WO2014008635A1 - 片断dna检测方法、片断dna检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

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Abstract

本发明公开了一种片断DNA检测方法、片断DNA检测试剂盒及其应用。其中，该方法包括以下步骤：根据片断DNA的待检位点或待检区域设计引物；将片断DNA进行环化，得到环化DNA；利用引物对环化DNA进行PCR扩增；以及对PCR扩增的产物进行检测。本发明中，将片断DNA进行环化后，仅有一条PCR引物能够与模板匹配就可以进行扩增。

Description

片断 DNA检测方法、 片断 DNA检测试剂盒及其应用 技术领域 本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种片断 DNA检测方法、片断 DNA 检测试剂盒及其应用。 背景技术 科研人员在进行分子生物学研究时，需从各种不同的组织标本中提取 DNA。其中， 体液中含有片断化的 DNA，对片断化的 DNA进行检测是分子生物学研究的重要步骤。 例如血浆 DNA，又称循环 DNA，是血液中的细胞外 DNA，长约几十到几百核苷酸（主 峰约 167bp)， 可以以 DNA-蛋白质复合物的形式存在， 也可以是游离的 DNA片段。 血浆 DNA来源于少量衰老死亡细胞的 DNA释放。 血浆 DNA的生成与清除处于动态 平衡状态， 维持在较恒定的低水平， lmL血浆约含有 2000个基因组 DNA的量， 含量 极低， 以致于采用现有技术中的 PCR技术检测不到其基因信息。 另外， 新鲜组织标本来源有限， FFPE方法解决了新鲜组织难与长久保存的难题， 但在 FFPE组织标本的制备和贮存过程中， 组织经福尔马林固定、 石蜡包埋后很容易 引起 DNA 的交联和片断化为 100bp-3000bp 片断， 科研人员很难获得足量高质量的 DNA样本用于高敏度的检测。 目前， 世界上有大量样本是使用 FFPE方法处理的， 而 这些组织样本已经成为科学研究最为常见的生物学资源之一。 传统检测片断 DNA是否存在碱基突变或其他变异的方法主要通过对要检测的特 定区域进行 PCR放大然后进行检测。 传统的 PCR技术通常是采用一对跨越目标区两 侧的引物， 以 DNA为模板在体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法， 由高温变性、 低温退火 （复性） 及适温延伸等几步反应组成一个周期， 循环进行， 使目标 DNA得 以迅速扩增， 具有特异性强、 灵敏度高、 操作简便、 省时等特点。 广泛应用于基因分 离、 克隆和核酸序列分析等基础研究， 以及疾病的诊断。 但 PCR技术要求一对引物间 的 DNA模板不能存在断裂点， 这为片断化严重的 DNA模板带来了很大挑战。 因为， 传统 PCR扩增要求被放大的区域保持完整， 所以传统的方法对片断 DNA的检测灵敏 度很低， 限制其在检测片段 DNA样品中的应用。 发明内容 本发明旨在提供一种片断 DNA检测方法、 片断 DNA检测试剂盒及其应用， 以解 决现有技术中片断 DNA检测灵敏度低的技术问题。 为了实现上述目的， 根据本发明的一个方面， 提供了一种片断 DNA检测方法。 该方法包括以下步骤： 根据片断 DNA的待检位点或待检区域设计引物； 将片断 DNA 进行环化， 得到环化 DNA; 利用引物对环化 DNA进行 PCR扩增； 以及对 PCR扩增 的产物进行检测。 进一步地， 引物是一对相邻且背向延伸的引物对。 进一步地， 背向延伸的引物对中的引物均位于片断 DNA的待检位点或待检区域 的 5'端或 3'端。 进一步地， 背向延伸的引物对之间间隔片断 DNA总碱基对的 0~1/2。 进一步地， 背向延伸的弓 I物对之间间隔 0~50对碱基对。 进一步地， 背向延伸的引物对之间间隔 0~10对碱基对。
进一步地， 引物为一条引物。 进一步地， 在对片断 DNA进行环化之前， 进一步包括对片断 DNA进行预扩增的
