可溶性B7-H3分子可能都是重要的炎症指标。但两种B7-H3分子间功能是否存在差异或关联，并未见有相关研究报道。此外，遗传性痉挛性截瘫(HSP)患者外周血中协同刺激分子的异常表达被认为是机体免疫系统T淋巴细胞过度活化的关键因素。而B7-H3分子在其病程中作用的研究迄今未见报道。B7-H3的检测大部分均依赖免疫相关检测技术，如ELISA，免疫组化法等。这些方法虽然灵敏度高，但耗时、费力、成本高。因此，人们一直在努力寻找快速、敏感、低成本和易于使用的蛋白质检测工具。
近年来，许多信号传感器被用于将待检测的蛋白信号转化为序列特异性的输出的DNA信号，然后通过DNA信号放大方法进一步放大输出DNA信号。例如，Ghadiri的团队设计了一种新的核酸检测策略，通过将目标核酸转换为预先设计的输出DNA进行信号放大(PicuriJ M,Frezza B M,Ghadiri M R.Universal translators for nucleic acid diagnosis[J].J Am Chem Soc,2009,131(26):9368-9377.)。在相关技术中，也已经开发出了一种基于结合诱导DNA链置换的分子翻译器，用于均质检测蛋白质，包括血小板衍生生长因子BB(PDGF BB)和前列腺特异性抗原(PSA)。这些检测方法均为单重核酸信号扩增，扩增能力不强，检测灵敏度偏低。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法，利用信号转换器把蛋白质信号转换成DNA信号后，进行指数等温扩增(exponential amplification reaction,EXPAR)与分枝杂交链反应(Dendtritic hybridization chain reaction,D-HCR)的多重核酸扩增，能够极大提高检测灵敏度，效率高，且全程只需要一次加样。
根据本发明的一个方面，提出了一种B7-H3蛋白检测方法，所述检测方法包括：
S1:将待测样品、抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物、抗B7-H3抗体-DNA2偶联物、发夹探针组、脱氧核糖核苷酸三磷酸、切刻内切酶、DNA聚合酶和荧光染料加入到检测体系缓冲液中；所述检测缓冲液中含有：40-60mM醋酸钾，10-30mM三羟基氨甲烷醋酸盐，5-15mM醋酸镁，50-150μg/mL重组白蛋白；
S2:在35～40℃反应80～100分钟后进行荧光检测。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物由抗B7-H3抗体-DNA1偶联物和DNA3混合孵育得到；所述DNA3的核苷酸序列为：
DNA3：5’-GATACGGCTGAGG CCTACGTACGAA-3’(SEQ ID NO.3)。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物的制备步骤包括：将抗B7-H3抗体-DNA1偶联物与DNA3加入到检测体系缓冲液中，50～60℃孵育3～7分钟，再自然等待冷却到20～30℃后，再孵育100～140分钟，即得抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物。
在本发明的一些具体实施方式中，所述检测缓冲液中含有：50mM醋酸钾，20mM三羟基氨甲烷醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL重组白蛋白。
在本发明的一些具体实施方式中，所述三羟基氨甲烷醋酸盐的CAS号为6850-28-8。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA1偶联物由DNA1与B7-H3单克隆抗体在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合液中偶联得到；所述DNA1的核苷酸序列为：
DNA1：5’-NH2-C6-TTTTTTTTTTTTTTTTTCGTACGTAGG-3’(SEQ ID NO.1)。
其中，NH2-C6代表氨基修饰，NH2为氨基，C6为核酸糖基第6位碳基团。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA1偶联物的制备步骤包括：将DNA1与抗B7-H3单克隆抗体在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合液中进行偶联。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA1偶联物的制备步骤为：将EDC和NHS混合在水中反应；将上述混合溶液加入含有抗B7-H3抗体、DNA1的碳酸盐缓冲液中反应后，将溶液离心，加水冲洗；弃去上清液，用rCutSmar缓冲液将沉淀重悬；用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定最终蛋白浓度。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA2偶联物由DNA2与B7-H3单克隆抗体在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合液中偶联得到；所述DNA2的核苷酸序列为：
DNA2：5’-CCTACGTACGAATTTTTTTTTTTTTTT-C6-NH2-3’(SEQ ID NO.2)。
其中，C6-NH2代表氨基修饰，NH2为氨基，C6为核酸糖基第6位碳基团。
