CN108070637A - 一种基于自环放大原理的循环dna预扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明所述的是一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法，此方法主要包括循环DNA自身环化以及改进的环式等温扩增两个步骤。这种预扩增方法大大提高了待检靶标分子数目，从而显著提高检测的灵敏度。此方法可应用于循环DNA，例如血浆游离DNA、血清游离DNA、尿液游离DNA、汗液DNA、唾液DNA以及FFPE切片中所提取的极微量DNA进行下游点突变检测、插入缺失(indel)、融合基因重排(SV)等基因变异方面的多项检测，在患者肿瘤分子分型、临床用药、耐药研究以及肿瘤的全程医疗管理方案中发挥着巨大的作用。

Description

一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法

技术领域

本发明专利涉及一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法，此方法可显著增强循环DNA检测的灵敏度。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的重大疾病。近年来，人口老龄化、环境污染、吸烟等问题日益突出，肿瘤面临的形势极其严峻。随着人类基因组计划的完成，人类基因组序列以及相关基因功能被逐步剖析，肿瘤相关的生物标志物也不断被发现。肿瘤的分型、诊治已不再局限于传统的影像学和组织病理学，肿瘤分子检测逐渐成为分子医学的重要组成部分，分子病理学在肿瘤研究领域的重要作用日益显现，以基因诊断为主导的分子病理分型将成为指导临床个性化治疗的重要手段。

肿瘤基因检测首先要获取病灶的样本。目前，穿刺活检是主要手段，但是部分患者却无法完成穿刺取样的过程，同时也有研究报道穿刺取样有可能会导致并发症的产生以及促进病灶发生转移，同时对于有多处转移病灶的患者穿刺取样也不适用。近几年来，基于分离纯化患者液体样本中的循环DNA的“液态活检”技术为肿瘤患者的活体检查提供了一种全新的方法及模式。循环DNA，广义上包括人体液体样本中的游离DNA，它们主要存在于血浆、血清、尿液、汗液以及唾液等人体液体的环境中。以血浆游离DNA为例，如果分离及纯化技术成熟，那么只需要人体内的一管血，就可以进行实时无创的肿瘤靶向药物敏感突变的检测、耐药机制以及患者的预后监测等研究。但是，由于存在于体液环境中的游离循环DNA的含量非常低，通常1mL血中只有2000个拷贝的基因组DNA。同时，每个患者个体间游离循环DNA的含量也相差很大，有些患者体内循环游离DNA含量相对较多，有些患者循环游离DNA含量极低从而致使目前正在使用的液态活检技术无法检测到这类患者液体标本中的循环DNA。因此，如何提高循环DNA检测灵敏度是目前临床基因检测亟待解决的一大难题。

目前，针对极微量DNA样本的检测，通常使用的方法是预先对待检测模板DNA的含量进行放大，之后再进行相关靶基因的检测。例如，目前热门的研究领域，即单细胞基因分析，往往采用多重转换扩增(MDA、WGA)的方法对样本中的微量DNA进行预扩增。除了MDA方法外，常用来进行预扩增的方法还有滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)以及普通PCR方法进行的预扩增。

MDA是全基因组扩增(WGA)最常用到的方法，它通过随机引物在模板DNA的多处位置起始DNA链置换反应，从而实现DNA含量的放大。因此，模板DNA的长度和完整性会影响MDA的放大效率。DNA链越长，引物启动置换的机会越多，MDA的放大效率也就越高，但往往循环DNA长度仅为200-500bp，因此对MDA方法的放大效率产生了极大影响，从而限制了MDA方法的应用。滚环预扩增方法(RCA)要求DNA模板必须是环状结构才可进行后续的扩增反应，对于直链的DNA这种方法无法完成扩增反应。普通PCR预扩增的方法存在的缺陷是由于普通Taq酶的扩增错配率较高，并且随着扩增循环数的增加，扩增错误会以指数级递增放大而导致后续分析准确率产生极大偏差。

综上所述，目前正在使用的预扩增方法都不适用于循环游离DNA的预扩增，也因此限制了循环游离DNA检测在分子医学中的推广及应用。为了有效提高循环DNA检测灵敏度，非常有必要提供一种用于高效增强循环DNA检测的预扩增的新方法。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种用于增强循环DNA检测的预扩增的新方法，此方法主要涉及到循环DNA自身环化以及改进的环式等温扩增两个步骤。其中，循环DNA的自身环化是基于单链DNA连接酶的作用，将已变性为单链的DNA分子进行自连接。循环DNA由单链DNA及双链DNA混合组成，变性后在单链DNA连接酶的作用下连接成环状DNA，这样可以保证DNA分子的完整性。之后的环式扩增主要是利用加速扩增反应的辅助因子来缩短扩增的孵育时间及增加DNA产量，从而提高循环DNA检测的灵敏度。

本发明的目的之二是利用这种增强检测的预扩增方法，针对循环DNA，包括血浆游离DNA、血清游离DNA、尿液游离DNA、汗液DNA、唾液DNA以及FFPE切片提取所得的极微量DNA，进行点突变检测、indel(插入、缺失)、SV(融合基因、重排)等基因的变异检测，从而为目前液体活检技术所涉及到的肿瘤分子分型、临床用药、耐药研究以及肿瘤的全程医疗管理方案提供强有力的工具。

附图说明

图1微量双链DNA片段中靶基因预扩增后的qPCR检测图

图2微量双链DNA片段预扩增放大后电泳检测图

图3预扩增后对患者血浆cfDNA中基因型进行qPCR的检测图

图4 RRM1预扩增后的测序结果

图5 RRM1测序后与GENEBANK网站上RRM1记载序列的比对结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但它们仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1、实验材料

人工合成的OLIGO及引物、探针由invitrogen完成合成。

2、实验试剂

AMPure XP beads：美国beckmancouler公司

Taqman qPCR supermix:美国Bio-Rad公司

Phi29DNA聚合酶：NEB

Bst DNA聚合酶：NEB

circligaseII酶：美国epicentre

焦磷酸酶：美国Sigma公司

海藻糖：美国Sigma公司

Betaine:美国Sigma公司

3、主要实验仪器

小型台式高速离心机：美国Sigma公司

NanoQ^TM微型分光光度计：博奥生物有限公司

凝胶成像系统：美国Bio-Rad公司

实时荧光定量PCR仪：美国Bio-Rad公司

普通PCR仪：美国Bio-Rad公司

磁力架：美国invitrogen公司

实施例1对微量的双链DNA片段进行预扩增并进行靶基因丰度检测：

实验方法

1、预扩增

在8ng约300bp双链DNA片段中，加入1μL10×CircLigase缓冲液混合物，并加热到95℃2分钟，在冰上冷却5分钟。加入2μL 5M甜菜碱、0.5μL 50mM MnCl₂和0.5μLCircLigaseII。60℃孵育至少12小时。加入2μL环式扩增引物，混合后加热至95℃2分钟，并冷却至37℃。加入5μL10X phi29缓冲液、2μL 25mM dNTP、2μL 50X BSA、2μL 10U/μL Phi29(NEB)、0.5μL焦磷酸酶、3μL海藻糖，补齐至50μL体系。在30℃孵育反应混合物2小时。

2、纯化

通过加入80μL AMPure beads纯化预扩增产物，以去除多余的引物和其它杂质。用20μL洗脱缓冲液并在65℃孵育5分钟后洗脱。纯化后，保存备用。

3、电泳检测

利用凝胶电泳观察预扩增与非预扩增后DNA量的变化。

4、检测靶基因

用等起始量，未进行预扩增的双链DNA片段作为对照。通过qPCR扩增检测预扩增对于靶基因检测灵敏度的提高效果。采用基因特异引物，对预扩增后的模板DNA进行Realtime PCR检测，特异基因引物序列见表1，实验方法如下：

表1特异基因引物序列

进行实时定量PCR检测采用Apexbio公司的HiTaq Univerval qPCR MASTER MIX(目录号：A030201)，每个反应体系设置3个平行对照，特异基因的PCR反应体系组成见表2，PCR扩增条件见表3。

表2PCR反应体系

试剂名称	加入体积
		HiTaq Univerval qPCR MASTERMIX	10μL
Forward primer(10μM)	0.8μL
		Reverse primer(10μM)	0.8μL
DNA模板	3μL
		总量	20μL

表3PCR扩增条件

实验结果

通过实施例1中所述的方法对双链DNA片段进行预扩增，随后进行qPCR靶基因检测。图1结果显示，对DNA进行预扩增后靶基因检测的CT值为11.03，而等起始量的未进行预扩增的DNACT值为31.86，而NTC没有扩增。相比于未进行预扩增的样品，预扩增极大地提高了模板DNA的量，CT值提高了近20。同样，对DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。图2显示，未预扩增的初始DNA(泳道3、4)未能看到，预扩增的DNA含量显著增多(泳道1、2)。所以用本方法对模板DNA进行预扩增后增加了游离DNA的含量，由此提高了检测的灵敏度，显著提高了对于极微量DNA样品的有效检测。