进一步地， 环化采用的是 CircLigase介导的双链 DNA环化。 进一步地， 片段 DNA包括血浆游离 DNA、 尿液游离 DNA、 汗液游离 DNA、 唾 液游离 DNA或福尔马林固定石蜡包埋组织提取的 DNA。 进一步地， 片断 DNA的待检测位点或待检区域具有插入、 缺失、 替换或基因融 合突变。 根据本发明的另一个方面，提供一种片断 DNA检测试剂盒。该试剂盒包括： DNA 提取试剂、 DNA环化酶、 目标 DNA扩增引物及扩增试剂。 进一步地， 该试剂盒包括： 目标 DNA预扩增引物及预扩增试剂。 进一步地， 目标 DNA扩增弓 I物是一对相邻且背向延伸的弓 I物对。 进一步地， 背向延伸的引物对中的引物均位于片断 DNA的待检位点或待检区域 的 5'端或 3'端。 进—步地， 背向延伸的引物对之间间隔到 1/2片断 DNA的碱基对。 进—步地， 背向延伸的弓 1物对之间间隔 0~50对碱基。 进—步地， 背向延伸的引物对之间间隔 0~10对碱基。 进—步地， 背向延伸的引物 5'端部分碱基重叠。 进—步地， 目标扩增引物为一条引物。 进—步地， 片断 DNA的待检测位点或待检区域具有插入、 缺失、 替换或基因融 合突变。 根据本发明的另一个方面， 提供一种上述片断 DNA检测试剂盒在检测癌症、 先 天性单基因遗传病、 染色体变异疾病、 传染病中的应用。 根据本发明的再一个方面， 提供一种上述片断 DNA检测试剂盒在体外检测 DNA 突变中的应用。 传统检测片断 DNA的方法主要通过对待检测区域进行 PCR放大然后进行检测。 因为 PCR的引物是设在待检测区域的两侧， 因此， 要求待检测区域保持完整， 而由于 片断 DNA是随机断裂产生的， 大多数片断 DNA的待检测区域并不完整， 因此， 能作 为扩增模板使用的片断 DNA数量极少， PCR很难检测到。 而本发明中， 首先将片断 DNA进行环化， 甚至只有一条 PCR引物能够与模板匹配都可以进行扩增， 因此极大 的增加了引物扩增的适应范围、 有效模板量， 也就使片断 DNA的检测灵敏度得到极 大的提高。 附图说明 说明书附图用来提供对本发明的进一步理解， 构成本发明的一部分， 本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。 在附图中： 图 1示出了本发明的设计原理; 图 2示出了本发明针对突变位点的检测原理; 图 3示出了本发明针对基因融合的检测原理; 图 4示出了本发明重复次数检测或短串联重复序列 （STR) 检测原理; 图 5示出了根据本发明实施例的片断 DNA检测方法流程图； 图 6示出了本发明实施例 1的 PCR扩增产物的凝胶检测结果； 图 7示出了本发明实施例 1的切胶回收 200bp目标条带的凝胶检测结果； 图 8示出了本发明实施例 1 cyclib3高通量测序分析结果； 以及 图 9示出了本发明实施例 1 cyclib4高通量测序分析结果。 具体实施方式 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本发明中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。 本发明中所称的"片断 DNA"是指生物基因组的 DNA随机断裂后形成的长度大约 在 20~2000bp的短片段 DNA。 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种片断 DNA检测方法， 包括以下步骤: 1 )根据片断 DNA的待检位点或待检区域设计引物； 2)将片断 DNA进行环化， 得到 环化 DNA; 3 ) 利用引物对环化 DNA进行 PCR扩增； 4) 对 PCR扩增的产物进行检 测。 传统检测片断 DNA的方法主要通过对待检测区域进行 PCR放大然后进行检测。 因为 PCR的引物是设在待检测区域的两侧， 因此， 要求待检测区域保持完整， 而由于 片断 DNA是随机断裂产生的， 大多数片断 DNA的待检测区域并不完整， 因此， 能作 为扩增模板使用的片断 DNA数量极少， PCR很难检测到。 而本发明中， 首先将片断 DNA进行环化， 甚至只有一条 PCR引物能够与模板匹配都可以进行扩增， 因此极大 的增加了引物扩增的适应范围、 有效模板量， 也就使片断 DNA的检测灵敏度得到极 大的提高。 根据本发明一种典型的实施方式， 本发明中的引物是一对相邻且背向延伸的引物 对。 