发明内容
本发明提供一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂,通过转座酶打断与限制性缺口平移反应结合,实现简单、快速的核酸单链环状文库的构建。
根据本发明的第一方面,本发明提供一种核酸单链环状文库的构建方法,包括如下步骤:
使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断,其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头,打断的核酸两端连接第一接头并且形成缺口;
去除体系中的转座酶,然后使用连接酶在缺口处连接上第二接头,第二接头的序列不同于第一接头;
进行第一PCR反应,得到两端分别连接第一接头和第二接头序列的产物,其中第一PCR反应的引物上带有U碱基;
使用User酶酶切U碱基位点产生切口,然后进行双链环化产生环状核酸分子;
以环状核酸分子为模板,从切口处开始进行限制性缺口平移反应;
消化除去环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分,得到线性核酸分子;
在线性核酸分子每条链的3’端连接第三接头,并在每条链的5’端连接寡核苷酸接头序列;
进行第二PCR反应,得到两端分别连接第三接头和寡核苷酸接头序列的产物,其中第二PCR反应的一条引物在5’端具有第一亲和标记;
使用带有第二亲和标记的载体结合产物,并通过核酸变性分离出不带亲和标记的核酸单链,其中第二亲和标记结合第一亲和标记;
使用单链环化“桥”序列对核酸单链进行环化,其中单链环化“桥”序列能够同时结合核酸单链的两端。
作为本发明的优选方案,在使用单链环化“桥”序列对核酸单链进行环化后,还包括:对未环化的核酸单链进行消化。
作为本发明的优选方案,去除体系中的转座酶,采用磁珠纯化、过柱纯化或化学试剂处理的方式进行。
作为本发明的优选方案,在限制性缺口平移反应过程中,通过控制体系中dNTP的量来控制限制性缺口平移反应生成的片段的长度。
作为本发明的优选方案,在限制性缺口平移反应之前,对未环化的核酸分子进行消化。
作为本发明的优选方案,消化除去环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分,具体包括:首先使用双链外切酶降解,直到两端的缺口相遇;然后使用单链外切酶降解单链。
作为本发明的优选方案,在线性核酸分子每条链的3’端连接第三接头之前,还包括:对线性核酸分子进行末端补平和去磷酸化反应。
作为本发明的优选方案,在线性核酸分子每条链的3’端连接第三接头之后,对5’端进行磷酸化,然后在每条链的5’端连接寡核苷酸接头序列。
作为本发明的优选方案,寡核苷酸接头序列在邻近连接的片段的部分与第三接头有部分碱基互补。
作为本发明的优选方案,第一亲和标记为生物素标记;第二亲和标记为链霉亲和素标记。
根据本发明的第二方面,本发明提供一种核酸单链环状文库的构建试剂,包括如下组成部分:
转座酶和含转座酶识别序列的第一接头,用于形成转座酶包埋复合体以对核酸进行随机打断,在打断的核酸两端连接第一接头并且形成缺口;
第二接头和连接酶组分,用于在缺口处连接上第二接头;
用于第一PCR反应的引物,引物上带有U碱基,用于进行第一PCR反应得到两端分别连接第一接头和第二接头序列的产物;
User酶,用于酶切U碱基位点产生切口,以便进行双链环化产生环状核酸分子;
限制性缺口平移反应的组分,用于以环状核酸分子为模板,从切口处开始进行限制性缺口平移反应;
消化酶,用于消化除去环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分,得到线性核酸分子;
第三接头和寡核苷酸接头序列,分别用于连接在线性核酸分子每条链的3’端和5’端;
用于第二PCR反应的引物,其中一条引物在5’端具有第一亲和标记,用于进行第二PCR反应得到两端分别连接第三接头和寡核苷酸接头序列的产物;
带有第二亲和标记的载体,用于结合产物,并通过核酸变性分离出不带亲和标记的核酸单链,其中第二亲和标记结合第一亲和标记;
单链环化“桥”序列,能够同时结合单链的两端,用于对单链进行环化。
作为本发明的优选方案,消化酶包括双链外切酶和单链外切酶。
作为本发明的优选方案,试剂还包括:末端补平组分,用于对线性核酸分子进行末端补平;和
去磷酸化组分,用于对线性核酸分子进行去磷酸化反应。
作为本发明的优选方案,试剂还包括:多核苷酸激酶,用于在线性核酸分子每条链的3’端连接第三接头之后,对5’端进行磷酸化。
作为本发明的优选方案,第一亲和标记为生物素标记;第二亲和标记为链霉亲和素标记。
