CN107083423B - 一种药物靶点预测和药物全方面评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物靶点预测或药物评价方法、多标签全转录组测序文库的构建方法和该方法所构建的一种多标签全转录组测序文库。本发明所提供的方法和文库适用于单细胞或少量细胞，成本低，对样本需求量小，可实现对药物在生命系统中作用的高通量准确评价，是新一代高精度及高维度药物筛选和评价体系，可对药物作用机理进行全面系统研究，可对不同药物间潜在组合效应及可能的新药研发靶点进行预测，从而指导新药研发及临床给药。

Description

一种药物靶点预测和药物全方面评价方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单细胞或少量细胞转录组测序方法的药物发现与评价，靶点预测及用药指导方法。
背景技术
目前世界上常用的药物筛选和评价体系主要分为高通量筛选和高内涵筛选。其中经典的高通量筛选主要是在制药及生物产业中采用机器人及计算机实现全自动化的生物及药理学实验，从而对大量未知化合物进行迅速评估，以发现具备生物学活性的潜在候选药物。
然而，由于高通量筛选技术本身的局限性使得其非常依赖于高度灵敏性的单一报告体系，使得通过高通量筛选虽然可以在短时间内完成大量未知化合物的测试，但这种筛选量上的提高并没有使得预期新药的发现量有所增加。相反，在大规模应用高通量筛选技术后，整个制药行业的产能在过去的几十年中出现了下降的趋势。并且由于高通量筛选技术依赖于高度灵敏性的单一报告体系，对于复杂的生命系统而言高通量筛选结果无法准确而全面反映药物在生命系统中作用的真实性。这使得提高药物筛选的效率和质量成为势在必行的途径，尽管这样会增加前期投入成本，但是会减少很多不必要的潜在药物流失。
随着成像技术的发展及在生物学上的应用，结合成像系统及高通量筛选系统就诞生了一种更先进的药物筛选和评价体系，即高内涵筛选系统。通过对多重报告体系的定量监测及精确到亚细胞结构的表型变化观测，对于药物在生命系统中的作用，高内涵筛选系统在更多的维度上提供了比高通量筛选单一报告体系更全面的评价指标。随着技术的开发及更多维度的观测指标的发现，高内涵筛选系统可以实现更加准确而全面反映药物在生命系统中的真实性作用。然而其代价是大大增加筛选系统的复杂性及前期药物筛选成本。因此现在的药物筛选的主流趋势是先利用高通量筛选系统发现具备生物学活性的潜在候选药物，然后利用高内涵筛选系统对高通量筛选系统得到的潜在候选药物进行多维度的评价。
虽然高内涵系统可以从多维度评价潜在的候选药物，但是其评价指标覆盖面仍然很难达到理想的效果。人们更多的还是希望获得一种全方面评价药物效果的测试方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种药物靶点预测或药物评价方法，所述方法包括：检测和分析细胞中全基因组RNA的表达水平。
所述细胞包括待测药物处理后的细胞、正常细胞和/或非正常细胞；具体可为待测药物处理后的肝癌细胞；再具体可为待测药物处理后的HepG2肝癌细胞。
所述方法还包括在检测和分析细胞中全基因组RNA的表达水平前，先对待测药物处理后的细胞、正常细胞和/或非正常细胞构建多标签全转录组测序文库；所述细胞具体可为肝癌细胞；再具体可为HepG2肝癌细胞。
所述方法还包括在构建多标签全转录组测序文库前，可进行待测药物有效性和/或基本毒理学评价，具体的可进行细胞凋亡检测分析和/或细胞周期阻滞检测分析。
所述方法还包括在进行待测药物有效性和/或基本毒理学评价前，可先进行细胞系的培养和传代；所述细胞系具体可为肝癌细胞系；再具体可为HepG2肝癌细胞系。
本发明的另一个目的是提供一种多标签全转录组测序文库的构建方法，所述方法包括：
1)在含有不同标签序列的RT引物裂解液中分别裂解细胞释放RNA分子，使RNA分子变性，进行逆转录反应，在逆转录反应结束后进行预扩增反应；
2)将步骤1)所得所有预扩增反应产物混合后纯化，纯化之后进行第二轮扩增；
3)第二轮扩增的产物纯化之后，利用超声破碎产物，富集3’末端产物，进行文库构建。
所述方法中，步骤1)所述细胞，可为单个或多个细胞；具体的，可为单个细胞；具体的，所述多个细胞为不超过500个细胞。
所述方法中，步骤1)所述细胞，包括待测药物处理后的细胞、正常细胞和/或非正常细胞；具体可为待测药物处理后的肝癌细胞；再具体可为待测药物处理后的HepG2肝癌细胞。
所述方法的具体操作过程包括：
(1)配制2.5ul的裂解液在无RNA酶的干净的96孔板中，每个孔中依次加入含有不同标签序列1-96号的RT引物，引物浓度可以是100nM到1uM。
上述2.5ul的裂解液的体系为：
Figure BDA0001255471380000021
