KR101802453B1

KR101802453B1 - 주형, 타겟 및 신호의 누적 증폭을 통한 타겟 핵산 검출 방법

Info

Publication number: KR101802453B1
Application number: KR1020150173671A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 최윤혁; 김철민
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2015-12-08
Publication date: 2017-11-28
Also published as: KR20170067242A

Abstract

본 발명은 시료, 시료의 검출을 위한 주형 RNA로부터 cDNA로의 역전사 및 이의 증폭을 동시에 수행하고, 이 후 타겟 핵산 및 신호의 누적증폭과 검출을 단일 튜브에서 수행하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 시료의 증폭과 시료의 검출을 위한 타겟 DNA의 증폭이 동시에 등온 조건 하에서 진행되며, 이 후 타겟 핵산 및 신호의 누적증폭을 단일 튜브 내에서 수행할 수 있어, 시료의 오염 가능성이 낮으며, 종래 기술에 비해 핵산 검출 시 민감도 및 특이도가 향상된 특징이 있다.

Description

주형, 타겟 및 신호의 누적 증폭을 통한 타겟 핵산 검출 방법{Method for detecting target nucleic acid via accumulative amplification of template, target and signal}

본 발명은 시료, 시료의 검출을 위한 주형 RNA로부터 cDNA로의 역전사 및 이의 증폭을 동시에 수행하고, 이 후 타겟 핵산 및 신호의 누적증폭과 검출을 단일 튜브에서 수행하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다.

분자진단이란 분자생물학적 기술을 이용해 유전정보물질(DNA, RNA 등)을 검출 및 분석하는 검사로 면역 조직 진단검사, 유전자 진단 검사 등을 포함하는 넓은 범위의 기술이다. 분자진단기술을 이용하면 유전정보물질을 기반으로 유전자와 대사 기능, 의약품의 대사 반응, 질병 관계를 평가할 수 있고 이에 따른 연구 생산성 및 임상 성공률의 증가, 시간 단축, 비용 절감이 가능하므로 생명공학 및 의약학 분야에서 중요성이 대두되고 있다.

분자진단기술 중 핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 데 있어서 매우 유용한 기술이다. 표적 핵산에 대한 핵산 증폭기술의 높은 민감성은 감염성 질환 및 유전성 질환의 진단과 분석을 위한 유전자의 분리 기술 및 법의학적 측면에서 중요하다. 핵산 증폭기술의 대표적인 예로 Real-time RT-PCR 기술, 등온 증폭법, RCA (Rolling Circle Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification), LCR (Ligase Chain Reaction) 등이 당업계에 공지되어 있다.

이 중, Real-time RT-PCR 기술은 RT-PCR을 기반으로 한 기술이며, 역전사(reverse transcription) 단계와 PCR(polymerase chain reaction) 단계로 구분되고, 역전사 단계에서는 주형 RNA가 cDNA로 변환되며 PCR 단계에서는 cDNA가 증폭되어 상보적인 프로브의 시그널 증폭으로 핵산이 검출된다. Real-time RT-PCR 기술은 주형의 증폭과 정량을 동시에 할 수 있으며, 순환 온도 제어을 통한 프라이머의 어닐링이 특이적으로 일어나게 되므로 높은 반응 특이도를 구현할 수 있다는 장점이 있으나, 초기 주형의 양적 차이에 의한 증폭의 민감도에 영향을 받게 되어 검출 효능이 낮아질 수 있다는 단점을 갖고 있다.

한편, 등온 증폭법은 일정한 반응온도 조건 하에서 주형을 증폭시키는 방법이며 대표적으로 NASBA(Nucleic acid sequence based amplification) 방법이 있다. NASBA 방법은 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 T7 프로모터를 포함하는 주형으로부터 RNA 다중 카피를 전사하는 방법으로, 단일온도 조건 하에서 핵산증폭이 이루어지므로 PCR과 같이 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 용이하며 단시간 내에 대량의 증폭이 가능하고, 바이러스 검사나 살아있는 박테리아 검사에 유용하게 사용될 수 있다. 그러나, NASBA 방법을 비롯한 등온증폭 방법은 시스템적으로 정량적인 분석이 어려우며 상대적으로 낮은 온도에서 작용하므로 비특이적 증폭이 일어날 수 있다는 단점이 있다.

최근 감염성 질병 등의 진단에 핵산 증폭기술이 중요하게 사용됨에 따라 다양한 핵산 증폭기술이 개발되고 있다. 그러나 핵산을 직접 증폭하여 측정할 경우, 타 기술보다 높은 검지율을 보이기는 하지만 공정이 복잡하여 측정시 많은 시간 및 노력이 필요하다는 문제점이 제기되어 왔다. 따라서, 기존 기술의 단점을 극복하고, 시료 내의 핵산을 신속하고 정확하게 증폭시켜 검출하기 위한 새로운 방법이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 시료의 증폭과 시료의 검출을 위한 타겟 DNA 및 신호의 증폭을 동시에 수행함으로써 핵산 검출의 민감도를 향상시킬 수 있는 방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 분해효소(ribonuclease) 및 시료를 혼합하는 단계; (b) 역전사효소에 의해서 시료를 역전사하여 DNA를 합성하는 단계; (c) RNA 중합효소에 의해서 상기 DNA로부터 RNA를 전사하고, 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 DNA를 역전사하는 반응을 반복하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및 (d) PCR을 수행하여 DNA 중합효소에 의해서 타겟 DNA를 증폭하고, 동시에 상기 타겟 DNA와 혼성 프로브의 결합이 이루어진 후 RNA 분해효소에 의해서 상기 결합이 분해되어 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하고, 여기서, 상기 (a) 내지 (d) 단계는 단일 튜브 내에서 진행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 RNA 분해효소(ribonuclease)를 포함하는 핵산 증폭용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 핵산 증폭용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 분해효소(ribonuclease) 및 시료를 혼합하는 단계; (b) 역전사효소에 의해서 시료를 역전사하여 DNA를 합성하는 단계; (c) RNA 중합효소에 의해서 상기 DNA로부터 RNA를 전사하고, 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 DNA를 역전사하는 반응을 반복하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및 (d) PCR을 수행하여 DNA 중합효소에 의해서 타겟 DNA를 증폭하고, 동시에 상기 타겟 DNA와 혼성 프로브의 결합이 이루어진 후 RNA 분해효소에 의해서 상기 결합이 분해되어 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하고, 여기서, 상기 (a) 내지 (d) 단계는 단일 튜브 내에서 진행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 RNA 분해효소(ribonuclease)를 포함하는 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 증폭용 키트를 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 시료의 증폭과 시료의 검출을 위한 타겟 DNA의 증폭이 동시에 등온 조건 하에서 진행되며, 이 후 타겟 핵산 및 신호의 누적증폭을 단일 튜브 내에서 수행할 수 있어, 시료의 오염 가능성이 낮으며, 종래 기술에 비해 핵산 검출 시 민감도 및 특이도가 향상된 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 방법의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머의 RNA 증폭 효과를 확인하기 위한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 RNA 중합효소의 농도에 따른 핵산 증폭의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법에 의할 경우 핵산 증폭 효과가 있는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 시료의 초기 양에 따른 핵산 증폭을 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 종래의 핵산 증폭방법과 본 발명의 방법의 효과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 분해효소(ribonuclease) 및 시료를 혼합하는 단계; (b) 역전사효소에 의해서 시료를 역전사하여 DNA를 합성하는 단계; (c) RNA 중합효소에 의해서 상기 DNA로부터 RNA를 전사하고, 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 DNA를 역전사하는 반응을 반복하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계; 및 (d) PCR을 수행하여 DNA 중합효소에 의해서 타겟 DNA를 증폭하고, 동시에 상기 타겟 DNA와 혼성 프로브의 결합이 이루어진 후 RNA 분해효소에 의해서 상기 결합이 분해되어 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하고, 여기서, 상기 (a) 내지 (d) 단계는 단일 튜브 내에서 진행되는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 방법 중 각 단계에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명의 (a) 단계는, RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 분해효소(ribonuclease) 및 시료를 혼합하는 단계이다.

본 발명에서 "시료"는 본 발명의 핵산 증폭용 조성물 내의 효소에 의해 전사, 역전사 등의 반응을 할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 RNA 이며, 상기 RNA는 dsDNA, ssDNA 등의 DNA로부터 전사될 수 있기에, 모든 핵산 분자를 포함한다. 상기 시료에는 인공적인 시료가 포함되며, 본 발명의 핵산 증폭 방법이 진단 용도로 사용되는 경우, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액(CSF), 흉수, 복수, 조직, 세포 및 그의 추출물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

상기 (a) 단계에서, RNA 중합효소 : 역전사효소 : DNA 중합효소 : RNA 분해효소는 2~4 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 2~4 유닛(U)의 비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 3:5:5:3의 유닛(U)의 비율로 혼합될 수 있다.

상기 혼합 범위를 벗어날 경우, 각 효소 간의 반응 저해 효과에 의해 효소의 활성이 저해되어 단일 튜브에서 cDNA 역전사, RNA 증폭 및 DNA 증폭 등의 일련의 과정이 한 번에 진행될 수 없는바, 타겟 핵산의 검출이 불가능하다. 본 발명자들은 상기 효소들이 단일 튜브 내 하나의 조성물 안에 포함될 경우, 기존에 공지된 방법에서 개시하는 조건에 의해서는 타겟 핵산의 검출이 불가능함을 확인하였고 타겟 핵산의 증폭을 위한 새로운 조성물을 발견하였으며, 단일 튜브 내에서 주형, 타겟 핵산 및 신호의 동시 증폭이 가능하여 미량의 시료로부터 빠르고 간편하게 타겟 핵산을 검출할 수 있는 효소의 혼합 비율을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "유닛(U)"은 효소량을 나타내기 위해 규정한 효소단위로서, 효소활성의 강도, 즉 일정조건에서 일정시간에 효소에 의해 촉매된 반응량으로 나타내어진다. 보통 1분 동안 기질 1μmol의 변화를 나타낼 수 있는 효소량을 1 유닛(U)으로 지칭한다.

상기 (a) 단계는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 지칭한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시 할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 특히, 시료 내 RNA 주형의 3' 또는 5' 말단에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열을 삽입하기 위해 설계되는 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터는 코딩 서열의 RNA로의 전사과정을 유도하는 부위를 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 프로모터는 중합효소와 전사인자들이 결합하는 부위를 포함할 수 있다.

상기 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소일 수 있으며, 바람직하게는 T7 RNA 중합효소이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "프로모터 서열" 은 인지된 서열에 결합하여, 전사 과정을 개시함으로써 RNA 전사물을 생성하는 RNA 중합효소에 의해 특이적으로 인지되는 핵산 서열의 영역을 의미한다. 원칙적으로는, 개시 서열을 인지할 수 있는 공지의 입수가능한 중합효소에 사용할 수 있는 것이라면 어떠한 프로모터 서열을 사용해도 무방하다. 공지의 이용가능한 프로모터는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6 같은 특정 박테리오파지 RNA 중합효소에 의해 인지되는 것이다.

상기 프라이머에 의해 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열이 삽입되면 RNA 주형으로부터 역전사되는 DNA 서열에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열이 삽입될 수 있으며, RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열이 삽입된 DNA를 인식하여 DNA로부터 RNA가 전사된다. DNA로부터 전사된 RNA는 시료의 RNA 주형에 상보적이며, 상기 과정의 반복을 통해 RNA를 증폭할 수 있는 바, 이후 타겟 핵산 검출의 민감도가 비약적으로 향상되는 효과를 나타낸다.

본 발명에서 용어 "프로브(probe)"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 일반적으로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 표지될 수 있다.

본 발명에서 프로브는 혼성 프로브(chimeric probe)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 "혼성 프로브(chimeric probe)"는 DNA 및 RNA가 하나의 프로브 내에 혼성되어 있는 프로브를 지칭하며, 더 구체적으로는 DNA의 내부 염기서열 중 일부(1~4개의 핵산서열로 이루어져 있으며 아데닌 또는 구아닌을 포함하고 있는 서열)가 RNA로 치환되어 RNA 분해효소에 의해 분해가 가능한 것을 특징으로 하는 프로브를 지칭한다.

상기 혼성 프로브는 말단이 검출 가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 "검출 가능한 표지 물질"은 바이오틴, 로다민, 사이아닌(Cyanine) 3, 사이아닌 5, 피렌(pyrene), 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa) 488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 카르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘 크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red) 및 티아디카르보시아닌(Thiadicarbocyanine)로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 검출 가능한 표지 물질로서 형광 물질을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 표지 물질을 사용함으로써 (d) 단계에서 타겟 DNA의 정량적 검출이 가능하다.

본 발명의 (b) 단계는, 도 1에 나타낸 바와 같이, (b-1) 역전사효소에 의해서 시료로부터 DNA를 역전사해서 RNA-DNA 이중가닥을 생성하는 단계; (b-2) RNA 분해효소에 의해서 상기 RNA-DNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 분해하는 단계; 및 (b-3) 역전사효소에 의해서 RNA 가닥이 분해되고 남은 DNA 가닥으로부터 상보적인 DNA를 합성하는 단계를 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 과정으로 수행된다.

프라이머가 시료 내 RNA의 3'방향에 어닐링(annealing)되고, 역전사효소에 의해서 시료로부터 시료 내 RNA와 상보적인 DNA가 역전사된다. 그 결과 RNA-DNA 이중가닥이 생성된다. RNA 분해효소에 의해서 상기 RNA-DNA 이중가닥 중 RNA 가닥이 분해되어, 시료 내 RNA에 상보적인 DNA가 남게 된다. 상기 DNA 가닥의 3'방향에 다른 프라이머가 어닐링되고, 역전사효소에 의해서 상보적인 DNA가 합성되어 이중가닥의 DNA가 합성된다. 여기서, 합성된 DNA는 타겟 DNA다.

본 발명에서 용어 "타겟 DNA(target DNA)" 또는 "타겟 핵산(target nucleic acid)"은 프로브와의 결합에 의하여 시료 내 존재하는 RNA 또는 DNA를 동정하기 위해 선택된 핵산을 의미한다. 상기 타겟 DNA 또는 타겟 핵산은 바람직하게, dsDNA이다.

본 발명의 (c) 단계는, 도 1에 나타낸 바와 같이, (c-1) RNA 중합효소에 의해서 상기 (b) 단계에서 합성된 DNA 또는 (c) 단계에서 증폭된 DNA로부터 RNA를 전사하는 단계; (c-2) 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 DNA를 역전사해서 RNA-DNA 이중가닥을 생성하는 단계; (c-3) RNA 분해효소에 의해서 상기 RNA-DNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 분해하는 단계; 및 (c-4) 역전사효소에 의해서 RNA 가닥이 분해되고 남은 DNA 가닥으로부터 상보적인 DNA를 합성하는 단계를 반복하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계를 포함하며, 보다 구체적으로 다음과 같은 과정으로 수행된다.

상기 (b) 단계에서 합성된 DNA는 본 발명의 프라이머에 의해서 5'말단에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열을 포함하므로, RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열을 인식하는 RNA 중합효소에 의해서 DNA로부터 RNA가 전사되며, 상기 전사된 RNA는 시료 내 RNA에 상보적이다. 이후, 상기 (b) 단계와 동일한 과정을 통해 상기 RNA로부터 역전사효소에 의해서 RNA-DNA 이중가닥이 생성된다. RNA 분해효소에 의해서 RNA-DNA 이중가닥 중 RNA 가닥이 분해되어, 시료 내 RNA와 같은 배열의 DNA가 남게 된다. 상기 DNA 가닥의 3'방향에 프라이머가 어닐링되고, 역전사효소에 의해서 상보적인 DNA가 합성되어 이중가닥의 DNA가 합성된다. 여기서, 상기 합성된 타겟 DNA에 다시 RNA 중합효소가 작용하여 RNA가 전사되므로, 검출의 대상인 RNA가 증폭되는 결과를 야기하여 표적 핵산의 검출 민감도가 유의적으로 증가한다. 이처럼, (c) 단계에서 합성된 DNA는 다시 RNA 중합효소에 의해 RNA로 전사되고 이중가닥의 DNA가 되는 (c) 단계를 반복하므로, 타겟 DNA가 증폭되는 결과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 (b) 및 (c) 단계는 동시에 진행되는 것이 특징이므로, 시료 내의 RNA와 타겟 DNA가 동시에 증폭된다.

또한, (b) 및 (c) 단계는 등온반응에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게, 등온반응은 40~50℃의 온도 조건 하에서 수행된다.

상기와 같이, 시료 내의 RNA와 타겟 DNA의 증폭이 등온반응에서 수행될 경우, PCR과 같이 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 용이하고 단시간 내에 대량의 증폭이 가능하고, 바이러스 검사나 살아있는 박테리아 검사에 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 핵산 증폭 방법에는 상기 (c) 단계와 (d) 단계사이에 RNA 중합효소의 활성을 억제하기 위한 고온처리단계가 더 포함될 수 있고, 바람직하게는 80℃ 이상에서 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 94℃에서 수행될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 (d) 단계는, 도 1에 나타낸 바와 같이, (d-1) 상기 (c) 단계에서 증폭된 타겟 DNA를 변성(denaturation)하는 단계; (d-2) 변성된 DNA 단일가닥에 혼성 프로브가 결합(annealing)하는 단계; (d-3) RNA 분해효소에 의해서 상기 혼성 프로브 내의 RNA 서열이 분해되어 상기 결합이 분해되는 단계; 및 (d-4) 분해된 프로브가 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하고, 보다 구체적으로 다음과 같은 과정으로 수행된다.

상기 (d) 단계는 당업계에 공지된 PCR 조건에 따라 수행될 수 있다. 먼저, 적절한 범위의 온도를 처리함에 따라 DNA가 변성(denaturation)되고, 혼성 프로브가 프라이머에 비해 높은 Tm 값을 갖게 되어 프라이머보다 우선하여 단일가닥 DNA에 어닐링하게 되며, 어닐링 반응과 연속적으로 RNA 분해효소, 예컨대 RNA 분해효소 H에 의하여 혼성 프로브 내부의 RNA 서열을 분해하게 되고 이를 통한 Tm 값의 변화가 일어나게 되어 단일 가닥 DNA로부터 분해된 프로브가 분리되면서 신호, 예컨대 형광 신호를 방출하게 된다. 종래의 기술과는 달리, 본 발명과 같이 혼성 프로브(chimeric probe)를 사용하게 될 경우 프로브의 결합, 분해 및 신호 방출이 지속적으로 순환 반복을 일으키게 되므로 전체적인 신호가 누적적으로 증가하게 되어 타겟 DNA의 검출 민감도가 높아지게 되는 효과가 있다. 여기서 단일 가닥 DNA에 혼성 프로브가 결합되어 있는 상태에서 DNA 중합효소가 갖는 5'→3'방향의 DNA 분해효소 활성에 의하여 프로브의 분해가 이루어지고 이를 통하여 신호가 방출되는 과정 또한 동시에 진행된다.

