JP2020530434A - Ｒｎａおよびｄｎａからの核酸ライブラリーの作製 - Google Patents

Ｒｎａおよびｄｎａからの核酸ライブラリーの作製 Download PDF

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Abstract

本発明の方法および組成物のいくつかの態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡから誘導される核酸ライブラリーの作製および使用に関する。いくつかの態様において、核酸ライブラリーは、ＲＮＡから誘導されるポリヌクレオチドにタグを付けることによって作製することができる。いくつかの態様は、そのようなライブラリーからの配列データの解析を含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、引用によりその全体が本書の一部とされる、２０１８年３月２２日に出願された“PREPARATION OF NUCLEIC ACID LIBRARIES FROM RNA AND DNA”と題する米国仮出願第６２／６４６４８７号に基づく優先権を主張する。
発明の分野
本発明の方法および組成物のいくつかの態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡから誘導される核酸ライブラリーの作製および使用に関する。いくつかの態様において、核酸ライブラリーは、ＲＮＡから誘導されるポリヌクレオチドにタグを付けることによって作製することができる。
組織サンプルの全ゲノムシーケンシング、ジェノタイピング、ターゲット・リシーケンシング、および遺伝子発現解析は、患者における疾患バイオマーカーの同定、疾患の正確な診断および予後診断、ならびに適切な処置の選択のために極めて重要でありうる。例えば、患者から採取した腫瘍組織の核酸配列解析によって、体細胞バリアント、構造再構成（structural rearrangement）、点変異、欠失、挿入といった特定の遺伝子バイオマーカーの存否、および／または特定遺伝子の存否を決定することができる。配列解析のために、セルフリー（cell-free）サンプルを用いて核酸ライブラリーを作製することができる。しかしながら、そのようなライブラリーにおいて、疾患バイオマーカーを含む核酸は稀であり得、検出が困難でありうる。
したがって、疾患バイオマーカー検出の感度を高めることが望まれる。
いくつかの態様は、
（ａ）複数のポリヌクレオチドを、複数の、タグを含むプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
（ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
（ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること
を含む、核酸ライブラリーを作製する方法を含む。いくつかの態様は、（ｄ）該核酸ライブラリーをシーケンスすることをも含む。いくつかの態様は、（ｅ）該タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、該複数のポリヌクレオチドの該ＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをも含む。いくつかの態様は、該タグを欠くポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、該複数のポリヌクレオチドの該ＤＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをも含む。
いくつかの態様において、複数のプライマーは異なる配列を含む。いくつかの態様において、各プライマーはそれぞれ異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、１００００を超える異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、１０００００を超える異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、ランダムヘキサマー配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、同じタグを含む。
いくつかの態様において、逆転写酵素はＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く。いくつかの態様において、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス（Ｒｏｕｓ）随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、
いくつかの態様において、（ｂ）は、前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる。いくつかの態様において、（ｂ）は、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの態様において、（ｃ）は、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む。
いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドはセルフリーである。いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドは、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得る。
いくつかの態様は、
（ａ）複数のポリヌクレオチドを複数のプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
（ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
（ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること
を含む、核酸ライブラリーを作製する方法を含む。
いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドはセルフリーである。いくつかの態様において、複数のポリヌクレオチドは、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得る。
いくつかの態様において、複数のプライマーは異なる配列を含む。いくつかの態様において、各プライマーはそれぞれ異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、１００００を超える異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、１０００００を超える異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、ランダムヘキサマー配列を含む。
いくつかの態様において、逆転写酵素はＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く。いくつかの態様において、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される。
いくつかの態様において、（ｂ）は、前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる。いくつかの態様において、（ｂ）は、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む。いくつかの態様において、（ｃ）は、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む。
いくつかの態様は、
（ｉ）前記方法のいずれか１つによって核酸サンプルから作製された核酸ライブラリーから、配列データを得ること；および
（ii）タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定すること
を含む、核酸サンプル中の核酸を同定する方法を含む。いくつかの態様は、（iii）タグを含むポリヌクレオチド配列におけるバリアントを同定することをも含む。いくつかの態様において、該バリアントは、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、置換、転位、重複、および遺伝子融合からなる群から選択される。いくつかの態様は、タグを含むポリヌクレオチド配列中の逆転写エラーを同定することをも含む。いくつかの態様は、タグを含むポリヌクレオチドを参照配列と比較することをも含む。いくつかの態様において、参照配列は、該核酸ライブラリーのＤＮＡポリヌクレオチドから誘導される。いくつかの態様において、前記サンプルはセルフリー核酸を含む。いくつかの態様において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択されるＲＮＡである。
いくつかの態様は、
逆転写酵素；および
複数の、タグを含むプライマー；ここで各プライマーは異なる
を含む、核酸ライブラリーを作製するためのキットを含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは同じタグを含む。いくつかの態様は、キナーゼ、ＲＮアーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターかからなる群から選択される成分をも含む。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く。いくつかの態様において、逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される。
図１は、ＲＮＡおよびＤＮＡから核酸ライブラリーを作製し、それをシーケンスする態様を示す図である。 図２は、複数の患者からのサンプルにおける特定の核酸の濃度のグラフである。 図３は、逆転写ステップを含む（ＲＴカウント）、または含まない（ｍｏｃｋ ＲＴカウント）方法により作製されたライブラリーから得た、特定の配列の数のグラフである。 図４は、ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルにおいて試験された、逆転写ステップを含む方法で作製されたライブラリー（ＲＴ）と、逆転写ステップを含まない方法で作製されたライブラリー（ｍｏｃｋ ＲＴ）との、特定の遺伝子領域のカバーの比を示すグラフである。 図５は、逆転写ステップを行って作製されたライブラリーにおいて増加した頻度で見られた変異の数のグラフである。 図６は、逆転写酵素を用いるか（Ａ）、または逆転写酵素を用いずに（Ｂ）、タグ付けされたランダムヘキサマーを用いて作製されたライブラリーからの、読み取りの数を示すグラフである。
本発明の方法および組成物の態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡから誘導される核酸ライブラリーの作製および使用に関する。いくつかの態様において、核酸ライブラリーは、ＲＮＡから誘導されるポリヌクレオチドにタグを付けることによって作製することができる。
体液、例えば血清、涙液、尿および汗は、セルフリー核酸を含む。そのような核酸は、疾患バイオマーカーを含みうる。しかしながら、そのような液体におけるそのようなバイオマーカーの頻度または濃度は、極めて低くありうる。いくつかの態様は、ＲＮＡおよびＤＮＡから、疾患バイオマーカーを包含する特定の核酸の検出感度を高める核酸ライブラリーを作製することを含む。
いくつかの態様は、ＲＮＡを、タグを含むプライマーを用いて逆転写して、該タグの配列を、該ＲＮＡから誘導されるポリヌクレオチドに組み込むことによって、核酸ライブラリーを作製することを含む。したがって、該ＲＮＡから誘導された配列を、タグによって同定することができる。いくつかの態様において、核酸配列のソースを識別することは、バリアントが、ライブラリー作製、例えば逆転写ステップの結果でありうるかを決定するために有用でありうる。いくつかの態様において、核酸配列のソースを識別することは、スプライスバリアント、組織特異的バリアント、ノンコーディングＲＮＡ、および特定の遺伝子融合を同定するために有用でありうる。ノンコーディングＲＮＡ、例えば長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、特定の癌タイプを同定し特徴付けるために有用でありうる。例えば、Yan, X., et al., (2015)“Comprehensive Genomic Characterization of Long Non-coding RNAs across Human Cancers”, Cancer Cell 28:529-540を参照されたい（その全体を引用により本書の一部とする）。セルフリーｌｎｃＲＮＡは、他のＲＮＡ、例えばタンパク質をコードするＲＮＡよりも、二次構造の故に血漿中でより安定でありうる。
本書において、「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、およびそのアナログをさしうる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を示しうる。また、ポリヌクレオチドの構造の記載は、５’または３’末端によることがあるが、これはポリヌクレオチドの方向性を示すものである。一本鎖ポリヌクレオチドにおいて、隣接ヌクレオチドどうしは典型的には、３’炭素と５’炭素の間のホスホジエステル結合によって連結される。しかしながら、例えばメチレン結合、ホスホラミデート結合等を包含する結合のような、異なるヌクレオチド間結合も用いられうる。このことは、５’および３’末端と称されうるポリヌクレオチドのいずれかの端において、対応する５’または３’炭素が暴露されうることを意味する。５’および３’末端はそれぞれ、該末端に結合している化学基から、ホスホリル（ＰＯ４）およびヒドロキシル（ＯＨ）末端とも称される。用語ポリヌクレオチドはまた、二本鎖および一本鎖のいずれの分子をもさす。ポリヌクレオチドの例は、遺伝子および遺伝子断片、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えばＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（PIWI-interacting RNA；ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）およびウイルスＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、または前記のいずれかの増幅されたコピーを包含する。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、例えば非天然の塩基を含むヌクレオチド、修飾された天然塩基（例えばアザ−またはデアザ−プリン）を含むヌクレオチドを包含しうる。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）の４種のヌクレオチド塩基の、ある特定の配列からなりうる。ウラシル（Ｕ）も、例えば、ポリヌクレオチドがＲＮＡであり場合にチミンの天然代替物として存在しうる。ウラシルはＤＮＡにおいても用いられうる。したがって、用語「配列」とは、天然および非天然の塩基を含む、ポリヌクレオチドまたは任意の核酸分子を、アルファベットで表したものをさす。
本書において、「ＲＮＡ分子」またはリボ核酸分子は、デオキシリボース糖よりもむしろリボース糖、および典型的にはピリミジン塩基の１つとしてチミンよりもむしろウラシルを有するポリヌクレオチドをさしうる。ＲＮＡ分子は通常、一本鎖であるが、２本鎖でもありうる。ＲＮＡサンプルからのＲＮＡ分子については、ＲＮＡ分子は、細胞核、ミトコンドリア、クロロプラストまたは細菌細胞においてＤＮＡから転写された一本鎖分子を包含し得、これは、転写元のＤＮＡ鎖に相補的なヌクレオチド塩基の線状配列を有する。
本書において、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」またはその文法上の変化形は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドが反応して複合体を形成する反応をさし得、ここで、該複合体は、少なくとも部分的に、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって形成される。該水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成によって、フーグスティーン（Hoogstein）結合によって、または他の任意の配列特異的な様式で生じうる。該複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本またはそれ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組み合わせを有しうる。鎖はまた、水素結合に加えて他の力によって、架橋または他の様式で連結しうる。
本書において、「伸長する」、「伸長」またはその文法上の変化形は、伸長酵素、例えばポリメラーゼによる、プライマー、ポリヌクレオチドまたは他の核酸分子へのｄＮＴＰの付加をさしうる。例えば、本書に開示するいくつかの方法において、生成する伸長されたプライマーは、ＲＮＡの配列情報を含む。伸長を、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いて行うものとして、いくつかの態様を説明するが、伸長は、当分野で周知の任意の他の方法で行うこともできる。例えば、伸長は、短いランダムオリゴヌクレオチドどうし、例えば関心のある鎖にハイブリダイズされているオリゴヌクレオチドどうしをライゲートすることにより行うことができる。
本書において、「逆転写」とは、ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列をＤＮＡ分子にコピーするプロセスをさしうる。逆転写は、鋳型ＲＮＡを、逆転写酵素としても知られるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと接触させることによってなされうる。逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡに転写するＤＮＡポリメラーゼである。用いられるポリメラーゼによっては、該逆転写酵素は、後で鋳型ＲＮＡを分解するためのＲＮアーゼＨ活性をも有しうる。
本書において、「相補的ＤＮＡ」または「ｃＤＮＡ」とは、逆転写酵素の作用によってＲＮＡから逆転写された合成ＤＮＡをさしうる。ｃＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得、ＲＮＡ配列の一部と実質的に同じ配列、またはＲＮＡ配列の一部に対する相補配列の、一方または両方を有する鎖を含むことができる。
本書において、「ｃＤＮＡライブラリー」とは、ＲＮＡ配列から生成されたＤＮＡ配列のコレクションをさしうる。ｃＤＮＡライブラリーは、該ＲＮＡの抽出元のサンプル中に存在するＲＮＡを表すことができる。いくつかの態様において、ｃＤＮＡライブラリーは、セルフリー核酸サンプル中に存在するＲＮＡを表すことができる。いくつかの態様において、ｃＤＮＡライブラリーは、１つの細胞または細胞集団において産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）および他のノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を包含する、ある特定の細胞または細胞集団のトランスクリプトームのすべてまたは一部を表すことができる。
本書において、「ライゲーション」もしくは「ライゲートする」またはその文法上の変化形は、２つのヌクレオチド鎖をホスホジエステル結合によって連結することをさしうる。そのような反応は、リガーゼによって触媒されうる。リガーゼとは、この反応をＡＴＰまたは同様のトリホスフェートの加水分解を伴って触媒する酵素群をさす。
本書において、核酸の配列に関して用いられる「誘導された」という表現は、その核酸を得たソースについて述べるものでありうる。例えば、配列を、サンプル中のＲＮＡ分子から誘導された核酸から得ることができる。さらに、ある特定のソースまたは源から誘導された核酸分子は、それとは別に、続いてコピーまたは増幅させうる。得られるコピーまたはアンプリコンの配列を、前記ソースまたは源から誘導されたもの、ということができる。
核酸ライブラリーの作製
いくつかの態様は、核酸ライブラリーの作製方法を含む。そのような態様のいくつかは、
ＲＮＡおよびＤＮＡを含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを入手すること；
該複数のポリヌクレオチドを複数のプライマーとハイブリダイズすること；および
該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること
を含みうる。そのような態様のいくつかにおいて、プライマーはタグを含む。いくつか態様は、該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから核酸ライブラリーを形成することをも含む。
いくつかの態様において、サンプルは、セルフリーの核酸、例えばＲＮＡおよびＤＮＡを含みうる。本書において核酸に関していう「セルフリー」とは、インビボで細胞から放出されている核酸のことをさしうる。該核酸放出は、壊死またはアポトーシスのような自然のプロセスでありうる。セルフリー核酸は、血液またはその画分、例えば血清から得ることができる。セルフリー核酸は、他の体液または体組織から得ることもでき、その例には、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙が包含される。
いくつかの態様は、プライマーの使用を含む。本書において「プライマー」とは、サンプル中に存在する標的または鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることによって結合し、その後伸長を促進して、該標的または鋳型に相補的なポリヌクレオチドを形成する、通常は遊離３’−ＯＨ基を有する、短いポリヌクレオチドをさしうる。プライマーは、５〜１０００ヌクレオチドまたはそれ以上の範囲のポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの態様において、プライマーは、少なくとも４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドの長さ、または前記長さの任意の２つの範囲内の長さを有する。
プライマーは、ランダムヌクレオチド配列を含みうる。本書において「ランダムヌクレオチド配列」とは、ポリヌクレオチド集団において、他のランダムヌクレオチド配列と組み合わされたとき、ある与えられた長さのヌクレオチドの、すべてまたは実質的にすべての可能なヌクレオチド組み合わせを表す、さまざまな配列のヌクレオチドをさしうる。例えば、ある与えられた位置において存在することが可能なヌクレオチドは４種であるから、２個のランダムヌクレオチドの長さの配列は１６の可能な組み合わせを有し、３個のランダムヌクレオチドの長さの配列は６４の可能な組み合わせを有し、４個のランダムヌクレオチドの長さの配列は２６５の可能な組み合わせを有する。ランダムヌクレオチド配列は、サンプル中の任意の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする可能性を有する。プライマーにおけるランダム配列は、複数の連続したヌクレオチドを含むことができ、少なくとも４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチドの長さ、または前記長さの任意の２つの範囲内の長さを有することができる。いくつかの態様において、複数のプライマーは、異なるランダム配列を含むプライマーを含みうる。いくつかの態様は、複数のプライマーの使用を含む。いくつかの態様において、各プライマーは、それぞれ異なる配列を含む。いくつかの態様において、複数のプライマーは、少なくとも１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００、１００００００００の異なる配列、または前記数の任意の２つの間の範囲の数の異なる配列を含む。
プライマーはタグを含むことができる。本書において、「タグ」とは、プライマーもしくはプローブに付加されるか、またはポリヌクレオチド内部に組み込まれるヌクレオチド配列で、方法またはプロセスの後続の反応またはステップにおいて該付加されたプライマー、プローブまたはポリヌクレオチドの同定、追跡または単離を可能にするものをさす。タグのヌクレオチド組成はまた、相補的なプローブ、例えばアレイ表面のような固体支持体上のプローブへのハイブリダイゼーション、または標的配列の選択的増幅のために用いられる相補的プライマーへのハイブリダイゼーションを可能にするように選択することができる。タグは、複数の連続するヌクレオチドを含むことができ、少なくとも３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチドの長さ、または前記長さの任意の２つの間の範囲内の長さを有しうる。タグは、プライマーの５’末端における配列、プライマーの３’末端における配列、またはプライマー内部における配列であってよい。いくつかの態様において、タグは、プライマーの３’末端における配列である。いくつかの態様において、複数のプライマーがそれぞれ異なるタグを有することができる。いくつかの態様において、複数のプライマーのそれぞれが同じタグを有することができる。
いくつかの態様は、逆転写酵素の使用を含む。逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを包含する。逆転写酵素の例には、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントが包含される。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠くことができる。いくつかの態様において、逆転写酵素は、ＤＮＡの存在下または不存在下にＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを伸長させることができる。ＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーの伸長によって、一本鎖ｃＤＮＡが生成する。したがって、核酸サンプル中のＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを形成することができる。また、いくつかの態様は、伸長したプライマーから、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドを用いて、二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む。
いくつかの態様は、タグを含む伸長されたプライマーを含む標的核酸から核酸ライブラリーを形成することを含む。そのような態様のいくつかにおいて、標的核酸は、タグを含む伸長されたプライマー、およびＤＮＡ、例えばセルフリーＤＮＡを含むこともできる。標的核酸から核酸ライブラリーを形成する方法の一例は、タグメンテーションを含む。本書において、「タグメンテーション」とは、標的核酸にトランスポゾンを挿入して、トランスポゾンが、標的核酸を切断して、切断された標的核酸の末端にアダプター配列を付加するようにすることをさしうる。タグメンテーション方法の例が、米国特許第９１１５３９６号、同第９０８０２１１号、同第９０４０２５６号、米国特許出願公開第２０１４／０１９４３２４号に開示されており、これら各文献の全体を引用により本書の一部とする。方法の他の一例は、リガーゼによる、標的核酸の末端へのアダプター配列のライゲーションを含む。ライゲーションに基づくライブラリー作製方法は、しばしば、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、および／またはインデックス配列を初期ライゲーションステップで組み込むことができるアダプター設計を利用し、しばしば、シングルリードシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、およびマルチプレックスシーケンシングのためのサンプルの調製に使用されうる。例えば、標的核酸は、フィルイン反応、エキソヌクレアーゼ反応またはそれらの組み合わせによって末端修復されうる。いくつかの態様において、得られる修復された平滑末端核酸を、次いで、アダプター／プライマーの３’末端上の１ヌクレオチドのオーバーハングに相補的な１ヌクレオチドで伸長させることができる。この伸長／オーバーハングヌクレオチドには、任意のヌクレオチドを使用することができる。いくつかの態様において、核酸ライブラリー作製は、アダプターオリゴヌクレオチドをライゲートすることを含む。アダプターオリゴヌクレオチドは、しばしば、フローセルアンカーに相補的であり、しばしば、核酸ライブラリーを固体支持体に固定するために利用される。いくつかの態様において、アダプターオリゴヌクレオチドは、アイデンティファイアー（identifier）、１つまたはそれ以上のシーケンシングプライマーハイブリダイゼーション部位、例えばユニバーサルシーケンシングプライマー、シングルエンドシーケンシングプライマー、ペアエンドシーケンシングプライマー、マルチプレックスシーケンシングプライマー等に相補的な配列、またはそれらの組み合わせを含み、例えばアダプター／シーケンシング、アダプター／アイデンティファイアー、アダプター／アイデンティファイアー／シーケンシングである。
いくつかの態様において、核酸ライブラリーまたはその一部を、アダプター配列中の増幅プライマー部位を用いて増幅することができる。核酸ライブラリーの増幅を、ＰＣＲに基づく方法、または等温増幅方法によって行うことができる。異なる種類の増幅方法の例には、以下のものが包含される：マルチプレックスＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ダイヤルアウト（dial-out）ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存増幅、ホットスタートＰＣＲ、ライゲーション仲介ＰＣＲ、ミニプライマー（miniprimer）ＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、ネストＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、固相ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写仲介増幅（ＴＭＡ）、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）（米国特許第８００３３５４号に記載され、該文献の全体を引用により本書の一部とする）。いくつかの態様において、増幅を、固相に結合された増幅プライマーを用いて行うことができる。表面に結合された２種類のプライマーを用いるフォーマットは、しばしば、ブリッジ増幅と称されるが、これは、コピー元の鋳型配列に隣接する２種類の表面結合プライマーの間に二本鎖アンプリコンがブリッジ様構造を形成するからである。ブリッジ増幅に用いることができる試薬および条件の例が、米国特許第５６４１６５８号、米国特許出願公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７１１５４００号、米国特許出願公開第２００４／００９６８５３号、米国特許出願公開第２００４／０００２０９０号、米国特許出願公開第２００７／０１２８６２４号、および米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号に記載されており、これら各文献を引用により本書の一部とする。他の核酸増幅方法としては、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を挙げることができる。例えば、米国特許第７５８２４２０号、同第５１８５２４３号、同第５６７９５２４号、および同第５５７３９０７号を参照されたい。これら各文献の全体を引用により本書の一部とする。関心のある核酸を増幅するために特異的に設計することができるプライマー伸長およびライゲーション用のプライマーの例が、米国特許第７５８２４２０号および同第７６１１８６９号に記載されており、これら各文献の全体を引用により本書の一部とする。等温増幅方法の例は、Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)に開示される多置換増幅（ＭＤＡ）、および米国特許第６２１４５８７号に開示される等温鎖置換核酸増幅を包含し、これら各文献の全体を引用により本書の一部とする。増幅反応、条件およびコンポーネントの詳細な説明は、米国特許第７６７０８１０号の開示においてもなされており、該文献の全体を引用により本書の一部とする。
いくつかの態様は、核酸をシーケンスすることを含みうる。シーケンシング技術の例には、１塩基合成（ＳＢＳ）が包含される。ＳＢＳにおいては、鋳型核酸に沿った核酸プライマーの伸長をモニターすることにより、鋳型のヌクレオチドの配列を決定する。基本となる化学プロセスは、重合でありうる。ある特定のポリメラーゼをベースとするＳＢＳの態様においては、鋳型に依存する様式でプライマーを伸長するように、蛍光標識したヌクレオチドを付加し、プライマーに付加されたヌクレオチドの順序および種類を検出することで、鋳型の配列を決定することができる。１つまたはそれ以上の増幅核酸を、ＳＢＳ、または複数のサイクルで試薬を繰り返しデリバーする他の検出技術に付すことができる。例えば、最初のＳＢＳサイクルを開始するために、１つまたはそれ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ等を、１つまたはそれ以上の増幅核酸分子を含むヒドロゲルビーズ中に、または該ヒドロゲルビーズを通して、流すことができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドの取り込みが起こる部位を検出することができる。場合により、該ヌクレオチドは、一旦ヌクレオチドがプライマーに付加されたら、さらなるプライマー伸長を停止する、可逆的停止特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログをプライマーに付加することによって、停止解除剤がデリバーされて該部分が除去されるまで、さらなる伸長が起こり得ないようにすることができる。したがって、可逆的停止を用いる態様において、検出を行う前または検出を行った後に、停止解除試薬をフローセルにデリバーすることができる。さまざまなデリバリーの、ステップとステップの間に、洗浄を行うことができる。そして、プライマーをｎ個のヌクレオチド分伸長するために、上記サイクルをｎ回繰り返し、それによって長さｎの配列を検出することができる。
ＳＢＳのいくつかの態様は、ヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる際に遊離するプロトンを検出することを含む。例えば、遊離プロトンの検出に基づくシーケンシングには、市販の電気的検出器と関連技術を利用することができる。そのようなシーケンシングシステムの例には、パイロシーケンシング、例えばRocheの子会社454 Life Sciencesからの市販プラットフォーム；γ−ホスフェート標識ヌクレオチドを用いるシーケンシング、例えばPacific Biosciencesからの市販プラットフォーム；およびプロトン検出によるシーケンシング、例えばLife Technologiesの子会社Ion Torrentからの市販プラットフォームがある。
パイロシーケンシングは、生成する核酸鎖に特定のヌクレオチドが取り込まれる際の、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する。パイロシーケンシングにおいて、放出されるＰＰｉは、検出が可能となるように、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換され、生成したＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼにより産生される光子によって検出することができる。すなわち、シーケンシング反応を、発光検出システムによってモニターすることができる。パイロシーケンシングには、蛍光に基づく検出システムに用いられるような励起光源は必要ない。
いくつかの態様は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みを、フルオロフォアを含むポリメラーゼとγ−ホスフェート標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって、またはゼロモード導波路（ＺＭＷ）を用いて検出することができる。別の有用なシーケンシング技術は、ナノポアシーケンシングである。ナノポアのいくつかの態様において、標的核酸、または標的核酸から取り出された個々のヌクレオチドが、ナノポアを通過する。核酸またはヌクレオチドがナノポアを通過する際のポアの電気伝導度の変化を測定することによって、各ヌクレオチド種を同定することができる。
いくつかの態様は、さまざまな試薬を用いる、核酸の単離、増幅およびシーケンシングを含むことができる。そのような試薬の例には、例えばリゾチーム；プロテイナーゼＫ；ランダムヘキサマー；ポリメラーゼ、例えばΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ；トランスポザーゼ、例えばＴｎ５；プライマー、例えばＰ５およびＰ７アダプター配列；リガーゼ；デオキシヌクレオチド三リン酸；緩衝剤；または二価陽イオン、例えばマグネシウム陽イオンが包含される。アダプターは、シーケンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、およびインデックスを含むことができる。本書において、「インデックス」は、核酸にタグを付けるため、および／または核酸のソースを同定するための、分子アイデンティファイアーおよび／またはバーコードとして使用することができるヌクレオチドの配列を包含しうる。いくつかの態様において、インデックスは、単一の核酸または核酸の亜集団を同定するために使用されうる。
図１は、核酸ライブラリー作製方法の例示態様を示す。図１に示すように、セルフリーＲＮＡおよびセルフリーＤＮＡを含むサンプルを用意する。該ＲＮＡに、ランダムヘキサマー配列およびタグ配列を含むプライマーをハイブリダイズする。ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長して、第１のｃＤＮＡ鎖を生成する。第１のｃＤＮＡ鎖から第２のｃＤＮＡ鎖を合成して、二本鎖ｃＤＮＡを生成することができる。前記ステップは、前記セルフリーＤＮＡの存在下に行うことができる。該二本鎖ｃＤＮＡおよび該セルフリーＤＮＡから、核酸ライブラリーを形成することができる。ステップは、核酸分子の末端修復、核酸分子のＡテーリング、アダプターのライゲーション、ライブラリーのＰＣＲによる増幅、およびライブラリーのシーケンシングを含むことができる。セルフリーＲＮＡから誘導された配列は、タグ配列を含むことによって、同定可能である。セルフリーＤＮＡから誘導された配列は、タグ配列を欠くことによって、同定可能である。
いくつかの態様は、核酸のサンプル中の核酸を同定することを含む。そのような態様のいくつかは、本発明の方法により核酸サンプルから作製された核酸ライブラリーから配列データを得ること、およびタグを含むポリヌクレオチド配列を同定すること、したがってＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することを含みうる。いくつかの態様は、タグを含むポリヌクレオチド配列中のバリアントを同定することをも含みうる。バリアントの例には、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、置換、転位、重複、および遺伝子融合が包含される。いくつかの態様は、タグを含むポリヌクレオチド配列における逆転写エラーを同定することをも含みうる。例えば、逆転写酵素は、ｃＤＮＡ中にエラーをもたらしうる。したがって、配列のソースの同定は、バリアントが逆転写の結果でありうるかを決定するために有用でありうる。いくつかの態様において、ＲＮＡから誘導されたポリヌクレオチド配列を、参照配列、例えばその核酸ライブラリーのＤＮＡポリヌクレオチドの配列と比較することができる。
キット
本発明のいくつかの態様は、キットを含む。キットは、ＲＮＡを含むサンプルから核酸ライブラリーを作製するための試薬を含みうる。そのようなキットは、逆転写酵素、および複数の、タグを含むプライマーを含みうる。キットはまた、二本鎖ｃＤＮＡを合成するための試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドを含みうる。キットはまた、キナーゼ、ＲＮアーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼ、およびシーケンシングアダプターのような試薬を含みうる。
血清中のＲＮＡ／ＤＮＡ分子
ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いて、癌患者および対照対象からの血清において、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ触媒サブユニットα（ＰＩＫ３ＣＡ）およびＢ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦ）をコードする核酸の濃度を測定した。増幅に先立ち、核酸を、逆転写ステップを行うか、または行わないで処理して、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡおよび逆転写されたＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むサンプルを調製した。ＰＩＫ３ＣＡ解析のために、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０の７９ｎｔアンプリコン（dHsaCP2506262）をＦＡＭで標識したものを用いた（BIO-RAD, Hercules, CA）。ＢＲＡＦ解析のためには、ＨＥＸで標識したＢＲＡＦの６６ｎｔエクソンアンプリコン（dHsaCP2500366）を用いた（BIO-RAD, Hercules, CA）。
ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦエクソンをコードするＤＮＡ分子の数、ならびにＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦエクソンをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ両分子の数について、初期血清中濃度を測定した。図２は、癌患者（癌１、２および３）および対照対象（正常１、２および３）からの血清中の、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦをコードする核酸の濃度を示すグラフである。初期エクソン濃度を算出するのに、逆転写ステップを行って処理された核酸サンプルは、「ＤＮＡ＋ＲＮＡ」として示す。初期エクソン濃度を算出するのに、逆転写ステップを行わずに処理された核酸サンプルは、「ＤＮＡ」として示す。
図２に示す結果は、サンプル中でＢＲＡＦのＲＮＡレベルがＰＩＫ３ＣＡのレベルよりも顕著に高いこと、および、ＤＮＡ：ＲＮＡの相対濃度が個体間で異なること示している。
ＲＴステップを行って作製したライブラリーを用いる全ゲノムシーケンシング
ＤＮＡおよびＲＮＡを含むセルフリー核酸サンプルから、逆転写ステップを行う場合と、行わない場合とで、核酸ライブラリーを作製した。ライブラリーを、Truseq RNA Access ライブラリーキット（Illumina, San Diego, CA）を使用して、濃縮を行わずに作製した。ライブラリーをシーケンスし、配列を全トランスクリプトームに対してアラインした。図３は、既知の遺伝子とアラインされた配列の数は、逆転写ステップを行って作製されたライブラリーからの配列（ＲＴ配列）では、逆転写ステップを行わずに作製されたライブラリーからの配列（ｍｏｃｋ ＲＴ配列）と比較して、有意に多かったことを示している。さらに、エクソン、例えばＧＮＡＱ遺伝子のエクソン４および５ならびにＬＩＮＣ００１５２ノンコーディング遺伝子のエクソンとアラインされた配列の数は、ＲＴ配列ではｍｏｃｋ ＲＴ配列と比較して有意に多かった（データを示さず）。
ＲＴステップを行って作製されたライブラリーを用いるターゲットシーケンシング
癌患者からのＤＮＡおよびＲＮＡを含むセルフリー核酸サンプルから、逆転写ステップを行う場合と、行わない場合とで、核酸ライブラリーを作成した。ライブラリーを、Truseq RNA Access ライブラリーキット（Illumina, San Diego, CA）を使用して作製し、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）Ｖ１パネルから設計されたプローブを用いて濃縮を行った。配列を、該ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルに含まれる標的遺伝子に対してアラインした。図４は、逆転写ステップを行った方法（ＲＴ）と逆転写ステップを行わなかった方法（ｍｏｃｋ ＲＴ）とで作製されたライブラリーの、該ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルの試験された特定の遺伝子領域のカバレッジの比を示すグラフである。図４は、該ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルの少なくとも１２の遺伝子のカバレッジが、ＲＴ配列においてはｍｏｃｋ ＲＴ配列の２倍を超えたことを示している。少なくとも１２の遺伝子の検出感度が、ライブラリー作製に逆転写を含めた場合に有意に高められた。
シーケンシングデータをさらに、ＢＲＡＦ遺伝子バリアント、およびＣＤ４４−ＦＧＦＲ２遺伝子融合バリアントについて解析した。各バリアントについての解析結果をそれぞれ表１および表２に示す。両バリアントについて、検出感度は、逆転写ステップを行って作製されたライブラリーからの解析されたＲＴ配列において、逆転写ステップを行わずに作製されたライブラリーからの解析されたｍｏｃｋ ＲＴ配列と比較して有意に高かった。
Figure 2020530434

Figure 2020530434
ＲＴステップを行って作製されたライブラリーにおいてのみ検出された変異
１５名の癌患者由来のＤＮＡおよびＲＮＡを含むセルフリー核酸サンプルから、逆転写ステップを行う場合と行わない場合とで、核酸ライブラリーを作製した。ライブラリーを、Truseq RNA Access ライブラリーキット（Illumina, San Diego, CA）を使用して作製し、ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルから設計されたプローブを用いて濃縮を行った。ライブラリーを、ターゲットシーケンシングによってシーケンスし、配列を標的遺伝子パネルに対してアラインした。図５は、逆転写ステップを行って作製されたライブラリーにおいて高められた頻度で見られた変異の数を示すグラフである。
ＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡのみにタグを付けたライブラリーの作製
ＤＮＡおよびＲＮＡを含むセルフリー核酸サンプルから、タグ付けしたランダムヘキサマーの存在下、および逆転写酵素の存在下または不存在下に、核酸ライブラリーを作製した。ライブラリーを、Truseq RNA Access ライブラリーキット（Illumina, San Diego, CA）を使用して作製し、ＮＳＣＬＣ Ｖ１パネルから設計されたプローブを用いて濃縮を行った。ライブラリーをシーケンスし、各ライブラリーについて、タグ付けされた配列のリードの数を調べた。図６は、タグ付けされたランダムヘキサマーを用い、逆転写酵素を用いるか（Ａ）、または逆転写酵素を用いずに（Ｂ）作製されたライブラリーからのリードの数を示すグラフである。図６は、逆転写酵素を用いて作製されたライブラリーにおいて、タグ付けされた配列が存在し、逆転写酵素を用いずに作製されたライブラリーにおいては、タグ付けされた配列が僅かなバックグラウンドレベルで検出されたことを示している。このことは、ＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡの配列が、タグによって容易に同定可能であり、タグ付けされていない配列から識別可能であることを示している。
本書において、用語「を含む」は、「を包含する」、「を含有する」または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的またはオープンエンドであって、記載されていない更なる要素または方法ステップを排除するものではない。
上記説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明には、該方法および材料における改変、ならびに該構成方法および資材における変更が可能である。そのような改変は、本開示の考慮、または本書に開示される発明の実施によって、当業者に明らかとなりうる。したがって、本発明は、本書に開示される特定の態様に限定されることを意図するものではなく、本発明は、本発明の真の範囲および精神の範囲内のいずれの改変および変更をも包含する。
公開された、および未公開の、出願、特許、および参考文献を包含するがそれに限定されない、本書において引用される参照物はいずれも、その全体が引用により本書に組み込まれ、本書の一部とされるものとする。引用により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する限りにおいて、そのような矛盾材料について本明細書が優先し、および／または優位となることを意図する。
キット
本発明のいくつかの態様は、キットを含む。キットは、ＲＮＡを含むサンプルから核酸ライブラリーを作製するための試薬を含みうる。そのようなキットは、逆転写酵素、および複数の、タグを含むプライマーを含みうる。キットはまた、二本鎖ｃＤＮＡを合成するための試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドを含みうる。キットはまた、キナーゼ、ＲＮアーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼ、およびシーケンシングアダプターのような試薬を含みうる。
本発明の態様を、以下、さらに記載する：
［項１］
（ａ）複数のポリヌクレオチドを、複数の、タグを含むプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
（ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
（ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること、
を含む、核酸ライブラリーを作製する方法。
［項２］
（ｄ）前記核酸ライブラリーをシーケンスすることをさらに含む、上記項１に記載の方法。
［項３］
（ｅ）前記タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドの前記ＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをさらに含む、上記項２に記載の方法。
［項４］
前記タグを欠くポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドの前記ＤＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをさらに含む、上記項３に記載の方法。
［項５］
前記複数のプライマーが異なる配列を含む、上記項１〜４のいずれかに記載の方法。
［項６］
各プライマーがそれぞれ異なる配列を含む、上記項１〜５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記複数のプライマーが、１００００を超える異なる配列を含む、上記項１〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］
前記複数のプライマーが、１０００００を超える異なる配列を含む、上記項１〜７のいずれかに記載の方法。
［項９］
前記複数のプライマーがランダムヘキサマー配列を含む、上記項１〜８のいずれかに記載の方法。
［項１０］
前記複数のプライマーが同じタグを含む、上記項１〜９のいずれかに記載の方法。
［項１１］
前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、上記項１〜１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］
前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス（Ｒｏｕｓ）随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、上記項１〜１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］
（ｂ）が前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる、上記項１〜１２のいずれかに記載の方法。
［項１４］
（ｂ）が、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む、上記項１〜１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］
（ｃ）が、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む、上記項１〜１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］
前記複数のポリヌクレオチドがセルフリー（cell-free）である、上記項１〜１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］
前記複数のポリヌクレオチドが、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得られる、上記項１６に記載の方法。
［項１８］
（ａ）複数のポリヌクレオチドを複数のプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
（ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
（ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること、
を含む、核酸ライブラリーを作製する方法。
［項１９］
前記複数のポリヌクレオチドがセルフリーである、上記項１８に記載の方法。
［項２０］
前記複数のポリヌクレオチドが、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得られる、上記項１８または１９に記載の方法。
［項２１］
前記複数のプライマーが異なる配列を含む、上記項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
［項２２］
各プライマーがそれぞれ異なる配列を含む、上記項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
［項２３］
前記複数のプライマーが、１００００を超える異なる配列を含む、上記項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
［項２４］
前記複数のプライマーが、１０００００を超える異なる配列を含む、上記項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
［項２５］
前記複数のプライマーがランダムヘキサマー配列を含む、上記項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
［項２６］
前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、上記項１８〜２５のいずれかに記載の方法。
［項２７］
前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、上記項１８〜２６のいずれかに記載の方法。
［項２８］
（ｂ）が前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる、上記項１８〜２７のいずれかに記載の方法。
［項２９］
（ｂ）が、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む、上記項１８〜２８のいずれかに記載の方法。
［項３０］
（ｃ）が、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む、上記項１８〜２９のいずれかに記載の方法。
［項３１］
（ｉ）上記項１〜３０のいずれかに記載の方法によって核酸サンプルから作製された核酸ライブラリーから、配列データを得ること；および
（ii）タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定すること、
を含む、核酸サンプル中の核酸を同定する方法。
［項３２］
（iii）前記タグを含むポリヌクレオチド配列におけるバリアントを同定することをさらに含む、上記項３１に記載の方法。
［項３３］
前記バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、置換、重複、転位、および遺伝子融合からなる群から選択される、上記項３２に記載の方法。
［項３４］
前記タグを含むポリヌクレオチド配列における逆転写エラーを同定することさらに含む、上記項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
［項３５］
前記タグを含むポリヌクレオチドを参照配列と比較することをさらに含む、上記項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
［項３６］
前記参照配列が、前記核酸ライブラリーのＤＮＡポリヌクレオチドから誘導される、上記項３５に記載の方法。
［項３７］
前記サンプルがセルフリー核酸を含む、上記項３１〜３６のいずれかに記載の方法。
［項３８］
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択されるＲＮＡである、上記項３１〜３７のいずれかに記載の方法。
［項３９］
逆転写酵素；および
複数の、タグを含むプライマー；ここで各プライマーは異なる、
を含む、核酸ライブラリーを作製するためのキット。
［項４０］
前記複数のプライマーが同じタグを含む、上記項３９に記載のキット。
［項４１］
キナーゼ、ＲＮアーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される成分をさらに含む、上記項３９または４０に記載のキット。
［項４２］
前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、上記項３９〜４１のいずれかに記載のキット。
［項４３］
前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、上記項３９〜４２のいずれかに記載のキット。

Claims (43)

  1. （ａ）複数のポリヌクレオチドを、複数の、タグを含むプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
    （ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
    （ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること、
    を含む、核酸ライブラリーを作製する方法。
  2. （ｄ）前記核酸ライブラリーをシーケンスすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ｅ）前記タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドの前記ＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記タグを欠くポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドの前記ＤＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記複数のプライマーが異なる配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 各プライマーがそれぞれ異なる配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記複数のプライマーが、１００００を超える異なる配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記複数のプライマーが、１０００００を超える異なる配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記複数のプライマーがランダムヘキサマー配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記複数のプライマーが同じタグを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス（Ｒｏｕｓ）随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. （ｂ）が前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. （ｂ）が、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. （ｃ）が、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記複数のポリヌクレオチドがセルフリー（cell-free）である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記複数のポリヌクレオチドが、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得られる、請求項１６に記載の方法。
  18. （ａ）複数のポリヌクレオチドを複数のプライマーとハイブリダイズすること；ここで、該複数のポリヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡを含む；
    （ｂ）該ハイブリダイズしたプライマーを逆転写酵素を用いて伸長すること；および
    （ｃ）該伸長したプライマーおよび該ＤＮＡから、核酸のライブラリーを形成すること、
    を含む、核酸ライブラリーを作製する方法。
  19. 前記複数のポリヌクレオチドがセルフリーである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記複数のポリヌクレオチドが、血清、間質液、リンパ、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、汗および涙液からなる群から選択されるサンプルから得られる、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記複数のプライマーが異なる配列を含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. 各プライマーがそれぞれ異なる配列を含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記複数のプライマーが、１００００を超える異なる配列を含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記複数のプライマーが、１０００００を超える異なる配列を含む、請求項１８〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記複数のプライマーがランダムヘキサマー配列を含む、請求項１８〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、請求項１８〜２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、請求項１８〜２６のいずれかに記載の方法。
  28. （ｂ）が前記ＤＮＡポリヌクレオチドの存在下に行われる、請求項１８〜２７のいずれかに記載の方法。
  29. （ｂ）が、前記伸長したプライマーから二本鎖ｃＤＮＡを生成することを含む、請求項１８〜２８のいずれかに記載の方法。
  30. （ｃ）が、前記伸長したプライマーおよびＤＮＡポリヌクレオチドを、キナーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される試薬と接触させることを含む、請求項１８〜２９のいずれかに記載の方法。
  31. （ｉ）請求項１〜３０のいずれかに記載の方法によって核酸サンプルから作製された核酸ライブラリーから、配列データを得ること；および
    （ii）タグを含むポリヌクレオチド配列を同定し、それによって、前記複数のポリヌクレオチドのＲＮＡポリヌクレオチドから誘導された配列を同定すること、
    を含む、核酸サンプル中の核酸を同定する方法。
  32. （iii）前記タグを含むポリヌクレオチド配列におけるバリアントを同定することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記バリアントが、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、置換、重複、転位、および遺伝子融合からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記タグを含むポリヌクレオチド配列における逆転写エラーを同定することさらに含む、請求項３１〜３３のいずれかに記載の方法。
  35. 前記タグを含むポリヌクレオチドを参照配列と比較することをさらに含む、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記参照配列が、前記核酸ライブラリーのＤＮＡポリヌクレオチドから誘導される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記サンプルがセルフリー核酸を含む、請求項３１〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、およびリボザイムからなる群から選択されるＲＮＡである、請求項３１〜３７のいずれかに記載の方法。
  39. 逆転写酵素；および
    複数の、タグを含むプライマー；ここで各プライマーは異なる、
    を含む、核酸ライブラリーを作製するためのキット。
  40. 前記複数のプライマーが同じタグを含む、請求項３９に記載のキット。
  41. キナーゼ、ＲＮアーゼ、リガーゼ、トランスポゾン、ポリメラーゼおよびシーケンシングアダプターからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項３９または４０に記載のキット。
  42. 前記逆転写酵素がＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を欠く、請求項３９〜４１のいずれかに記載のキット。
  43. 前記逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ヒト免疫ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）逆転写酵素、ラウス随伴ウイルス−２（ＲＡＶ２）逆転写酵素、C. hydrogenoformans ＤＮＡポリメラーゼ、T. thermus ＤＮＡポリメラーゼ、T. flavus ＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの機能性バリアントからなる群から選択される、請求項３９〜４２のいずれかに記載のキット。
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