CN104711340A - 一种转录组测序方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种转录组测序方法，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0-5个碱基，随机序列由4-12个随机碱基组成，特定序列为5-30个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。通过对逆转录引物的设计，本发明既能对带有poly(A)尾的RNA进行测序，又能对不带poly(A)尾的RNA进行测序，进行细胞转录组测序时无需rRNA去除步骤，尤其适用于低起始核糖核酸量和细胞数量的转录组的测序。
Description
技术领域
本发明涉及一种转录组扩增测序检测方法，特别涉及微量样品中能够同时覆盖含和不含多聚腺苷酸尾巴的核糖核酸种类的扩增测序技术。
背景技术
随着生命科学研究技术的发展，第二代高通量测序技术的开发，对生物体的研究越来越详尽和深入，发现生物体内同种细胞间往往存在异质性，这些个体的特征可能是影响和引导生物体发育的重要因素，所以对单细胞水平的分析越来越重要。尤其是对单细胞转录组的测序分析，可以直接反应不同细胞间的整体表达差异，反应细胞生长的调控状态。
细胞内的RNA主要包括带有poly(A)尾的mRNA(约占细胞全部RNA的5％)，不带poly(A)尾的核糖体RNA(rRNA，占细胞全部RNA的90％以上)。对细胞转录组的测序分析首先需要将不稳定的RNA通过体外逆转录反应变成较为稳定的DNA序列，然后进一步扩增富集样品，达到标准商业化方法建库的起始量。为了防止含量过多的rRNA污染，目前存在的单细胞转录组测序方法在逆转录中利用与poly(A)互补配对的寡聚胸腺嘧啶(olig dT)作为引物，使得引物只能与带有poly(A)尾的mRNA结合，不与不带poly(A)尾的rRNA结合。虽然该做法可以杜绝rRNA的污染，但是同时也将研究对象限定在了带poly(A)尾的RNA中，其中最为重要的一种是mRNA。随着对转录组研究的不断深入，发现细胞中还存在许多其他种类的不带poly(A)尾的RNA，比如长非编码核糖核酸(1ong-noncoding RNA，lncRNA)，环形核糖核酸(circular RNA)等，它们可能对细胞基因表达存在重要的调控作用，但在逆转录时以olig dT作为引物的转录组测序方法中，由于引物不与不带poly(A)尾的RNA结合，该部分RNA的信息无法获得。
另一方面，现有技术中的转录组测序往往针对大量细胞(总核糖核酸在微克级)进行，为减少rRNA干扰，在进行逆转录之前先用针对细胞中大量存在的rRNA的探针将其去除之后再进行后续的实验。而在少量细胞、甚至是单细胞的转录组测序时，由于去除rRNA的步骤而带来的其他RNA的损失是无法承受的。
发明内容
针对现有技术中存在的无法对转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序，尤其是无法对少量细胞转录组中不带poly(A)尾的RNA进行测序的问题，本发明提供了一种能够逆转录出所有种类的RNA并将其扩增建库的方法，该方法使用包含随机序列的“随机引物”进行逆转录，不依赖poly(A)尾，因此可以覆盖所有核糖核酸种类。同时，由于反应温度条件的控制，可以减少rRNA的污染。
本发明提供一种转录组测序方法，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0-5个碱基，随机序列由4-12个随机碱基组成，优选由6-8个随机碱基组成(A、T、G、c中任意组合成六-八聚体)，特定序列为5-30个碱基的同聚体，优选为10-20个碱基的同聚体，更优选为15个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。传统利用olig dT作为引物的方法中，由于引物结合位置都只能结合在mRNA链末端的聚腺苷酸尾巴上，导致绝大部分情况下能够覆盖的片段都在整条核糖核酸链的末尾段，不利于研究基因转录的完整性以及揭示可变剪切等现象。本发明的随机引物理论上可以结合整条核糖核酸链的各个部位，因此可以大大提高逆转录的均匀性，反映细胞中转录本的真实状态。虽然随机引物可以随机的与任何序列结合，但是由于引物本身设计在随机组合的4-12个核糖核苷酸之后连接5-30个胸腺嘧啶(T)，更倾向于结合具有poly(A)尾的RNA序列，使得利用本方法对核糖体核糖核酸的逆转录非常少(小于2％)，不对测序数据造成损失，同时同聚体的存在也很少引入引物多聚体等人为的污染。