在本发明的一些实施方式中，所述抗B7-H3抗体-DNA2偶联物的制备步骤参考上述抗B7-H3抗体-DNA1偶联物的制备步骤，将DNA1替换为等量的DNA2，其他成分及步骤不变。
在本发明的一些实施方式中，所述所述发夹探针组由发夹探针1、发夹探针2和发夹探针3组成；所述发夹探针1～3的核苷酸序列分别为：
发夹探针1：5’-TTTGATACGGCTGCGTCGTAGGCCTCAGCCGTATCAAA-3’(SEQ ID NO.4)；
发夹探针2：5’-TTTGATACGGCTGTGTCGTAGACCATGCTACGACACAGCCGT-3’(SEQ IDNO.5)；
发夹探针3：
5’-CTACGACACAGCCGTATCAAACTACGACACAGCCGTATCAAAGCTGTGTCGTAGACGGCTGTGTCGTAGCATGGT-3’(SEQ ID NO.6)。
在本发明的一些实施方式中，所述切刻内切酶为Nb.BbvCI切刻内切酶。
在本发明的一些实施方式中，所述DNA聚合酶为Bst 2.0warmstart DNA聚合酶。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光染料为SYBR GreenⅠ。
在本发明的一些实施方式中，所述检测方法的检测体系为：
在本发明的一些具体实施方式中，所述检测方法的检测体系为：
在本发明的一些实施方式中，所述荧光检测可以按照本领域常规检测方法，如荧光定量PCR仪、荧光分光光度计、荧光酶标仪等设备实现测定，或在特定波长的激发光照射下也可进行可视化检测。
在本发明的一些具体实施方式中，所述荧光强度的检测方法为终点法，所使用的设备为荧光分光光度计。
在本发明的一些具体实施方式中，所述荧光检测中激发峰为480nm。
在本发明的一些具体实施方式中，所述荧光检测中记录的发射峰为524nm。
本发明的第二个方面，提供一种检测试剂，所述检测试剂中含有本发明第一个方面所述的抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物、抗B7-H3抗体-DNA2偶联物和发夹探针组。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂中还含有辅剂。
在本发明的一些实施方式中，所述辅剂包括：脱氧核糖核苷酸三磷酸dNTPs、Nb.BbvCI切刻内切酶、Bst 2.0warmstart DNA聚合酶、荧光染料1×SYBR GreenⅠ和检测体系缓冲液。
本发明的第三个方面，提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有第二个方面所述的检测试剂。
本发明的第四个方面，提供本发明的第二个方面所述的检测试剂和第三个方面所述的检测试剂盒在B7-H3蛋白检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括体内和/或体外的B7-H3蛋白的检测。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供了一种B7-H3蛋白检测方法，操作简单，在两小时内可实现对B7-H3蛋白的快速检测。
2.本发明中的蛋白检测方法以荧光为检测信号，可结合实时荧光定量PCR仪、荧光分光光度计、荧光酶标仪等设备实现测定，在特定波长的激发光照射下也可进行可视化检测。
3.本发明中的方法检测B7-H3蛋白特异性好，不易受其它蛋白影响，能从相似蛋白(如B7家族相近蛋白如B7-H1，B7-H2，B7-H4，B7-H5，B7-H6等蛋白)中特异性识别B7-H3蛋白。
4.本发明中的检测方法灵敏度高，能够对B7-H3蛋白实现定量检测，该检测方法的检测限可达100fg/mL，线性范围为100fg～1μg/mL。
5.本发明的检测方法可实现单管一步法检测，一次加样，中途无需开盖清洗等步骤。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白的检测原理图；
图2为本发明实施例中不同浓度的B7-H3蛋白检测的荧光发射光谱图(510nm-600nm)；
图3为本发明实施例中基于信号转换与核酸多重等温扩增测定B7-H3蛋白的线性范围；
图4为本发明实施例中为不同蛋白及对照组所产生的荧光强度情况，其中图A为不同蛋白和对照组的实物曝光图，图B为不同蛋白和对照组在发射峰为524nm时产生的荧光信号强度图；
图5为本发明实施例中B7-H3蛋白分别在20％的血清与唾液中回收试验的散点图；
图6为本发明实施例中B7-H3蛋白检测方法与对照检测方法(ELISA检测法)检测临床标本的对比结果；
图7为本发明实施例中不同浓度梯度下的荧光强度散点图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
以下实施例所使用的其他实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法
本实施例为一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法，具体方法步骤包括：
1.制备抗B7-H3抗体-DNA1与抗B7-H3抗体-DNA2偶联物
将DNA1和DNA2分别通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液体系与抗B7-H3单克隆抗体偶联后即得。具体步骤为：
(1)将20.6mg EDC和11.5mg NHS混合在1mL水中反应10分钟，取10μLEDC和NHS混合溶液，加入200μL含有13.5mg/mL抗B7-H3单克隆抗体(购自默克有限公司)，含有10μM的DNA1的碳酸盐缓冲液(pH为11.0)中，反应2小时；
