CN102703426A - 构建核酸库的方法、试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明为建立具有标签的核酸库提供了方法、试剂及试剂盒，并采用了体外转座的方法。首先用转座酶随机打断目标DNA，然后用核酸酶和DNA聚合酶处理，产生有标记的DNA文库。本发明允许连接任何所需标记的DNA片段，使所产生标记的DNA片段，可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，Life Technologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，Pacific Biosciences这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。

Description

构建核酸库的方法、试剂及试剂盒
技术领域
本发明为建立核酸库提供了方法、试剂及试剂盒。特别是在建库过程中使用了转座酶、核酸酶和连接酶。
背景技术
怎样有效和高效地用各种不同材料的DNA和RNA来建立文库，这对第二代测序(NGS)的研究人员和操作人员来说是一个挑战。现有的技术，包括通过物理手段：超声波法或雾化法来打断双链DNA，这需要较大量的起始材料。这个过程是漫长的，很难以高通量的方式进行。NEB的科学家最近开发使用Fragmentase，在离心管中进行酶反应，这和物理打断相比是一个不错的选择，但仍然需要大量的起始材料。EPICENTRE公司开发了Nextera试剂，从而使研究人员能够在2小时内完成建库过程，并且起始材料只要50ng。然而，它需要的测序引物与现有的测序平台的测序引物不兼容，这是让许多潜在用户感到失望的一点。
第二代测序建库领域面临的另一个挑战是，测序平台发展非常快，新测序仪的研发只需要几年的时间，更新换代很快。第三代测序技术也有可能在不久的将来会对第二代技术进行挑战或替换。新技术和设备的快速发展，为那些只需进行很小的调整，就能将建库技术应用于新的仪器和技术平台的建库产品带来了技术和商业上的竞争力，也为那些企业带来了巨大的商业机会。
本发明的目的是建立一个文库的制备方法，可用于所有现有的和即将推出的极少改动的新测序仪，可以用于高通量，并适用于机器操作，只需要较少的起始材料，即可产生满意的测序结果。
发明内容
本发明提供了随机断裂并同时标记DNA片段的方法，组分和试剂盒。特别是，本发明采用体外转座，用核酸酶和连接酶来标记核酸库以适合下一代测序应用。
在一些实例中，本发明方法为随机断裂并同时标记DNA片段提供了方法，适用的DNA片段可以是纯化的基因组DNA，双链的cDNA，PCR后的双链DNA产物，或是滚环复制产生的大片段DNA，这些DNA的来源可以是人，动物，植物或者微生物。
其中包括：a)将转座酶和转座子末端序列(Transposone End-TE)与双链目标DNA混合，在转座酶的催化作用下，双链的转座子随机插入目标DNA序列中。转座酶可以包括：(Tn5，Tn3，Tn7，Tn8，Tn9，Tn10，Tn11，Tn2，Tn4，Tn6以及它们的各种突变版本。在转座子插入过程中，转座子末端的一条单链以共价键连接在DNA片断的5’端，转座子末端的第二条链与DNA片断不相连，但是在退火条件下，仍以双链形式存在。在第二链的转座末端和DNA片段3’端之间有9个碱基的空位。由此就产生了随机断裂的，并被(TE)标记的DNA片段。这些片段从5’至3’，始于双链转座子末端序列，继而是9个碱基对的单链DNA序列，然后是双链目标DNA片段，9bp的单链DNA序列和双链转座子末端；b)从转座子末端序列(TE)标记的DNA片断中去除双链转座子末端序列(TE)，生成未标记的DNA片段；c)在未标记的DNA片断上连接需要的DNA标记，产生一个新的有标记的DNA片段。
在一些实例中，转座子可以包括：(Tn5)，转座子末端序列可以包括(TE)。
在本发明的一些实例中，单链DNA内切酶被用来切割9个碱基转座子末端序列(TE)标记的DNA上9个碱基的单链区域，目的是移除双链转座子末端序列。许多单链DNA内切酶能够用来去除单链DNA，以此除去DNA两端双链转座子末端序列，产生带有平末端的未被标记的双链DNA片断。在另外一些实例中，用DNA聚合酶来补平5’端，在3’端加上A尾。适用于这一应用的聚合酶不仅仅局限于DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶，大片段DNA聚合酶I(Klenow片段)也可以使用。Klenow片段是去除了3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶I。而用DNA聚合酶补平5’端，形成平末端(而不是A尾)，则要用有3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶，如T7DNA聚合酶，T4DNA聚合酶，大片断DNA聚合酶I等。