图 1示出了本发明设计原理； 假设基因组均匀断裂， a为传统引物， 可利用的模 板为实线间无断点的 DNA片断， b 为本发明引物， 可利用的模板为虚线间无断点的 DNA片断， 由此可见， 本发明设计的引物可利用的模板数目远高于传统方法。 图 2示出了针对突变位点检测原理。 左侧为含有特异性背靠背引物的 DNA片断， 其两端方框所示为预扩增引物退火区， 斜线方框所示单核苷酸多态性 （S P) 位点、 插入 /缺失突变点， 黑色框为待检区域。 因 DNA片断断裂点位置不同， 背靠背引物、 单核苷酸多态性 （S P)位点、 插入 /缺失突变点在 DNA片断的 （左侧、 中间、 右侧） 位置会有变化， 待检框区域大小也会相应变化， 但它们间的相对位置不变。 中间为对 应 DNA片断环化产物示意。 右侧为对应 DNA片断开环后的 PCR产物示意。 该方法 可以利用所有含有特异性背靠背引物的 DNA片断为模板， 高于传统 PCR。 图 3示出了针对基因融合的检测原理。 左侧为含有特异性背靠背引物的 DNA片 断， 其两端方框所示为预扩增引物退火区， 在背靠背引物的下游存在基因融合 （黑白 不同的两个区域）。 因 DNA片断断裂点位置不同， 融合点在 DNA片断的 （左侧、 中 间、 右侧） 位置会有变化， 但相对背靠背引物距离不变。 右侧为对应 DNA片断开环 后的 PCR产物示意。该方法可以利用所有含有特异性背靠背引物的 DNA片断为模板， 高于传统 PCR。 图 4示出了本发明重复次数检测或短串联重复序列 （STR) 检测原理。 左侧为含 有特异性背靠背引物的 DNA片断， 其两端方框所示为预扩增引物退火区， 重复区在 背靠背引物的下游。 因 DNA片断断裂点位置不同， DNA片断含有的重复次数会有变 化， 但通过检测重复区及两侧序列可以判断出重复次数。 右侧为对应 DNA片断开环 后的 PCR产物示意。 综上， 上述情况均因为本发明方案中可用的 DNA模板高于传统 PCR， 从而提高 了检测的灵敏度。 优选地，背向延伸的引物对中的引物均位于片断 DNA的待检位点或待检区域的 5' 端或 3'端。 根据片断 DNA的待检测区域及片断 DNA的长度，背向延伸的引物对之间的间隔 可以是片断 DNA总碱基对的 0~1/2。片断 DNA环化后， 因为 1/2环周长（碱基对数） 时可利用的模板数与扩增产物长度为 1/2环周长的传统 PCR相当， 小于 1/2环周长时 可利用模板数远大于传统 PCR， 因此， 背向延伸的引物对之间的间隔越小， 可利用的 DNA片断模板越多， 检测的灵敏度越高。 优选地， 背向延伸的引物对之间间隔 0-50 对碱基。 进一步优选地， 优选地， 背向延伸的引物对之间间隔 0-10对碱基。 本发明中， 背向延伸的引物 5'端可以有部分碱基重叠。 根据本发明一种典型的实 施方式， 引物可以为一条引物。 背靠背引物对中正向引物指靠近检测点的引物。 当只 有一条引物时， 扩增由指数级扩增转换为线性级扩增， 扩增产物长短不一， 但都含有 检测位点， 因此， 也可以用于 PCR检测。 根据片断 DNA 的量， 如果量过少， 也可以步骤 1 ) 和步骤 2) 之间加入对片断 DNA进行预扩增的步骤。图 5示出了根据本发明实施例的片断 DNA检测方法流程图； 当 DNA片断量不足时需对 DNA片断进行预扩增， 将扩增产物 /片断 DNA环化， 利用 背靠背特异性引物对检测区扩增， 然后对扩增产物检测， 包括高通量测序、 qPCR等， 但不局限于此。 其中， 此预扩增可以采用在片断 DNA两端连接上接头或全基因组扩 增的的方法进行。 本发明中片断 DNA的环化可以采用现有技术中的任意环化技术， 优选地， 环化 采用的是 CircLigase 介导的双链 DNA 环化， 因为， 可以高效的自身环化单 /双链 DNA/RNA, 关于单链 DNA/RNA 的环化产物说明中有相应介绍， 实验中发现其对双 链 DNA/RNA的也具有高效的自身环化作用。 本发明中采用的 CircLigase是 epicentre 公司的产品， 产品编号为 CL9025K, 详见 http://www.epibio.com/item.asp?ID=547) 本发明的方法可以用来检测片断 DNA，其中，检测片断 DNA的长度为 100~1000bp 时优势明显。 本发明的方法可以用来检测的片断 DNA是体液游离 DNA。 其中， 体液 游离 DNA包括血浆游离 DNA、尿液游离 DNA、汗液游离 DNA、唾液游离 DNA或福 尔马林固定石蜡包埋组织提取的 DNA。 