用无核酸酶的水补齐到2.5ul
上述RT引物的组成结构如下：
5’TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTXXXXXXXXNNNNNNNNttttttttttttttttttttttttt
上述RT引物中，X序列为标签序列，本实施例共设计了96个标签序列，用于区分同一文库中不同的细胞；N序列为随机的未定义的分子标记(unique molecular identifier)序列，可以用来计算每个基因的转录本拷贝数。96个标签序列的具体核苷酸序列为：
序号 标签序列 序号 标签序列 序号 标签序列 序号 标签序列
1 AACGTGAT 25 AGATCGCA 49 GATAGACA 73 AATGTTGC
2 AAACATCG 26 AGCAGGAA 50 GCCACATA 74 ACACGACC
3 ATGCCTAA 27 AGTCACTA 51 GCGAGTAA 75 ACAGATTC
4 AGTGGTCA 28 ATCCTGTA 52 GCTAACGA 76 AGATGTAC
5 ACCACTGT 29 ATTGAGGA 53 GCTCGGTA 77 AGCACCTC
6 ACATTGGC 30 CAACCACA 54 GGAGAACA 78 AGCCATGC
7 CAGATCTG 31 CAAGACTA 55 GGTGCGAA 79 AGGCTAAC
8 CATCAAGT 32 CAATGGAA 56 GTACGCAA 80 ATAGCGAC
9 CGCTGATC 33 CACTTCGA 57 GTCGTAGA 81 ATCATTCC
10 ACAAGCTA 34 CAGCGTTA 58 GTCTGTCA 82 ATTGGCTC
11 CTGTAGCC 35 CATACCAA 59 GTGTTCTA 83 CAAGGAGC
12 AGTACAAG 36 CCAGTTCA 60 TAGGATGA 84 CACCTTAC
13 AACAACCA 37 CCGAAGTA 61 TATCAGCA 85 CCATCCTC
14 AACCGAGA 38 CCGTGAGA 62 TCCGTCTA 86 CCGACAAC
15 AACGCTTA 39 CCTCCTGA 63 TCTTCACA 87 CCTAATCC
16 AAGACGGA 40 CGAACTTA 64 TGAAGAGA 88 CCTCTATC
17 AAGGTACA 41 CGACTGGA 65 TGGAACAA 89 CGACACAC
18 ACACAGAA 42 CGCATACA 66 TGGCTTCA 90 CGGATTGC
19 ACAGCAGA 43 CTCAATGA 67 TGGTGGTA 91 CTAAGGTC
20 ACCTCCAA 44 CTGAGCCA 68 TTCACGCA 92 GAACAGGC
21 ACGCTCGA 45 CTGGCATA 69 AACTCACC 93 GACAGTGC
22 ACGTATCA 46 GAATCTGA 70 AAGAGATC 94 GAGTTAGC
23 ACTATGCA 47 GACTAGTA 71 AAGGACAC 95 GATGAATC
24 AGAGTCAA 48 GAGCTGAA 72 AATCCGTC 96 GCCAAGAC
(2)当把药物处理之后的细胞手动挑取到步骤(1)所述的裂解液)(每管裂解液挑入细胞不超过500个)之后，迅速剧烈震荡并离心，在PCR仪器上进行72℃3分钟裂解细胞释放RNA分子并使其变性。然后加入2.85ul的逆转录反应液体系，迅速混匀离心，放在PCR仪上进行逆转录反应，具体温度程序为：25℃5分钟；42℃60分钟；50℃30分钟；72℃10分钟失活逆转录酶。
上述2.85ul逆转录反应液体系为：
Figure BDA0001255471380000031
Figure BDA0001255471380000041
用无核酸酶的水补齐到2.85ul
上述TSO引物的核苷酸序列为：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G，LNA修饰
(3)在逆转录反应结束后紧接着做预扩增反应，在上述步骤(2)的反应体系中加入7.5ul的扩增混合液，预扩增分为两步：先是4个循环的98℃20秒,65℃30秒,72℃5分钟；然后是8-12个循环(本实施例具体是8个循环)的98℃20秒,67℃15秒,72℃5分钟。扩增结束后直接将一个96孔板的所有反应产物转移到一个管子中，纯化之后进行第二轮扩增。
上述7.5ul的扩增混合液体系为：
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix(货号为KK2602) 6.5ul