在该方法中，无需去除核糖体RNA。
在该方法中，所述的引物还包括锚定序列，锚定序列为cDNA扩增步骤中PCR引物序列。
在该方法中，所述RNA起始量为少量，甚至为单细胞当量，RNA起始量为0.1pg-100ng，优选10pg-500pg。相应的细胞数量为1-10000个，优选1-100个，更优选1-10个。
在该方法中，逆转录之前加热以释放细胞中的RNA并破坏其二级结构，加热的温度为60-80℃，加热时间为10s-3min，优选30s-120s，更优选90s。rRNA具有比mRNA更为丰富的二级结构。传统步骤中，逆转录前对RNA65C5min的加热会使rRNA结构充分打开，使在后续步骤中引入rRNA干扰。而本方法通过精确控制加热温度和时间，使细胞中的RNA充分释放，同时避免打开rRNA的二级结构，从而减少对rRNA的逆转录。
该方法包括如下步骤：(1)加热，(2)逆转录反应获得cDNA一链，(3)消化未反应的引物，(4)一链cDNA加polyA尾，(5)二链cDNA合成，(6)cDNA模板扩增反应，(7)扩增产物的纯化，(8)扩增cDNA片段的筛选，(9)二轮扩增，(10)二轮扩增产物纯化及片段筛选，(11)cDNA文库构建及测序。
在该方法中，一链cDNA加polyA尾的过程中，加入dATP和ddATP，所加入的dATP和ddATP的摩尔比为50-200：1，优选100：1。传统扩增方法实现单细胞核糖核酸测序技术在第一条互补脱氧核糖核酸链(cDNA)形成后，直接加入末端转移酶和一定浓度的脱氧腺嘌呤核苷酸(dATP)，在末端加上一段聚腺苷酸，作为第二条互补脱氧核糖核酸链合成的引物结合区。这一步往往由于酶的效率过高，在单细胞反应体系的小体系中(5u1)很难再修改加入反应物的浓度和体积，导致合成的聚腺苷酸尾巴过长，污染测序数据。我们在发明中引入双脱氧腺嘌呤(ddATP)，一端可以与dATP结合，但结合之后另一端无法再继续结合其他碱基，这样就可以终止聚脱氧腺嘌呤链的继续延长。本发明中，我们以双脱氧腺嘌呤：脱氧腺嘌呤＝1：100的比例加入反应体系，可以合理控制添加的聚脱氧腺嘌呤链的长度，从而使得测序得到的有效数据比例更高。
本发明提供了一套完整的单细胞测序实验技术，得到的样品直接用于核酸文库构建操作，所以需要达到一定的文库构建起始量，需要两轮PCR(聚合酶链式反应)扩增反应，第一轮和第二轮PCR反应的循环数分别是16-20，8-10不等，需要根据实验起始细胞量的大小(总的核糖核酸含量多少)决定。以10pg核糖核酸起始量为例，第一轮和第二轮扩增分别需要20和10个循环。本方法尤其适用于微量实验，虽然测序结果显示，随着起始核糖核酸量的增加，会有更多的基因被覆盖，但是ng级别的核糖核酸起始量已经达到饱和，过度的扩增会带来更大的噪声，超过1ng的样品起始量得到的实验结果稳定性可能反而不如100pg。
使用本发明的单细胞核糖核酸测序技术拥有很高的技术重复性，在研究细胞间差异时可以排除技术误差，适于分析单细胞及微量核糖核酸样品中含聚腺苷酸尾巴和不含聚腺苷酸尾巴的核糖核酸，从而可以更全面研究单细胞转录组，对更多未知的核糖核酸展开研究。
本发明的有益效果是：(1)既能对带有poly(A)尾的RNA进行测序，又能对不带poly(A)尾的RNA进行测序；(2)细胞转录组测序时无需rRNA去除步骤；(3)尤其适用于低起始核糖核酸量和细胞数量的转录组的测序。
附图说明
以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
图1为实施例1中实验流程示意图。
图2为对使用本发明的方法检测到的一种特定不带poly(A)尾的环形RNA的验证结果图。
具体实施方式
实施例1
1.单细胞的裂解：
配制如下裂解液：
25mM MgCl2是包含在10X PCR buffer ll包装里的。AnchorX-T15-N6primer为在RNA到cDNA逆转录过程中所使用的引物，其中的N6为由6个随机碱基组成的序列，随机碱基随机选自A、G、C、T中任一个。T15为15bp的T同聚体。Anchor)(为锚定序列，是一段合成的与哺乳动物基因序列都不同源的23个碱基长度序列。
将4.5μl裂解液混匀后加入到含有单细胞的PCR管中。
单细胞的分离：
将细胞用0.25％胰蛋白酶消化3-5分钟，用三倍体积的含有白血病抑制因子(LIF)的细胞培养基终止消化，然后用移液枪将悬浮的细胞团吹打成单分散，再置于PBS缓冲液放在显微镜下进行观察和操作，用横截面直径20-30μm的毛细针利用毛细作用吸取单个细胞，并将细胞转移到含有裂解液的PCR管中。在PCR仪中进行如下程序：70℃90s可以完全释放细胞中的核糖核酸，并破坏其二级结构，便于后续逆转录反应的进行。
2.逆转录反应
反应液配制如下：
在上一步反应后的产物中直接加入配制好的逆转录反应液，在PCR仪器上执行以下操作进行逆转录：25℃5min：50℃30min合成与RNA互补的DNA链(一链cDNA)。最后在70℃15min灭活逆转录酶。
3.消化未反应的引物
在上一步反应产物中直接加入lul Exo-SAP-IT(USB，78201)消化没有参与反应的引物，在PCR仪上执行以下程序：37℃30min；80℃25min。
4.一链cDNA末端加聚腺苷酸(poly(A))尾巴
配制如下反应溶液：
将配制好的溶液加入上一步反应的PCR样品管中，在PCR仪上执行以下程序：37℃15min；70℃10min。5.二链cDNA合成
配制如下反应液：
其中ExTaq buffer和2.5mM dNTP都是ExTaq Hot Start(TAKARA)包装中附带的。AnchorY-T24primer为合成二链cDNA所用的引物，其中的AnchorY序列是一段合成的与哺乳动物基因序列都不同源的24个碱基长度序列，与AnchorX-T15-N6引物中的AnchorX互补配对。24个连续的胸腺嘧啶核苷与上一步一链cDNA末尾合成的poly(A)形成互补配对，通过以下反应程序控制，可以在ExTaq Hot Start聚合酶作用下合成第二条cDNA链。95℃3min；50℃2min；72℃10min。
6.cDNA模板扩增反应
要达到后续建库实验的样品起始量，必须要对上述反应产物进行PCR扩增。扩增反应液如下：
| 成分 | 体积(ul) | 终浓度 |
| 10X ExTaq buffer | 7.6 | 1X |
| 2.5mM dNTP | 7.6 | 0.25mM |
| AnchorX-T15primer(100uM) | 0.76 | 1uM |
| H2O | 59.28 | |
| ExTaq Hot Start(TAKARA，DRR006B) | 0.76 | 0.2U/ul |
| 总体积 | 76 |
将以上反应混合液加入上一步反应之后的PCR试管中，混匀(总体积164ul)分装到3个PCR试管中(单个试管中反应体积不要超过60ul，体积太大会导致反应条件控制不均匀，影响扩增效率)。在PCR仪上执行以下程序：g5℃3min预变性：95℃30s，67℃1min，72℃6min(每个循环增加12s)16至20个循环(根据细胞大小或者核糖核酸起始量调整)。
7.扩增产物的纯化
扩增反应结束后的产物通过QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN，28106)进行纯化，步骤包括：
a)加入5倍体积(820ul)Buffer PB，混匀之后加入5ul浓度为3M的醋酸钠(pH=5.2)，混匀。
b)将溶液转移到试剂盒提供的分离柱中，15000prm旋转一分钟，去掉液相。
c)向分离柱中加入700μl Buffer PE，15000rpm旋转一分钟，去掉液相。
d)将分离柱15000rpm空旋一分钟。
e)将分离柱转移到新的1.5mL离心管中(Eppendorf#0030120.086)，加入50pL的TE buffer或者ddH2O，室温静置1分钟后，15000rpm旋转一分钟，附着在硅胶膜上的DNA将会被洗脱回收。
8.扩增cDNA片段筛选
由于扩增过程中可能产生一些引物二聚体，需要用切胶纯化回收的方法，才能比较干净地去掉片段比较小的引物二聚体等序列。所以将上一步的纯化产物用2％琼脂糖凝胶进行分离，切取200bp-8kb的片段用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN，28706)回收，步骤包括：
a)称量胶重，加入三倍体积(1mg胶加入3ul)Buffer QG，50℃震荡10min将胶粒完全溶解。加入10ul醋酸钠(PH＝5.2)混匀。
b)将溶液转移到试剂盒提供的分离柱中，15000prm旋转一分钟，去掉液相。
c)向分离柱中加入500μl Buffer QG，15000rpm旋转一分钟，去掉液相。
d)向分离柱中加入700ul Buffer PE，15000rpm旋转一分钟，去掉液相。
e)将分离柱15000rpm空旋一分钟。
f)将分离柱转移到新的1.5mL离心管中Eppendorf#0030120.086)，加入50μL的TE buffer或者ddH2O，室温静置1分钟后，15000rpm旋转一分钟，附着在硅胶膜上的DNA将会被洗脱回收。
g)将洗脱样品取1ul用Qubit dsDNA(HS)assay kit测量浓度。
9.二轮扩增
为了进一步对RNA样品进行富集，产生足够的illumina建库起始量，需要对上一轮胶回收的cDNA产物再进行一轮PCR扩增。反应体系如下：
| 成分 | 终浓度 | 体积(ul) |
| 10xExTaq buffer | 1X | 40 |
| 2.5mM dNTP | 0.25mM | 40 |
| (NH2)AnchorX-T15primer(100uM) | 0.5uM | 2 |
| (NH2)AnchorY-T24primer(100uM) | 0.5uM | 2 |
| H2O | ---- | |
| DNA template from step7 | ---- | 10-40ng |
| ExTaq Hot Start(TAKARA，DRR006B) | O，1U/ul | 4 |
| 总体积 | 400 |
将以上反应混合液混匀分装到PCR试管中，(单个试管中反应体积不要超过60ul，体积太大会导致反应条件控制不均匀，影响扩增效率)，在PCR仪上执行以下程序：95℃3min预变性；95℃30s，67℃1min，72℃6
min(每个循环增加12s)10个循环。
10.二轮扩增产物纯化及片段筛选
反应的产物按照步骤8和9进行再一次的纯化和切胶回收。得到的DNA产物可以冻存于-20℃。
11.DNA的破碎
由于高通量测序的读长限制，需要破碎生成的DNA至较短的片段。
取出步骤10获得的产物200ng-500ng，用1301u1的Low TE缓冲液进行稀释，用Covaris超声仪进行破碎，使用程序为自带的DNA150-200。用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN，28106)进行纯化，纯化操作与步骤7一致。
12.测序文库的建立：
使用TruSeq DNA Sample Preparation Kits(i1lumina，#FC-121-2001)对上一步破碎的DNA产物进行测序文库的建立。操作步骤按照其提供的说明进行。
13.测序及生物信息学分析
我们使用Illumine公司的或者HiSeq2500测序仪进行测序，产生的读数是100个碱基长度的片段。
通过对基因表达的分析，我们发现所有样品(36个细胞样品包括小鼠胚胎干细胞，小鼠成熟卵细胞，小鼠合子及二细胞，人HEK392T细胞)中测得的rRNA的含量均不超过2％。另外我们以环形RNA为例证实该发明能够覆盖不含p01y(A)尾巴的RNA种类，首次在单细胞样品中发现了数百个环形RNA，与之前报道的环形RNA有部分重合，更多的是新发现的环形RNA，充分说明了本发明的方法对非poly(A)RNA的覆盖效果很好。环形RNA的存在是通过以下方法证实的：我们利用在基因组序列中呈反方向的两个PCR引物对一段由RNA序列逆转录产生的eDNA序列进行扩增(如图2上半部分的序列所示)，如果该RNA序列没有首尾相连形成环状，就不会产生扩增片段，而如果存在的环形RNA，该扩增方法则会富集环形RNA接头部位的序列。通过sanger测序(图2最下面的波形图即为测序的峰图)对扩增产物进行检测，可以检测到原本在基因组上呈线性关系的前后两个外显子位置关系发生了变化，后面的外显子末端与前面外显子的起始端相连接(如图2下半部分的序列所示，黑色稀疏竖线和黑色密集竖线分别代表在基因组顺序上的前后两个外显子，黑色虚线及黑色实线表示成环前后首尾两个外显子序列位置的对应关系)，证明了这段RNA序列是首尾连接成环的。可见，本发明的方法检测到的环形RNA是真实存在的。
对比例1
起始样品为lng总RNA，使用常规方法通过探针去除rRNA和mRNA，研究不带poly(A)的样品。逆转录之前在65℃进行5min加热处理，逆转录及后续实验步骤按照实施例1中的条件进行，由测序及生物信息学分析可知rRNA的比例仍然有43％到45％不等。
Claims (11)
1.一种转录组测序方法，其特征在于，在RNA到cDNA的逆转录过程中所使用的引物包含随机序列和特定序列，随机序列位于特定序列的3’端，二者之间有0-5个碱基，随机序列由4-12个随机碱基组成，特定序列为5-30个碱基的同聚体，特定序列的碱基选自A、G、C、T中任意一个。
2.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，随机序列由6-8个随机碱基组成，特定序列为10-20个碱基的同聚体。
3.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，特定序列为15个碱基的同聚体，特定序列的碱基为T。
4.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，无需去除核糖体RNA。
5.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，所述的引物还包括锚定序列，锚定序列为cDNA扩增步骤中PCR引物序列。
6.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，所述转录组可以来自少量细胞，细胞个数为1-10000个，优选1-100个，更优选1-10个。
7.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，所述转录组所包含的RNA起始量为0.1pg-100ng，优选10pg-500pg。
8.根据权利要求1所述的转录组测序方法，其特征在于，在逆转录之前进行加热，加热的温度为60-80℃，加热的时间为10s-3min，优选30s-120s，更优选90s。
9.根据权利要求1-8任一项所述的转录组测序方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)加热，(2)逆转录反应获得cDNA一链，(3)消化未反应的引物，(4)一链cDNA加polyA尾，(5)二链cDNA合成，(6)cDNA模板扩增反应，(7)扩增产物的纯化，(8)扩增cDNA片段的筛选，(9)二轮扩增，(10)二轮扩增产物纯化及片段筛选，(11)cDNA文库构建及测序。
10.根据权利要求9所述的转录组测序方法，其特征在于，一链cDNA加poly(A)尾的过程中，加入dATP和ddATP。
11.根据权利要求10所述的转录组测序方法，其特征在于，所加入的dATP和ddATP的摩尔比为50-200：1，优选为100：1。
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