또한, 본 발명의 핵산 증폭방법의 모든 과정은 단일 튜브(tube) 내에서 이루어지므로, 핵산의 실시간 검출을 위한 대량처리가 가능하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 장점은 증폭기술의 광범위한 사용을 제한하였던 오염에 의한 부가반응이 발생할 위험을 최소화시킬 수 있다.

본 발명에서 용어 "RNA 중합효소(RNA polymerase)"는 RNA를 합성하는 효소의 총칭으로, DNA를 주형으로 RNA를 합성하는 효소, RNA를 주형으로 RNA를 합성하는 효소, RNA 복제효소를 포함하는 개념으로, T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, SP6 RNA 중합효소일 수 있으며, 바람직하게는 T7 RNA 중합효소이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "역전사효소(reverse trasncriptase)"는 레트로바이러스에서 발견되었으며, RNA를 주형으로 하여 DNA를 합성하는 효소를 지칭하며 DNA 의존성 DNA 중합효소의 활성도 갖는다. 용어 "역전사"란 효소가 RNA 사슬을 주형으로 이용하여 DNA 사슬(즉, 상보적인 DNA 또는 cDNA)을 합성할 수 있는 능력을 말한다. 본 발명의 역전사효소는 본 명세서에서 개시되거나 본 기술분야에서 공지인 임의의 방법에 따라 측정할 때 역전사효소 활성을 나타내는 임의의 효소를 말한다. 본 발명의 일 실시예에서 RNAaseH 활성이 결손된 REV RH(-) Revese Transcriptase를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "DNA 중합효소(DNA polymerase)"는 주형 DNA (template DNA)에 의존하여 5'→3' 방향으로 DNA를 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제 (DNA replication)나 수리 (DNA repair)시에 가장 중요한 역할을 하는 효소를 지칭한다. 본 발명의 DNA 중합효소는 DNA를 합성하는 효소를 제한 없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 열안정성 (내열성)을 나타내는 DNA 중합효소로서 고온의 최적 온도를 가지는 중합효소, 예컨대 Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermis flavus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Thermotoga maritima, Pyrococcus profundus, Thermococcus stetteri, Thermococcus peptonophilus, Thermococus celer, Thermococcus fumicolans 및 Thermococcus litoralis로부터 분리된 DNA 중합효소이다. 보다 바람직하게는, Thermus aquaticus로부터 분리된 Taq DNA 중합효소이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "RNA 분해효소(ribonuclease)"는 RNA 내의 뉴클레오티드 사이의 인산에스테르 결합을 가수분해하는 효소를 지칭한다. RNA 분해효소에는 폴리뉴클레오티드사슬의 말단에만 작용하는 핵산말단가수분해효소(exonuclease)와 인식하는 구조가 있으면 폴리뉴클레오티드 사슬 어디에나 작용하는 핵산내부가수분해효소(enconuclease)가 있으며, 기질에 대한 특이성이 다양하다. 본 발명에서 사용한 RNA 분해효소는 DNA-RNA 이중가닥의 퓨린(Purine)기를 특이적으로 분해 할 수 있는 효소이며, 바람직하게는 RNase H이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 DNA-RNA 이중가닥의 퓨린기를 특이적으로 분해할 수 있는 RNA 분해효소를 사용함으로써 혼성 프로브 내부의 RNA 서열을 분해하였으며, 이를 통해 Tm 값의 변화가 일어나게 되어 프로브가 단일 가닥 DNA로부터 분리되면서 신호를 방출할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭용 조성물은 상기 4 종류의 효소 외에도 RNA 증폭의 효율을 위해 필요한 Tris-HCl, NTP, DTT, MgCl₂, Spermidine, RNA 분해효소의 활성을 위해 필요한 HEPES 완충액, Trehalose, BSA, RT-PCR을 위해 필요한 PCR 완충액, dNTP, MgCl₂, Trehalose를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭용 조성물은 4 종류의 효소를 모두 포함하는 것을 특징으로 하며, 4 종류의 효소가 모두 작동하는 조건 하에서 핵산 시료, 검출에 필요한 타겟 핵산 및 신호를 동시에 증폭하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭용 조성물 내에서 상기 RNA 중합효소 : 역전사효소 : DNA 중합효소 : RNA 분해효소는 2~4 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 2~4 유닛(U)의 비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 3:5:5:3의 유닛(U)의 비율로 혼합될 수 있다.

효소는 상기 비율로 혼합되는 경우, 효소 상호간 반응의 저해 없이 4 종류의 효소가 특정 온도에서 활성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 증폭용 조성물을 포함하는 핵산 증폭용 키트를 제공한다.