(2)将反应后的上述溶液以4000转/分的速度离心5分钟，加入200μL的水以4000转/分的速度离心冲洗2次，5分钟；
(3)弃去上清液，用rCutSmar缓冲液(购自纽英伦生物技术有限公司)将沉淀重悬至最终体积为200μL，制得抗B7-H3抗体-DNA1偶联物；
(4)用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定最终蛋白浓度。
其中，将上述含有10μM的DNA 1的碳酸盐缓冲液中的DNA1替换为等量的DNA2，其他成分及步骤不变，即可制得抗B7-H3抗体-DNA2偶联物。
2.制备检测体系缓冲液
配置缓冲液，其体系中包含：50mM醋酸钾，20mM三羟基氨甲烷醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL重组白蛋白(购自纽英伦生物技术有限公司)。
检测体系缓冲液的制备步骤为：在100mL体积的去离子水中，分别依次加入410mg无水醋酸钾，410mg三羟基氨甲烷醋酸盐以及10mg重组白蛋白，充分混匀后用0.22μm孔径的除菌滤膜过滤制成，置于4℃下保存备用。
3.抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物的制备
将3μM抗B7-H3抗体-DNA1偶联物与2μM DNA3加入到上述检测体系缓冲液中，55℃孵育5分钟，再自然等待冷却到25℃后，再孵育120分钟，即得抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物。
4.B7-H3蛋白荧光检测
在实验室环境中室温(25±2℃)下配置反应体系(如表1所示)，然后在37℃下反应90分钟后，进行荧光检测，本发明中均采用终点法的方式进行检测，荧光检测中所使用的荧光分光光度计购自珀金埃尔默仪器有限公司。
表1检测反应体系
其中，抗B7-H3单克隆抗体购自默克有限公司、DNA1、DNA2、DNA3、发夹探针1、发夹探针2、发夹探针3由生工生物工程股份有限公司合成，Bst 2.0warmstart DNA聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶购自纽英伦生物技术有限公司，dNTPs购自生工生物工程股份有限公司。
上述DNA1、DNA2、DNA3、H1、H2、H3的核苷酸序列如下所示：
DNA1：5’-NH2-C6-TTTTTTTTTTTTTTTTTCGTACGTAGG-3’(SEQ ID NO.1)；
DAN2：5’-CCTACGTACGAATTTTTTTTTTTTTTT-C6-NH2-3’(SEQ ID NO.2)；
DNA3：5’-GATACGGCTGAGG CCTACGTACGAA-3(SEQ ID NO.3)；
发夹探针1(Hairpin probe1，H1)：
5’-TTTGATACGGCTGCGTCGTAGGCCTCAGCCGTATCAAA-3’(SEQ ID NO.4)；
发夹探针2(Hairpin probe2，H2)：
5’-TTTGATACGGCTGTGTCGTAGACCATGCTACGACACAGCCGT-3’(SEQ ID NO.5)；
发夹探针3(Hairpin probe3，H3)：
5’-CTACGACACAGCCGTATCAAACTACGACACAGCCGTATCAAAGCTGTGTCGTAGACGGCTGTGTCGTAGCATGGT-3’(SEQ ID NO.6)。
其中，DNA1和DNA2的序列经过氨基修饰，具体为将NH2基团与相应核酸的糖基第6位碳基团(C6基团)相连而成。
在本发明的检测方法的技术原理为：
如图1的检测原理图所示，蛋白信号换能器由目标识别元件(抗B7-H3抗体-DNA1偶联物和抗B7-H3抗体-DNA2偶联物)和信号输出元件(DNA3)组成：与抗B7-H3抗体偶联的DNA1首先与DNA3杂交形成稳定的DNA1/DNA3二聚体结构。DNA3被设计为在其5'端(图1中的绿色区域)附近有一个切刻内切酶识别位点。
其中的DNA2序列被设计成与DNA1序列互补。
根据靶蛋白B7-H3存在与否分为以下两种情况：
(1)在靶蛋白B7-H3存在的情况下，同一个B7-H3蛋白与DNA1和DNA2偶联的两种抗体结合，将偶联物中的DNA1和DNA2组装在一起，从而增加它们的局部有效浓度。这一过程提高了分子内杂交(DNA1和DNA2)的熔解温度，有利于DNA2和DNA3之间的链置换反应。结果，输出的DNA3被释放用于进一步放大的被检测的蛋白信号。
(2)在缺乏靶蛋白B7-H3的情况下，37℃时DNA2和DNA3之间的链置换活性较差，竞争DNA2释放输出DNA3的能力极为有限，故无法释放出蛋白信号。
之后，在检测体系中所加入的3种发夹探针：H1、H2、H3，分别用指数等温扩增(EXPAR)和树枝杂交链反应(D-HCR)进行多重信号放大。
对应上述靶蛋白B7-H3存在与否的两种情况分别为：
(1)发夹探针在靶蛋白B7-H3存在的情况下，输出的DNA3识别并与H1并部分互补形成双链DNA结构，形成部分互补的双链DNA，在其5'端附近包含一个完整的切刻核酸的切刻内切酶识别位点。EXPAR在切刻酶与聚合酶存在时启动。NB.BbvCI切刻内切酶、Bst2.0warmstart DNA聚合酶和dNTPs在切刻、聚合和链置换的循环中产生大量的单链DNA(D-HCR触发DNA)。所得到的ssDNA识别并与H2部分杂交，导致发夹探针发生构象变化并导致茎结构打开并形成H2-ssDNA中间体。然后H2-ssDNA中间体暴露出与H3的互补序列，从而生成ssDNA-H2-H3多聚体。同时生成的ssDNA-H2-H3多聚体双暴露出两个与H2结合的互补互补序列，该中间体又可以与两个H2结合并分别打开与H3结合的位点，在发夹结构不断打开中进行信号放大。最后，生成由双链构成的大分子DNA产物，其与荧光染料SYBR Green I结合后可被荧光分光光度计记录荧光信号而被检测。