10uM IS PCR引物 0.25ul
10uM 3’P2引物 0.75ul
用无核酸酶的水补齐到7.5ul
引物浓度可以在200nM到1uM。
上述IS PCR引物的核苷酸序列如下：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
上述3’P2引物的核苷酸序列如下：
5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
(4)经过4-5个循环的二轮扩增(本实施例具体是4个循环)，具体扩增的程序为98℃20秒,67℃15秒,72℃5分钟。扩增产物纯化之后，利用超声破碎到250至500个碱基长度不等，这样物理地随机打断比酶切破碎产生的DNA断裂位置更随机。打断后每个文库用10ulinvitrogen的C1磁珠(货号65002)孵育，富集出转录本的3’末端。后续用KAPA的建库试剂盒(货号KK8506)进行文库构建。
上述二轮扩增的扩增反应体系为：
Figure BDA0001255471380000042
用无核酸酶的水补齐到50ul。
上述cDNA模板总量可以是1ng到100ng不等，引物浓度可以是300nM到600nM不等。
上述Biotin-index引物的组成结构如下：
5’/Biotin/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
其中index对应的为6个碱基序列，可以多样化，本实施例具体的index核苷酸序列为：GTAGAG。
上述IS PCR引物的核苷酸序列如下：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(与步骤3中的一样)
本发明的还一个目的是提供一种多标签全转录组测序文库，所述文库是通过上述多标签全转录组测序文库的构建方法构建获得的。
本发明的还一个目的是提供多标签全转录组测序文库在药物靶点发现、预测、各药物相互关系、药物作用机理研究、药物新用途的发现和/或药物评价中的应用。
所述多标签全转录组测序文库为上述的多标签全转录组测序文库和/或通过上述多标签全转录组测序文库的构建方法所构建的多标签全转录组测序文库。
本发明的还一个目的是提供多标签全转录组测序文库在制备药物靶点发现、预测、不同药物相互关系、药物作用机理研究、药物新用途的发现和/或药物潜在安全风险性评价产品中的应用。所述产品可为试剂盒。
本发明的还一个目的是提供靶点HAGH、SDHAF4、LDHA和/或ELF3在制备治疗与靶点HAGH、SDHAF4、LDHA和/或ELF3有关的疾病的药物中的应用。具体的靶向肝癌细胞杀伤作用的靶向药物中的应用。
本发明的还一个目的是提供R428或Sorafenib或Crizotinib在制备治疗与靶点HAGH、SDHAF4、LDHA和/或ELF3有关的疾病的药物中的应用。
本发明的还一个目的是提供Sunitinib、R428和/或Crizotinib在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供R428在制备治疗与细胞周期相关调控网络相关疾病药物中的应用，所述疾病不包括与细胞周期相关调控网络相关的白血病；Sorafenib在制备治疗与蛋白质及大分子功能网络相关疾病药物中的应用，所述疾病不包括与蛋白质及大分子功能网络相关的肝癌、肾癌；Crizotinib在制备治疗与糖类及碳水化合物代谢网络相关疾病药物中的应用，所述疾病不包括与糖类及碳水化合物代谢网络相关的肺癌和淋巴癌；Sunitinib在制备治疗与细胞凋亡相关疾病药物中的应用，所述疾病不包括与细胞凋亡相关的晚期肾细胞癌、胃肠间质瘤和胰腺神经内分泌瘤。
本发明提供的药物靶点预测或药物评价方法是一种全方面评价药物效果的测试方法，添补了目前药物全方面评价方法的空白。
本发明提供的一种多标签全转录组测序文库的构建方法和该方法所构建的一种多标签全转录组测序文库，所构建的文库反映了作为生命系统基本单位的细胞在不同状态下的生理活动，进而准确而全面反映药物在生命系统中作用的真实性，其精确度和维度覆盖面是目前所有药物评价体系难以企及的。
本发明提供的药物靶点预测或药物评价方法和本发明提供的一种多标签全转录组测序文库的构建方法和该方法所构建的一种多标签全转录组测序文库，适用于单细胞或少量细胞，成本低，对样本需求量小，可实现对药物在生命系统中作用的高通量准确评价，是新一代高精度及高维度药物筛选和评价体系，可对药物作用机理进行全面系统研究，可对不同药物间潜在组合效应及可能的新药研发靶点进行预测，从而指导新药研发及临床给药。
附图说明
图1为细胞凋亡分析结果图。
图2为细胞周期分析结果图。
图3为多标签的全转录组测序文库构建示意图。
图4为多标签全转录组测序文库的评价结果图。
图5为待测药物作用72h的HepG2基因表达聚类分析情况图。
图6为待测药物作用72h的HepG2基因表达Spantree分析情况图。
图7为对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药物的共同抑制基因分析图。
图8为新的药物作用代表性靶基因LDHA的表达情况随三种药物作用浓度的变化趋势图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、多标签的全转录组测序文库的构建
(一)细胞培养
1.HepG2肝癌细胞系的培养和传代
(1)将HepG2肝癌细胞系置于含10％FBS的DMEM-HG培养基下培养至接近80％密度。
(2)用PBS缓冲液洗2遍，以除去上层死细胞，加入适量Trypsin于37℃消化3分钟，之后用10％FBS的DMEM-HG培养基进行中和，离心并去除上清。
(3)用10％FBS的DMEM-HG培养基进行重悬，计数并传代，传代比例1：6.
2.在HepG2肝癌细胞系上对FDA批准靶向药物的有效性进行测试
(1)将HepG2肝癌细胞系置于含10％FBS的DMEM-HG培养基下培养至接近80％密度。
(2)用PBS缓冲液洗2遍，以除去上层死细胞，加入适量Trypsin于37℃消化3分钟，之后用10％FBS的DMEM-HG培养基进行中和，离心并去除上清。
(3)用10％FBS的DMEM-HG培养基进行重悬，计数并传代，传代密度：1.0x10^5/孔。
(4)待测药物准备：将药物稀释到合适的浓度，一般浓储为10mM。测试浓度设置为1000x，5000x，10000x。
(5)传代24小时后，待细胞汇合度达到60％左右加入待测药物。每个浓度设3个平行孔。
(6)分别于加入药物后24h，48h，72h观察细胞状态，拍照记录，并于72h收样进行毒理学检测及下述步骤(三)的多标签的全转录组测序。
本实施例所用FDA批准的靶向药物具体信息如表1所示。
表1
Figure BDA0001255471380000071
(二)药物基本毒理学评价
1.细胞凋亡检测
(1)将每个待测孔的细胞用PBS缓冲液洗2遍，以除去上层死细胞，加入适量Trypsin于37℃消化3分钟，之后用10％FBS的DMEM-HG培养基进行中和，离心并去除上清。之后用PBS清洗2次；
(2)利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)：对细胞进行凋亡分析。分析结果如图1所示，纵坐标为第72h凋亡细胞占总细胞的比例。横坐标CK为未处理组。可见#3Sorafenib(靶向ERK)作为已知具有靶向肝癌细胞的药物。其对HepG2肝癌细胞的杀伤作用随着浓度的增加而增强。而#4Ibrutinib，#8Nilotinib，和#11Dasatinib作为白血病特征靶点(BTK和ABL)靶向药对肝癌细胞HepG2无杀伤作用。有趣的是同#3Sorafenib作用靶点相近的#5Crizotinib(靶点为c-Met)和#7Sunitinib(靶点为RTK)尽管不是作为肝癌的靶向药，在本研究中也可以有效杀伤HepG2肝癌细胞。此外，我们还观察到#2R428(靶点为Axl)在低浓度组(10000x)即可在短时间(24h)完全杀伤肝癌细胞HepG2。结果未展示。
2.细胞周期阻滞检测
(1)将每个待测孔的细胞用PBS缓冲液洗2遍，以除去上层死细胞，加入适量Trypsin于37℃消化3分钟，之后用10％FBS的DMEM-HG培养基进行中和，离心并去上除上清。之后用PBS清洗2次；
(2)利用流式细胞仪(BD FACSCalibur)：对细胞进行周期分析，分析结果如图2所示，纵坐标为处于不同细胞周期的细胞所占细胞总数的百分比。横坐标CK为未处理组。可见#3Sorafenib(靶向ERK)作为已知具有靶向肝癌细胞的药物。其对HepG2肝癌细胞的细胞周期的影响主要是使其阻滞在G2/M期，其它对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药#2R428(靶点为Axl)，#5Crizotinib(靶点为c-Met)和#7Sunitinib(靶点为RTK)则分别会使HepG2阻滞在G0/G1期和G2/M期。对肝癌细胞HepG2没有明显抑制作用的#8Nilotinib(靶点为ABL)则同未处理组一样对细胞周期没有显著影响。
(三)多标签的全转录组测序文库的构建
1.细胞收样及文库构建
多标签的全转录组测序文库构建的示意图如图3所示，将处于不同生命生理状态的细胞(同样状态的细胞可一个或多个)利用手工操作分别依次转移到包含有不同标签序列的RT引物的裂解液中。为了提高反转录步骤的效率并保证标签序列的引入不会影响数据质量，我们严格控制反转录引物中标签序列的长度，设计了总共96组标签序列。接下来分别对每个样本独立进行逆转录和预扩增。预扩增完后的产物直接混合到一起，纯化之后得到的cDNA模板用IS PCR引物和Biotin-index引物进行二次扩增。扩增产物通过纯化去除引物二聚体之后进行超声打碎，利用带有链霉亲和素修饰的磁珠富集cDNA产物的一端后在磁珠上进行单端index建库流程。
具体操作过程如下所述：
(1)配制2.5ul的裂解液在无RNA酶的干净的96孔板中，每个孔中依次加入含有不同标签序列1-96号的RT引物，引物浓度可以是100nM到1uM。
上述2.5ul的裂解液的体系为：
Figure BDA0001255471380000091
用无核酸酶的水补齐到2.5ul
上述RT引物的组成结构如下：
5’TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTXXXXXXXXNNNNNNNNttttttttttttttttttttttttt
上述RT引物中，X序列为标签序列，本实施例共设计了96个标签序列，用于区分同一文库中不同的细胞；N序列为随机的未定义的分子标记(unique molecular identifier)序列，可以用来计算每个基因的转录本拷贝数。
96个标签序列的具体核苷酸序列及编号见表2：
表2
序号 标签序列 序号 标签序列 序号 标签序列 序号 标签序列
1 AACGTGAT 25 AGATCGCA 49 GATAGACA 73 AATGTTGC
2 AAACATCG 26 AGCAGGAA 50 GCCACATA 74 ACACGACC
3 ATGCCTAA 27 AGTCACTA 51 GCGAGTAA 75 ACAGATTC
4 AGTGGTCA 28 ATCCTGTA 52 GCTAACGA 76 AGATGTAC
5 ACCACTGT 29 ATTGAGGA 53 GCTCGGTA 77 AGCACCTC
6 ACATTGGC 30 CAACCACA 54 GGAGAACA 78 AGCCATGC
7 CAGATCTG 31 CAAGACTA 55 GGTGCGAA 79 AGGCTAAC
8 CATCAAGT 32 CAATGGAA 56 GTACGCAA 80 ATAGCGAC
9 CGCTGATC 33 CACTTCGA 57 GTCGTAGA 81 ATCATTCC
10 ACAAGCTA 34 CAGCGTTA 58 GTCTGTCA 82 ATTGGCTC
11 CTGTAGCC 35 CATACCAA 59 GTGTTCTA 83 CAAGGAGC
12 AGTACAAG 36 CCAGTTCA 60 TAGGATGA 84 CACCTTAC
13 AACAACCA 37 CCGAAGTA 61 TATCAGCA 85 CCATCCTC
14 AACCGAGA 38 CCGTGAGA 62 TCCGTCTA 86 CCGACAAC
15 AACGCTTA 39 CCTCCTGA 63 TCTTCACA 87 CCTAATCC
16 AAGACGGA 40 CGAACTTA 64 TGAAGAGA 88 CCTCTATC
17 AAGGTACA 41 CGACTGGA 65 TGGAACAA 89 CGACACAC
18 ACACAGAA 42 CGCATACA 66 TGGCTTCA 90 CGGATTGC
19 ACAGCAGA 43 CTCAATGA 67 TGGTGGTA 91 CTAAGGTC
20 ACCTCCAA 44 CTGAGCCA 68 TTCACGCA 92 GAACAGGC
21 ACGCTCGA 45 CTGGCATA 69 AACTCACC 93 GACAGTGC
22 ACGTATCA 46 GAATCTGA 70 AAGAGATC 94 GAGTTAGC
23 ACTATGCA 47 GACTAGTA 71 AAGGACAC 95 GATGAATC
24 AGAGTCAA 48 GAGCTGAA 72 AATCCGTC 96 GCCAAGAC
(2)将上述步骤(一)中经不同药物及不同药物浓度处理的细胞(同一药物同一浓度处理的细胞可以是单个细胞或者多个)利用手工操作分别依次转移到(1)所述包含有不同标签序列的RT引物的裂解液中(每管裂解液挑入细胞不超过500个)之后，迅速剧烈震荡并离心，在PCR仪器上进行72℃3分钟裂解细胞释放RNA分子并使其变性。然后加入2.85ul的逆转录反应液体系，迅速混匀离心，放在PCR仪上进行逆转录反应，具体温度程序为：25℃5分钟；42℃60分钟；50℃30分钟；72℃10分钟失活逆转录酶。
上述2.85ul逆转录反应液体系为：
Figure BDA0001255471380000101
用无核酸酶的水补齐到2.85ul
上述TSO引物的核苷酸序列为：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G，LNA修饰
(3)在逆转录反应结束后紧接着做预扩增反应，在上述步骤(2)的反应体系中加入7.5ul的扩增混合液，预扩增分为两步：先是4个循环的98℃20秒,65℃30秒,72℃5分钟；然后是8-12个循环(本实施例具体是8个循环)的98℃20秒,67℃15秒,72℃5分钟。扩增结束后直接将一个96孔板的所有反应产物转移到一个管子中，纯化之后进行第二轮扩增。
上述7.5ul的扩增混合液体系为：
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix(货号为KK2602) 6.5ul
10uM IS PCR引物 0.25ul
10uM 3’P2引物 0.75ul
用无核酸酶的水补齐到7.5ul
引物浓度可以在200nM到1uM。
上述IS PCR引物的核苷酸序列如下：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
上述3’P2引物的核苷酸序列如下：
5’GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
(4)经过4-5个循环的二轮扩增(本实施例具体是4个循环)，具体扩增的程序为98℃20秒,67℃15秒,72℃5分钟。扩增产物纯化之后，利用超声破碎到250至500个碱基长度不等，这样物理地随机打断比酶切破碎产生的DNA断裂位置更随机。打断后每个文库用10ulinvitrogen的C1磁珠(货号65002)孵育，富集出转录本的3’末端。后续用KAPA的建库试剂盒(货号KK8506)进行文库构建。
上述二轮扩增的扩增反应体系为：
Figure BDA0001255471380000111
用无核酸酶的水补齐到50ul。
上述cDNA模板总量可以是1ng到100ng不等，引物浓度可以是300nM到600nM不等。
上述Biotin-index引物的组成结构如下：
5’/Biotin/CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATindexGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
其中index对应的为6个碱基序列，可以多样化，本实施例具体的index核苷酸序列为：GTAGAG。
上述IS PCR引物的核苷酸序列如下：
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(与步骤3中的一样)
2.对所构建的多标签全转录组测序文库的评价结果如图4所示，其中，图a1-a4分别依次为本实施例所构建的多标签全转录组测序文库的片段分布、GC含量、文库数据的错误率、文库数据碱基平均质量值；图b1-b4为普通文库(即用普通smartseq2方法构建的单细胞文库)的片段分布、GC含量、文库数据的错误率、文库数据碱基平均质量值。
由于本发明所构建的多标签全转录组测序文库read2端(具体为上述步骤1中的Biotin-index引物一端)碱基存在高度一致性，所以数据的质量值比普通文库低，同时错误率比普通文库高，但是主要用于下述实施例2所述分析的read1端(和含有Biotin-index引物端相反的另外一端)得到的序列的错误率和质量值与普通文库没有差异，本发明所构建的多标签全转录组测序文库可进一步用于下述实施例2的测序及结果分析。
实施例2、多标签全转录组测序文库的测序及结果分析
(一)将实施例1所构建的文库在Illumina测序平台进行双端测序。
(二)对上述测序结果进行分析:
1、测序结果的聚类分析
图5为待测药物作用72h的HepG2基因表达聚类分析情况，可以看出对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药药物#2R428(靶点为Axl)，#5Crizotinib(靶点为c-Met)具有相似的表达特征。而与#7Sunitinib(靶点为RTK)及已知具有靶向肝癌细胞的药物#3Sorafenib(靶向ERK)不同，说明它们对肝癌细胞HepG2杀伤作用的机理不同。
2、测序结果的Spantree分析
图6为待测药物作用72h的HepG2基因表达Spantree分析情况，可以看出对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药药物#2R428(靶点为Axl)，#5Crizotinib(靶点为c-Met)具有相近的关系。已知具有靶向肝癌细胞的药物#3Sorafenib(靶向ERK)的关系较为独立。而另一个对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药药物#7Sunitinib(靶点为RTK)则介于二者之间。图6中drug2为药物#2R428(靶点为Axl)，drug3为药物#3Sorafenib(靶向ERK)，drug5为药物#5Crizotinib(靶点为c-Met)，drug7为药物#7Sunitinib(靶点为RTK)。
3、测序结果的GO分析
表3-表6为对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药物抑制基因的GO分析。由表3可知已知具有靶向肝癌细胞的药物#3Sorafenib(靶向ERK)主要作用在蛋白质及大分子功能网络。由表4可知#2R428(靶点为Axl)主要作用在细胞周期相关调控网络。由表5可知#5Crizotinib(靶点为c-Met)主要作用在糖类及碳水化合物代谢网络。由由表6可知#7Sunitinib(靶点为RTK)主要影响细胞凋亡。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE004
4、对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药物的共同抑制基因分析及对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的新的药物作用靶点预测
图7为对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药物的共同抑制基因分析。由图7可以看出三种药物的共同靶点包括SPRSSA、LXN、BNIP3、GATB、HAGH、SDHAF4、LDHA、ELF3、URB1-AS1、CCDC125。其中粗体表示的基因为预测得到的首选新的药物作用靶点,分别为HAGH、SDHAF4、LDHA、ELF3。图7中drug2为药物#2R428(靶点为Axl)，drug3为药物#3Sorafenib(靶向ERK)，drug5为药物#5Crizotinib(靶点为c-Met)。
5、新的药物作用代表性靶基因LDHA的表达情况随三种药物作用浓度的变化趋势
图8为新的药物作用代表性靶基因LDHA的表达情况随三种药物作用浓度的变化趋势(处理72h)。由图8可以看出预测的到的新靶点LDHA的表达水平随着对肝癌细胞HepG2有杀伤作用的靶向药物的浓度升高而逐渐降低。图8中drug2为药物#2R428(靶点为Axl)，drug3为药物#3Sorafenib(靶向ERK)，drug5为药物#5Crizotinib(靶点为c-Met)。

Claims (5)

1.一种药物靶点预测或药物评价方法，其特征在于，所述方法包括：检测和分析细胞中全基因组RNA的表达水平，所述细胞包括待测药物处理后的细胞、正常细胞和/或非正常细胞，检测和分析细胞中全基因组RNA的表达水平前，先对待测药物处理后的细胞、正常细胞和/或非正常细胞构建用于区分同一文库中不同细胞的多标签全转录组测序文库，所述多标签全转录组测序文库的构建方法包括：1)在含有不同标签序列的RT引物裂解液中分别裂解细胞释放RNA分子，使RNA分子变性，进行逆转录反应，在逆转录反应结束后进行预扩增反应；2)将步骤1)所得所有预扩增反应产物混合后纯化，纯化之后进行第二轮扩增；3)第二轮扩增的产物纯化之后，利用超声破碎产物，富集3’末端产物，进行文库构建；所述转录组测序文库使用的RT引物包括标签序列和用于计算转录本拷贝数的随机的未定义的分子标记序列；所述细胞处于不同状态，所述每种不同状态的细胞数量不超过500个并且在含有不同标签序列的RT引物裂解液中独立地进行逆转录反应；所述细胞具体可为肝癌细胞；在构建多标签全转录组测序文库前，进行细胞凋亡检测分析和/或细胞周期阻滞检测分析。
2.一种多标签全转录组测序文库，所述文库是通过权利要求1所述方法构建获得的。
3.权利要求2所述的多标签全转录组测序文库在药物靶点发现、预测、各药物相互关系、药物作用机理研究、药物新用途的发现和/或药物评价中的应用。
4.权利要求2所述的多标签全转录组测序文库在制备药物靶点发现、预测、不同药物相互关系、药物作用机理研究、药物新用途的发现和/或药物潜在安全风险性评价产品中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述药物靶点为HAGH、SDHAF4、LDHA和/或ELF3。
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