在一些实例中，转座子末端的第二条链，是游离的，并不和目标DNA序列共价连接。在高温条件下，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段被分离，而目标DNA部分保持不变。在移除转座子末端的第二条链后，可以使用一些特定的单链DNA核酸酶来移除剩下的转座子的第一条链和9个碱基对的单链DNA。
在本发明的一些实施方案中，被随机断裂的目标DNA需要被加上有特殊要求的标签，产生标记的DNA片段以适用于下游应用的需要。DNA连接酶，如T4DNA连接酶可把标记的DNA与DNA片断连接起来。根据下游应用需要的DNA片段，可以加上所需的标签：如测序标签，barcode标签，地址标签，酶切位点标记，捕捉标记，检测标记，扩增标记，或转录启动子序列标签。多个标记也可以连接在一起使用。在未标记的双链DNA片段的两端可以连接相同或不同的标签。在一些实例中，所需的序列标签是由许多二代测序公司提供的，如Illumina，LifeTechnologies，Roche，Complete Genomics and Pacific Biosciences等。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于随机断裂，并形成有标记的DNA片段的试剂盒，其中包括纯化的转座子，转座子末端(TE)，和单链DNA核酸酶。该试剂盒还可以包括DNA聚合酶，例如，DNA聚合酶I，大片段DNA聚合酶I(Klenow片段)或Taq DNA聚合酶。在一些实施例中，该试剂盒还包括DNA连接酶，例如，T4DNA连接酶，。在一些实施例中，该试剂盒还可以包括所需的标签，可以是一个或多个测序标签，barcode标签，地址标签，酶切位点标记，捕捉标记，检测标记，扩增标记，或转录启动子序列标签。在一些实施例中，所需的序列标签是由许多二代测序公司提供的，如Illumina，Life Technologies，Roche，Complete Genomics and Pacific Biosciences等。
本发明采用在体外转座系统，将目标DNA随机断裂到所需的片断大小，用单链DNA核酸酶修平末端，并在DNA的平末端连接所需的标签来标记DNA片段。这些被标记的片段可用于各种应用，包括患者样本的宏基因组DNA的分析，比较基因组分析，全基因组测序，单核苷酸多态性基因分型，原位杂交。
本发明提供了一种有效的方法产生标记的随机断裂的DNA片段文库，适应各种不同的测序平台。本发明的一个优点是，它允许连接任何所需标记的DNA片段，使所产生标记的DNA片段，可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，Life Technologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，Pacific Biosciences这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。本发明的另一个优点是，本发明的方法可以很容易地提高通量，并由机器人进行自动化操作。
专业术语“转座子末端”或“转座子末端序列”，是指由特定核苷酸序列组成的双链DNA。它可以和转座酶形成一个在体外有转座功能的转座复合体。这对在体外进行转座反应时插入双链目的DNA是至关重要的。转座子末端为双链DNA序列，第一条链(可转移链)可以与目的DNA的5’端共价连接，第二条链(非转移链)在转座过程中不与目的DNA直接连接，但是是经过退火反应与转座末端的第一条链(可转移链)相连接。在转座反应中每个转座酶会识别和使用特定的转座子末端序列。
“转座酶”是指可以和转座末端序列形成功能复合物的酶，形成的复合物可以催化转座子末端序列插入到目的DNA中。原病毒整合酶也包括在转座酶中。
“转座反应”或“体外转座反应”是指转座酶复合物可以打断目的DNA，将转座子末端序列插入在目的DNA片断中。当同一个目的DNA的两端转入两个转座子，那两个转座子之间的DNA片断即被分离开。因此转座反应可以对目的片断进行随机打断并在末端进行标记。转座过程会在目标DNA和转座子末端序列之间产生9个碱基的单链DNA。
附图说明
图1：相同初始量的同种DNA在不同缓冲液体系中断裂后分子量区间的差别。A，使用低分子量区间缓冲液；B，使用高分子量区间缓冲液。
图2：新一代测序技术DNA文库构建结果：1，1kb Plus DNA Ladder(LifeTechnologies，10787-018)；2，50ng纯化后人基因组DNA；3，50ng人基因组DNA采用滚环复制后(illustra GenomiPhi V2 DNA amplification Kit，GEHealth Care Life Sciences，25-6600-30)；4，50ng PCR产物(4kb用特定探针从人基因组DNA扩增得到的片段，Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix，NEBM0536L).