(2)发夹探针在缺乏靶蛋白B7-H3情况下，其无法通过信号转换器把蛋白信号转变成DNA信号，从而无法产生大量的大分子双链DNA，最终无法产生荧光信号。
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法的灵敏度评估：
本实施例测试本申请中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法测定B7-H3蛋白的灵敏度，具体过程为：
在其他实验条件不变的情况下，检测方法参考上述基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法，设置B7-H3蛋白浓度梯度，分别为0fg/mL，10fg/mL，100fg/mL，1pg/mL，10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1μg/mL，10μg/mL，所使用的人类B7-H3蛋白购自默克有限公司；测定出相应的波长和荧光强度。
荧光发射光谱结果如图2所示，其中图2的X与Y轴分别为波长和荧光强度，随着靶蛋白浓度的增加，当中的524nm荧光强度呈逐渐增加的趋势，激发峰是495nm，记录的发射峰是524nm。
线性范围结果如图3所示，使用100fg/mL，1pg/mL，10pg/mL，100pg/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1μg/mL八个梯度浓度的对数为自变量X，在524nm的荧光强度为应变量Y作出线性回归方程，可得线性回归方程y＝20.4+42.81x，相关系数R2＝0.997，表明基于信号转换与核酸多重等温扩增的检测方法测定B7-H3蛋白在100fg/mL-1μg/mL范围内线性关系较好，以阴性对照524nm的荧光信号的3倍荧光信号转换成对应的浓度后，作为检测阳性最低检测限，其为100fg/mL。根据人类B7-H3(CD276)分子量49837.82(49.83kDa)计算，其最低检测量为200aM。
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法的特异性评估：
本实施例验证本申请中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法测定的B7-H3蛋白的特异性，具体过程为：
在其他实验条件不变的情况下，检测方法参考上述基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法，分别检测以下蛋白：B7-H3蛋白，B7家族相近蛋白B7-H1，B7-H2，B7-H4，B7-H5，B7-H6，以及阴性对照(negative control，NC)组，将不同蛋白和阴性对照分组，其中除NC组的靶蛋白浓度为0μg/mL，其余组浓度均为10μg/mL。其中，所使用的人类B7-H1，B7-H2，B7-H4，B7-H5，B7-H6等蛋白购自默克有限公司，阴性对照NC中以等量的去离子水代替其他蛋白的标准溶液中的蛋白，其余组分与其他蛋白的标准溶液中的组成一致。
结果如图4所示，其中图A曝光图对应的检测蛋白从左到右分别对应的是B7-H3蛋白，B7家族相近蛋白如B7-H1，B7-H2，B7-H4，B7-H5，B7-H6等蛋白，以及阴性对照NC，B7-H3蛋白的荧光信号强度明显高于其余各组；其中图B定量值图的X和Y轴分别为靶标蛋白的类别和524nm的荧光强度。对比不同组的荧光强度，可以发现：B7-H3蛋白的荧光信号明显高于B7家族相近蛋白如B7-H1，B7-H2，B7-H4，B7-H5，B7-H6等蛋白和NC组的荧光强度，信号差异可达10倍或以上，两图中的实验结果相一致，表明本发明所述的检测方法可以特异性检测B7-H3蛋白，且对于相似蛋白有较强的特异性。
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法的蛋白回收效果评估：
本实施例验证本申请中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法中的蛋白回收效果，具体过程为：
在其他实验条件不变的情况下，检测方法参考上述基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法，分别预先设置B7-H3蛋白浓度为100ng/mL，1ng/mL，10pg/mL的20％的血清和唾液的样本，对上述浓度的不同标本分别用同样的检测方法进行检测，与加入非血清与唾液的标本的浓度进行比对，从而计算出相应的蛋白回收量与回收率。
表1分别在20％的血清与唾液中的B7-H3蛋白回收试验
样本 标准浓度 蛋白回收量 回收率 相对标准偏差
20％的血清 100ng/mL 106.9ng/mL 106.9％ 2.62％
20％的血清 1ng/mL 1.054ng/mL 105.4％ 4.64％
20％的血清 10pg/mL 9.057pg/mL 90.57％ 8.20％
唾液 100ng/mL 89.42ng/mL 89.42％ 3.32％
唾液 1ng/mL 1.096ng/mL 109.6％ 3.25％
唾液 10pg/mL 11.22pg/mL 112.2％ 8.28％
表中的所有数据都代表了五个测量值的平均值。
结果如图5和表1所示，蛋白回收实验中，分别预先设置B7-H3蛋白浓度为100ng/mL，1ng/mL，10pg/mL的20％的血清和唾液的样本的回收率在89.42％-112.2％之间，相对标准差在8.28％以内，这些结果表明该检测方法在20％的血清和唾液的样本表现稳定；不受标本中复杂成分影响，具有临床应用的潜力。