实施例2对肿瘤患者血浆游离DNA预扩增并进行化疗耐药相关基因型检测：

实验方法

1、血浆游离DNA提取采用Qiagen公司的circulating DNA extraction Kit，参照试剂盒说明书进行。

2、预扩增与纯化：参照实施例1的方法进行。

3、检测基因型

用与实施例1相等的DNA起始量，未进行预扩增的双链DNA片段作为对照。通过qPCR扩增检测预扩增对于基因型检测的效果。RRM1C-37A用来指导检测化疗耐药基因检测。RRM1C-37A被认为与吉西他滨的治疗效果相关。基因型为AC的患者，在使用吉西他滨时较为敏感。采用基因特异引物，对预扩增后的模板DNA进行Real time PCR检测，实验方法如下，特异基因引物序列见表4。

表4特异基因引物序列

引物序列	引物名
		CTTGCCCAGACTCAACAT	Seq4
CCAGACAGCACTTTCTTCAG	Seq5
		FAM-TGTGAAGCCTACCCCG-MGB	Seq6
HEX-TCTGTGAAGACTACCCC-MGB	Seq7

进行实时定量PCR检测采用Promega公司的Taqman qPCR MASTERMIX，每个反应体系设置3个平行对照，特异基因的PCR反应体系见表5，PCR扩增条件见表6。

表5PCR反应体系

试剂名称	加入体积
		Taqman qPCR MASTERMIX	10μL
Forward primer(10μM)	0.8μL
		Reverse primer(10μM)	0.8μL
Probe1	0.4μL
		Probe2	0.4μL
血浆DNA溶液	3μL
		总量	20μL

表6PCR扩增条件

实验结果

通过实施例2中所述的方法对血浆中DNA进行预扩增，并进行RRM1基因型检测。图3结果中显示，蓝色曲线代表基因型上对应的碱基为A，绿色曲线代表基因型上对应的碱基为C，其中曲线上标识为三角代表未进行预扩增的DNA，曲线上标识为圆形代表已预扩增的DNA。微量DNA经过预扩增后，基因型AA的灵敏度显著提高，而野生型CC由于自身DNA含量较高，因此本方法的预扩增对其影响不大。

为了进一步检测AA基因型的真实性，我们将预扩增得到的PCR产物进行了测序(invitrogen公司进行测序)。测序AB1结果参见图4，并将测序结果在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站登录后进行序列比对，发现我们预扩增得到的PCR序列的确为RRM1基因的序列，同时基因序列的比对结果也显示覆盖度为100％，ident值为99％，表明此预扩增序列在-37C>A的位点发生了突变(图5)。

Claims (10)

1.一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于以下步骤：

A、将循环DNA变性成单链DNA并置于冰上；

B、利用特定的环化酶将单链DNA自身环化；

C、将环化的DNA进行新型环式等温扩增并纯化；

D、纯化所得到的环式扩增产物进行后续检测。

3.按照权利要求1所述的一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法适用于核苷酸数量为100～500nt范围内的DNA片段，包括血浆游离DNA、血清游离DNA、尿液游离DNA、汗液DNA、唾液DNA以及FFPE切片提取所得到的DNA。

4.按照权利要求2所述的方法，一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法步骤A所述的循环DNA包括所有双链及单链循环DNA。

5.按照权利要求2所述的一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法中步骤B所述的自身环化过程采用Circligase II连接酶。

6.按照权利要求2所述的方法，一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法中步骤C所述的扩增引物为单条或多条引物的混合物。其中，引物部分由随机引物组成。

7.按照权利要求2所述的方法，一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法中步骤C所述的扩增过程过程为等温扩增过程。此等温扩增过程所用的聚合酶分别为phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶及Bst DNA聚合酶混合物。

8.按照权利要求2所述的方法，一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法中步骤C所述的扩增过程中在扩增反应液中加入加速扩增反应的酶及辅助因子。

9.按照权利要求2所述的方法，一种基于自环放大原理的循环DNA预扩增方法中步骤C所述的纯化方法为使用AM Pure XP磁珠法对扩增得到的DNA进行纯化。

10.按照权利要求2所述的方法所得到的循环DNA可应用于DNA的点突变检测、核苷酸的插入及缺失检测(indel)、基因融合及重排检测(SV)等基因变异患者的检测及筛查。