CN105524920A - 用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法 - Google Patents

用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于Ion？Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法。其中，引物组包括用于接头包埋的SEQ？ID？NO：1-3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQ？ID？NO：4-5所示的序列。本发明提供的引物组使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于Ion？Proton的文库，构建的文库可以直接上机测序。不仅摒弃了原始的复杂文库构建程序，而且操作简单，测序结果稳定。

Description

用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法
技术领域
本发明涉及测序技术领域，尤其是一种用于IonProton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法。
背景技术
生命技术(LifeTechnologies)公司研发的IonProtonTM基因测序仪采用了新一代半导体测序技术。该系统拥有快速、简单及可扩展等特征，能有效推进临床研究在癌症及遗传性疾病等诊断中的发展。但是在上机文库构建中，依然需要传统的DNA片段化、加接头、修复、片段选择等操作，过程繁琐，耗时较长。并且所需要的DNA起始量较高，不适合微量体系(<10ng)建库。虽然该公司在后期开发了基于MuA转座子的MuSeekTM文库构建试剂盒(MuSeekTMLibraryPreparationKit)，但是依然需要较高的DNA起始量(>50ng)，并且试剂中的酶需要存储在-70℃冰箱中，使得一些小型、简单的实验室无法保存利用。
高度活化变异的TN5转座酶能够随机介导双链DNA的片段化并短时间内添加寡核苷酸片段，这使得TN5能够应用于二代测序的文库制备中。但是目前商品化的TN5转座酶主要应用于Hiseq测序仪平台中，illumina公司生产的NexteraDNAkits即是此类快速高效制备文库的代表。其它平台未见其应用。因此，亟需开发一种技术，使得TN5转座酶能够适于IonProtonTM的文库构建。
发明内容
本发明提供一种用于IonProton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法，使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于IonProton的文库，构建的文库可以直接上机测序。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于IonProton测序平台的TN5建库的引物组，该引物组包括用于接头包埋的SEQIDNO：1-3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQIDNO：4-5所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案，上述引物组还包括用于PCR扩增的SEQIDNO：6-7所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案，上述用于PCR扩增的SEQIDNO：5所示的序列具体包括：SEQIDNO：8-23所示的序列。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于IonProton测序平台的TN5建库的试剂盒，该试剂盒包括第一方面的引物组。
作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括TN5转座酶，任选地还包括用于TN5转座酶的缓冲液。
作为本发明的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于PCR扩增的聚合酶，任选地还包括用于上述聚合酶的缓冲液。
根据本发明的第三方面，本发明提供一种用于IonProton测序平台的TN5建库方法，该方法包括：使用SEQIDNO：1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋；使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理；使用SEQIDNO：4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增；以及对PCR扩增产物进行纯化。
作为本发明的进一步改进的方案，上述方法还包括：在PCR扩增过程中还使用SEQIDNO：6-7所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案，上述SEQIDNO：5所示的序列具体包括：SEQIDNO：8-23所示的序列。
作为本发明的优选方案，上述片段化处理的DNA的起始量是50ng以下。
本发明提供的引物组，使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于IonProton的文库，构建的文库可以直接上机测序。本发明不仅摒弃了原始的复杂文库构建程序，而且操作简单，测序结果稳定。文库构建可在1h内完成，特别是DNA建库起始量可以达到纳克级(1-10ng)，极大地促进了IonProtonTM基因测序仪的应用和整体测序速度。
附图说明
图1为本发明一个实施方案的IonProton测序平台的TN5建库方法流程图；
图2为本发明实施例1得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图；
图3为本发明实施例1得到的文库的基因表达数量检测图；
图4为本发明比较例1的引物组一得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图；
图5为本发明比较例1的引物组二得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图；
图6为本发明比较例1的引物组三得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图；
图7为本发明比较例1的引物组四得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图；
图8为本发明比较例1的引物组五得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
发明人经深入研究和筛选得到一组可以用于IonProton测序平台的TN5建库的引物组，使用该组引物能够使得TN5转座酶高效、快速、微量的构建适于IonProton的文库，构建的文库可以直接上机测序。
需要说明的是，在实际应用中，需要经过反复试验筛选才能得到可用的引物，本发明的发明人还尝试使用其它序列作为引物用于IonProton测序平台的TN5建库，难以获得成功，而出乎意料地发现本发明的引物组不但能够实现基本的建库功能，而且具有高效、快速、微量的特点。
本发明的引物组包括表1所示的几条引物，其中SEQIDNO：1-5所示的引物为必需引物，而SEQIDNO：6-7为进一步可以包括的引物。在不包括SEQIDNO：6-7的情况下，也能实现基本的PCR扩增功能；而在包括SEQIDNO：6-7的情况下，能够实现嵌套式PCR扩增功能，增加敏感性和可靠性。
表1
表1中，SEQIDNO：1-3所示的序列用于接头包埋，其中Tn5-M是短接头序列，而Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion是长接头序列，短接头序列分别与两条长接头序列形成配对，与TN5转座酶包埋形成包埋复合体。
本发明中，PCR扩增至少需要两条引物序列，即IonAdapter-P和IonAdapter-A，其中IonAdapter-P是序列固定的序列，而IonAdapter-A含有标签(Barcode)序列“[i-A]”，其中标签序列用于区分不同的样本，因此也可以称为“样本标签序列”。标签序列可以采用目前高通量测序中通用的标志(index)序列。一般只要能够区分出样本且不干扰测序即可，可以是一段连续的随机序列，长度一般大于6bp，比如8bp、10bp或12bp等。本发明一个实施例中使用的标签序列的长度是10bp，因此SEQIDNO：5所示的IonAdapter-A序列中的[i-A]可以是10个连续的随机碱基，即“NNNNNNNNNN”，也就是说本发明中的SEQIDNO：5所示的IonAdapter-A序列可以表示为如下序列：
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGATGCTGGCTGACGGGAT-3′。
然而，应当理解的是，本发明中SEQIDNO：5所示的序列并不局限于标签序列是“NNNNNNNNNN”的序列，而是任何只要标签序列互不相同、而其它部分序列相同的引物组。
因此，SEQIDNO：5所示的序列实际上可以包括一组具有不同标签序列的引物组，其中引物的数量可以是2以上的任何自然数，具体可以根据具体应用需求确定。一般而言，十几条至几十条带有标签序列的序列即可满足本发明的应用需求。在本发明的一个实施例中，SEQIDNO：5所示的序列实际上包括16条具体的序列，即表2所示的序列。
表2
表2中，带下划线的序列是标签序列，长度是10bp。
在本发明的引物组中包括SEQIDNO：6所示的IonPrimer-P和SEQIDNO：7所示的IonPrimer-A的情况下，SEQIDNO：6所示的IonPrimer-P和SEQIDNO：7所示的IonPrimer-A作为嵌套式PCR的外扩增引物，而SEQIDNO：4所示的IonAdapter-P和SEQIDNO：5所示的IonAdapter-A作为嵌套式PCR的内扩增引物，进行嵌套式PCR扩增。
本发明的试剂盒的特点在于，包括本发明的引物组。除此之外，还可以包括其它组分，例如，TN5转座酶，以及任选地用于TN5转座酶的缓冲液；用于PCR扩增的聚合酶，以及任选地用于上述聚合酶的缓冲液。
本发明还提供一种用于IonProton测序平台的TN5建库方法，该方法使用SEQIDNO：1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋；使用SEQIDNO：4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增。在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括：使用SEQIDNO：1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋；使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理；使用SEQIDNO：4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增；以及对PCR扩增产物进行纯化。
在进一步改进的方案中，本发明的方法还包括：在PCR扩增过程中还使用SEQIDNO：6-7所示的序列。
在进一步改进的方案中，其中SEQIDNO：5所示的序列具体包括：SEQIDNO：8-23所示的序列。
如图1所示的流程图，在本发明的一个具体实施例中，用于IonProton测序平台的TN5建库方法包括步骤：TN5转座酶以及接头设计和制备；TN5转座酶与接头(AdapterMix)包埋；DNA片段化；片段化反应终止；片段化产物PCR扩增；扩增产物纯化；以及文库质检。
采用本发明的建库方法，DNA的起始量能够在50ng以下。在本发明的一个实施例中，DNA的起始量是1ng。其中DNA可以是基因组DNA或cDNA扩增产物等。不同起始量的DNA可以使用不同量的TN5转座酶与接头序列的包埋产物来打断，一般而言DNA的起始量越低，需要的TN5转座酶与接头序列的包埋产物越少。本发明的方法中，由于提供的序列的高效性，能够实现低起始量DNA的建库，因此相应地，TN5转座酶和接头序列的用量也减少，大大节省了成本。
以下通过具体实施例详细描述本发明的实现，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明的保护范围具有限定作用。
实施例1
根据以上技术方案，使用1ngHela转录组cDNA扩增产物为模板进行文库构建。终产物纯化后，溶解于15μL中。
1、TN5转座酶及接头制备
TN5转座酶及5×Buffer(50mMTAPS-NaOH，pH8.5RT，25mMMgCl2，50％DMF，试剂分别来自BBI公司)按照SimonePicelli等(GenomeRes.2014.24:2033-2040)发表的方法进行制备。
a、设计合成表1所示的引物Tn5-M、Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion。
b、使用退火缓冲液(AnnealingBuffer)溶解Tn5-M、Tn5-M-A-Ion、Tn5-M-P-Ion至100μM。
c、分别配制如表3的反应体系：
表3
d、分别将反应1和反应2涡旋震荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内，进行如表4的反应程序(热盖温度105℃)：
表4
e、反应结束后，将反应1和反应2等体积混合，混匀，命名为接头混合物(AdapterMix)，-20℃保存。
2、接头包埋
a、在灭菌PCR管中依次添加表5的各反应组分：
表5
b、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
c、将反应置于25℃反应1h。反应产物命名为TN5-Mix，置于-20℃储存。
3、DNA片段化
a、配置0.1％SDS(BBI公司)作为终止液，保存于室温，如有沉淀，可于37℃加热并剧烈震荡充分混匀沉淀即会溶解。
b、在灭菌PCR管中依次添加表6的各反应组分：
表6
组分 用量(μL)
5×Buffer 4
cDNA扩增产物(1ng) 1
TN5-Mix 0.2
H2O 补齐20
c、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
d、将PCR管置于PCR仪中，设置如下表7的反应程序(热盖温度75℃)：
表7
待样品温度降低至4℃后，取出PCR管。
e、向上述反应产物中加入5μL0.1％SDS，使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。置于室温放置5min。体系保持25μL用于后续PCR反应。
4、片段化产物PCR扩增
a、设计合成表1所示的引物：IonPrimer-P、IonPrimer-A、IonAdapter-P，以及表2所示的引物IonAdapter-A-1至IonAdapter-A-16。
b、将灭菌PCR管置于冰浴中，依次添加表8的各反应组分：
表8
c、使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
d、将PCR管置于PCR仪中，设置如下表9的反应程序(热盖温度105℃)：
表9
5、扩增产物纯化
使用0.8×AgencourtAMPureXPbeads(NEB公司)，进行选择性纯化。起始PCR产物体积应补齐至50μL，否则分选长度会与预期不一致。
a、涡旋震荡混匀AMPureXPbeads并吸取35μL体积至50μLPCR产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
b.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心转移上清至干净EP管中，丢弃磁珠。
c.涡旋震荡混匀AMPureXPbeads并吸取7.5μL体积至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
d.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心移除上清。
e.保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清。
f.重复上步，总计漂洗两次。
g.保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10分钟。
h.将EP管从磁力架中取出，加入15μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。
如需获得长度分布更集中的文库，扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化。
6、文库质检
使用安捷伦2100生物分析仪(2100Bioanalyzer)进行检测。图2示出了本实施例的2100生物分析仪检测结果图，其中峰1的峰值是50bp，质量浓度是4.20ng/μl，摩尔浓度是424.2nmol/l，表示最小分子量标记；峰2的峰值是346bp，质量浓度是8.29ng/μl，摩尔浓度是36.3nmol/l，表示产物；峰3的峰值是17000bp，质量浓度是2.10ng/μl，摩尔浓度是2.1nmol/l，表示最大分子量标记。
7、测序及数据分析
质检合格的文库IonProtonTM测序及数据分析。图3示出了本实施例的文库的基因表达数量检测图。图中，RPKM表示每百万个读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数(ReadsPerKilobasesperMillionreads)，其中每个柱状图分为上、中、下三段，上段表示0＜RPKM＜1，中段表示1＜RPKM＜30，下段表示RPKM＞30。
比较例1
按照与实施例1相同的实验方法(差别仅在于引物组不同)，发明人研究了其它引物组在IonProton测序平台的TN5建库中的有效性，发现其它各组引物均不能有效地实现IonProton测序平台的TN5建库或者建库效果极差。
表10示出了不能有效地实现IonProton测序平台的TN5建库的引物组的序列。
表10
图4至图8分别示出了引物组一至引物组五的2100生物分析仪检测结果图。结果显示：通常没有产物、产物浓度低或产物片段大小不稳定等。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于IonProton测序平台的TN5建库的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于接头包埋的SEQIDNO：1-3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQIDNO：4-5所示的序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于PCR扩增的SEQIDNO：6-7所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，所述用于PCR扩增的SEQIDNO：5所示的序列具体包括：SEQIDNO：8-23所示的序列。
4.一种用于IonProton测序平台的TN5建库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括TN5转座酶，任选地还包括用于TN5转座酶的缓冲液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的聚合酶，任选地还包括用于所述聚合酶的缓冲液。
7.一种用于IonProton测序平台的TN5建库方法，其特征在于，所述方法包括：使用SEQIDNO：1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋；使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理；使用SEQIDNO：4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增；以及对PCR扩增产物进行纯化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在PCR扩增过程中还使用SEQIDNO：6-7所示的序列。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述SEQIDNO：5所示的序列具体包括：SEQIDNO：8-23所示的序列。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述片段化处理的DNA的起始量是50ng以下。
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