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法与现有检测技术的对比：
本实施例验证本申请中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法和现有检测技术方法ELISA检测法的检测效果差异(ELISA检测试剂盒购自睿信生物有限公司)，检测18例取于血清的临床标本(来源于东莞市大朗医院)的可溶性B7-H3蛋白的测试效果，具体过程为：
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法参考实施例1，对照方法则按照睿信生物有限公司的ELISA检测试剂盒的检测方法操作说明书进行检测，分别检测18例临床标本的可溶性B7-H3蛋白含量。
检测结果如图6所示，本申请的检测方法与对照方法测试结果基本一致，临床相关性良好，可得线性回归方程为y＝-1.907+1.032x，相关系数R2＝0.9881。因此，本发明的检测方法具有很高的临床应用价值。
基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法的稳定性评估：
本实施例验证本申请中基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法的稳定性，具体过程为：
配制抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物，抗B7-H3抗体-DNA2偶联物，发夹探针组等检测组成成分，按上述检测方法将检测组成成分混合制成检测试剂，在4℃保存0，1，3，6，9，12，15天后，分别检测0fg/mL，100fg/mL，10pg/mL，1ng/mL，100ng/mL，1μg/mL浓度的B7-H3蛋白标准试剂六个梯度浓度，在其他实验条件不变的情况下，检测方法参考上述基于信号转换与核酸多重等温扩增的B7-H3蛋白检测方法中步骤。
由图7所示，上述检测试剂在4℃保存0-15天后，所设置的6个梯度的荧光强度无显著性差异，荧光强度均小于10％以内。该结果表明本发明所制得的检测试剂在15天内稳定性良好。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种B7-H3蛋白检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
S1:将待测样品、抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物、抗B7-H3抗体-DNA2偶联物、发夹探针组、脱氧核糖核苷酸三磷酸、切刻内切酶、DNA聚合酶和荧光染料加入到检测体系缓冲液中；所述检测缓冲液中含有：40-60mM醋酸钾，10-30mM三羟基氨甲烷醋酸盐，5-15mM醋酸镁，50-150μg/mL重组白蛋白；
S2:在35～40℃反应80～100分钟后进行荧光检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物由抗B7-H3抗体-DNA1偶联物和DNA3混合孵育得到；所述DNA3的核苷酸序列为：
DNA3：5’-GATACGGCTGAGG CCTACGTACGAA-3’。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述抗B7-H3抗体-DNA1偶联物由DNA1与B7-H3单克隆抗体在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合液中偶联得到；所述DNA1的核苷酸序列为：
DNA1：5’-NH2-C6-TTTTTTTTTTTTTTTTTCGTACGTAGG-3’。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗B7-H3抗体-DNA2偶联物由DNA2与B7-H3单克隆抗体在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合液中偶联得到；所述DNA2的核苷酸序列为：
DNA2：5’-CCTACGTACGAATTTTTTTTTTTTTTT-C6-NH2-3’。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述发夹探针组由发夹探针1、发夹探针2和发夹探针3组成；所述发夹探针1～3的核苷酸序列分别为：
发夹探针1：5’-TTTGATACGGCTGCGTCGTAGGCCTCAGCCGTATCAAA-3’；
发夹探针2：5’-TTTGATACGGCTGTGTCGTAGACCATGCTACGACACAGCCGT-3’；
发夹探针3：
5’-CTACGACACAGCCGTATCAAACTACGACACAGCCGTATCAAAGCTGTGTCGTAGACGGCTGTGTCGTAGCATGGT-3’。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测体系为：
7.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1所述的抗B7-H3抗体-DNA1/DNA3复合物、抗B7-H3抗体-DNA2偶联物和发夹探针组。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求7所述检测试剂。