图3：M，1kb Plus DNA Ladder(Life Technologies，10787-018)；1，100ng纯化后玉米基因组DNA图4：M，1kb Plus DNA Ladder(Life Technologies，10787-018)；1，50ng纯化后链球弧菌DNA；2，打断的链球弧菌DNA经PCR得到双链DNA片段；
具体实施方式
实施例1、有末端标记的DNA文库的构建
利用转座酶和转座子末端序列(TE)对目的DNA进行随机打断，使其达到我们期望的片段大小。通常我们把目的DNA和转座酶及其特定的转座末端序列置于转座反应的缓冲液中进行孵育。加入目的DNA(例如人基因组DNA)、转座酶(EZ-Tn5 Transposase，EPICENTRE)及其特定转座末端序列的量(0.01ng/ul-1ug/ul)依据不同的应用而有所不同。缓冲液的成分和浓度(1×GPSBuffer，25mM Tris-HCl，2mM DTT)，孵育的温度及其时间也要根据所要切割片段的大小而定。如图1所示：在两种不同的缓冲液体系中，DNA被断裂的分子量区间是不一样的。在加入反应终止液(10％蔗糖，66mM EDTA，20mM TRIS，0.1％SDS，0.9％Orange G，and 100g/ml蛋白酶K)，50℃加热10分钟后反应即可终止。可以在1％的琼脂糖凝胶(Promega公司V2111)电泳上查看断裂后的DNA片段的大小。
一旦转座反应完成，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段即可用ZymoDNAClean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来进行纯化。
将纯化好的转座子末端序列(TE)标记的DNA片段和单链DNA内切酶(S1nuclease，Promega)与外切酶(exoVII，Promega)的混合物在37℃进行孵育，直到单链的DNA片段末端修平。用ZymoDNA Clean and Concentrator kit来纯化没有标记的DNA。转座子的末端序列至此被移除，产生了未标记的DNA片段。
在以上产生的未标记的DNA片段中加入无外切酶活性的DNA聚合酶I大片段，即Klenow片段，在37℃孵育20分钟。经此处理的DNA片段即可与寡核苷酸接头相连。
把没有标记的DNA片段、自测序标签，barcode标签的测序标签及连接反应所用的T4DNA连接酶的混合物，在16℃处理5分钟或过夜。加入EDTA或是在72℃反应20分钟终止连接反应。带有标签的DNA片段文库即可用来下游分析。
起始材料用Tn5在LMW 50℃5分钟(Nextera DNA Sample Preparation Kit，EPICENTRE，GA09115)，然后37度用S1 nuclease(Promega，M5761)孵化30分钟.得到的加a尾的DNA片段用Klenow从3’到5’外切打断(NEB，0212L)，37℃孵化20minutes.16℃5分钟使用快速链接试剂盒链接测序街头.得到的加标记的DNA按照标准的PCR操作流程和如下体系进行PCR扩增(Phusion HotStart Flex 2X Master Mix，NEB M0536L).所有的样品在每次用酶处理的过程中用ZymoDNA Clean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来纯化和富集，得到的PCR产物在1％的agarose胶电泳并且用SYBRgreen I Nucleic Acid染料染色(Life technologies，S7567)，所得到的结果见用Safe Imager Blue Light Transil luminator拍下的图片2(Lifetechnologies，G6600).
实施例2
采用玉米的基因组DNA片段作为材料，利用转座酶和转座子末端序列(TE)对目的DNA进行随机打断，使其达到我们期望的片段大小。材料采用的缓冲体系是(1×GPS Buffer，25mM Tri s-HCl)，在不同的孵化条件下(37℃，20分钟)处理样本，然后加入反应终止液(10％蔗糖，66mM EDTA，20mM TRIS，0.1％SDS，0.9％Orange G，and 100g/ml蛋白酶K)，50℃加热10分钟后反应即可终止。可以在1％凝胶电泳下观察裂解的DNA片段大小。
一旦转座反应完成，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段即可用ZymoDNAClean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来进行纯化。
将纯化好的转座子末端序列(TE)标记的DNA片段和单链DNA内切酶(S1nuclease，Promega)与外切酶的混合物在37℃进行孵育，直到单链的DNA片段末端修平。用ZymoDNA Clean and Concentrator kit来纯化没有标记的DNA。转座子的末端序列至此被移除，产生了未标记的DNA片段。
在以上产生的未标记的DNA片段中加入无外切酶活性的DNA聚合酶I大片段，即Klenow片段，在37℃孵育20分钟。经此处理的DNA片段即可与寡核苷酸接头相连。
把没有标记的DNA片段、，捕捉标记，检测标记的测序标签及连接反应所用的T4DNA连接酶的混合物，在16℃处理5分钟或过夜。加入EDTA或是在72℃反应20分钟终止连接反应。带有标签的DNA片段文库即可用来下游分析。起始材料用用Tn5在LMW 50℃5分钟(Nextera DNA Sample Preparation Kit，EPICENTRE，GA09115)，然后37度用S1 nuclease(Promega，M5761)孵化30分钟.得到的加a尾的DNA片段，用Klenow从3’到5’外切打断(NEB，0212L)，37℃孵化20minutes.16℃5分钟使用快速链接试剂盒链接接头.得到的加标记的DNA按照标准的PCR操作流程和如下体系进行PCR扩增(Phusion Hot StartFlex 2X Master Mix，NEB M0536L).所有的样品在每次用酶处理的过程中用ZymoDNA Clean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来纯化和富集，得到的PCR产物在1％的agarose胶电泳并且用SYBR green INucleic Acid染料染色(Life technologies，S7567)，所得到的结果用SafeImager Blue Light Transilluminator拍下的图片3(Life technologies，G6600).
