CN109295048A - 一种全基因组分子标记检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全基因组分子标记检测的方法。本发明将传统的转座子显示技术与高通量测序技术相结合,简化了传统的转座子显示技术的实验流程,提高了实验结果的准确性。和传统的转座子显示技术不同,本发明利用Tn5转座酶复合体打断DNA,并在打断的DNA片段末端加上可以用来作为引物结合位点的DNA接头。本发明的方法操作简单,利用高通量测序技术替代聚丙烯酰胺凝胶电泳,不仅简化了实验流程,也提高了全基因组标记检测的准确性。结合高通量测序的barcoding技术,可以将不同样品的PCR扩增产物混合在一起进行测序,因此可以同时检测多个样本的分子标记信息,提高了分子标记检测的样本通量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种利用改进的转座子显示技术做全基因组分子标记检测的方法。
背景技术
SNP(Single-nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)标记是一种以DNA多态性为基础的遗传标记,它是DNA水平上遗传多态性的直接反映,广泛存在于基因组的各个区域,数量巨大,通过对随机分布于整个基因组的SNP标记的多态性进行比较,就能够全面评估研究对象的多样性,并揭示其遗传本质。
目前,在科研、农业育种和临床检测等领域,常用的全基因组SNP标记检测的方法有芯片杂交、全基因组测序、简化基因组测序RAD(Restriction-site associated DNAsequencing)或GBS(Genotyping-by-Sequencing)、目标区域捕获测序、rAmpseq(RepeatAmplification Sequencing),多重PCR等。除芯片杂交外,这些方法的本质都是通过测序,找出不同个体中的DNA序列差异作为分子标记。芯片杂交是将基因组DNA与一组已知序列的DNA探针杂交,通过杂交信号区分不同的基因型;全基因组测序技术是对整个基因组测序,然后将测序结果与参考基因组序列比对,找出多态性位点,全基因组测序虽然可以鉴定出全基因组水平的所有多态性标记,标记的密度最高,但其成本也相对较高,在实际应用中,有时低密度的全基因组分子标记即可满足需要,在这种需求驱动下,简化基因组测序(RAD或GBS)应运而生。简化基因组测序是指通过一系列的分子生物学操作,只选择部分基因组(一般为1%-10%)测序而获得散布于全基因组的部分分子标记,用于代表全基因组的遗传多样性信息。目前常用的简化基因组测序方法有RAD,GBS,2bRAD,2dRAD等。目标序列捕获测序,是将感兴趣的基因组区域合成为带生物素的特异性DNA或RNA探针,与制备好的基因组DNA测序文库进行杂交(固相或液相),将目标基因组区域的DNA片段进行富集后进行测序,以获得目标区域的遗传信息,由于是定制探针,所以目标区域捕获测序的靶位点位置和数量可以灵活控制,但其成本也较高;rAmpseq测序是筛选基因组中的中度重复序列区域的一些保守序列设计引物,用少数几对引物扩增基因组中的包含这些引物序列的所有中度重复序列然后进行测序,获得分子标记信息。多重PCR也叫多重引物PCR,是在同一个PCR反应中加入多对引物,达到扩增多个目标片段的目的。
转座子是基因组的重要组成成分,依据不同的转座机制可分为两大类:一类是RNA介导的转座子,这类转座子的复制和转座涉及逆转录过程,被称为反转录转座子;另一类是以DNA为介导,采用剪切—粘贴机制来完成自身转座,称为DNA转座子。MITE(miniatureinverted repeat transposable element)类转座子属于DNA转座子,在基因组上广泛分布,具有拷贝数量多和高度保守的特点,且多分布在基因富集区域。这些特点使其很适合做全基因组分子标记。转座子显示(transposon display,TD)技术是利用高拷贝保守转座子在基因组中散布分布的特点,通过接头连接PCR对转座子附近的目标DNA区域进行扩增,然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分不同长度的PCR产物,作为分子标记。
上述芯片杂交、全基因组测序、简化基因组测序、目标区域捕获测序、rAmpseq,多重PCR等技术等方法存在着一些缺陷:
1.芯片杂交:针对每一个物种都需要根据已知SNP序列信息设计探针,当这些信息缺失时就不能使用芯片杂交来做基因型检测,此外,虽然芯片杂交后期的成本低廉,但前期芯片的设计和制作成本昂贵,只有当样品数量大时才可以摊薄这一部分的成本,因此,芯片杂交不适用于不常研究物种和一些个性化的研究。
2.全基因组重测序:需要对整个基因组进行测序,测序量大,成本高,有时并不需要全基因组的高密度标记,因此就会造成数据的浪费。
3.简化基因组测序:文库制备的操作流程繁琐,涉及到酶切、接头连接、片段选择等。
4.目标区域捕获测序:需要根据参考基因组序列设计探针,只适合已经有全基因组序列的物种;此外,探针合成的成本非常高,实验操作繁琐,探针杂交时需要在15μL左右的体系中60℃杂交16小时左右,稍有不慎,就会蒸干,整个实验流程的失败率高。
5. rAmpseq:标记全部位于基因组重复区域,最终得到的序列有时无法确定是位于基因组不同位置的copy本身的多态性还是不同个体之间同样位置的copy之间的多态性,因此,这种方法得到的多态性标记准确度不高。
6.传统的转座子显示技术:实验操作繁琐,PCR产物需要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,通量低,得到的标记数量也少,实验过程中限制性内切酶酶切和PCR的效率会对标记的准确度产生影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用改进的转座子显示技术做全基因组分子标记检测的方法,克服传统分子标记方法成本高,操作过程繁琐,失败率高以及标记不准确等问题。
一种全基因组分子标记检测的方法,包括如下步骤:
(1)利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA,同时,Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物,在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处,作为后续PCR反应的引物结合位点;
(2)Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物,所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分:不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段;第一轮PCR反应以T-primer1与TD-seq1为引物进行扩增;被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段,而不含目标转座子的DNA片段由于没有T-primer1引物结合位点,不会被扩增;经过第一轮PCR,包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集,PCR产物的一端为目标转座子,此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列,另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列;
(3)在第二轮PCR扩增时,以第一轮PCR产物为模板,利用引物T-primer2和TD-seq2,进行PCR扩增,通过第二轮PCR扩增,目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列;
(4)经过两轮PCR扩增,目标转座子附近的序列得到极大富集,对所富集的片段进行片段选择并进行高通量测序,得到的扩增片段中包含的SNP信息便反映基因组相应区域的DNA多态性。
所述T-primer1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
所述TD-seq1引物5’端为Amp7序列,中间为8bp的index序列,3’端碱基序列可退火结合在Tn5接头序列上。
所述引物T-primer2 3’端碱基序列可以在T-primer1的左侧退火,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
所述引物T-primer2的3’端碱基结合在T-primer1的Illumina P5接头序列上,中间为8bp的index序列,5’端碱基序列为Amp5。
所述TD-seq1包含Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列;所述P7端的接头序列包含barcode。
本发明的有益效果:本发明将传统的转座子显示技术与高通量测序技术相结合,简化了传统的转座子显示技术的实验流程,提高了实验结果的准确性。利用了Tn5转座酶复合体在打断DNA的同时,可以在断点处连接上DNA接头的特性,理论上,连接DNA接头的效率近乎100%,基因组DNA只要能够被打断,其断点处都会被连接上DNA接头,连接效率远远高于反向PCR、接头PCR等同类技术。本发明的方法操作简单,利用高通量测序技术替代聚丙烯酰胺凝胶电泳,不仅简化了实验流程,也提高了标记检测的准确性。结合高通量测序的barcoding技术,可以将不同样品的PCR扩增产物混合在一起进行测序,因此可以同时检测多个样本的分子标记信息,提高了分子标记检测的样本通量。
附图说明
图1为TD-seq扩增转座子侧翼未知序列的主要流程。
图2为T-primer1在蜀恢498 12条染色体上的结合位点分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明的方法原理和操作流程如图1所示。
实施例1:
1.DNA定量
利用琼脂糖凝胶电泳对提取的水稻基因组DNA进行质量检测,然后利用dsDNA High Sensitivity Kit测定DNA的浓度。
2.转座酶复合体打断水稻基因组DNA并在断点处加Tn5接头。Tn5接头由两条单链DNA退火后形成,两条单链DNA序列如下:
5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH3-3'
5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
利用Tn5转座酶复合体打断水稻基因组DNA,按表1成分在灭菌PCR管中配置反应体系,然后将反应管置于PCR仪中,运行如下反应程序:105℃热盖,55℃反应10min,4℃hold。
表1.转座酶复合体反应体系
3.利用柱式纯化法对转座酶复合体打断后的产物进行纯化
采用 Cycle Pure Kit(OMEGA),向反应后的酶切体系中加入5倍体积的CP Buffer,即5μL酶切体系中加入25μL CP Buffer,混合均匀后转入吸附柱进行纯化,最终洗脱体积为20μL,取2μL用3.0荧光计进行浓度测定。
4.纯化后的转座酶打断产物进行PCR反应
PCR扩增所需引物序列如下:
表2. PCR扩增所需引物序列
表3.第一轮PCR反应体系
表4.第二轮PCR反应体系
表5.第一轮PCR的反应程序
表6.第二轮PCR的反应程序
5.将PCR扩增的产物进行纯化
前后两次PCR反应的终产物,使用 Cycle Pure Kit(OMEGA)分别纯化,并进行浓度测定,纯化步骤及浓度检测方法与第二步相同。
6.片段选择
利用Sage Science公司的Sage ELF仪器对混合好的文库进行片段选择,先将混合好的文库与6×loading buffer混合均匀,利用2%琼脂糖凝胶DNA回收胶盒(Cassette),选择时间模式,来回收约400~550bp大小的片段。
7.测序
根据所回收文库的浓度,按照Illumina相关仪器的要求,上机测序。
8.数据分析
8.1T-primer1在水稻品种蜀恢498(Oryza sativa subsp.indica)基因组中的分布。
发明人首先利用生物信息学手段分析了水稻品种蜀恢498全基因组序列中T-primer1的结合位点。结果显示,在该品种中,T-primer1共有651个结合位点,这些结合位点近乎平均分布于12条染色体上,说明这些位点附近的SNP/indel标记可以用来作为全基因组的分子标记(图2)。
表7. T-primer1在蜀恢498全基因组中的结合位点分布
8.2 TD-seq的扩增效率
我们从下机的raw data中提取与T-primer1引物20bp完全互补的raw reads,共提取出236,323对,去除低质量read后获得193,897对clean reads,占提取出来的raw reads的82.0%。利用二代测序read定位软件BWA把这些clean read定位到染色体上,结果显示,651个T-primer1引物结合位点中,共有648个位点被成功扩增出来,扩增比例为99.54%,每个位点的平均覆盖深度53.3×(表8),说明TD-seq可以对T-primer附近的序列标签(Tag)进行高效的扩增。
表8. TD-seq对T-primer1附近的序列标签(Tag)的扩增效率
8.3利用TD-seq的数据鉴定SNP
发明人以水稻品种日本晴(Oryza.Sativa subsp.japonica)的基因组序列为参考序列,利用软件GATK鉴定提取出来包含T-primer引物序列的clean reads的SNP,符合过滤标准的SNP(备注:GATK call SNP过滤参数:-window 10-cluster 3--filterExpression"DP<5||QD<2.0||QUAL<30.0||MQ<40.0||FS>60.0||SOR>3.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0")共有3703个,其中有1154位于日本晴参考序列的重复序列区域,2550个位于非重复区域。位于非重复区域的SNP中,纯合型2182个;杂合型368个。综上,说明TD-seq可以用来进行全基因的分子标记检测。
序列表
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一种全基因组分子标记检测的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctac 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatggtttc tccaccagtg 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagtgatcta cgtacccttg tagac 25
Claims (6)
1.一种全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA,同时,Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物,在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处,作为后续PCR反应的引物结合位点;
(2)Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物,所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分:不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段;第一轮PCR反应以T-primer1与TD-seq1为引物进行扩增;被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段,而不含目标转座子的DNA片段由于没有T-primer1引物结合位点,不会被扩增;经过第一轮PCR,包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集,PCR产物的一端为目标转座子,此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列,另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列;
(3)在第二轮PCR扩增时,以第一轮PCR产物为模板,利用引物T-primer2和TD-seq2,进行PCR扩增,通过第二轮PCR扩增,目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列;
(4)经过两轮PCR扩增,目标转座子附近的序列得到极大富集,对所富集的片段进行片段选择并进行高通量测序,得到的扩增片段中包含的SNP信息便反映基因组相应区域的DNA多态性。
2.根据权利要求1所述全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,所述T-primer1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,所述TD-seq1引物5’端为Amp7序列,中间为8 bp 的index序列,3’端碱基序列可退火结合在Tn5接头序列上。
4.根据权利要求1所述全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,所述引物T-primer2 3’端碱基序列可以在T-primer1的左侧退火,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求1所述全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,所述引物T-primer2的3’端碱基结合在T-primer1的Illumina P5接头序列上,中间为8 bp 的index序列,5’端碱基序列为Amp5。
6.根据权利要求1所述全基因组分子标记检测的方法,其特征在于,所述TD-seq1包含Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列;所述P7端的接头序列包含barcode。
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