상기 키트는 핵산 또는 항체 이외에 유전자 발현량이나 유전자 발현량이나 발현 패턴의 분석 방법 또는 단백질 존재량이나 존재 패턴의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트가 유전자의 발현량이나 발현 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 바이오마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 키트가 단백질의 존재량이나 존재 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, 이 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 또는 단백질 마이크로어레이를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: RNA 증폭을 위한 프라이머 (primer) 설계

시료 내 주형 RNA를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예로써 엔테로바이러스 유전자인 VP1 또는 VP3를 타겟으로 하며, 타겟의 5' 또는 3' 말단에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 T7 프로모터 서열을 삽입하기 위하여 하기와 같은 프라이머를 설계하였다. 대조군으로는 T7 프로모터 서열을 삽입하지 않은 VP1 또는 VP3 특이적 프라이머를 사용하였다.

* 대조군 프라이머

EVcom Primer 1 : 5'- CGGCCCCTGAATGCGCCTAA -3'

EVcom Primer 2 : 5'- ATTGTCACCATAAGCAGCCA -3'

* 본 발명의 프라이머

EV-N Primer 1 :

5'- TAATACGACTCACTATAGGGCGGCCCCTGAATGCGCCTAA -3'

EV-N Primer 2 :

5'- TAATACGACTCACTATAGGGATTGTCACCATAAGCAGCCA -3'

실시예 2: RNA 증폭 확인

상기 실시예 1의 프라이머에 의해서 주형 RNA가 증폭되는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 엔테로바이러스 배양액 또는 상기 바이러스가 감염된 세포의 파쇄물을 원심분리하여 얻은 상층액으로부터 엔테로바이러스의 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 (주)인트론바이오테크놀로지사의 Pathogene-spin^TM DNA/RNA Extraction Kit를 사용하여 제품 사용 설명에 따라 실시하였다.

RNA 시료의 증폭을 확인하기 위하여, 주형 RNA 10ng에 대해 인트론바이오테크놀로지사의 Maxime^TM RT-PCR premix 키트 또는 Maxime^TM i-StarTaq 키트를 이용하여 제조사의 제품 사용 설명에 따라 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 40초를 40회 반복한 후 72℃에서 5분 처리하는 방식으로 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 산물을 전기영동으로 확인한 결과를 도 2(INPUT)에 나타내었다. 또한, RT-PCR 산물 10ng을 주형으로 하여 실시예 1의 프라이머(최종 농도가 10pM) 및 T7 RNA 중합효소(엔지노믹스, cat. RP001S)를 첨가하고 45℃에서 30분, 94℃에서 10분 처리하였다. 상기 처리 후 산물을 PCR로 증폭하여 DNA를 전기영동으로 확인한 결과를 도 2(TRANSCRIPTION)에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 프라이머가 잘 작동하여 T7 RNA 중합효소에 의해서 RNA가 증폭됨을 확인하였다.

실시예 3: RNA 중합효소의 농도에 따른 핵산증폭 억제 효과 확인

본 발명에 따른 방법에 의해서 주형의 등온증폭 과정과 표적 핵산의 증폭 과정을 동시에 수행할 경우 RNA 중합효소의 농도에 따른 핵산증폭 억제 효과를 확인하기 위해서 하기와 같이 수행하였다. 주형 RNA 10ng, RT-PCR용 시약(완충액, dNTP, MgCl₂, 50% trehalose, Rnase 저해제, REV Rtase, DNA 폴리머라제), 프라이머(최종 농도가 10pM), T7 RNA 중합효소(엔지노믹스, cat. RP001S), RNase H 활성을 위한 시약(HEPES 완충액, 50% trehalose, BSA, Rnase 저해제, RNase H)를 혼합하였다. cDNA 합성 단계로서, 상기 시료를 45℃에서 30분, 94℃에서 10분 처리하여 cDNA를 합성하였다. 이 때 T7 RNA 중합효소를 1U, 2U, 4U, 8U, 16U, 32U, 64U, 128U로 처리하였다. 상기 처리 후 주형 증폭 단계로서, 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 40초를 40회 반복한 후 72℃에서 5분 처리한 뒤 4℃에 방치하였다. 이를 전기영동으로 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 in 으로 표시된 레인은 증폭 전 주형 RNA이고, 1 내지 8로 표시된 레인은 각각 T7 RNA 폴리머라제를 1U, 2U, 4U, 8U, 16U, 32U, 64U, 128U로 처리하여 반응시킨 결과물이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 반응의 증폭방법에 따라 주형 RNA가 증폭되었음을 확인하였으며, T7 RNA 중합효소에의 농도가 증가함에 따라 RNA 증폭 효율이 감소함을 확인하였다.

이러한 결과를 통해, 본 발명의 구현에 필수적인 효소의 동시 작용에 있어서 각 효소의 작용을 위한 최적의 조건이 상이하고 각 효소가 상호간 반응을 저해할 수 있으므로, 종래 기술에 사용되던 조건이 아닌 새로운 조건을 확립해야 함을 알 수 있다.

실시예 4: 반응 조건 확립

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 구현을 위해서는 반응 조건 및 조성물 내의 혼합 비율이 확립된 독자적인 PCR 조성물이 필요하다. 일 구현예로써, 하기의 표 1 내지 3과 같은 종래의 조성물 및 사용량으로 RNA 주형 증폭 실험을 수행하였으며, 효소의 양을 조절해가며 동일 실험을 반복하였다.

상기 표 1 내지 3의 반응 조성물 내 성분의 비율을 조절하여, RNA 주형 10ng, 상기 실시예 1의 프라이머를 혼합한 뒤, 45℃에서 30분, 94℃에서 10분 처리하여 cDNA를 합성한 이후 94℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 40초를 40회 반복한 후 72℃에서 5분 처리한 뒤 4℃에 방치하였다. 이를 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 확인한 결과를 도 4에 나타내었다(레인 4). 대조군으로서, 실시예 1의 대조군 프라이머를 사용하여 종래 공지된 방법에 따라 RT-PCR를 수행하였고(레인 1 및 2), 상기 온도 조건에서 종래 공지된 방법에 따라 PCR 조성물을 제조하여 PCR을 수행하였다(레인 3).

도 4에 나타낸 바와 같이, 동일량의 주형을 사용하여 종래의 RT-PCR 방법을 수행할 경우, 표적 핵산이 증폭되긴 하나 증폭 효율이 낮고(레인 1 및 2), 상기 온도 조건 하에서 종래의 PCR 방법을 수행한 결과 표적 핵산이 증폭되지 않음을 확인하였다(레인 3). 반면, 상기 온도 조건에 따라 효소의 조성 비율을 변화시키며 표적 핵산을 증폭한 결과 특정 효소 비율 조건 하에서 표적 핵산 검출의 민감도가 비약적으로 향상됨을 확인하였다(레인 4).

최종적으로 본 실시예를 통해 확인된 핵산 증폭용 반응 조성물의 조성비는 하기와 같다.

* HEPES Buffer(pH6.8), 0.25mM dNTP, 1.25mM NTP, REV-RTase 5U, RNaseH 3U, T7 Polymerase 3U, BSA 5mg, Trehalose 5%, DNA polymerase 5U, RNase inhibitor 6U, DTT 1mM, Spermidine 0.1mM 및 미량의 PCR 인핸서(enhancer)들.

실시예 5: 증폭된 RNA 검출을 위한 프로브 (probe) 설계

증폭된 RNA 및 증폭된 표적 핵산의 신호 검출을 위해 필요한 혼성 프로브(chimeric probe)를 설계하였다. 혼성 프로브란, 프로브 서열 중 일부 서열이 RNA로 치환된 프로브를 말하며, 이러한 혼성 프로브가 증폭된 RNA 산물에 결합하여 이중가닥을 형성한 후, RNase H에 의해 프로브 중 일부 RNA 서열이 절단되면 형광 신호가 나타나는데 이러한 신호의 세기를 측정하여 RNA 증폭을 검출할 수 있다.

대조군으로는 엔테로바이러스의 VP1 또는 VP3에 특이적인 프로브를 사용하였으며, 본 발명의 일 구현예로써 엔테로바이러스의 VP1 또는 VP3에 특이적인 프로브 서열 중 일부를 RNA 서열로 치환한 프로브를 사용하였다.

* 대조군 프로브

EVcom Probe :

/FAM/ 5'-AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3' /BHQ1/

* 본 발명의 프로브

EV-Chimeric Probe :

/FAM/ 5'-AACCGACTACTTTrGrGrGTGTCCGTGTTT-3' /BHQ1/

실시예 6: 증폭된 핵산의 검출 확인

상기 실시예 4로부터 확정된 핵산 증폭용 반응 조성물을 이용하여 RNA 증폭에 의한 표적 핵산의 검출 가부를 확인하기 위하여, 실시예 5에서 설계한 프로브를 이용하였다. 구체적으로, 실시예 4의 반응 조성물, 프로브, RNA 주형(1ng, 10^-1ng, 10^-2ng, 10^-3ng, 10^-4ng, 10^-5ng, 10^-6ng)을 혼합하고 실시예 4의 조건으로 LG전자의 SLAN Real-time PCR 기기를 이용하여 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이 실시예의 조건에 따라 표적 핵산을 검출할 수 있음을 확인하였다.

비교예 1

본 발명의 방법과 종래 기술인 RT-NASBA, Taqman 기술 및 Chimeric 기술의 증폭 민감도를 비교하였다. Taqman 기술은 종래의 realtime RT-PCR 기술과 동등하므로 실시예 4의 표 1 의 조성을 사용하였으며 Chimeric 기술의 경우 실시예 4의 표 1과 표 3을 조합한 조성을 사용하였다. RT-PCR 조건은 종래기술과 본 발명의 기술 조건의 동등성을 위하여 실시예 4에서 사용한 조건을 그대로 사용하여 동시 비교하였다. RT-NASBA의 경우 등온증폭조건으로 45℃에서 50분간 처리하고 1분마다 형광 시그널을 측정하여 증폭을 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법(MAT Technology)에 의하면 종래 기술에 비해 민감도가 10~100배 이상(Ct값 3~7 이상) 증가함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용하면 주형의 등온증폭과 타겟 핵산의 증폭을 동시해 수행함으로써 핵산검출시 민감도 및 특이도를 비약적으로 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

(a) RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase), RNA 분해효소(ribonuclease)를 2~4 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 2~4 유닛(U)의 비율로 혼합한 시료 및 주형 RNA의 3' 또는 5' 말단에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열을 삽입하기 위한 프라이머를 혼합하는 단계;
(b) 역전사효소에 의해서 시료를 역전사하여 cDNA를 등온조건에서 합성하는 단계;
(c) RNA 중합효소에 의해서 상기 cDNA로부터 RNA를 전사하고, 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 cDNA를 역전사하는 반응을 반복하여 타겟 DNA를 등온조건에서 증폭하는 단계; 및
(d) PCR을 수행하여 DNA 중합효소에 의해서 타겟 DNA를 증폭하고, 동시에 상기 타겟 DNA와 혼성 프로브의 결합이 이루어진 후 RNA 분해효소에 의해서 상기 결합이 분해되어 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하고,
여기서, 상기 (a) 내지 (d) 단계는 단일 튜브 내에서 진행되는 것을 특징으로 하는, 핵산 증폭 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 RNA 중합효소 : 역전사효소 : DNA 중합효소 : RNA 분해효소는 3:5:5:3의 유닛(U)의 비율로 혼합되는 것인, 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b-1) 역전사효소에 의해서 시료로부터 cDNA를 역전사해서 RNA-cDNA 이중가닥을 생성하는 단계; (b-2) RNA 분해효소에 의해서 상기 RNA-cDNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 분해하는 단계; 및 (b-3) 역전사효소에 의해서 RNA 가닥이 분해되고 남은 cDNA 가닥으로부터 상보적인 DNA를 합성하는 단계를 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 (c-1) RNA 중합효소에 의해서 상기 (b) 단계에서 합성된 cDNA 또는 (c) 단계에서 증폭된 cDNA로부터 RNA를 전사하는 단계; (c-2) 역전사효소에 의해서 상기 전사된 RNA로부터 cDNA를 역전사해서 RNA-cDNA 이중가닥을 생성하는 단계; (c-3) RNA 분해효소에 의해서 상기 RNA-cDNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 분해하는 단계; 및 (c-4) 역전사효소에 의해서 RNA 가닥이 분해되고 남은 cDNA 가닥으로부터 상보적인 DNA를 합성하는 단계를 반복하여 타겟 DNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계는 동시에 진행되는 것인, 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 (d-1) 상기 (c) 단계에서 증폭된 타겟 DNA를 변성(denaturation)하는 단계; (d-2) 변성된 DNA 단일가닥에 혼성 프로브가 결합(annealing)하는 단계; (d-3) RNA 분해효소에 의해서 상기 혼성 프로브 내의 RNA 서열이 분해되어 상기 결합이 분해되는 단계; 및 (d-4) 분해된 프로브가 신호를 방출하는 반응을 반복하여 타겟 DNA 및 신호를 증폭하는 단계;를 포함하는, 핵산 증폭 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 프로브를 더 포함하여 혼합하는 것인, 핵산 증폭 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 RNA 중합효소는 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 및 SP6 RNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 핵산 증폭 방법.
제8항에 있어서, 상기 프로브는 혼성 프로브(chimeric probe)인, 핵산 증폭 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 등온반응은 40~50℃에서 수행되는 것인, 핵산 증폭 방법.
RNA 중합효소(RNA polymerase), 역전사효소(reverse trasncriptase), DNA 중합효소(DNA polymerase) 및 RNA 분해효소(ribonuclease)를 2~4 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 4~6 유닛(U) : 2~4 유닛(U)의 비율로 혼합한 시료 및 주형 RNA의 3' 또는 5' 말단에 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 프로모터 서열을 삽입하기 위한 프라이머를 포함하는, 핵산 증폭용 조성물.
삭제
제14항에 있어서, 조성물 내에 상기 RNA 중합효소 : 역전사효소 : DNA 중합효소 : RNA 분해효소가 3:5:5:3의 유닛(U)의 비율로 혼합된 것인, 핵산 증폭용 조성물.
제14항의 조성물을 포함하는, 핵산 증폭용 키트.