血浆游离 DNA包括但不限于癌症病人血浆游 离 DNA、 或孕妇血浆游离 DNA。 本发明中的检测方法可以用于检测包含突变的片断 DNA， 该突变可以是纯合突 变、 杂合突变； 可以是碱基缺失、 碱基插入、 碱基替换； 也可以用于检测体细胞突变 ( somatic mutation) 即突变点的数量变异； 也可以是基因融合； 也可以是碱基序列的 重复并以此方法检测出重复的次数。 根据本发明一种典型的实施方式， 提供一种片断 DNA检测试剂盒。 包括： DNA 提取试剂、 DNA环化酶、 目标 DNA扩增引物及扩增试剂。 优选地， 进一步包括： 目 标 DNA预扩增引物及扩增试剂。优选地， 目标 DNA扩增引物是一对相邻且背向延伸 的引物对。 优选地， 背向延伸的引物对中的引物均位于片断 DNA的待检位点或待检 区域的 5'端或 3'端。 优选地， 背向延伸的引物对之间间隔 0到 1/2所述片断 DNA的 碱基对。 优选地， 背向延伸的引物对之间间隔 0-50对碱基。 优选地， 背向延伸的引物 对之间间隔 0-10对碱基。 优选地， 背向延伸的引物 5'端部分碱基重叠。 根据本发明一 种典型的实施方式， 目标扩增引物为一条正向引物， 背靠背引物对中正向引物指靠近 检测点的引物。 下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果， 下列实施例中的实验条件也可 以通过本领域的常规手段实现。 以下实施例中所用的试剂均可以包含在本发明的试剂 盒当中。 本发明实施例 1和 2中采用的 CircLigase是 epicentre公司的产品， 产品编号为 CL9025K, 详见 http://www.epibio.com/item.asp?ID=547)， 其他没有标注的试剂均为市 售试剂。 实施例 1
1. 接头设计， 需退火为双链 ssCycADT-1 (SEQIDNO: 1)： GTCTCATCCCTGCGTGT ssCycADT-2 (SEQIDNO: 2)： pCACGCAGGGTACGTGT 连接产物结构：
Top: GTCTCATCCCTGCGTGT ( SEQ ID NO: 3 ) NN pCACGCAGGGTACGTGT (SEQIDNO: 4)
Bottom: TGTGCATGGGACGCACp ( SEQ ID NO: 5) NNN TGTGCGTCCCTACTCTG (SEQIDNO: 6) 引物： ssCycUniprimer-F (SEQIDNO: 7) ： pGTCTCATCCCTGCGTGT ssCycUniprimer-R (SEQIDNO: 8) ： pACACGTACCCTGCGTGT 预扩增后文库结构： pGTCTCATCCCTGCGTGT ( SEQ ID NO: 9) NNN ACACGCAGGGTACGTGT
(SEQIDNO: 10)
CAGAGTAGGGACGCACA ( SEQ ID NO ： 11 ) NNN TGTGCGTCCCATGCACAp (SEQIDNO: 12) 背靠背目标区扩增引物， 针对 EGFR外显子 18。 EGFR外显子 18的序列如下 （SEQIDNO: 13)： TTCGGCACGGTGTATAAG
Figure imgf000010_0001
特异性背靠背引物：
F-l (SEQIDNO: 15) ： GCTGAGGTGACCCTTGTCTC
R-l (SEQIDNO: 16) ： CCTCACCATGCTGGAAAGC
2. 取 ImL正常人血浆抽提血浆游离 DNA。
3. 末端补平
制备表 1中的反应混合液：
表 1
Figure imgf000010_0002
在 20°C温浴 30分钟；
在纯化柱上纯化 DNA样品， 并在 42μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。 在 DNA片段的 3'末端加多聚腺嘌吟尾。
制备表 2中的反应混合液： 表 2
Figure imgf000011_0001
在 37°C温浴 30分钟；
在柱上纯化 DNA样品， 并在 25μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。
为 DNA片段连接接头。