9.权利要求7所述的检测试剂或权利要求8所述的检测试剂盒在B7-H3蛋白检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括体内和/或体外的B7-H3蛋白的检测。
CN202310407291.5A 2023-04-14 2023-04-14 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法 Pending CN116500273A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310407291.5A CN116500273A (zh) 2023-04-14 2023-04-14 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310407291.5A CN116500273A (zh) 2023-04-14 2023-04-14 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116500273A true CN116500273A (zh) 2023-07-28

Family

ID=87324048

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310407291.5A Pending CN116500273A (zh) 2023-04-14 2023-04-14 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116500273A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5688643A (en) Method of nucleic acid-differentiation and assay kit for nucleic acid differentiation
JP4976429B2 (ja) オリゴ核酸探針ビーズアレイを用いたヒトパピローマウイルス検出キットおよび方法
CN110878343B (zh) 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN110804669B (zh) 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途
CN114381538B (zh) 用于检测鼻疽诺卡菌的lamp引物组和检测试剂盒
CN113186341B (zh) CRISPR介导的一步式恒温扩增检测SARS-CoV-2的方法
US20240002917A1 (en) Method of detection of a target nucleic acid sequence
JP2021006056A (ja) ハイブリッド多元ステップ核酸増幅
CN115820889A (zh) 一种用于幽门螺旋杆菌检测的crRNA、CRISPR Cas12a系统及其应用
Li et al. A simple and rapid method to assay SARS-CoV-2 RNA based on a primer exchange reaction
CN113702641A (zh) 一锅式核酸-抗体共检测方法及应用
CA1309932C (en) Nucleic acid hybridization technique and kit therefor
EP4269608A1 (en) Proximity detection assays
CN113201533A (zh) 基于催化发夹自组装恒温扩增技术检测核酸的通用探针及其应用
KR102551477B1 (ko) 표적 물질의 검출용 키트 및 이를 이용하여 표적 물질을 검출하는 방법
CN111718985A (zh) 一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用
CN116500273A (zh) 一种基于信号转换与核酸多重等温扩增的b7-h3蛋白检测方法
US20080003600A1 (en) Isothermal screening of breast cancer related nucleic acid
KR100760525B1 (ko) 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 검출방법
CN114790492A (zh) 一种基于葡萄糖信号的便携式核酸检测方法
CN108486222B (zh) 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法
WO2008004706A1 (fr) Procédé de détection d'une substance cible à l'aide d'un procédé d'amplification de l'acide nucléique, disponible dans des conditions thermostatiques
JPH11243995A (ja) 尿サンプル中の膀胱癌の検出
WO2023170152A1 (en) Method for detecting nucleic acid amplification products using blocking agents
JP4227139B2 (ja) 生体試料の分析方法、反応液、及び分析装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination