CN108486222B - 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法 - Google Patents

基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108486222B
CN108486222B CN201810227750.0A CN201810227750A CN108486222B CN 108486222 B CN108486222 B CN 108486222B CN 201810227750 A CN201810227750 A CN 201810227750A CN 108486222 B CN108486222 B CN 108486222B
Authority
CN
China
Prior art keywords
telomerase
toto
primer
sequence
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810227750.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108486222A (zh
Inventor
卫伟
杨海堂
刘松琴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN201810227750.0A priority Critical patent/CN108486222B/zh
Publication of CN108486222A publication Critical patent/CN108486222A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108486222B publication Critical patent/CN108486222B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开一种基于核酸染料TOTO‑1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本方法步骤如下：1）细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞溶液；2）将裂解后的细胞溶液加入端粒酶扩增缓冲溶液，对端粒酶引物进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；3）加入TS primer的互补序列，杂交后，再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO‑1，孵育，检测荧光光谱。本发明利用了TOTO对含G碱基DNA链的识别作用来检测端粒酶，简化了检测方法，避免了标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

Description

基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活 性的方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，涉及一种荧光法定量检测端粒酶的技术，具体涉及基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。
背景技术
传统的检测方法主要是利用聚合酶链式反应(PCR)法对端粒的重复序列进行扩增。此方法稳定性好，特异性高，但是需要样品量较大，灵敏性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测。此外，TRAP法需要使用昂贵的设备和试剂，再加上端粒酶抑制剂的开发已被提议作为人类癌症治疗的潜在方法，而TRAP在筛选有效的端粒酶抑制剂时易受PCR派生产物的影响，因此，该方法存在很多局限性。荧光不仅价格便宜，不需要复杂的仪器设备，而且测量简便、快速，因而得到了较快的发展。
虽然后续有一些研究者提供了很多方法来检测端粒酶，但是大多数需要借助纳米材料制备、比较贵重的仪器或比较复杂的荧光循环步骤，考虑到生物体本身复杂的环境，涉及的物质和操作过程越多，实验的重现性和准确性越差。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法。本发明针对TOTO-1与TS Primer扩增后的链结合荧光强度会发生明显变化，从而建立荧光法检测端粒酶，同时结合ExoⅢ来降低该实验方案的背景干扰，通过荧光强度的改变可以对端粒酶进行定量检测。本发明是利用TOTO-1对TSPrimer扩增出的富G序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入ExoⅢ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。
技术方案：本发明提供了一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：
1)细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；
2)将裂解后的细胞溶液加入含有端粒酶扩增引物(TS primer)的端粒酶缓冲溶液，对TS primer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；
3)在产物溶液中加入TS primer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；
4)在杂交好的产物中再加ExoⅢ酶切除双链，最后加TOTO-1，孵育，检测荧光光谱。
其中，所述步骤1)的细胞的培养以及提取端粒酶的提取具体步骤如下：A549肺癌细胞加入含10％FBS和双抗的DMEM培养基，在含5％CO2，37℃细胞培养箱培养后收集，4×106个细胞分散在1.5mL的EP管中，用1×PBS在1800rpm离心机清洗5min后，弃去上清液，将这些收集到的细胞分散在裂解液中，冰上孵育30min后，12000rpm，4℃下离心20min，将上清液转移到无RNase离心管，快冻后保存在-80℃冰箱中。
其中，所述步骤1)细胞数目为2～4000个。
其中，所述步骤2)具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将细胞配置成不同的浓度，在含有dNTPs、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2h。
其中，所述步骤2)端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、EGTA、Tween 20的pH 8.3的20mMTris-HCl，所述MgCl2初始浓度为1～5mM，EGTA初始浓度为0.05～5mM，Tween 20初始浓度为0.005％～1％(v/v)，dNTPs初始浓度为0.5～2mM。