制备表 3中的反应混合液
表 3
Figure imgf000011_0002
在 20°C温浴 15分钟。
在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。 通过 PCR预扩增富集接头修饰的 DNA片段。
制备表 4中的 PCR反应混合液：
表 4
Figure imgf000011_0003
用如下的 PCR实验方案进行扩增:
a. 98 °C 30秒； b. 18个如下的循环:
98 °C 10秒， 65V 30秒， 72°C 30秒； c.72 V 5 分钟； d. 保持在 4°C。 将 PCR产物置于 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳， 结果见图 6所示， 其中， 对样品 cyclib3、 cyclib4预扩增后切 2%琼脂糖胶纯化， 左为切胶前， 右为切胶后， 目标条带 大小与预期相符。 然后采用 Qiagnenkit切胶回〜 200bp目标条带 （图 7)， 洗脱于 20 μΐ 的洗脱缓冲液中。 环化反应 配制环化体系 （表 5): 表 5
Figure imgf000012_0001
反应条件如表 6: 表 6:
Figure imgf000012_0002
酶切消化 将所有的环化产物分别用 Exo III消化: Exo III的消化体系为 （表 7): 表 7
Figure imgf000012_0003
将以上消化体系置于 PCR仪中， 37 °C反应 3 Omin。 反应结束后将消化产物进行过柱纯化， 溶于 30ul EB， Qubit (Invitrogen公司） 浓度， 结果如下 （表 8 ): 表 8
Figure imgf000013_0001
背靠背引物针对目标区筛选 配制 PCR反应体系 （表 9) 表 9
Figure imgf000013_0002
备注： 对照分别为 positive (只加引物不加模板）和 negative (模板为未环化的 ssCyc Lib)。 PCR反应条件 （表 10) 表 10
Figure imgf000013_0003
将上步 PCR产物制作为 Illumina高通量测序的文库， 取 10 uL文库置于 2%的琼 脂糖凝胶上进行电泳， 结果如下图所示： 将剩余的 40uL文库产物用 QIAGEN柱子进行纯化后， 即为最终上机文库。 将制作好的文库质控后， Illumina公司 Hiseq 2000进行 100bp双端测序。 将高通量测序序列进行 blast检索， 计算基因组覆盖， 用于评估文库特异性。 截取 背靠背引物上下游 200bp区域， 图 8示出了本发明实施例 1 cyclib3高通量测序分析结 果， 图 9示出了本发明实施例 l cyclib4高通量测序分析结果， 数据结果如表 11所示。 表 11
Figure imgf000014_0001
本发明实施例采用的是 CircLigase (Epicenter公司） 对双链进行环化， 但环化步 骤并不局限于此， 如 T4 DNA连接酶介导的末端连接、 接头介导的连接， 位点特异 性重组， cre-loxp环化系统。本发明实施例采用的是设计紧临的背靠背引物对对突变点 进行富集筛选， 但富集筛选步骤并不局限于此， 如特异引物介导的滚环扩增。 实施例 1中所采用的本发明的片断 DNA检测试剂盒包括： 上述 DNA提取试剂、 预扩增试剂、 DNA环化酶、 目标 DNA扩增引物及扩增试 剂及相应的装置。 其中， 片段 DNA提取试剂主要针对血浆游离 DNA、 尿液游离 DNA、 汗液游离 DNA、 唾液游离 DNA或福尔马林固定石蜡包埋组织提取方法。 提取出的片段 DNA含量较低时， 需进行预扩增处理。 可通过通用接头连接介导 的 PCR扩增， 全基因组扩增、 转录介导的扩增。
DNA环化可通过 CircLigase作用单 /双链 DNA T4 DNA连接酶介导的末端连接， cre-loxp环化系统、 In-fUsion (takara) 等介导的重组环化。 预扩增试剂主要包括 DNA聚合酶及相应缓冲液、 全基因组扩增试剂。 扩增试剂主要包括 DNA聚合酶及相应缓冲液。 主要试剂包括： 血浆 DNA溶液、 T4DNA磷酸化缓冲液 （10x)、 lOmMdNTP混 合液、 T4DNA聚合酶、 T4DNA磷酸化酶、 Klenow酶、 Klenow反应缓冲液（10χ)、 dATP溶液、 klenowex- (3'-5'外切活性缺失）、 快速连接反应缓冲液（5χ)、 Υ形 DNA 双链接头、 快速 T4DNA连接酶（ EB)、 Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶 混合物）、 预扩增引物、 超纯水、 CircLigasell lOx反应缓冲液、 50 mM 氯化锰、 5M 甜菜碱 (优选)、 CircLigase II 单链 DNA连接酶、 10x NEBufFer 1、Exo III、 AmpliTaq Gold 360 Master Mix (2><)、 实施例 1中所提到的背靠背扩增引物。 实施例 2
1. 接头设计， 需退火为双链 ssCycADT-1 (SEQIDNO: 1) ： GTCTCATCCCTGCGTGT ssCycADT-2 (SEQIDNO: 2)： pCACGCAGGGTACGTGT 连接产物结构：
Top: GTCTCATCCCTGCGTGT ( SEQ ID NO ： 3 ) NN pCACGCAGGGTACGTGT (SEQIDNO: 4) Bottom: TGTGCATGGGACGCACp ( SEQ ID NO ： 5 ) NNN
TGTGCGTCCCTACTCTG (SEQIDNO: 6) 引物： ssCycUniprimer-F (SEQIDNO: 7) ： pGTCTCATCCCTGCGTGT ssCycUniprimer-R (SEQIDNO: 8) ： pACACGTACCCTGCGTGT 预扩增后文库结构： pGTCTCATCCCTGCGTGT ( SEQ ID NO: 9) NNN AC ACGC AGGGTACGTGT (SEQIDNO: 10)
CAGAGTAGGGACGCACA ( SEQ ID NO ： 11 ) NNN TGTGCGTCCCATGCACAp (SEQIDNO: 12) 背靠背目标区扩增引物， 针对人 kit基因外显子 9， 其中， kit基因外显子 9的序 列为 （SEQIDNO: 21)： TAGCCTATATTTAACTTTGCATTTAAAGGTAACAACAAAG
KIT基因外显子 9序列及其上下游内含子序列 （SEQIDNO: 22)
Figure imgf000016_0001
AGCCTATATTTAACTTTGCATTTAAA
Figure imgf000016_0002
GTAATACATGCATCACACCATACTGTCATCAAACTCACTA
该样品含本区域含有体细胞突变， 突变点为 GCCTAT的重复插入。
F-l (SEQIDNO: 23) ： AACGATGTGGGCAAGACTTCTGC
R-l (SEQIDNO: 24) ： AAGCCTTACATTCAACCGTGCCA
2. 取 lmL正常人血浆抽提血浆游离 DNA。
3. 末端补平
制备表 12中的反应混合液
表 12
Figure imgf000016_0003
在 20°C温浴 30分钟; 在纯化柱上纯化 DNA样品， 并在 42μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。
在 DNA片段的 3'末端加多聚腺嘌吟尾。
制备表 13中的反应混合液
表 13
Figure imgf000017_0001
在 37°C温浴 30分钟；
在柱上纯化 DNA样品， 并在 25μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。
为 DNA片段连接接头。
制备表 14中的反应混合液： 表 14
Figure imgf000017_0002
在 20°C温浴 15分钟。
在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25μ1的无菌 dH20或洗脱缓冲液中洗脱。 通过 PCR预扩增富集接头修饰的 DNA片段。
制备表 15中的 PCR反应混合液： 表 15
Figure imgf000018_0001
用如下的 PCR实验方案进行扩增： a. 98 °C 30秒； b. 18个如下的循环：
98 °C 10秒， 65°C 30秒， 72°C 30秒； c 72 °C 5 分钟； d. 保持在 4°C。 将 PCR产物置于 2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后采用 Qiagnen kit切胶回〜 200bp 目标条带， 洗脱于 20 μΐ的洗脱缓冲液中。 环化反应 配制环化体系 （表 16): 表 16
Figure imgf000018_0002
反应条件 （表 17) 60 °C lh
80 °C lOmin
4°C 保温
酶切消化
将所有的环化产物分别用 Exo III消化: Exo III的消化体系为 （表 18 ): 表 18
Figure imgf000019_0001
将以上消化体系置于 PCR仪中， 37 °C反应 3 Omin。
反应结束后将消化产物进行过柱纯化， 溶于 30ul EB。
背靠背引物针对目标区筛选
配制 PCR反应体系 （表 19) 表 19
Figure imgf000019_0002
备注：
对照分别为 P (只加引物不加模板） 和 N (模板为未环化的 ssCyC Lib)。 PCR反应条件 （表 20) 表 20
Figure imgf000019_0003
17 将上步 PCR产物制作为 Illumina高通量测序的文库， 取 10 uL置于 2%的琼脂糖 凝胶上进行电泳： 将剩余的 40uL文库用 QIAGEN柱子进行纯化后即为最终上机文库。 将制作好的文库质控后， Illumina Hiseq 2000进行 36bp单端测序。 检测结果见表 21 表 21
Figure imgf000020_0001
实施例 2中所采用的本发明的片断 DNA检测试剂盒包括: 上述 DNA提取试剂、 预扩增试剂、 DNA环化酶、 目标 DNA扩增引物及扩增试 剂及相应的装置。 其中， 片段 DNA提取试剂主要针对血浆游离 DNA、 尿液游离 DNA、 汗液游离
DNA、 唾液游离 DNA或福尔马林固定石蜡包埋组织提取方法。 提取出的片段 DNA含量较低时， 需进行预扩增处理。 可通过通用接头连接介导 的 PCR扩增， 全基因组扩增、 转录介导的扩增。
DNA环化可通过 CircLigase作用单 /双链 DNA， T4 DNA连接酶介导的末端连接， cre-loxp环化系统、 In-fUsion (takara) 等介导的重组环化。 预扩增试剂主要包括 DNA聚合酶及相应缓冲液、 全基因组扩增试剂。 扩增试剂主要包括 DNA聚合酶及相应缓冲液。 主要试剂包括： 血浆 DNA溶液、 T4 DNA磷酸化缓冲液 （10x)、 lO mM dNTP混 合液、 T4 DNA聚合酶、 T4 DNA磷酸化酶、 Klenow酶、 Klenow反应缓冲液（10χ )、 dATP溶液、 klenow ex- (3'-5'外切活性缺失）、 快速连接反应缓冲液（5χ )、 Υ形 DNA 双链接头、 快速 T4 DNA连接酶（ EB)、 Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶 混合物）、 预扩增引物、 超纯水、 CircLigase II 1 Οχ反应缓冲液、 50 mM 氯化锰、 5 M 甜菜碱 (优选)、 CircLigase II 单链 DNA连接酶、 10x NEBufFer 1、Exo III、 AmpliTaq Gold 360 Master Mix (2x )、 实施例 2中提到的背靠背扩增引物。 从实施例 1和 2的实验结果可以看出，采用本发明的方法及试剂盒采用血浆 DNA 溶液就可以检测到目标片段 DNA， 而这是现有技术中的 PCR不能直接检测到的。 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的 任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

权 利 要 求 书 一种片断 DNA检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤：
根据片断 DNA的待检位点或待检区域设计引物；
将所述片断 DNA进行环化， 得到环化 DNA;
利用所述引物对所述环化 DNA进行 PCR扩增； 以及
