KR20200024167A - Rna 및 dna로부터의 핵산 라이브러리의 제조 - Google Patents

Rna 및 dna로부터의 핵산 라이브러리의 제조 Download PDF

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KR20200024167A
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dna
rna
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홍샤 수
댄 차오
알렉스 아라바니스
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물의 몇몇 실시형태는 RNA 및 DNA로부터 유래된 핵산 라이브러리의 제조 및 용도에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 라이브러리는 RNA로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드를 태그화함으로써 제조될 수 있다. 몇몇 실시형태는 이러한 라이브러리로부터의 서열 데이터의 분석을 포함한다.

Description

RNA 및 DNA로부터의 핵산 라이브러리의 제조
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 발명의 명칭이 "PREPARATION OF NUCLEIC ACID LIBRARIES FROM RNA AND DNA"인 2018년 3월 22일자로 출원된 미국 가출원 제62/646487호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초 출원은 그 전문이 본 명세서에 참고로 원용된다.
기술분야
본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물의 몇몇 실시형태는 RNA 및 DNA로부터 유래된 핵산 라이브러리의 제조 및 용도에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 라이브러리는 RNA로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드를 태그화(tagging)함으로써 제조될 수 있다.
조직 샘플의 전체 게놈 서열분석, 유전자형분석, 표적화된 재서열분석 및 유전자 발현 분석은 질환 바이오마커를 확인하고, 질환을 정확히 진단하고 예후분석하고, 환자에 대한 적절한 치료를 선택하기 위한 상당한 중요성을 가질 수 있다. 예를 들어, 환자로부터 절제된 종양 조직의 핵산 서열 분석은 특정한 유전자 바이오마커의 존재 또는 부재, 예컨대, 체세포 변이체, 구조적 재배열, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 및/또는 특정한 유전자의 존재 또는 부재를 결정하도록 이용될 수 있다. 세포 유리 샘플(cell-free sample)은 서열 분석을 위한 핵산 라이브러리를 제조하도록 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 라이브러리에서 질환 바이오마커를 포함하는 핵산은 드물고 검출하기 어려울 수 있다. 따라서, 질환 바이오마커의 검출에서의 증가된 민감도에 대한 요망이 있다.
몇몇 실시형태는 (a) 복수의 폴리뉴클레오타이드를 태그를 포함하는 복수의 프라이머로 혼성화시키는(hybridizing) 단계(여기서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함함); (b) 혼성화된 프라이머를 역전사효소(reverse transcriptase)로 연장시키는 단계; 및 (c) 연장된 프라이머 및 DNA로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 (d) 핵산의 라이브러리를 서열분석하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 (e) 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 복수의 폴리뉴클레오타이드의 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 태그가 없는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 복수의 폴리뉴클레오타이드의 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머는 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 10,000개 초과의 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 100,000개 초과의 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 랜덤 육합체 서열(random hexamer sequence)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 동일한 태그를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(avian myeloblastosis virus: AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus: MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(human immunovirus: HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2(Rous-associated virus-2: RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스(C. hydrogenoformans) DNA 폴리머라제, 티. 테르무스(T. thermus) DNA 폴리머라제, 티. 플라버스(T. flavus) DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, (b)는 DNA 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 수행된다. 몇몇 실시형태에서, (b)는 연장된 프라이머로부터 이중 가닥 cDNA를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, (c)는 연장된 프라이머 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 키나제, 리가제, 트랜스포슨(transposon), 폴리머라제 및 서열분석 어댑터(sequencing adaptor)로 이루어진 군으로부터 선택된 시약과 접촉시키는 것을 포함하다.
몇몇 실시형태에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 세포 유리 상태이다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 혈청, 간질액(interstitial fluid), 림프, 뇌척수액, 가래, 소변, 젖, 땀 및 눈물로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플로부터 수득된다.
몇몇 실시형태는 (a) 복수의 폴리뉴클레오타이드를 복수의 프라이머로 혼성화시키는 단계(여기서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함함); (b) 혼성화된 프라이머를 역전사효소로 연장시키는 단계; 및 (c) 연장된 프라이머 및 DNA로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 세포 유리 상태이다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 폴리뉴클레오타이드는 혈청, 간질액, 림프, 뇌척수액, 가래, 소변, 젖, 땀 및 눈물로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플로부터 수득된다.
몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머는 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 10,000개 초과의 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 100,000개 초과의 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 랜덤 육합체 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2 (RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스 DNA 폴리머라제, 티. 테르무스 DNA 폴리머라제, 티. 플라버스 DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, (b)는 DNA 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에 수행된다. 몇몇 실시형태에서, (b)는 연장된 프라이머로부터 이중 가닥 cDNA를 생성하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, (c)는 연장된 프라이머 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 키나제, 리가제, 트랜스포슨, 폴리머라제 및 서열분석 어댑터로 이루어진 군으로부터 선택된 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태는 (i) 상기 방법 중 어느 하나에 의해 핵산의 샘플로부터 제조된 핵산의 라이브러리로부터 서열 데이터를 수득하는 단계; 및 (ii) 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 복수의 폴리뉴클레오타이드의 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 (iii) 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변이체를 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변이체는 단일 뉴클레오타이드 다형(single nucleotide polymorphism: SNP), 결실, 삽입, 치환, 전위, 중복 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태는 또한 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 역전사 오류를 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 기준 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 기준 서열은 핵산의 라이브러리의 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 세포 유리 핵산을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, RNA 폴리뉴클레오타이드는 mRNA, tRNA, 리보솜 RNA, 비암호화 RNA, piRNA, siRNA, lncRNA, shRNA, snRNA, miRNA, snoRNA, 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA이다.
몇몇 실시형태는 또한 역전사효소; 및 태그를 포함하는 복수의 프라이머(여기서, 각각의 프라이머는 상이함)를 포함하는 핵산의 라이브러리를 제조하기 위한 키트를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 동일한 태그를 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 키나제, RNase, 리가제, 트랜스포슨, 폴리머라제 및 서열분석 어댑터로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2 (RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스 DNA 폴리머라제, 티. 테르무스 DNA 폴리머라제, 티. 플라버스 DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1은 RNA 및 DNA로부터 핵산 라이브러리를 제조하고 이를 서열분석하기 위한 실시형태의 도식적 도면이다.
도 2는 다양한 환자로부터의 샘플에서의 소정의 핵산의 농도의 그래프이다.
도 3은 역전사 단계 유(RT 계수치) 또는 무(모의 RT 계수치)의 방법에 의해 제조된 라이브러리로부터 얻은 소정의 서열의 수의 그래프이다.
도 4는 NSCLC V1 패널에서 시험된 소정의 유전자 영역에 대한 역전사 단계(RT) 유의 방법 대 역전사 단계(모의 RT) 무의 방법에 의해 제조된 라이브러리에 대한 커버리지의 비율의 그래프이다.
도 5는 역전사 단계에 의해 제조된 라이브러리에서의 증가된 빈도로 발견된 돌연변이의 수의 그래프이다.
도 6은 역전사효소 유(A); 또는 역전사효소 무(B)의 태그화된 랜덤 육합체에 의해 제조된 라이브러리로부터의 판독의 수의 그래프이다.
본 명세서에서 제공된 방법 및 조성물의 실시형태는 RNA 및 DNA로부터 유래된 핵산 라이브러리의 제조 및 사용에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 라이브러리는 RNA로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드를 태그화함으로써 제조될 수 있다.
체액, 예컨대, 혈청, 눈물, 소변 및 땀은 세포 유리 핵산을 함유한다. 이러한 핵산은 질환 바이오마커를 포함할 수 있다. 그러나, 이 체액에서의 이러한 바이오마커의 빈도 또는 농도는 극도로 낮을 수 있다. 몇몇 실시형태는 질환 바이오마커를 포함하는 소정의 핵산을 검출하는 것의 민감도를 증가시키는 RNA 및 DNA로부터 핵산 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태는 태그를 포함하고 태그의 서열을 RNA로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드로 도입시키는 프라이머로 RNA를 역전사시킴으로써 핵산의 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다. 따라서, 태그는 RNA로부터 유래된 서열을 확인할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열의 소스를 구별하는 것은 변이체가 라이브러리 제조, 예컨대, 역전사 단계의 결과일 수 있는지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 서열의 소스를 구별하는 것은 스플라이스 변이체, 조직 특이적 변이체, 비암호화 RNA 및 소정의 유전자-융합을 확인하기 위해 유용할 수 있다. 비암호화 RNA, 예컨대, 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNA: lncRNA)는 소정의 암 유형을 확인하고 구명하기 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yan, X., et al., (2015) "Comprehensive Genomic Characterization of Long Non-coding RNAs across Human Cancers", Cancer Cell 28:529-540](그 전문이 참고로 원용됨)을 참조한다. 세포 유리 lncRNA는 2차 구조로 인해 다른 RNA, 예컨대, 단백질 암호화 RNA보다 혈장에서 더 안정적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 구조는 또한 이의 5' 또는 3' 단부 또는 말단에 의해 표기될 수 있고, 이는 폴리뉴클레오타이드의 방향성을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥에서의 인접한 뉴클레오타이드는 통상적으로 이의 3' 탄소와 5' 탄소 사이의 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된다. 그러나, 상이한 뉴클레오타이드간 연결, 예컨대, 메틸렌을 포함하는 연결, 포스포르아미데이트 연결 등이 또한 이용될 수 있다. 이것은 각각의 5' 및 3' 탄소가 5' 및 3' 단부 또는 말단이라고 칭해질 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단에서 노출될 수 있다는 것을 의미한다. 5' 및 3' 단부는 이 단부에 부착된 화학기 때문에 각각 포스포릴(PO4) 및 하이드록실(OH) 단부라고도 칭해질 수 있다. 용어 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중 및 단일 가닥 분자 둘 다를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드의 예는 유전자 또는 유전자 단편, 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(messenger RNA: mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 비암호화 RNA(non-coding RNA: ncRNA), 예컨대, PIWI 상호작용 RNA(PIWI-interacting RNA: piRNA), 소형 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA) 및 긴 비암호화 RNA(lncRNA), 소형 헤어핀 RNA(small hairpin RNA: shRNA), 소형 핵 RNA(small nuclear RNA: snRNA), 마이크로 RNA(micro RNA: miRNA), 소형 핵소체 RNA(small nucleolar RNA: snoRNA) 및 바이러스 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 임의의 상기의 증폭된 카피를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어 비중성 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 변형된 중성 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 예컨대, 아자- 또는 데아자-퓨린을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 4개의 뉴클레오타이드 염기의 특정한 서열로 구성될 수 있다: 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 및 타이민(T). 유라실(U)은 또한, 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때, 예를 들어, 타이민에 대한 자연적인 대체로서 존재할 수 있다. 유라실은 또한 DNA에서 사용될 수 있다. 따라서, 용어 '서열'은 천연 및 비천연 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 핵산 분자의 알파벳상 표시를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "RNA 분자" 또는 리보핵산 분자는 피리미딘 염기 중 하나로서 데옥시리보스 당보다는 리보스 당 및 통상적으로 타이민보다는 유라실을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. RNA 분자는 일반적으로 단일 가닥이지만, 또한 이중 가닥일 수 있다. RNA 샘플로부터의 RNA 분자의 맥락에서, RNA 분자는 이것이 전사되는 DNA 가닥에 상보성인 뉴클레오타이드 염기의 선형 서열을 갖는, 세포핵, 미토콘드리아, 엽록체 또는 박테리아 세포에서 DNA로부터 전사된 단일 가닥 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "혼성화", "혼성화시키는" 또는 이의 문법상 균등물은 적어도 부분적으로 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 형성되는 복합체를 형성하도록 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하는 반응을 지칭할 수 있다. 수소 결합은 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 짝짓기, 후그스틴(Hoogstein) 결합에 의해 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가 혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 가닥은 또한 가교결합되거나 그렇지 않으면 수소 결합 이외의 힘에 의해 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "연장하는", "연장" 또는 이의 임의의 문법상 균등물은 연장 효소, 예컨대, 폴리머라제에 의한 프라이머, 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 핵산 분자에 대한 dNTP의 첨가를 의미할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 몇몇 방법에서, 생성된 연장된 프라이머는 RNA의 서열 정보를 포함한다. 몇몇 실시형태는 폴리머라제, 예컨대, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 사용하여 연장을 수행하는 것으로 기재되어 있지만, 연장은 당해 분야에 널리 공지된 임의의 다른 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 연장은 관심 대상의 가닥에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드와 같은 함께 랜덤 올리고뉴클레오타이드의 짧은 조각을 결찰함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "역전사"는 DNA 분자로 RNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 카피하는 과정을 의미할 수 있다. 역전사는 RNA 주형을 역전사효소로도 공지된 RNA 의존적 DNA 폴리머라제와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 역전사효소는 단일 가닥 DNA로 단일 가닥 RNA를 전사시키는 DNA 폴리머라제이다. 사용된 폴리머라제에 따라, 역전사효소는 RNA 주형의 후속하는 분해를 위해 RNase H 활성을 또한 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "상보성 DNA" 또는 "cDNA"는 역전사효소의 작용을 통해 RNA로부터 역전사된 합성 DNA를 의미할 수 있다. cDNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 서열의 일부 또는 RNA 서열의 일부에 대한 보체와 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나 또는 둘 다를 가질 수 있는 가닥을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "cDNA 라이브러리"는 RNA 서열로부터 생성된 DNA 서열의 집단을 의미할 수 있다. cDNA 라이브러리는 RNA가 추출되는 원래의 샘플에 존재하는 RNA를 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, cDNA 라이브러리는 핵산의 세포 유리 샘플에 존재하는 RNA를 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서, cDNA 라이브러리는 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA) 및 하나의 세포 또는 세포의 집단에서 생성된 다른 비암호화 RNA(ncRNA)를 포함하는 주어진 세포 또는 세포의 집단의 전사체의 전부 또는 일부를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "결찰" 또는 "결찰하는" 또는 이의 다른 문법상 균등물은 포스포다이에스터 결합에 의한 2개의 뉴클레오타이드 가닥의 연결을 지칭할 수 있다. 이러한 반응은 리가제에 의해 촉매화될 수 있다. 리가제는 ATP 또는 유사한 트라이포스페이트의 가수분해로 이 반응을 촉매화하는 효소의 종류를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "유래된"은, 핵산의 서열과 관련하여 사용될 때, 핵산이 수득되는 소스를 의미할 수 있다. 예를 들어, 서열은 샘플에서 RNA 분자로부터 유래된 핵산으로부터 수득될 수 있다. 특정한 소스 또는 기원으로부터 유래된 핵산 분자는 그럼에도 불구하고 후속하여 카피되거나 증폭될 수 있다. 생성된 카피 또는 앰플리콘의 서열은 소스 또는 기원으로부터 유래된 것으로 지칭될 수 있다.
핵산 라이브러리의 제조
몇몇 실시형태는 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 이러한 실시형태는 RNA 및 DNA를 포함하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 복수의 폴리뉴클레오타이드를 복수의 프라이머로 혼성화시키는 단계; 및 혼성화된 프라이머를 역전사효소로 연장시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 이러한 실시형태에서, 프라이머는 태그를 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 연장된 프라이머 및 DNA로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 샘플은 세포 유리 핵산, 예컨대, RNA 및 DNA를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이,, 핵산과 관련하여 "세포 유리"는 생체내 세포로부터 제거되는 핵산을 의미할 수 있다. 핵산의 제거는 괴사 또는 아폽토시스와 같은 천연 과정일 수 있다. 세포 유리 핵산은 혈액, 또는 이의 분획, 예컨대, 혈청으로부터 수득될 수 있다. 세포 유리 핵산은 다른 체액 또는 조직으로부터 수득될 수 있고, 예는 간질액, 림프, 뇌척수액, 가래, 소변, 젖, 땀 및 눈물을 포함한다.
몇몇 실시형태는 프라이머의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "프라이머"는, 표적 또는 주형에 의한 혼성화, 및 이후 프라이머의 연장의 촉진에 의한 표적 또는 주형에 상보성인 폴리뉴클레오타이드의 형성에 의해, 일반적으로 샘플에 존재하는 표적 또는 주형 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 유리 3'-OH 기를 갖는 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다. 프라이머는 5개 내지 1000개 또는 초과의 뉴클레오타이드의 범위의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 프라이머는 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드의 길이, 또는 상기 길이의 임의의 2의 범위 내의 길이를 갖는다.
프라이머는 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "랜덤 뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 집단에서 다른 랜덤 뉴클레오타이드 서열과 조합될 때 뉴클레오타이드의 주어진 길이에 대한 뉴클레오타이드의 모든 또는 실질적으로 모든 가능한 조합을 나타내는 뉴클레오타이드의 다양한 서열을 의미할 수 있다. 예를 들어, 임의의 주어진 위치에 존재하는 4개의 가능한 뉴클레오타이드 때문에, 2개의 랜덤 뉴클레오타이드 길이의 서열은 16개의 가능한 조합을 갖거나, 3개의 랜덤 뉴클레오타이드 길이의 서열은 64개의 가능한 조합을 갖거나, 4개의 랜덤 뉴클레오타이드 길이의 서열은 265개의 가능한 조합을 갖는다. 랜덤 뉴클레오타이드 서열은 샘플에서 임의의 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 가능성을 갖는다. 프라이머에서의 랜덤 서열은 몇몇 연속적 뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드의 길치, 또는 상기 길이의 임의의 2의 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 상이한 랜덤 서열을 포함하는 프라이머를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태는 복수의 프라이머의 사용을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 프라이머는 상이한 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 적어도 1000개, 10,000개, 100,000개, 1,000,000개, 10,000,000개, 100,000,000개의 상이한 서열, 또는 상기 숫자의 임의의 2 사이의 범위의 다수의 상이한 서열을 포함할 수 있다.
프라이머는 태그를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "태그"는 프라이머 또는 프로브에 부착되거나, 또는 방법 또는 공정에서 후속하는 반응 또는 단계에서의 부착된 프라이머, 프로브 또는 폴리뉴클레오타이드의 확인, 추적 또는 단리를 허용하는, 폴리뉴클레오타이드로 도입된 뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다. 태그의 뉴클레오타이드 조성물은 상보성 프로브, 예컨대, 고체 지지체, 예컨대, 어레이의 표면 상의 프로브에 대한 혼성화, 또는 표적 서열을 선택적으로 증폭시키도록 사용된 상보성 프라이머에 대한 혼성화를 허용하도록 또한 선택될 수 있다. 태그는 몇몇 연속적 뉴클레오타이드를 포함하고, 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 길이의 임의의 2의 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 태그는 프라이머의 5' 말단, 프라이머의 3' 말단에서의 서열일 수 있거나, 프라이머 내의 서열일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 태그는 프라이머의 3' 말단에서의 서열이다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 각각 상이한 태그를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 복수의 프라이머는 각각 동일한 태그를 가질 수 있다.
몇몇 실시형태는 역전사효소의 사용을 포함한다. 역전사효소는 RNA 의존적 DNA 폴리머라제를 포함한다. 역전사효소의 예는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2(RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스 DNA 폴리머라제, 티. 테르무스 DNA 폴리머라제, 티. 플라버스 DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 역전사효소는 DNA의 존재 또는 부재 하에 RNA에 혼성화된 프라이머를 연장시킬 수 있다. RNA에 혼성화된 프라이머의 연장은 단일 가닥 cDNA를 생성시킨다. 그러므로, cDNA 라이브러리는 핵산의 샘플에서 RNA로부터 생성될 수 있다. 몇몇 실시형태는 또한 DNA 의존적 DNA 폴리머라제 및 뉴클레오타이드를 사용한 연장된 프라이머로부터의 이중 가닥 cDNA의 생성을 포함한다.
몇몇 실시형태는 태그를 포함하는 연장된 프라이머를 포함하는 표적 핵산으로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 것을 포함한다. 몇몇 이러한 실시형태에서, 표적 핵산은 또한 태그 및 DNA, 예컨대, 세포 유리 DNA를 포함하는 연장된 프라이머를 포함할 수 있다. 표적 핵산으로부터 핵산의 라이브러리를 생성하기 위한 예시적인 방법은 태그먼테이션(tagmentation)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "태그먼테이션"은, 트랜스포슨이 표적 핵산을 절단하고 절단된 표적 핵산의 말단에 어댑터 서열이 첨가하게 하는, 트랜스포슨의 삽입을 지칭할 수 있다. 태그먼테이션의 예시적인 방법은 미국 특허 제9,115,396호; 제9,080,211호; 제9,040,256호; 미국 특허 출원 공보 제2014/0194324호(이들의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 개시되어 있다. 또 다른 예시적인 방법은 리가제에 의한 표적 핵산의 말단에 대한 어댑터 서열의 결찰을 포함한다. 결찰 기반 라이브러리 제조 방법은 대개 초기 결찰 단계에서 서열분석 프라이머 부위, 증폭 프라이머 부위, 및/또는 인덱스 서열(index sequence)을 도입할 수 있고, 대개 단일-판독 서열분석, 페어-엔드 서열분석(paired-end sequencing) 및 멀티플렉스화 서열분석(multiplexed sequencing)을 위한 샘플을 제조하기 위해 사용될 수 있는 어댑터 설계를 이용한다. 예를 들어, 표적 핵산은 필-인(fill-in) 반응, 엑소뉴클레아제 반응 또는 이들의 조합에 의해 말단 보수될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 생성된 무딘-말단 보수된 핵산은 이후 어댑터/프라이머의 3' 말단에서 단일 뉴클레오타이드 오버행(overhang)에 상보성인 단일 뉴클레오타이드에 의해 연장될 수 있다. 임의의 뉴클레오타이드는 연장/오보행 뉴클레오타이드에 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵산 라이브러리 제조는 어댑터 올리고뉴클레오타이드를 결찰하는 것을 포함한다. 어댑터 올리고뉴클레오타이드는 대개 유세포 앵커에 상보성이고, 때때로 고체 지지체에 핵산 라이브러리를 부동화하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 어댑터 올리고뉴클레오타이드는 식별자(identifier), 하나 이상의 서열분석 프라이머 혼성화 부위, 예컨대, 보편적 서열분석 프라이머, 단일 말단 서열분석 프라이머, 페어-엔드 서열분석 프라이머, 멀티플렉스화 서열분석 프라이머 등에 상보성인 서열, 또는 이들의 조합, 예컨대, 어댑터/서열분석, 어댑터/식별자, 어댑터/식별자/서열분석을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 핵산 라이브러리 또는 이의 일부는 어댑터 서열에서 증폭 프라이머 부위를 사용하여 증폭될 수 있다. 핵산 라이브러리는 PCR 방법, 또는 등온 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있다. 증폭 방법의 상이한 유형의 예는 미국 특허 제8,003,354호(그 전문이 참고로 원용됨)에 기재된 바와 같은 멀티플렉스 PCR, 디지털 PCR(digital PCR: dPCR), 다이알-아웃 PCR(dial-out PCR), 대립유전자 특이적 PCR, 비대칭 PCR, 헬리카제 의존적 증폭, 핫 스타트 PCR(hot start PCR), 결찰 매개된 PCR, 미니프라이머 PCR, 멀티플렉스 결찰 의존적 프로브 증폭(multiplex ligation-dependent probe amplification: MLPA), 네스팅된 PCR(nested PCR), 정량적 PCR(quantitative PCR: qPCR), 역전사 PCR(reverse transcription PCR: RT-PCR), 고상 PCR, 리가제 연쇄 반응, 가닥 대체 증폭(strand displacement amplification: SDA), 전사 매개된 증폭(transcription mediated amplification: TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 증폭은 고상에 부착된 증폭 프라이머로 발생할 수 있다. 이중 가닥 앰플리콘이 카피되는 주형 서열을 측접(flank)시키는 2개의 표면 부착된 프라이머 사이의 브리지 유사 구조를 형성하므로, 표면에 부착된 프라이머의 2개의 종을 사용하는 포맷은 대개 브리지 증폭이라 칭한다. 브리지 증폭에 사용될 수 있는 예시적인 시약 및 조건은 미국 특허 제5,641,658호; 미국 특허 공보 제2002/0055100호; 미국 특허 제7,115,400호; 미국 특허 공보 제2004/0096853호; 미국 특허 공보 제2004/0002090호; 미국 특허 공보 제2007/0128624호; 및 미국 특허 공보 제2008/0009420호(이들의 각각은 본 명세서에 참고로 원용됨)에 기재되어 있다. 핵산의 증폭을 위한 다른 방법은 올리고뉴클레오타이드 연장 및 결찰, 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 및 올리고뉴클레오타이드 결찰 검정(oligonucleotide ligation assay: OLA)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,582,420호, 제5,185,243호, 제5,679,524호 및 제5,573,907호(이들의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)를 참조한다. 관심 대상의 핵산을 증폭시키도록 특별히 설계될 수 있는 결찰 프라이머 및 프라이머 연장의 예는 미국 특허 제7,582,420호 및 제7,611,869호(이들의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 개시되어 있다. 예시적인 등온 증폭 방법은 문헌[Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 개시된 다중 대체 증폭(multiple displacement amplification: MDA); 미국 특허 제6,214,587호(상기 문헌의 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)에 개시된 등온 스트랜드 대체 핵산 증폭을 포함한다. 증폭 반응, 조건 및 성분의 추가적인 설명은 미국 특허 제7,670,810호(본 명세서에 그 전문이 참고로 원용됨)의 개시내용에 자세히 기재되어 있다.
몇몇 실시형태는 핵산의 서열분석을 포함할 수 있다. 서열분석 기술의 예는 합성에 의한 서열분석(sequencing-by-synthesis: SBS)을 포함한다. SBS에서, 핵산 주형을 따른 핵산 프라이머의 연장은 주형에서 뉴클레오타이드의 서열을 결정하도록 모니터링된다. 기초하는 화학 공정은 중합일 수 있다. 특정한 폴리머라제 기반 SBS 실시형태에서, 형광으로 표지된 뉴클레오타이드는 주형 의존적 방식으로 프라이머를 연장하도록 첨가되어서, 프라이머에 첨가되는 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출은 주형의 서열을 결정하도록 이용될 수 있다. 하나 이상의 증폭된 핵산은 SBS 또는 사이클에서 시약의 반복 전달을 수반하는 다른 검출 기법으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시시키기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 폴리머라제 등은 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 보유하는 하이드로겔 겔로/겔을 통해 흐를 수 있다. 프라이머 연장이 표지된 뉴클레오타이드가 도입되게 하는 이들 부위는 검출될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는, 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되면, 추가의 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체는, 탈블록화제(deblocking agent)가 모이어티를 제거하도록 전달될 때까지, 후속하는 연장이 발생할 수 없도록 프라이머에 첨가될 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 이용하는 실시형태에 대해, 탈블록화 시약은 검출이 발생하기 전에 또는 후에 유세포로 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척을 수행할 수 있다. 이후, 사이클은 n개의 뉴클레오타이드에 의해 프라이머를 연장시키도록 n회 반복될 수 있어서, 길이 n의 서열을 검출한다.
몇몇 SBS 실시형태는 연장 산물로의 뉴클레오타이드의 도입 시 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 전기 검출기 및 상업적으로 이용 가능한 연관된 기법을 이용할 수 있다. 이러한 서열분석 시스템의 예는 파일로시퀀싱(pyrosequencing), 예컨대, 로슈사(Roche)의 자회사인 454 Life Sciences로부터의 상업적으로 이용 가능한 플랫폼; γ-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열분석, 예컨대, Pacific Biosciences로부터 상업적으로 이용 가능한 플랫폼; 및 양성자 검출을 이용한 서열분석, 예컨대, Torrent subsidiary of Life Technologies로부터 상업적으로 이용 가능한 플랫폼이다.
특정한 뉴클레오타이드가 미성숙(nascent) 핵산 가닥으로 도입되면서, 파일로시퀀싱은 무기 피로포스페이트(inorganic pyrophosphate: PPi)의 방출을 검출한다. 파일로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설퓨릴라제(sulfurylase)에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제 생성된 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 사용된 여기 방사선원은 파일로시퀀싱 절차에 필요하지 않다.
몇몇 실시형태는 DNA 폴리머라제 활성의 실시간 모니터링을 수반하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 도입은 형광단 보유 폴리머라제와 γ-포스페이트 표지된 뉴클레오타이드 사이의 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 통해, 또는 제로 모드 도파관(zero mode waveguide: ZMW)으로 검출될 수 있다. 또 다른 유용한 서열분석 기법은 나노기공 서열분석이다. 몇몇 나노기공 실시형태에서, 표적 핵산으로부터 제거된 표적 핵산 또는 개별 뉴클레오타이드는 나노기공을 통해 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오타이드가 나노기공을 통해 통과하면서, 각각의 뉴클레오타이드 유형은 기공의 전기 전도도의 변동을 측정함으로써 확인될 수 있다.
실시형태는 다양한 시약을 사용한 핵산의 단리, 증폭 및 서열분석을 포함할 수 있다. 이러한 시약은, 예를 들어, 라이소자임; 프로테인게나제 K; 랜덤 육합체; 폴리머라제, 예컨대, Φ29 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, Bsu 폴리머라제; 트랜스포사제, 예컨대, Tn5; 프라이머, 예컨대, P5 및 P7 어댑터 서열; 리가제; 데옥시뉴클레오타이드 트라이포스페이트; 완충제; 또는 2가 양이온, 예컨대, 마그네슘 양이온을 포함할 수 있다. 어댑터는 서열분석 프라이머 부위, 증폭 프라이머 부위 및 인덱스를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인덱스(index)"는 핵산을 태그화하기 위해, 그리고/또는 핵산의 소스를 확인하기 위해 분자 식별자 및/또는 바코드로서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 인덱스는 단일 핵산 또는 핵산의 하위집단을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법의 예시적인 실시형태를 도시한다. 도 1에 도시된 바대로, 세포 유리 RNA 및 세포 유리 DNA를 포함하는 샘플이 제공된다. 랜덤 육합체 서열 및 태그 서열을 포함하는 프라이머는 RNA에 혼성화된다. 혼성화된 프라이머는 역전사효소를 사용하여 제1 cDNA 가닥을 생성하도록 연장된다. 제2 cDNA 가닥은 이중 가닥 cDNA를 생성하도록 제1 cDNA 가닥으로부터 합성될 수 있다. 상기 단계는 세포 유리 DNA의 존재 하에 수행될 수 있다. 핵산의 라이브러리는 이중 가닥 cDNA 및 세포 유리 DNA로부터 생성될 수 있다. 단계는 핵산 분자의 말단-보수, 핵산 분자의 A-테일링, 어댑터의 결찰, PCR에 의한 라이브러리의 증폭 및 라이브러리의 서열분석을 포함할 수 있다. 세포 유리 RNA로부터 유래된 서열은 태그 서열의 포함에 의해 확인될 수 있다. 세포 유리 DNA로부터 유래된 서열은 태그 서열의 포함에 의해 확인될 수 있다.
몇몇 실시형태는 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 것을 포함한다. 몇몇 이러한 실시형태는 본 명세서에서 제공된 방법에 의해 핵산의 샘플로부터 제조된 핵산의 라이브러리로부터 서열 데이터를 수득하는 것 및 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태는 또한 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변이체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 변이체의 예는 단일 뉴클레오타이드 다형(SNP), 결실, 삽입, 치환, 전위, 중복 및 유전자 융합을 포함한다. 몇몇 실시형태는 또한 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 역전사 오류를 확인하는 것을 포함한다. 예를 들어, 역전사효소는 오류를 cDNA로 도입할 수 있다. 따라서, 서열의 소스의 확인은 변이체가 역전사의 결과일 수 있는지를 결정하는 데 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, RNA로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 서열은 기준 서열, 예컨대, 핵산의 라이브러리의 DNA 폴리뉴클레오타이드의 서열과 비교될 수 있다.
키트
본 명세서에서 제공된 몇몇 실시형태는 키트를 포함한다. 키트는 RNA를 포함하는 샘플로부터 핵산 라이브러리를 제조하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 역전사효소, 및 태그를 포함하는 복수의 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 또한 이중 가닥 cDNA를 생성하기 위한 시약, 예컨대, DNA 폴리머라제 및 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 키트는 또한 시약, 예컨대, 키나제, RNase, 리가제, 트랜스포슨, 폴리머라제 및 서열분석 어댑터를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1 - 혈청에서의 RNA/DNA 분자
드랍플렛 디지털 PCR(droplet digital PCR: ddPCR)은 암 환자 및 대조군 대상체로부터의 혈청에서 포스파티딜이노시톨-4를 암호화하는 핵산, 5-비스포스페이트 3-키나제 촉매 아단위 알파(PIK3CA) 및 B-Raf(BRAF)의 농도를 측정하기 위해 사용되었다. 증폭 전에, 핵산은 DNA, 또는 DNA 및 역전사된 RNA(cDNA)를 함유하는 샘플을 제공하도록 역전사 단계의 존재 및 부재 하에 제조되었다. PIK3CA 분석을 위해, FAM으로 표지된 PIK3CA의 엑손 20의 79 nt 앰플리콘(dHsaCP2506262)(BIO-RAD(캘리포니아주 허큘리스 소재))을 사용하였다. BRAF 분석을 위해, HEX로 표지된 BRAF의 66 nt 엑손 앰플리콘(dHsaCP2500366)(BIO-RAD(캘리포니아주 허큘리스 소재))을 사용하였다.
초기 혈청 농도는 PIK3CA 및 BRAF 엑손을 암호화하는 DNA 분자의 수, 및 PIK3CA 및 BRAF 엑손을 함께 암호화하는 DNA 및 RNA 분자의 수에 대해 결정되었다. 도 2는 암 환자(암 1, 2 및 3) 및 대조군 대상체(정상 1, 2 및 3)로부터의 혈청에서 PIK3CA 및 BRAF를 암호화하는 핵산의 농도의 그래프이다. 엑손의 초기 농도를 계산하기 위해 역전사 단계로 처리된 핵산 샘플은 "DNA+RNA"로 표지된다. 엑손의 초기 농도를 계산하기 위해 역전사 단계로 처리되지 않은 핵산 샘플은 "DNA"로 표지된다.
도 2에 요약된 결과는 BRAF RNA 수준이 샘플에서 PIK3CA 수준보다 상당히 크고, DNA:RNA 종의 상대 농도가 대상체 사이에 변한다는 것을 나타낸다.
실시예 2 - RT 단계로 제조된 라이브러리에 의한 전체 게놈 서열분석
핵산 라이브러리는 역전사 단계의 존재 및 부재 하에 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산의 세포 유리 샘플로부터 제조되었다. 라이브러리는 농후화를 수행함이 없이 Truseq RNA Access 라이브러리 키트(일루미나사(Illumina)(캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 사용하여 제조되었다. 라이브러리는 서열분석되고, 서열은 전체 전사체로 정렬되었다. 도 3은 공지된 유전자로 정렬된 서열의 수가 역전사 단계 없이 제조된 라이브러리로부터의 서열(모의 RT 서열)에 대한 것보다 역전사 단계로 제조된 라이브러리로부터의 서열(RT 서열)에 대해 상당히 더 크다는 것을 나타낸다. 또한, GNAQ 유전자의 엑손 4 및 5 및 LINC00152 비암호화 유전자의 엑손과 같은 엑손으로 정렬된 서열의 수는 모의 RT 서열보다 RT 서열에 대해 상당히 더 크다(데이터 비기재).
실시예 3 - RT 단계로 제조된 라이브러리에 의한 표적화된 서열분석
핵산 라이브러리는 역전사 단계의 존재 및 부재 하에 암 환자로부터의 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산의 세포 유리 샘플로부터 제조되었다. 라이브러리는 Truseq RNA Access 라이브러리 키트(일루미나사(캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 사용하여 제조되고, 비소형 세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC) V1 패널로부터 설계된 프로브를 사용하여 농후화되었다. 서열은 NSCLC V1 패널에 포함된 표적화된 유전자로 정렬되었다. 도 4는, NSCLC V1 패널에서 시험된 소정의 유전자 영역에 대해, 역전사 단계가 없는 방법(모의 RT)에 대해 역전사 단계가 있는 방법(RT)으로 제조된 라이브러리에 대한 커버리지의 비율의 그래프이다. 도 4는 NSCLC V1 패널에서의 적어도 12개의 유전자에 대한 커버리지가 모의 RT 서열보다 RT 서열에 대해 2배 초과라는 것을 나타낸다. 적어도 12개의 유전자의 검출의 민감도는, 역전사가 라이브러리 제제에 포함될 때, 상당히 증가하였다.
서열분석 데이터는 BRAF 유전자 변이체, 및 CD44-FGFR2 유전자 융합 변이체에 대해 추가로 분석되었다. 각각의 변이체에 대한 분석의 결과는 각각 표 1 및 표 2에 요약되어 있다. 변이체 둘 다에 대해, 검출의 민감도는, 역전사 단계 없이 제조된 라이브러리로부터 분석된 모의 RT 서열과 비교하여, 역전사 단계로 제조된 라이브러리로부터 분석된 RT 서열에 대해 상당히 증가하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 4 - 오직 RT 단계로 제조된 라이브러리에서 검출된 돌연변이
핵산 라이브러리는 역전사 단계의 존재 및 부재 하에 15명의 암 환자로부터의 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산의 세포 유리 샘플로부터 제조되었다. 라이브러리는 Truseq RNA Access 라이브러리 키트(일루미나사(캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 사용하여 제조되고, NSCLC V1 패널로부터 설계된 프로브를 사용하여 농후화되었다. 라이브러리는 표적화된 서열분석에 의해 서열분석되고, 서열은 표적화된 유전자 패널로 정렬되었다. 도 5는 역전사 단계로 제조된 라이브러리에서 증가된 빈도로 발견되는 돌연변이의 수의 그래프이다.
실시예 5 - RNA 단독으로부터 유래된 cDNA가 태그화된 라이브러리의 제조
핵산 라이브러리는 태그화된 랜덤 육합체의 존재 하에, 및 역전사효소의 존재 또는 부재 하에 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산의 세포 유리 샘플로부터 제조되었다. 라이브러리는 Truseq RNA Access 라이브러리 키트(일루미나사(캘리포니아주 샌 디에고 소재))를 사용하여 제조되고, NSCLC V1 패널로부터 설계된 프로브를 사용하여 농후화되었다. 라이브러리는 서열분석되고, 태그화된 서열에 대한 리드의 수는 각각의 라이브러리에 대해 결정되었다. 도 6은 역전사효소의 존재(A); 또는 역전사효소의 부재(B) 하에 태그화된 랜덤 육합체로 제조된 라이브러리로부터의 판독의 수의 그래프이다. 도 6은 태그화된 서열이 역전사효소로 제조된 라이브러리에 존재하고, 태그화된 서열의 대단찮은 배경 수준이 역전사효소 없이 제조된 라이브러리에서 검출된다는 것을 예시한다. 이것은 RNA로부터 유래된 cDNA의 서열이 태그를 사용하여 용이하게 확인될 수 있고, 비태그화된 서열로부터 구별될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "포함한다"는 "수반하는", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 동의어이고, 포함적 또는 개발 말단이고, 추가적인, 언급되지 않은 부재 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
상기 설명은 본 발명의 몇몇 방법 및 재료를 개시한다. 본 발명은 방법 및 재료의 변형, 및 제작 방법 및 설비의 변형에 처리된다. 이러한 변형은 본 개시내용의 고려 또는 본 명세서에서 개시된 발명의 실행으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 결과적으로, 본 발명이 본 명세서에서 개시된 특정한 실시형태에 제한되는 것으로 의도되지 않고, 이것이 본 발명의 진정한 범주 및 사상 내에 있는 모든 변형 및 대안을 포괄한다.
공개 및 비공개 출원, 특허 및 참조 문헌(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 본 명세서에 그 전문이 참고로 원용되고, 이로써 본 명세서의 일부가 된다. 참고로 원용된 공보 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 내포 개시내용을 부정하는 정도로, 본 명세서는 임의의 이러한 부정하는 자료를 대체하고/하거나 우선성을 취하도록 의도된다.

Claims (43)

  1. 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
    (a) 복수의 폴리뉴클레오타이드를 태그를 포함하는 복수의 프라이머로 혼성화시키는(hybridizing) 단계로서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함하는, 상기 혼성화시키는 단계;
    (b) 상기 혼성화된 프라이머를 역전사효소(reverse transcriptase)로 연장시키는 단계; 및
    (c) 상기 연장된 프라이머 및 상기 DNA로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (d) 상기 핵산의 라이브러리를 서열분석하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, (e) 상기 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드의 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 태그가 없는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드의 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머는 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 10,000개 초과의 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 100,000개 초과의 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 랜덤 육합체 서열(random hexamer sequence)을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 동일한 태그를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(avian myeloblastosis virus: AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus: MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(human immunovirus: HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2(Rous-associated virus-2: RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스(C. hydrogenoformans) DNA 폴리머라제, 티. 테르무스(T. thermus) DNA 폴리머라제, 티. 플라버스(T. flavus) DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 상기 DNA 폴리뉴클레오타이드의 존재에서 수행되는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 상기 연장된 프라이머로부터 이중 가닥 cDNA를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 상기 연장된 프라이머 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 키나제, 리가제, 트랜스포슨(transposon), 폴리머라제 및 서열분석 어댑터(sequencing adaptor)로 이루어진 군으로부터 선택된 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 세포 유리(cell-free) 상태인, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 혈청, 간질액(interstitial fluid), 림프, 뇌척수액, 가래, 소변, 젖, 땀 및 눈물로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플로부터 수득된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  18. 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법으로서,
    (a) 복수의 폴리뉴클레오타이드를 복수의 프라이머로 혼성화시키는 단계로서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함하는, 상기 혼성화시키는 단계;
    (b) 상기 혼성화된 프라이머를 역전사효소로 연장시키는 단계; 및
    (c) 상기 연장된 프라이머 및 상기 DNA로부터 핵산의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 세포 유리 상태인, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 복수의 폴리뉴클레오타이드는 혈청, 간질액, 림프, 뇌척수액, 가래, 소변, 젖, 땀 및 눈물로 이루어진 군으로부터 선택된 샘플로부터 수득된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머는 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 10,000개 초과의 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 100,000개 초과의 상이한 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 랜덤 육합체 서열을 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2(RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스 DNA 폴리머라제, 티. 테르무스 DNA 폴리머라제, 티. 플라버스 DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 상기 DNA 폴리뉴클레오타이드의 존재에서 수행되는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (b)는 상기 연장된 프라이머로부터 이중 가닥 cDNA를 생성하는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  30. 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, (c)는 상기 연장된 프라이머 및 DNA 폴리뉴클레오타이드를 키나제, 리가제, 트랜스포슨, 폴리머라제 및 서열분석 어댑터로 이루어진 군으로부터 선택된 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 핵산의 라이브러리를 제조하는 방법.
  31. 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법으로서,
    (i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법에 의해 핵산의 샘플로부터 제조된 핵산의 라이브러리로부터 서열 데이터를 수득하는 단계; 및
    (ii) 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인함으로써, 복수의 폴리뉴클레오타이드의 RNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된 서열을 확인하는 단계를 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, (iii) 상기 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 변이체를 확인하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 변이체는 단일 뉴클레오타이드 다형(single nucleotide polymorphism: SNP), 결실, 삽입, 치환, 중복, 전위 및 유전자 융합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 역전사 오류를 확인하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 기준 서열과 비교하는 단계를 더 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 기준 서열은 핵산의 라이브러리의 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 유래된, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 세포 유리 핵산을 포함하는, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 폴리뉴클레오타이드는 mRNA, tRNA, 리보솜 RNA, 비암호화 RNA, piRNA, siRNA, lncRNA, shRNA, snRNA, miRNA, snoRNA, 바이러스 RNA, 박테리아 RNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA인, 핵산의 샘플에서 핵산을 확인하는 방법.
  39. 핵산의 라이브러리를 제조하기 위한 키트로서,
    역전사효소; 및
    태그를 포함하는 복수의 프라이머로서, 각각의 프라이머는 상이한, 상기 복수의 프라이머를 포함하는, 키트.
  40. 제39항에 있어서, 상기 복수의 프라이머는 동일한 태그를 포함하는, 키트.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 키나제, RNase, 리가제, 트랜스포슨, 폴리머라제 및 서열분석 어댑터로 이루어진 군으로부터 선택된 성분을 추가로 포함하는, 키트.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 DNA 의존적 폴리머라제 활성이 결여된, 키트.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소, 인간 면역바이러스(HIV) 역전사효소, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 역전사효소, 라우스 연관된 바이러스-2(RAV2) 역전사효소, 씨. 하이드로게노포르만스 DNA 폴리머라제, 티. 테르무스 DNA 폴리머라제, 티. 플라버스 DNA 폴리머라제, 및 이들의 기능적 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된, 키트.
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