其中，所述步骤2)的TS primer的序列如SEQ ID NO：1所示，所述TS primer的浓度为1～6μM。
其中，所述步骤2)细胞裂解液的细胞浓度为2～4000个cells/mL。
其中，所述步骤3)具体如下：将TS primer的互补序列加入到已扩增好的引物中，再加入杂交缓冲液，置于95℃水浴5min后渐渐冷却至室温。
其中，所述步骤3)的杂交缓冲溶液为含有NaCl、EDTA的Tris-HCl，所述NaCl初始浓度为50mM，EDTA的初始浓度0.1～1mM。
其中，所述步骤3)的TS primer的互补序列终浓度为0.5～1μM。
其中，所述步骤4)具体如下：取杂交好的产物，加ExoⅢ酶，37℃反应1～2小时，取TOTO-1加入到上述反应物中，定容至200μL，对其溶液进行记录和荧光光谱检测；
其中，步骤4)中的ExoⅢ酶的终浓度为0.5～3U/μL，所述步骤4)的核酸染料TOTO-1浓度为25～300nM。
有益效果：本发明是利用核酸染料TOTO-1对TS Primer扩增出的富G序列的特定的荧光信号增强作用来检测端粒酶的活性，同时引入ExoⅢ来降低实验方案的背景信号，从而提高了该方法的灵敏性。本发明原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，无需任何大型仪器。将该方法用于肿瘤患者实际样品时，与临床诊断结果一致。所以可以将该方法进一步开发，做成一种小型诊断仪器，方便患者使用，定时诊断，将肿瘤细胞扼杀在早期。
附图说明
图1基于TOTO-1荧光检测端粒酶活性的流程图；
图2端粒酶检测原理验证图；图2A，a：Poly ADNA与TOTO-1的荧光光谱；b：Poly C与TOTO-1的荧光光谱；c：PolyT与TOTO-1的荧光光谱；d：Poly G与TOTO-1的荧光光谱；e：dsDNA与TOTO-1的荧光光谱；图2B，a：TOTO-1；b：ds经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度；c：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs与TOTO-1孵育的荧光强度；d：ds经过ExoⅢ酶切后产物，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；e：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs，热处理A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；f：ds经过Exo Ⅲ酶切后产物，dNTPs，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度；图2C，a：TOTO-1的荧光强度；b：TOTO-1与A549细胞的荧光强度；c：TOTO-1与dNTPs的荧光强度；d：ds经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度；e：TOTO-1与TSprimer的荧光强度；f：TOTO-1与TS primer互补DNA的荧光强度；图2D，a:TS Primer与其互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱；b：TS Primer经端粒酶扩增后产物与TS Primer互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱；c：TS Primer加TOTO-1的荧光光谱；d：TS Primer经端粒酶扩增后产物加TOTO-1的荧光光谱。
图3检测端粒酶活性的条件优化图：A：TS Primer的浓度优化；B：TOTO-1的浓度优化；C：ExoⅢ酶浓度优化；D：ExoⅢ酶切时间优化。
图4检测端粒酶活性的荧光强度值变化图：图4A：在不同的A549细胞浓度下，得到的紫外-可见光曲线图(A549细胞浓度：(a)0(b)2(c)7(d)13(e)40(f)320(g)750(h)2000cells/mL)(i)4000cells/mL；图4B：荧光强度与A549细胞浓度的标准曲线；插图：荧光强度与A549细胞浓度之间的线性关系；从图中可以看出A549细胞在2cells/mL到4000cells/mL呈良好的线性关系。
图5端粒酶选择性验证；
图6BIBR和姜黄素两种抑制剂对端粒酶的抑制作用，图6A:不同浓度BIBR对端粒酶的抑制作用(BIBR浓度：10,100,200,350,600,650nM)；图6B：不同浓度姜黄素对端粒酶的抑制作用(2,6,8,10,18,26,34μM)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器
实验用到的DNA序列均购自上海生物工程技术服务有限公司，A549肺癌细胞购买于上海复祥生物科技公司，核酸染料TOTO-1购自于Thermo Fisher Scientific(美国)，BIBI购于selleck化学公司(美国，休斯敦)，姜黄素购于J&K化学公司(中国，上海)。Fluoromax-4荧光光谱仪(HORIBA，日本)。
端粒酶引物(TS primer)序列：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′
TS primer的互补DNA序列：5′-AACTCTGCTCGACGGATT-3′
PoyA 5′-AAAAAAAA-3′，PoyG 5′-GGGGGGGG-3′，PoyT 5′-TTTTTTTT-3′
PoyC 5′-CCCCCCCC-3′
实施例1原理验证1
1)我们首先检测1×PBS溶液中250nM TOTO-1的荧光强度，检测结果表明核酸染料TOTO-1自身的荧光信号很弱，见图2B曲线a。
2)将TS Primer与其互补DNA在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA)里面杂交后，得到dsDNA。
3)将poly A，Poly C，PolyT，Poly G DNA，ds DNA分别与TOTO-1混合反应1h，记录荧光光谱值，其中poly A，Poly C，PolyT，Poly G DNA，ds DNA的终浓度均为0.27μM bp(bp代表碱基对)，TOTO-1的终浓度为250nM。如图2A，250nM TOTO-1与PolyC，PolyT荧光信号几乎不可见，与PolyA有比较低的荧光强度，TOTO-1与Poly G DNA反应有荧光增强作用，250nMTOTO-1与TS primer的荧光强度；TOTO-1与TS primer互补DNA的荧光强度。图2A中a：Poly ADNA与TOTO-1的荧光光谱；b：Poly C与TOTO-1的荧光光谱；c：PolyT与TOTO-1的荧光光谱；d：Poly G与TOTO-1的荧光光谱；e：ds DNA与TOTO-1的荧光光谱；从图2A中可以看出，TOTO-1对含G碱基的DNA有明显的荧光增强作用。
实施例2原理验证2
1、首先，提取细胞培养和端粒酶：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2、接着，我们做几组对照实验：第一组：在含有2mM dNTPs,5μM端粒酶扩增引物(TSprimer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mMEGTA，0.5％(v/v)Tween 20)对其TS Primer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第二组：在含有5μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA，0.5％(v/v)Tween 20)加入750Cells/mL的A549细胞裂解液，对其TS Primer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第三组：在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA，0.5％(v/v)Tween 20)加入热失活的750Cells/mL的A549细胞裂解液，对其TS Primer进行扩增延伸，37℃反应1h。
第四组：在含有2mM dNTPs,5μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA，0.5％(v/v)Tween 20)加入750Cells/mL的A549细胞裂解液，对其TS Primer进行扩增延伸，37℃反应1h。
3、酶切实验步骤：将上述第一组、第二组、第三组、第四组扩增后产物分别与TSprimer的互补DNA在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，分别用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，得到的产物用于下一步试验。同时将实施例1中得到的ds DNA也采用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，得到的产物用于下一步试验(对照2)。
4、荧光检测1：取5μL10μM TOTO-1分别加入到步骤3得到的酶切产物中，孵育1h，对其溶液荧光检测，TOTO-1在溶液中的浓度为250nM。同时设置对照，对照为仅含有250nMTOTO-1的1×PBS溶液；实验结果参见图2B显示，a：TOTO-1(对照1)；b：dsDNA经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度(对照2)；c：dsDNA经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs与TOTO-1孵育的荧光强度(第一组)；d：dsDNA经过ExoⅢ酶切后产物，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度(第二组)；e：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs，热处理A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度(第三组)；f：ds经过ExoⅢ酶切后产物，dNTPs，A549细胞与TOTO-1孵育的荧光强度(第四组)；通过试验得出，必须同时满足第四组试验方案中的所有条件，才能实现该方案，同时进一步说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。
5、荧光检测2：分别测TOTO-1的荧光强度(对照1)、TOTO-1与A549细胞裂解液混合测荧光强度(对照2)、TOTO-1与dNTPs混合测荧光强度(对照3)、dsDNA经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育测荧光强度(对照4)、TOTO-1与TS primer混合测荧光强度(对照5)、将终浓度取3μL初始浓度50cells/mL的A549细胞裂解液，为2mM dNTPs，1μM TS primer，1μM TSprimer互补DNA分别与终浓度250nM TOTO-1混合静置1h，记录溶液的荧光光谱。实验结果见图2C，图2C曲线a：TOTO-1的荧光强度(对照1)；图2C曲线b：TOTO-1与A549细胞的荧光强度(对照2)；图2C曲线c：TOTO-1与dNTPs的荧光强度；图2C曲线d：dsDNA经过ExoⅢ酶切后产物与TOTO-1孵育的荧光强度；图2C曲线e：TOTO-1与TS primer的荧光强度；图2C曲线f：TOTO-1与TS primer互补DNA的荧光强度；。只有TS primer，TS primer互补DNA和TOTO-1的混合溶液有荧光。该实验排除了端粒酶扩增过程中所涉及物质对检测的干扰。
实施例3基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之ExoⅢ酶的背景信号降低作用
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA，0.05％(v/v)Tween 20)加入750cells/mL的A549细胞裂解液，对其TS Primer进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增产物。
3)在上述步骤2扩增后产物中加入5μL10μM TOTO-1，孵育1h，得到产物1，对照实验：直接将TS primer中加入5μL10μM TOTO-1，孵育1h，得到产物2，对两组产物荧光检测。实验结果参见图2D(曲线c,d)显示。c：TS Primer中加TOTO-1的荧光光谱(产物2)；d：TSPrimer经端粒酶扩增后产物加TOTO-1的荧光光谱(产物1)；
4)酶切实验步骤：将上述步骤2扩增后产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，得到产物3，同时设置对照实验：直接将TS primer与TS primer的互补DNA在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，得到产物4。得到的两组产物中分别加TOTO-1，孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果参见图2D(曲线a,b)显示。TS Primer与其互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱；b：TS Primer经端粒酶扩增后产物与TS Primer互补序列杂交后加ExoⅢ酶切后产物加TOTO-1的荧光光谱。
通过图2D可以看出，其中有酶切的信号升高值为空白的4298％(曲线a,b)，无酶切的信号升高值466％(曲线c,d)。故加入ExoⅢ酶可以降低该发明的信号背景，从而提高检测端粒酶的灵敏度。
实施例4基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之TS Primer的浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)Tween 20)将裂解后750cells/mL的A549细胞，在含有2mM dNTPs，分别用不同浓度端粒酶扩增引物(TS primer)(1，2,3,4,5,6μM)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/mL裂解后的A549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：分别将扩增好的产物与相同浓度的TS primer的互补DNA在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用1.5U/μL Exo Ⅲ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：分别取5μL 10μM核酸染料TOTO-1加入到已经用ExoⅢ酶切好的产物中，孵育1h，溶液总体积用1xPBS定容至200μL，此时TOTO-1浓度250nM，对其溶液荧光检测。实验结果如图3A显示，TS Primer浓度选择5μM。
实施例5基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之TOTO-1的浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)Tween 20)将裂解后750cells/mL的A549细胞，在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TSprimer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/mL裂解后的A549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：将扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：分别取0.5、1、2、3、4、5、6μL浓度为10μM的核酸染料TOTO-1加入到已经用ExoⅢ酶切好的的产物中，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1终浓度分别为25、50、100、150、200、250、300nM，孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果如图3B显示，TOTO-1浓度选择处于水平阶段的浓度，选择250nM。
实施例6基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之ExoⅢ酶浓度优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)Tween 20)将裂解后750cells/mL的A549细胞，在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TSprimer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/mL裂解后的A549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，分别用不同浓度ExoⅢ酶(0,0.1,0.4,0.9，1.5，2,3U/μL)切开双链，37℃反应1h,得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：取5μL初始浓度10μM核酸染料TOTO-1分别加入到已经用ExoⅢ酶切好的产物中，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1终浓度250nM孵育1h，对其溶液荧光检测。实验结果如图3C显示，ExoⅢ酶浓度选择处于水平阶段的浓度选择1.5U/μL。
实施例7基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之ExoⅢ酶切时间优化
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)Tween 20)将裂解后750cells/mL的A549细胞，在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TSprimer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/mL裂解后的A549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用浓度1.5U/μLExoⅢ酶切开双链，分别改变酶反应时间(0,10,30,60,120,180,240min)，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μL 10μM核酸染料TOTO-1分别加入到用ExoⅢ酶切采用不同酶切时间好的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1浓度250nM，对其溶液荧光检测。实验结果如图3D显示，ExoⅢ酶切时间大于等于60min即可将双链切开。
实施例8基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之端粒酶选择性验证
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mM dNTPs,1μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(v/v)Tween 20)中滴加750cells/mL A549细胞、750cells/mL高温失活的A549细胞、1mg/mL BSA、1mg/mL HSA、1mg/mL HRP，分别对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用浓度1.5U/μLExoⅢ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μL 10μM核酸染料TOTO-1分别加入到已经用ExoⅢ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1浓度250nM，对其溶液荧光检测。实验结果参见图5显示，只有A549细胞会有荧光信号的增强，说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。
实施例9基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之最优实施例
基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强测定端粒酶活性的检测方法，具体步骤是：
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)端粒酶对端粒酶引物进行扩增步骤：用端粒酶扩增缓冲溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.3，1.5mM MgCl2，0.05mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、0.005％(v/v)Tween 20)将裂解后的A549细胞配置成不同的浓度(A549细胞浓度：0，2，7，13，40，320，750，2000，4000个cells/mL)，在含有2mM dNTPs，5μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液中滴加750cells/mL裂解后的A549细胞对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h得到扩增好的产物。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交，再用1.5U/μL ExoⅢ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：取5μL10μM核酸染料TOTO-1加入到已经用ExoⅢ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1浓度250nM，对其溶液荧光检测。实验结果如图4显示，端粒酶在2～4000cells/mL呈良好的线性关系，检测限时2cells/mL。
实施例10基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法之姜黄素和BIBR两种抑制剂对端粒酶的抑制作用
1)细胞培养和端粒酶提取步骤：A549肺癌细胞在含有10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并在5％CO2，37℃培养箱中培养。所有细胞都是收集于指数生长时期。将4×106个细胞分装于1.5mL的EP管中，用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤两次，并重新分散在200μL冰冷的CHAPS裂解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM MgCl2，1mM EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)，0.5％(w/v)CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，10％(v/v)glycerol(甘油)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中。将细胞在冰上孵育30分钟，然后在4℃，12000rpm的转速下离心20分钟。离心后将澄清的裂解液小心地转移到新的EP管中得到裂解后的A549细胞，快速冷冻并储存在-80℃的冰箱中。
2)在含有2mM dNTPs，1μM端粒酶扩增引物(TS primer)的50μL端粒酶扩增缓冲溶液(60mM Tris-HCl,pH 8.3,1.5mM MgCl2,0.05mM EGTA，0.5％(v/v)Tween 20)中滴加A549细胞和分别加入不同浓度的抑制剂(BIBR浓度：10,100,200,350,600,650nM；姜黄素浓度：2,6,8,10,18,26,34μM)，对其引物进行扩增延伸，37℃反应1h。
3)酶切实验步骤：扩增好的产物(浓度1μM)与TS primer的互补DNA(浓度1μM)在杂交缓冲液(pH 7.4的10mM Tris-HCl，50mM NaCl,1mM EDTA)里面杂交后，用浓度1.5U/μLExoⅢ酶切开双链，37℃反应1h，得到的产物用于下一步试验。
4)端粒酶活性检测步骤：5μL 10μM核酸染料TOTO-1加入到已经用ExoⅢ酶切好的的产物中，孵育1h，检测溶液总体积用1xPBS定容至200μL，TOTO-1浓度250nM，对其溶液荧光检测。实验结果参见图6显示，只有A549细胞会有荧光信号的增强，说明了该方案可以准确用于端粒酶的检测。实验结果显示，抑制剂浓度越高，荧光强度越低，说明了该方案可以准确用于端粒酶抑制剂的选择。该发明对姜黄素与BIBR的半数抑制浓度(IC50)值分别为8.64μM和251nM。随着抑制剂浓度变化，荧光减弱，说明该方法可用于抗癌药物的筛选。
序列表
<110> 东南大学
<120> 基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 端粒酶引物序列(TS primer)
<400> 1
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> TS primer的互补DNA序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aactctgctc gacggatt 18

Claims (7)

1.一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）细胞的培养以及端粒酶的提取获得裂解后的细胞溶液；
2）将裂解后的细胞溶液加入含有TS primer的端粒酶缓冲溶液，对TS primer进行扩增，得到重复的富G序列的产物溶液；
3）在产物溶液中加入TS primer的互补序列和杂交缓冲液进行杂交得到杂交好的产物；
4）杂交好的产物中再加入ExoⅢ酶切除双链，最后加入核酸染料TOTO-1孵育，检测荧光光谱；
所述步骤2）TS primer的序列如SEQ ID NO：1所示，扩增端粒酶时TS primer的浓度为1～6 μM；所述步骤4）中的ExoⅢ 酶的终浓度为0.5～3U/μL，所述步骤4）的核酸染料TOTO-1浓度为25~300nM。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤1）细胞数目为2~4000个。
3.根据权利要求1所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2）具体步骤如下：用端粒酶缓冲溶液将裂解后的细胞溶液配置成不同的浓度，在含有dNTPs、端粒酶扩增引物的端粒酶缓冲溶液中滴加不同浓度的裂解后的细胞溶液对其引物进行扩增延伸，37℃反应1～2 h。