本发明的核酸单链环状文库的构建方法,通过第二接头的连接,将转座酶打断后的产物两端的接头改变为不同的序列信息,从而使得打断后的靶序列的应用不再受限于两侧共有转座酶识别序列的影响;通过含U碱基的引物进行PCR扩增,方便后续进行User酶切反应和双链环化;双链环化之后使用限制性缺口平移反应构建所需长度的分子,片段长度控制更加灵活;然后连接第三接头和寡核苷酸序列,并使用亲和磁珠分离所需的单链并进行环化,得到单链环状文库,整个过程较为简便且时间花费较少。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明,下面实施例中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术;所使用的仪器设备和试剂等,均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
本发明中用到的术语说明如下:第一接头在具体实施方式中称作一号接头;第二接头在具体实施方式中称作二号接头;第三接头在具体实施方式中称作三号接头。
本发明中,任何情况下使用的“第一”和“第二”等概念都不应当理解为具有顺序和技术的含义,其作用仅在于将其与其它对象区别开来。
请参考图1,本发明一个实施例的核酸单链环状文库的构建方法,包括如下步骤:使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断,其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头,打断的核酸两端连接第一接头并且形成缺口(9nt缺口);去除体系中的转座酶,然后使用连接酶在缺口处连接上第二接头,第二接头的序列不同于第一接头;进行第一PCR反应,得到两端分别连接第一接头和第二接头序列的产物,其中第一PCR反应的引物上带有U碱基;使用User酶酶切U碱基位点产生切口,然后进行双链环化产生环状核酸分子;以环状核酸分子为模板,从切口处开始进行限制性缺口平移(CNT)反应;依次使用双链核酸外切酶和单链核酸外切酶,消化除去环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分,得到线性核酸分子;在线性核酸分子每条链的3’端连接第三接头,然后使用多核苷酸激酶(PNK)对5’端进行磷酸化,并且在每条链的5’端连接寡核苷酸接头序列(L-Oligo序列);进行第二PCR反应,得到两端分别连接第三接头和寡核苷酸接头序列的产物,其中第二PCR反应的一条引物在5’端具有第一亲和标记(生物素Bio);使用带有第二亲和标记(链霉亲和素)的载体结合PCR产物,并通过核酸变性分离出不带亲和标记的核酸单链;使用单链环化“桥”序列对核酸单链进行环化,其中单链环化“桥”序列能够同时结合核酸单链的两端。
本发明中,第一接头含有转座酶识别序列,典型地是公知的19bp Me序列,第一接头以双链形式存在,其中一条链可以在3’端具有双脱氧修饰,即双脱氧核苷酸,防止接头间的自连或互连。“自连”是指同一种接头的不同分子之间的连接,比如第一接头的不同分子之间的连接或第二接头的不同分子之间的连接;所谓“互连”是指不同种接头的分子之间的连接,比如第一接头的分子与第二接头的分子之间的连接。转座酶包埋复合体打断核酸后将第一接头的一条链连接到打断的核酸的一条链上,而第一接头的另一条链与打断的核酸的另一条链之间形成9nt碱基缺失的缺口,该缺口在传统的方法中需要通过缺口平移反应来补平,而在本发明的方法中正好为第二接头的连接提供结合位点。
本发明中,第二接头的序列不受限制,可以是任何序列,只要与第一接头的序列不同即可。因为本发明中使用第二接头主要是为了避免两端具有共同的转座酶识别序列的影响。第二接头连到缺口处,然后通过分别靶向结合第一接头和第二接头的引物进行PCR反应,即可得到两端分别连接有不同接头序列的产物。
本发明中,在转座酶打断核酸后,需要去除体系中的转座酶,以消除对后续酶促反应的影响。一般是通过磁珠纯化、过柱纯化或化学试剂处理的方式进行。其中,磁珠纯化和过柱纯化是本领域公知的传统的纯化方法,比如使用Ampure XP beads进行磁珠纯化,使用QIAGEN PCR纯化柱进行过柱纯化。毫无疑问,任何类似的磁珠纯化或过柱纯化产品均可用于本发明。纯化处理的优势在于,能够从体系中彻底除去转座酶,但是在具体操作中要增加相应的操作和成本。化学试剂处理使转座酶变性或消化而从靶序列上解离下来。由于转座酶在化学性质上属于蛋白质,因此可以使用相应的变性或消化手段将其从靶序列上解离下来,虽然这样处理后的转座酶仍然可能在体系中有残留,但是已经失去了其生物活性,对后续反应也不会有不利的影响。
本发明中,化学试剂处理可以首先选用蛋白酶溶液、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和NT缓冲液(Truprep试剂盒S5系列中配套的NT缓冲液)等,打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用;然后再进行纯化处理。
本发明中,在限制性缺口平移反应过程中,通过控制体系中dNTP的量来控制限制性缺口平移反应生成的片段的长度。因为dNTP是进行缺口平移反应的原料,当体系中dNTP耗尽时,不再继续进行缺口平移反应,因此本发明中dNTP用量是一个关键性的限制性因素。可以根据预期想得到的片段长度,决定dNTP用量,这样即可实现针对特定测序平台需要的特定文库片段长度的生成,不需要后期的切胶回收等步骤繁琐的片段选择步骤。
本发明中,限制性缺口平移反应是以环状核酸分子为模板进行的,为了消除未环化的核酸分子的影响,在限制性缺口平移反应之前,需要对未环化的核酸分子进行消化,本发明一个实施例中使用外切酶消化未环化的核酸分子。
本发明中,限制性缺口平移反应之后,分别使用双链核酸外切酶和单链核酸外切酶,消化除去环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分,得到线性核酸分子。但是,这样得到的线性核酸分子两端可能是不平的,需要进一步使用聚合酶进行末端补平反应;并且为了防止片段的自连,需要对片段5’端进行去磷酸化反应。
本发明中,第三接头和寡核苷酸接头序列分别连接线性核酸分子每条链的3’端和5’端,因此使用的第三接头的其中一条链的3’端进行了双脱氧修饰,即末端为双脱氧核苷酸,保证只有另一条链的5’端与线性核酸分子的3’端相连。连接第三接头后,需要使用多核苷酸激酶对线性核酸分子的5’端进行磷酸化处理,以便寡核苷酸接头序列的连接。
本发明中,寡核苷酸接头序列与第一接头、第二接头和第三接头均不同的是:寡核苷酸接头序列是一段单链核苷酸序列,而第一接头、第二接头和第三接头均为双链核苷酸序列。寡核苷酸接头序列的3’端连到上述线性核酸分子的磷酸化处理的5’端上,在本发明的一个优选实施方式中,寡核苷酸接头序列在邻近连接的片段的部分与第三接头有部分碱基互补,这样的好处是:一方面,通过部分碱基互补将寡核苷酸接头序列定位到连接位点,提高连接效率;另一方面,其它碱基与第三接头不互补,保证寡核苷酸接头序列连接之后再进行特异性PCR扩增能够得到两端有不同连接序列的产物,避免两端相同序列带来的不利影响。
本发明中,第二PCR反应使用的引物对中有一条引物在5’端具有第一亲和标记,其中第一亲和标记可以是生物学上常用的生物结合反应的一个组成部分,比如抗原或抗体,双链DNA短片段的一条链,生物素或链霉亲和素,等等。在第一亲和标记选用了抗原的情况下,第二亲和标记选用与该抗原结合的抗体,反之亦然;在第一亲和标记选用了双链DNA短片段的一条链的情况下,第二亲和标记选用与该链互补配对的另一条链,反之亦然;在第一亲和标记选用了生物素的情况下,第二亲和标记选用与生物素结合的链霉亲和素,反之亦然。本发明的一个实施方案中,第一亲和标记是生物素标记,第二亲和标记是链霉亲和素标记,二者具有很强的结合能力。
本发明中,用于与第二PCR反应的产物结合的载体,可以是芯片或磁珠等。具体地,在芯片或磁珠上标记上第二亲和标记,第二亲和标记能与第一亲和标记结合。在本发明的一个实施例中,采用链霉亲和素标记的磁珠。
本发明中,对结合到载体上的PCR产物进行变性处理,可以采用热变性或碱变性的方式实现,优选碱变性方式,例如氢氧化钠或氢氧化钾变性等,本发明一个实施例采用氢氧化钠变性。
本发明中,单链环化“桥”序列是一段序列能够同时结合单链的两端的序列,通过对单链两端的互补结合,而实现单链的环化。称为“桥”序列,是因为它正像桥一样将单链两端搭接起来。
下面通过实施例详细说明本发明。
本实施例采用转座酶试剂盒(Vazyme Biotech)进行技术开发,试剂盒包含5ng基因组DNA和50ng基因组DNA用量两种,本实施例使用的是50ng基因组试剂盒。
本实施例自主设计了一种包埋接头序列(一号接头),用转座酶和该种包埋接头序列进行转座酶包埋复合体的制备,并且将转座酶操作与CNT结合,实现新的建库模式方法。本实施例的具体操作步骤如下:
1、设计订购带有19bp Me序列的一对引物序列(序列A和序列B),用于制备包埋用的单接头(一号接头):
一号接头序列A:AGGUCGCCAGCCCUACAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:1);
一号接头序列B:CTGTCTCTTATACACATC ddT(SEQ ID NO:2,dd表示3’端双脱氧修饰)。
设计订购用于连接的二号接头(序列A和序列B):
二号接头序列A:
pACTGCTGAGCTGAGGANNNNNNNNNTCGTCAAGGTCGCCAGCC ddC(SEQ ID NO:3,dd表示3’端双脱氧修饰,p表示5’端磷酸化修饰,N表示的序列为一段用于区分不同样本的标签序列);
二号接头序列B:TCCTCAGCTCAGCAG ddT(SEQ ID NO:4,dd表示3’端双脱氧修饰)。
2、将一号接头序列A和序列B稀释到100μM,充分混合后离心,于PCR仪中按如下程序(表1)退火得到一号接头,储存于-20℃,用于包埋复合体的制备。
表1
3、按照如下体系(表2)将一号接头与转座酶包埋成转座酶复合体,轻轻吹打20次混合,30℃孵育1小时后完成复合体包埋,该复合体储存于-20℃。
表2
组分 |
用量 |
转座酶 |
85μL |
一号接头 |
30μL |
偶联缓冲液 |
85μL |
合计 |
200μL |
4、按照如下体系(表3)将50ng的高质量基因组和转座酶复合体进行混合,轻轻吹打20次混合,55℃孵育10分钟后降温至4℃,完成基因组的打断。
表3
基因组打断后,加入2.5μL体积的0.5%SDS混匀后再用1.2倍数的Ampure XPbeads纯化回收,用纯水或TE回融。
5、打断纯化后产物按照如下体系(表4)进行二号接头的连接,25℃孵育60分钟完成接头连接。
表4
组分 |
用量 |
水 |
8μL |
3×连接缓冲液 |
20μL |
二号接头(5μM) |
10μL |
连接酶 |
2μL |
DNA |
20μL |
合计 |
30μL |
二号接头连接后,使用1.2倍数的Ampure XP beads纯化;然后采用纯水回融。
6、按照如下体系(表5)及反应条件(表6)进行PCR扩增。
表5
组分 |
用量 |
DNA |
21.3μL |
5×PCR混合缓冲液 |
25μL |
引物1 |
1.25μL |
引物2 |
1.25μL |
PCR酶 |
1.2μL |
合计 |
50μL |
其中,PCR引物序列如下:
引物1:AGGUCGCCAGCCCUACAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:5);
引物2:GGGCUGGCGACCTUGACGA(SEQ ID NO:6)。
表6
7、配制下列User酶反应体系(表7),将上述PCR产物与之混合均匀,于PCR仪中37℃孵育1小时,然后逐渐降温至4℃。
表7
组分 |
用量 |
纯水 |
25.8μL |
User酶缓冲液 |
11μL |
User酶 |
13.2μL |
合计 |
50μL |
8、双链环化:准备酶反应混合液,配制如下(表8)。
表8
将上一步得到的产物分到四个小管子里,每个管子27.5μL,然后每个管子分别加入423μL的上述酶反应混合液,振荡混匀,置于水浴锅中70℃孵育30min;随后置于常温水浴锅中,冷却20min,配制如下环化酶反应混合液(表9)。
表9
加入上述环化酶反应混合液50μL到各个管子里,混匀,室温1小时进行环化反应。反应后纯化方法是0.6倍体积的Ampure XP beads取上清,后用0.4倍体积的Ampure XPbeads纯化回收,用纯水或TE回融。
9、向纯化好的60μL DNA样品中加入以下20μL的消化未环化DNA酶反应溶液(表10),于37℃孵育1小时并逐渐降温至4℃。
表10
消化后,使用1倍体积的Ampure XP beads纯化回收,使用纯水或TE回收。
10、配制下列混合液(表11),以产生合适长度的CNT反应的DNA产物。
表11
纯水 |
5.6μL |
稀释的dNTP |
3.9μL |
NEB缓冲液2 |
5.5μL |
DNA |
40μL |
稀释的聚合酶 |
5μL |
合计 |
60μL |
其中,稀释的dNTP配制:取2μL 25mM dNTP加入到18μL纯水中,混合均匀,然后从上一步稀释物中取出3μL 2.5mM dNTP加入到327μL纯水中,混合均匀;稀释的聚合酶配制:使用CNT缓冲液1∶4倍稀释聚合酶。
CNT反应程序如下(表12):
表12
温度 |
时间 |
8℃ |
15min |
65℃ |
15min |
4℃ |
∞ |
11、将上述产物加入下列反应液(表13)中,目的是去除缺口处的双链,置于25℃1小时,并缓慢降温至4℃。
表13
组分 |
用量 |
纯水 |
15.15μL |
NEB缓冲液4 |
10μL |
T7核酸外切酶 |
14.85 |
DNA |
60μL |
合计 |
100μL |
反应完成后,使用0.6倍体积的PEG 32 beads纯化回收,用水或TE回融。
12、按照下列配制消化单链的反应体系(表14),而后37℃孵育30分钟,逐渐降温至4℃。
表14
组分 |
用量 |
纯水 |
14.51μL |
核酸外切酶8缓冲液 |
10μL |
核酸外切酶8 |
0.495μL |
DNA |
25μL |
合计 |
50μL |
反应完成后,使用1倍体积的Ampure XP beads纯化回收,用纯水或TE缓冲液回融。使用Qubit检测浓度,并跑胶图确认片段大小。
13、按照下列体系(表15),对产物进行末端补平,12℃反应20分钟,逐渐降温至4℃。
表15
组分 |
用量 |
末端补平缓冲液 |
5.4μL |
脱氧核苷酸 |
0.8μL |
牛血清白蛋白 |
0.4μL |
DNA |
44μL |
聚合酶 |
2μL |
合计 |
52.6μL |
反应完成后,使用1.3倍PEG 32 beads纯化回收,用纯水或TE回融。
14、配制去磷酸化反应体系(表16),并置于37℃下反应孵育45分钟,并逐渐降温至4℃。
表16
组分 |
用量 |
去磷酸化缓冲液 |
5.75μL |
去磷酸化酶 |
5.75μL |
DNA |
46μL |
合计 |
57.5μL |
反应完成后,使用1.3倍PEG32 beads纯化回收,用纯水或TE缓冲液回融。
15、设计订制第三接头:
第三接头序列-1:pAAGTCGGAGGCCAAGCGTGCTTAGGA(SEQ ID NO:7,p表示5’端磷酸化修饰);
第三接头序列-2:TCCGACT ddT(SEQ ID NO:8,dd表示3’端双脱氧修饰)。
配制如下反应体系(表17),引入第三接头,25℃孵育1小时,65℃孵育10min,后缓慢降温至4℃。
表17
反应完成后,再加入1μL多核苷酸激酶,37℃孵育20min,缓慢降温至4℃。使用1倍体积的Ampure XP beads纯化,用纯水或TE缓冲液洗脱。
16、订制L-Oligo接头:pCATGTAGTGTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:9,p表示5’端磷酸化修饰);配制如下反应体系(表18),引入L-Oligo接头。
表18
组分 |
用量 |
纯水 |
5μL |
L-Oligo接头 |
4μL |
连接缓冲液 |
25μL |
连接酶 |
1μL |
DNA |
40μL |
合计 |
75μL |
反应完成后,使用1.1倍Ampure XP beads纯化回收,用水或TE缓冲液回融。
17、配制如下PCR体系(表19),以扩增DNA产物。
表19
组分 |
用量 |
纯水 |
136.5μL |
PCR缓冲液 |
275μL |
PCR酶 |
11μL |
接头引物-1 |
13.75μL |
接头引物-2 |
13.75μL |
DNA |
100μL |
合计 |
550μL |
将550μL体系平均分成4管,每管110μL进行反应,PCR程序如下(表20)。
表20
注:接头引物-1:5’Bio-TCCTAAGCACGCTTGGCCT(SEQ ID NO:10,Bio表示5’端生物素修饰);接头引物-2:pCATGTAGTGTACGATCCGACTT(SEQ ID NO:11,p表示5’端磷酸化修饰)。
反应完成后,将2管合并一起,使用1.1倍PEG32 beads纯化回收,用水或TE缓冲液回融。并取出进行Qubit检测及电泳。
18、配制如下试剂(表21和表22)进行单链分离:
表21
表22
加入1/3倍体积的4×高盐结合缓冲液于60μL DNA中,加入40μL链霉素标记的磁珠到1×高盐结合缓冲液中,并使用配制后的NaoH溶液进行单链分离,使用1×结合洗脱缓冲液/吐温混合液进行洗涤纯化回收。
19、按照下列体系(表23和24),使用单链环化“桥”序列(第四接头)做搭桥,将分离的单链末端连接起来,形成核酸单链环状文库。
表23
组分 |
用量 |
分离的单链DNA |
58μL |
第四接头 |
2μL |
合计 |
60μL |
75℃孵育5min,缓慢降温至20℃。
其中,第四接头序列:GTACACTACATGTCCTAAGCACGC(SEQ ID NO:12)。
随后配制环化体系(表24),37℃孵育1小时,逐渐降温至4℃。
表24
组分 |
用量 |
纯水 |
2.1μL |
10×TA反应缓冲液 |
7.0μL |
三磷酸腺苷 |
0.7μL |
分离的单链DNA+第四接头 |
60μL |
连接酶 |
0.2μL |
合计 |
70μL |
反应完成后,取出10μL进行电泳检测。
20、然后按照下列体系(表25),进行酶切消化反应,37℃孵育30分钟,缓慢降温至4℃。
表25
组分 |
用量 |
纯水 |
0.35μL |
10×TA反应缓冲液 |
0.35μL |
核酸外切酶1 |
2.1μL |
核酸外切酶3 |
0.7μL |
DNA |
65μL |
合计 |
69.5μL |
反应完成后,使用1.3倍体积的PEG 32 beads纯化回收,用纯水或TE缓冲液回融。
21、检测:取出2μL纯化后的环化单链产物进行电泳检测,结果如图2所示,每个泳道中环化单链产物的浓度均为2ng/μL,图中呈现有环化的单链,由于环较双链或单链跑地慢,因此条带分布会偏上一些。使用Agilent 2100检测纯化后的环化单链产物的结果如图3所示,显示环化单链产物大小在236bp左右,满足环化大小要求,可上机测序。
22、测序:核酸单链环状文库构建完成,在CG测序平台上进行上机测序。测序得到的碱基质量结果如图4所示,图中数据大都在80~90之间,一般在75以上认为是可以接受的,而传统的两端有19bp转座酶识别序列的方法的测序结果该数据一般达不到这样高,甚至只有30~40之间。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 华大基因科技有限公司
<120> 一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂
<130> PIDC3170182PCN
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 尿嘧啶碱基
<222> (4)..(4)
<220>
<221> 尿嘧啶碱基
<222> (14)..(14)
<400> 1
aggtcgccag ccctacagat gtgtataaga gacag 35
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 3'端双脱氧修饰
<222> (19)..(19)
<400> 2
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5'端磷酸化修饰
<222> (1)..(1)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(25)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 3'端双脱氧修饰
<222> (44)..(44)
<400> 3
actgctgagc tgaggannnn nnnnntcgtc aaggtcgcca gccc 44
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 3'端双脱氧修饰
<222> (16)..(16)
<400> 4
tcctcagctc agcagt 16
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 尿嘧啶
<222> (4)..(4)
<220>
<221> 尿嘧啶
<222> (14)..(14)
<400> 5
aggtcgccag ccctacagat gtgtataaga gacag 35
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 尿嘧啶
<222> (5)..(5)
<220>
<221> 尿嘧啶
<222> (14)..(14)
<400> 6
gggctggcga ccttgacga 19
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5'端磷酸化修饰
<222> (1)..(1)
<400> 7
aagtcggagg ccaagcgtgc ttagga 26
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 3'端双脱氧修饰
<222> (8)..(8)
<400> 8
tccgactt 8
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5'端磷酸化修饰
<222> (1)..(1)
<400> 9
catgtagtgt acgatccgac tt 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5'端生物素修饰
<222> (1)..(1)
<400> 10
tcctaagcac gcttggcct 19
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 5'端磷酸化修饰
<222> (1)..(1)
<400> 11
catgtagtgt acgatccgac tt 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtacactaca tgtcctaagc acgc 24