实施例3
采用链球弧菌的基因组DNA和以打断的链球弧菌DNA在循环的PCR双链DNA片段作为材料，利用转座酶和转座子末端序列(TE)对目的DNA进行随机打断，使其达到我们期望的片段大小。材料采用的缓冲体系是((1×GPS Buffer，25mMTris-HCl)，在不同的孵化条件下(25℃，2个小时)处理样本，然后加入反应终止液(10％蔗糖，66mM EDTA，20mM TRIS，0.1％SDS，0.9％Orange G，and 100g/ml蛋白酶K)，50℃加热10分钟后反应即可终止。可以在1％凝胶电泳下观察裂解的DNA片段大小。
一旦转座反应完成，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段即可用ZymoDNAClean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来进行纯化。
将纯化好的转座子末端序列(TE)标记的DNA片段和单链DNA内切酶(S1nuclease，Promega)与外切酶的混合物在37℃进行孵育，直到单链的DNA片段末端修平。用ZymoDNA Clean and Concentrator kit来纯化没有标记的DNA。转座子的末端序列至此被移除，产生了未标记的DNA片段。
在以上产生的未标记的DNA片段中加入无外切酶活性的DNA聚合酶I大片段，即Klenow片段，在37℃孵育20分钟。经此处理的DNA片段即可与寡核苷酸接头相连。
把没有标记的DNA片段、barcode标签，酶切位点标记，转录启动子序列标签的测序标签及连接反应所用的T4DNA连接酶的混合物，在16℃处理5分钟或过夜。加入EDTA或是在72℃反应20分钟终止连接反应。带有标签的DNA片段文库即可用来下游分析。
起始材料用Tn5在LMW 50℃5分钟(Nextera DNA Sample Preparation Kit，EPICENTRE，GA09115)，然后37度用S1 nuclease(Promega，M5761)孵化30分钟.得到的加a尾的DNA片段用Klenow从3’到5’外切打断(NEB，0212L)，37℃孵化20minutes.16℃5分钟使用快速链接试剂盒链接测序街头.得到的加标记的DNA按照标准的PCR操作流程和如下体系进行PCR扩增(Phusion HotStart Flex 2X Master Mix，NEB M0536L).所有的样品在每次用酶处理的过程中用ZymoDNA Clean and Concentrator kit(Zymo Research Corporation，Irvine，CA)来纯化和富集，得到的PCR产物在1％的agarose胶电泳并且用SYBRgreen I Nucleic Acid染料染色(Life technologies，S7567)，所得到的结果见用Safe Imager Blue Light Transilluminator拍下的图片4(Lifetechnologies，G6600).
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本发明已在一些细节上进行了描述，各种形式和细节的变化不会偏离发明的真正范围。上面提到的所有的数字，表格，附录，专利，专利申请和文献，现予纳入参考。

Claims (10)

1.一种随机断裂并同时标记DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：
i.转座酶、双链转座子及目标DNA混合后发生反应，就是在转座酶的催化作用下，双链的转座子末端序列随机插入目标DNA序列中，形成被转座子末端序列标记的DNA片段，这些片段从5’至3’，始于双链转座子末端序列，继而是9个碱基对的单链DNA序列，然后是双链目标DNA片段，9个碱基对的单链DNA序列和双链转座子末端；
ii.去除标记在DNA两端的双链转座子末端序列，生成未标记的DNA片段。
iii.在未标记的DNA片断上连接需要的DNA标签，产生一个有新的标签的DNA片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用单链DNA内切酶来去除标记在DNA两端的双链转座子末端序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用单链DNA外切酶来产生带平末端的双链DNA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用DNA聚合酶来产生可连接的DNA末端。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，DNA聚合酶为大片断DNA聚合酶I，T7DNA聚合酶或T4DNA聚合酶，或是Taq DNA聚合酶或无3’至5’外切酶活性的Klennow片断。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，未标记的DNA片断被连接上需要的标签是用DNA连接酶来实现的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，DNA连接酶是T4 DNA连接酶，T7 DNA连接酶，或是Taq DNA聚合酶。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA标签为选自测序标签，barcode标签，酶切位点标记，捕捉标记，检测标记，扩增标记，或转录启动子序列标签中的一种或一种以上。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，多个标签可以连接在一起使用。
10.一种使用权利要求1-9方法的用于随机断裂，并形成有标记的DNA片段的试剂盒，其中包括纯化的转座子，转座子末端，和单链DNA核酸酶，DNA聚合酶，和DNA连接酶以及所需的标签。
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