4.根据权利要求3所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤2）端粒酶缓冲溶液为含有MgCl2、EGTA、Tween 20的Tris-HCl，所述MgCl2初始浓度为1～5 mM，EGTA初始浓度为0.05~5 mM，Tween 20初始体积百分比浓度为0.005%～1%，dNTPs初始浓度为0.5~2mM。
5.根据权利要求1所述的一种核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤3）的杂交缓冲溶液为含有NaCl、EDTA的Tris-HCl，所述NaCl初始浓度为50 mM，EDTA的初始浓度0.1～1 mM。
6.根据权利要求1所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强检测端粒酶的方法，其特征在于，所述步骤3）的TS primer的互补序列终浓度为0.5～1μM。
7.根据权利要求6所述的一种基于核酸染料TOTO-1对单链G序列荧光增强检测端粒酶的方法，其特征在于，所述步骤4）的具体步骤如下：取杂交好的产物加ExoⅢ酶，37℃反应1~2小时，取TOTO-1加入到上述反应物中，对其溶液进行记录和荧光光谱检测。
CN201810227750.0A 2018-03-20 2018-03-20 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法 Active CN108486222B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810227750.0A CN108486222B (zh) 2018-03-20 2018-03-20 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810227750.0A CN108486222B (zh) 2018-03-20 2018-03-20 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108486222A CN108486222A (zh) 2018-09-04
CN108486222B true CN108486222B (zh) 2021-08-10

Family

ID=63318496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810227750.0A Active CN108486222B (zh) 2018-03-20 2018-03-20 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108486222B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841135B (zh) * 2017-01-06 2019-05-31 东南大学 一种通过荧光法同时检测多种miRNA的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108486222A (zh) 2018-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6480511B2 (ja) 試料中の核酸配列を定量するための組成物および方法
KR101041106B1 (ko) 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
JP2019162102A (ja) 末梢血中で、がんによって変化したｒｎａを検出するシステムおよび方法
CN107130024B (zh) 一种基于依赖解旋酶DNA恒温扩增技术检测microRNA的方法
Gao et al. In situ detection of plasma exosomal microRNA for lung cancer diagnosis using duplex-specific nuclease and MoS 2 nanosheets
Liu et al. A sensitive and specific method for microRNA detection and in situ imaging based on a CRISPR–Cas9 modified catalytic hairpin assembly
JP2012513216A (ja) Ｘｍｒｖの検出方法
Sun et al. A Cas12a-mediated cascade amplification method for microRNA detection
CN109266721B (zh) 一种基于无猝灭分子信标检测端粒酶活性的方法
CN110777193A (zh) 一种核酸单碱基突变检测的方法
CN109251960A (zh) 基于碱基切除修复诱导的检测Dam甲基转移酶活性方法
CN113308518B (zh) Dna甲基化的超敏检测方法及其应用
You et al. Visual detection of heart failure associated MiRNA with DSN enzyme-based recycling amplification strategy
CN108486222B (zh) 基于核酸染料toto-1对单链g序列荧光增强的检测端粒酶活性的方法
CN108642137B (zh) 一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法
CN114507706B (zh) 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用
CN114196733B (zh) 端粒G四链体DNA与硫黄素T介导的荧光生物传感器及其在lncRNA检测中的应用
CN116716400A (zh) 一种双重催化发夹自组装的序列组、试剂盒及其应用
CN111979295B (zh) 一种酪氨酸磷酸酶生物传感器及其检测方法与应用
KR101802453B1 (ko) 주형, 타겟 및 신호의 누적 증폭을 통한 타겟 핵산 검출 방법
CN116940692A (zh) 用于多核苷酸检测的组及方法
CN110004214B (zh) 一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法
Xu et al. Label-free and sensitive detection of uracil-DNA glycosylase using exponential real-time rolling circle amplification
WO2021130496A1 (en) Method of detecting epigenetic modification
TW202129010A (zh) 檢測聚核苷酸之方法及套組

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant