CN103938277A

CN103938277A - 以痕量dna为基础的二代测序文库构建方法

Info

Publication number: CN103938277A
Application number: CN201410158326.7A
Authority: CN
Inventors: 杨祖玉; 王开乐; 吴大飞; 吕雪梅; 吴仲义
Original assignee: Beijing Institute of Genomics of CAS
Current assignee: Beijing Institute of Genomics of CAS
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: CN103938277B

Abstract

本发明涉及一种针对痕量DNA样本的二代测序文库的构建方法，利用随机碱基对每一个原始分子进行标定，进而通过现有的二代测序平台获得相应的DNA文库。本方法通过微量细胞分离、总DNA提取、插入片段的构建、PCR扩增基因组文库及及琼脂糖凝胶电泳回收目的片段等步骤，成功构建只需10-40ngDNA起始的全基因组二代测序文库。

Description

以痕量DNA为基础的二代测序文库构建方法

技术领域

本发明涉及一种利用EZ-Tn5^TM转座酶构建微量DNＡ二代测序文库的方法，利用转座子插入打断DNA的同时将测序平台的adapter及测序引物加至DNA片段之上，并使用随机碱基对每一个原始分子进行标定。

背景技术

DNA测序已经成为生物学研究中不可缺少的一项重要技术，从根本上改变了人们研究生命蓝图的方式。随着测序平台硬件及相应软件的优化，阻碍研究进展的亦非测序技术本身而是与其相关的文库构建以及数据的分析和解释。

454Life Sciences公司(Roche)首先推出了革命性的基于焦酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。该技术的原理是酶级联化学发光反应:首先将PCR扩增的单链DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。此后，Illumina公司和ABI公司相继推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。它们与焦磷酸测序法的原理类似，核心思想都是边合成边测序(sequencing by synthesis)，即生成新DNA互补链时，要么加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。大规模即第二代测序技术平台主要包括利用焦磷酸测序的Roche/454FLX、边合成边测序的Illumina sequencingsystems(HiSeq2500/1500,HiSeq2000/1000,Genome Analyzer IIx,MiSeq)和连接酶测序法的lifetechnologies Sequencing systems(Applied Biosystems SOLID及Ion Torren)。

所有相关的技术平台都涉及复杂的文库制备过程，即将基因组或反转所得的DNA连接上各自平台特异的adapter。标准的文库构建过程包括基因组DNA经机械或酶切进行片段化，末端修复，接头序列连接，电泳切胶选择合适片段以及PCR扩增等步骤，只是不同的测序平台在测序上机之前会有相应的一些小的修饰。尽管标准文库构建方法适用于大多数需要测序的研究，但其对DNA起始量需求较多，通常需要1-10ug，因此当起始DNA量不足以用于标准文库构建的时候，相关的研究就会受到限制。例如，在肿瘤基因组相关研究中，虽然二代测序技术为我们对肿瘤的理解提供了许多新的认识，并筛选出许多与乳腺癌、直肠癌、白血病、肺癌、胰腺癌、脑瘤、肝癌、肾癌等相关的基因和重要信号通路；但同时也认识到肿瘤的发生具有很强的异质性，即使在同一个人不同肿瘤甚至同一个肿瘤的不同部位存在很高的异质性。

为了研究特定疾病所涉及的细胞群体异质性，就需要对疾病样本组织内部进行多点以及尽可能小的取样，因此就需要能够针对少量细胞构建没有偏差的二代测序文库。

发明内容

本发明人以广泛使用的典型二代测序系统，EZ-Tn5^TM转座酶测序平台为基础，研发了一种适用于前述多种二代测序平台，大幅度降低测序建库所需DNA量的技术，能够使用痕量DNA构建二代测序文库的方法。

转座子又称为转座因子或称作跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。细菌Tn5转座子属于复合转座子，最早是在Escherichia coli中被发现的，由编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)的核心序列和两条倒置的IS50序列组成。其中一个IS50(IS50R)编码476个氨基酸的Tnp，以及一个转座阻遏蛋白Inh，IS50L与IS50R高度同源，只是IS50L的第1442碱基处存在一个无义突变，不能产生有活性的Inh和Tnp。IS50具有19bp的外倒置末端OE，此倒置末端是转座酶(Tnp)的作用位点。Tn5的转座是非复制型、多步骤的复杂过程：首先在有Mg²⁺存在的条件下，两个Tnp分子的N末端和活性中心的几个氨基酸残基分别结合到Tn5的OE末端，形成两个Tnp-OE的复合体，随后两个复合体联会，Tnp的C末端相互作用而二聚体化，形成一个复合体。只有形成该复合体，Tnp才具有切割DNA的活性。结合在左末端的Tnp负责催化右末端的磷酸二酯键水解，而结合在右末端的Tnp负责催化左末端的磷酸二酯键水解。Tnp活化水分子，活化的水分子水解DNA链，在Tn5的两末端分别形成两个3’-OH亲核基团。3’-OH进而攻击互补链形成发夹结构。随后另一活化的水分子水解该发夹结构，形成平末端的Tn5。整个复合体离开供体链，并结合到靶DNA上。Tn5的3’-OH亲核攻击靶序列，在转座子插入位点之间形成9bp的粘性末端，转座子的3’-OH同靶DNA的5’-P之间形成共价键，转座子就插入到靶序列之中。在DNA聚合酶的作用下补平缺口，转座子的两端形成9bp的正向重复序列。野生型Tnp在体外无转座酶活性，EZ-Tn5^TM转座酶是Tn5转座酶编码基因经过Tnp突变而产生的极度活跃形式，具有体外活性在。不存在Mg²⁺的情况下，EZ-Tn5^TM转座酶与EZ-Tn5转座子可以形成一个稳定的EZ-Tn5转座体。因此，可以利用体外转座复合体插入并打断DNA的原理构建二代测序文库。

以EZ-Tn5^TM转座酶测序平台为基础，发明人利用EZ-Tn5转座子的作用原理，合成3’包含转座子序列的Inserting DNA（包含Illumina测序平台的adapter，PCR引物，测序引物，标定原始DNA分析的随机碱基，样品Barcode等）,使用EZ-Tn5^TM转座酶与EZ-Tn5转座子，在插入打断基因组DNA的同时将测序平台adapter、测序引物、样品Barcode等一次性加至DNA片段上，并利用5～20个随机碱基（随机碱基的数量可以随需求和样本的情况增减）标定了每一个原始的DNA分子，其中测序平台adapter可以根据实际需求做相应的调整。该方法仅需少量肿瘤细胞（10～40ng DNA）即可完成建库工作。这种技术突破让研究肿瘤内部异质性及肿瘤演化历史成为可能。

该建库方法还可以结合外显子或目标区域捕获针对特殊的区域进行研究。此外还可以应用于许多只有痕量待测序DNA样本的研究领域。

本发明提供一种以痕量DNA样品（10～40ng）出发，构建二代测序DNA文库的方法。所述方法包括如下步骤，

步骤一，以特定数量的样本细胞，进行总DNA提起操作，获得样本细胞全基因组DNA；

步骤二，构建Inserting DNA1与Inserting DNA2插入序列双链；

步骤三，以步骤二所获得的双链组装插入复合体；

步骤四，以插入复合体打断待测DNA，PCR扩增测序片段；

步骤五，回收扩增的PCR片段，并进行测序工作。

本发明所述的样本细胞，可以来源于个体化的病理组织，正常生理组织，血液样本，皮肤及毛发。

本发明所述的构建测序文库的方法中，Inserting DNA1的结构包含测序系统插入结构单元，测序primer1；Inserting DNA2的结构包含测序系统插入单元，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列。

本发明所述的Barcode用于标定不同样品（当不同样品混合到一起进行测序时，可以通过Barcode的序列将样品区分）。

本发明所述的DNA分子随机标签为6～20个随机碱基，用于标定每一个原始的DNA分子，随机碱基的个数可以据实际需求进行增加或减少，理论上8个随机碱基具有65536的标签，在分析数据时利用随机标签能很好的对数据进行去冗余分析。

本发明还涉及所述的建库方法用于制备诊断试剂盒的应用。

本发明还涉及一种诊断试剂盒，其包括使用本发明所述建库方法的必要试剂和相应的操作说明书。

本发明所述的诊断试剂盒可以是肿瘤诊断试剂盒，包括但不限于诊断肝癌、结直肠癌肝转移、乳腺癌和结直肠癌等实体肿瘤的诊断试剂盒。

优选的，本发明所述的技术应用于EZ-Tn5^TM转座酶测序平台时，Inserting DNA1的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter1，测序primer1，EZ-Tn5转座子序列；Inserting DNA2的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter2，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列，EZ-Tn5转座子。

本发明所述的以EZ-Tn5^TM转座酶测序平台为基础，针对少量样品构建二代测序DNA库的方法包括如下步骤：

1.细胞群体分离操作

手术切下的肿瘤样本用OTC包埋剂将肿瘤冷冻包埋，利用冷冻切片机将肿瘤切为1mm厚度的薄片，再用内径为0.5mm的Micro-punch打孔取样器将肿瘤细胞从冰冻的状态取下，每个样品为0.2mm³的圆柱体，约包含10,000-20,000个细胞。

2.总DNA提取

对步骤1所获得的细胞样本，使用微量基因组提取试剂盒TIANamp Micro DNA Kit(Tiangen,Beijing,China)抽提获得基因组DNA约100ng。

3.Inserting DNA1或Inserting DNA2与EZ-Tn5转座子序列退火形成双链

反应在200ul的PCR小管中进行，每管加入5ul10X DNA Oligos退火缓冲（100mM/L Tris-HCl PH7.5，10mM/L EDTA，1M/L NaCl），10ul10uM/ul的Inserting DNA1(终浓度为2uM/ul)或Inserting DNA2和转座子反向重复序列,最后加入25ul无核酸酶污染的双蒸水。将溶液混匀，置于PCR仪上，运行以下程序：

①95℃保持5分钟；

②以0.1℃/分钟的降温速度降至4℃；

退火形成的双链可以于-20℃长期保存。

4.EZ-Tn5转座复合体组装

以人类基因组20ng起始DNA构建全基因组文库(约300-500bp)的需求量为例设定如下反应体系：Inserting DNA1双链(1ul,2uM)，Inserting DNA2(1ul,2uM)，甘油2ul，EZ-Tn5^TM转座酶（Epicnetre,EZ-Tn5^TM<KAN2>Inserion Kit）1ul。将反应体系混匀，置于PCR仪器上，25℃孵育20min。体系可以根据实际需求按照上述比例做相应的调整，组装好的转座复合体可以置于-20℃长期保存。

5.EZ-Tn5转座复合体打断基因组DNA

在PCR反应管中加入：基因组DNA（20ng），5X打断缓冲液2ul，来自上述步骤4的EZ-Tn5转座复合体5ul，补水至10ul，混匀，置于PCR仪上，55℃孵育10min。EZ-Tn5转座复合体的用量可根据起始DNA量及所需文库大小做相应调整。

5X打断缓冲液：50mM/L Tris-OAc，25mM/L Mg(OAc)₂，pH8.0

6.PCR扩增基因组文库

将上述步骤5所得的产物用QIAGEN酶切反应纯化试剂盒进行纯化，纯化产物溶于10-20ul无核酸酶污染的双蒸水中。

PCR扩增：上述纯化得到的DNA分为2份分别加入PCR管中，然后依次加入无核酸酶污染的双蒸水，2X Phusion mix（Thermo Scientific），PCR primer1，PCR primer2,混匀，置于预热的PCR仪上。

PCR循环设置如下：

首先72℃，5min；

然后98℃，10s

然后98℃，10s、53℃，30s、72℃，3min循环8-10次

72℃，10min。

PCR实际循环数可以根据测序目的做相应的调整，如果是构建的文库直接用于上机测序，则8个循环后的产物足够测序需要；如果要进一步用于全外显子组捕获，一般采取10个循环。

7.电泳及胶回收

使用2%琼脂糖凝胶电泳上述步骤6获得的DNA片段，将片段大小在350-550bp左右的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于二代测序或进行目标区域捕获后测序。

由于以上方法的改进，可以使用20ng基因组DNA样本进行构建测序工作，并可以进一步进行目标区域捕获，使得许多只有少量DNA进行基因组分析成为可能。例如，在我们的研究中，我们利用该方法对肿瘤内异质性进行深度解析，构建其演化历史，对我们理解肿瘤的本质提供了进一步的理解。该方法适用于许多只有少量DNA的研究，此外，根据测序系统的不同，可以合成带相应测序系统上adapter的Inserting DNA,因此也适用于其他测序系统构建文库。

附图说明

图1：本发明所述利用EZ-Tn5^TM转座酶的微量DNA二代测序文库构建方法流程示意图

图2:本发明所述针对肝癌肿瘤样本20ng基因组构建二代测序全基因组文库的DNA电泳图谱。

图3：使用Agilent2100分析本发明所述方法获得的二代测序DNA文库中核酸的片段大小的分析结果。

具体实施方式

以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。

实施例1.肿瘤细胞分离

（1）、收集临床手术的肿瘤样本，取得样品后立即置于冰上保存。在肿瘤细胞分离前，样本一直保存在-80℃冰箱。利用OTC包埋剂将肿瘤冷冻包埋，利用121E小蛮刀冻肉切片机（壹纲机械，广州）手动将肿瘤切为1mm厚度的薄片，切好的样品可以于-80℃长期保存。

（2）、利用内径为0.5mm的Micro-punch打孔取样器将肿瘤细胞从冰冻的状态取下置于1.5ml的离心管中，每管中的肿瘤细胞数约为10,000～20,000个。

实施例2.微量细胞中总DNA的提取

（1）、在冷冻保存的细胞样品（来自实施例1）中加入来自TIANamp Micro DNA Kit（Tiangen,Beijing,China)的GA缓冲液180ul，室温放置，使离心管温度平衡到室温。

（2）、加入20ul蛋白酶K（20mg/ml）溶液，涡旋混匀10s。

（3）、将离心管放置于56℃水浴中孵育直到样本充分降解消化，期间每15分钟涡旋混匀，简短离心，收集收集管内所有液体。

（4）、加入200ul的缓冲液GB（TIANamp Micro DNA Kit），充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10s，溶液变为清亮，简短离心，收集管内所有液体。

（5）、加入-20℃预冷的200ul无水乙醇，轻微颠倒混匀样品，室温放置5min,简短离心，收集管内所有液体。

（6）、取步骤（5）所得溶液全部转入吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

（7）、向吸附柱CR2中加入500ul缓冲液GD（TIANamp Micro DNA Kit），12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

（8）、向吸附柱CR2中加入700ul漂洗液PW（TIANamp Micro DNA Kit），12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

（9）、向吸附柱CR2中加入500ul漂洗液PW（TIANamp Micro DNA Kit），12,000rpm离心30s，弃废液。

（10）、将吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm离心2min，弃废液，然后将吸附柱CR2置于室温中置放数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

（11）、将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20ul无核酸酶污染的双蒸水，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将液体收集在离心管中。

（12）、取1ul上述步骤所得产物，Qubit2.0荧光计（Invitrogen）测定总DNA的量。

实施例3.Inserting DNA1和Inserting DNA2与EZ-Tn5转座子序列退火形成双链

一、在200ul的PCR管中，依次加入

（1）、10ul5×DNA Oligos退火缓冲液；

（2）、5ul浓度为20uM/ul的Inserting DNA1或Inserting DNA2；

（3）、5ul浓度为20uM/ul，长度为19bp的转座子反向重复序列（Complementary_Transposon）CTGTCTCTTATACACATCT；

（4）30ul无核酸酶污染的双蒸水；

二、将溶液混匀，置于PCR仪上，运行以下程序：

（1）95℃ 5分钟；

（2）以0.1℃/分钟的降温速度降至4℃。

步骤一中，Inserting DNA1由测序平台adapter1，PCR扩增引物1，测序引物1，以及19bp的转座子识别序列组成，其序列为：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3’

AATGATACGGCGACCACCGAGATCT为Illumina Hiseq2000测序平台adapter1；

AATGATACGGCGACCACCGA为PCR primer1；

为测序引物1；

为转座子识别序列；

Inserting DNA2由测序平台adapter2，PCR扩增引物2，8bpUID，样品Barcod，测序引物2，UID+Barcode的测序引物（测序引物3）以及19bp的转座子识别组成，其序列为：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNCGTGATCGGTCTGCCTT

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT为Illumina Hiseq2000测序平台adapter2；

CAAGCAGAAGACGGCATACG为PCR primer2；

NNNNNNNN为随机序列，用于标定DNA原始分子；

CGTGAT为样品Barcode，使用不同Barcode，可以将样品混在一起进行测序，最后利用Barcode的序列将样品数据分开；

为测序引物2；

CGGTCT的反向重复序列CTGTCTCTTATACACATCTCTGAGCGGGCTGGCAAGGCAGACCG为UID和Barcode的测序引物3；

为转座子识别序列；

实施例4.EZ-Tn5转座复合体组装

在200μl薄壁PCR管中依次加入如下试剂：

（1）、1ul Inserting DNA1（2uM，来自实施例3的inserting DNA1）；

（2）、1ul Inserting DNA2（2uM，来自实施例3的inserting DNA2），2ul甘油，1ul EZ-Tn5^TM转座酶（1U/ul）。

将反应体系混匀，置于PCR仪上，25℃孵育20min。

实施例5.EZ-Tn5转座复合体打断基因组DNA

在200μl薄壁PCR管中依次加入如下试剂：

（1）、3μl基因组DNA（20ng,来自上述实施例2），

（2）、2μl5×打断缓冲液（50mM/L Tris-OAc，25mM/L Mg(OAc)2，pH8.0），

（3）、实施例4制备获得的5μl EZ-Tn5转座复合体。

将溶液混匀，置于PCR仪上，55℃孵育10min。

实施例6.基因组片段产物纯化

将实施例5所得产物中转入1.5ml的离心管中，使用MinElute Reaction Cleanup Kit（Qiagen）进行DNA片段产物纯化。

加入300μl的ERC Buffer(Qiagen)，将溶液混匀，简短离心，收集管内所有液体。

将上述溶液转入吸附柱MilElute(Qiagen)中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm，离心1min，弃废液。

向吸附柱MilElute中加入750ul漂洗液PE，13,000rpm离心1min，弃废液。

将吸附柱MilElute放回收集管中，12,000rpm离心2min,弃废液。将吸附柱MilElute置于室温中置放数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱MilElute转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20ul无核酸酶污染的双蒸水，室温放置5min，12,000rpm离心2min，将液体收集在离心管中。

实施例7.基因组文库扩增

将经实施例6步骤后获得的相应DNA片段分两个50μl体系进行PCR扩增，

一、在2个200μl薄壁PCR管中分别加入以下试剂：

13μl无核酸酶污染的双蒸水

25μl2×Phusion High-Fidelity PCR master mix（Thermo Scientific）

1μl Primer1(10uM)

5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’

1μl Primer2(10uM)

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’

将以上溶液混匀，置于PCR仪上。PCR循环设置如下：

首先72℃，5min；

然后98℃，10s

然后98℃，10s、53℃，30s、72℃，3min循环8次

72℃，10min。

实施例8.电泳及胶回收

配置2%的琼脂糖凝胶。

每管PCR产物中加入6μl6×Gel Loading Buffer，混匀。

每个样品点到一个点样孔中。样品与DNA Ladder(100bp和50bp,Tiangen,Beijing,China)有至少一个点样孔的间距。

在60V电泳约1h，至浅蓝色染料刚好溢出。

在紫外灯下，将片段大小在350-550bp之间的胶切下（如图2所示），置于2ml的离心管中。

以下纯化使用Qiagen的QIAquick Gel Extraction Kit。

每个样品得到的小胶颗粒中按重量比例加入3倍Elution Buffer，利用垂直混合仪，在室温下溶解

待凝胶完全溶解后，加入凝胶重量1倍体积的异丙醇，充分混匀。

将步骤7所得的凝胶溶液分步完全转移至MinElute(Qiagen)离心柱中，在室温下12,000rpm离心1min，以充分除去胶颗粒。

向吸附柱MilElute中加入500ul漂洗液PE，13,000rpm离心1min，弃废液。

将吸附柱MilElute放回收集管中，12,000rpm离心2min，弃废液。

将吸附柱置于室温中置放数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20ul无核酸酶污染的双蒸水,室温放置5min，12,000rpm离心2min，将液体收集在离心管中。

实施例9.库的质量检测

使用Agilent Bioanalyzer分析库中核酸的片段大小在350-550bp左右（如图2）。

使用qRT-PCR检测库中含有Inserting DNA序列的核酸量。因为qRT-PCR的引物是根据测序平台adapter的核酸序列设计的，因此，只有含有双端正确的adapter核酸可以被检测到。检测结果显示核酸量均大于3.5nmol/L，可用于二代测序。

通过TA克隆，对克隆进行Sanger测序，结果显示随机挑取的约30个克隆中90%序列含有两端正确的Inserting DNA序列，8个随机碱基也完全呈现随机状态。

通过上机测序，结果显示以该方法构建的全基因组文库测2个Lane所得的数据约为70G，其中能够比对到人类基因组的比例为87%，利用该方法所得的数据质量与传统方法构建的文库测序结果一致，具体结果见表1。

表1：利用本发明所述涉EZ-Tn5^TM方法构建肿瘤细胞全基因组文库测序结果

样品名称	Hiseq20002个lane数据总量(base)	Pair-Mapped Bases	MappingRate	AverageDepth
					Hep-11	118，694，714，800	103,749,973,700	87.4%	35

最后，需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员能够根据一般技术知识和公知常识获得的相关技术方案，都属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国科学院基因组研究所

<120>以痕量DNA为基础的二代测序文库构建方法

<130>序列表

<160>12

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ctgtctctta tacacatct 19

<210>2

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctccctcgc gccatcagag atgtgtataa 60

gagacag 67

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aatgatacgg cgaccaccga gatct 25

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcctccctcg cgccatcaga gatgtgtata agagacag 38

<210>6

<211>82

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nncgtgatcg gtctgccttg ccagcccgct 60

cagagatgtg tataagagac ag 82

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

caagcagaag acggcatacg agat 24

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

caagcagaag acggcatacg a 21

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gccttgccag cccgctcaga gatgtgtata agagacag 38

<210>10

<211>6

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cgtgat 6

<210>11

<211>8

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

nnnnnnnn 8

<210>12

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ctgtctctta tacacatctc tgagcgggct ggcaaggcag accg 44

Claims

1.本发明涉及一种针对痕量DNA样品，构建二代测序文库的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤（1）、细胞分离及细胞总DNA提取；

步骤（2）、构建Inserting DNA1与Inserting DNA2插入序列双链；

步骤（3）、以步骤（2）所获得的插入序列双链组装插入复合体；

步骤（4）、以插入复合体打断待测DNA，PCR扩增测序片段；

步骤（5）、回收扩增的PCR片段，并进行测序建库工作。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的Inserting DNA1的结构包含测序系统插入结构单元，测序primer1；Inserting DNA2的结构包含测序系统插入单元，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的细胞样本来源于个体化的病理组织，正常生理组织，血液样本，皮肤及毛发，优选来源为临床肿瘤样本，每个样本包含10,000-20,000个细胞。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的总DNA提取步骤为：对细胞样本进行裂解，吸附柱吸附DNA，漂洗，洗脱等，所获得的DNA溶于20ul水中。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，上述步骤（5）的操作步骤为，使用琼脂糖凝胶电泳步骤（4）PCR扩增获得的DNA片段，将大小在目标区域的DNA片段切下，并回收其中的DNA，获得的DNA片段即可用于二代测序或进行目标区域捕获后测序。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的DNA分子随机标签为6～20个随机碱基，用于标定每一个原始的DNA分子。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

步骤（2）所述的Inserting DNA1的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter1，测序primer1，EZ-Tn5转座子序列；Inserting DNA2的结构依次包含原EZ-Tn5^TM转座酶测序系统adapter2，测序primer2，DNA分子随机标签，样品Barcode，及用于和测序primer3配对的序列，EZ-Tn5转座子序列；

步骤（3）所述的插入复合体的构建方法为，将步骤（2）所述的Inserting DNA1和Inserting DNA2、以及甘油、EZ-Tn5^TM转座酶在PCR管内混匀，置于PCR仪器上，温育。

步骤（4）所述的插入复合体打断待测DNA的方法为，在PCR管中加入步骤（3）构建的插入复合体、基因组DNA、打断缓冲液混匀并置于PCR仪上，温育。

8.权利要求1-7任一所述的建库方法在制备针对特异性疾病的诊断试剂盒中的应用。

9.权利要求1-7任一所述的建库方法在制备以痕量DNA样本为基础的二代测序试剂盒中的应用。

10.由权利要求8所述的方法制备获得的诊断试剂盒。