对所述 PCR扩增的产物进行检测。 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述引物是一对相邻且背向延伸的 引物对。 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述背向延伸的引物对中的引物均 位于所述片断 DNA的待检位点或待检区域的 5'端或 3'端。 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述背向延伸的引物对之间间隔所 述片断 DNA总碱基对的 0 1/2。 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔 0~50 对碱基对。 根据权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述背向延伸的引物对之间间隔 0~10 对碱基对。 根据权利要求 2所述的方法， 其特征在于， 所述背向延伸的引物 5'端部分碱基 重叠。 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述引物为一条引物。 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 在对所述片断 DNA进行环化之前， 进一步包括对所述片断 DNA进行预扩增的步骤。 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述环化采用的是 CircLigase介导 的双链 DNA环化。
11. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述片段 DNA包括血浆游离 DNA、 尿液游离 DNA、汗液游离 DNA、唾液游离 DNA或福尔马林固定石蜡包埋组织 提取的 DNA。
12. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述片断 DNA的待检测位点或待 检区域具有插入、 缺失、 替换或基因融合突变。
13. 一种片断 DNA检测试剂盒，其特征在于，包括： DNA提取试剂、 DNA环化酶、 目标 DNA扩增弓 I物及扩增试剂。
14. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 进一步包括： 目 标 DNA预扩增弓 I物及预扩增试剂。
15. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述目标 DNA 扩增引物是一对相邻且背向延伸的引物对。
16. 根据权利要求 15所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述背向延伸的 弓 I物对中的引物均位于所述片断 DNA的待检位点或待检区域的 5'端或 3'端。
17. 根据权利要求 16所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述背向延伸的 引物对之间间隔所述片断 DNA总碱基对的 0~ 1/2。
18. 根据权利要求 17所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述背向延伸的 弓 I物对之间间隔 0~50对碱基。
19. 根据权利要求 18所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述背向延伸的 弓 I物对之间间隔 o~ 10对碱基。
20. 根据权利要求 15所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述背向延伸的 引物 5'端部分碱基重叠。
21. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述目标扩增引 物为一条引物。
22. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒， 其特征在于， 所述片断 DNA 的待检测位点或待检区域具有插入、 缺失、 替换或基因融合突变。
23. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒在检测癌症、先天性单基因遗传 病、 染色体变异疾病、 传染病中的应用。
4. 根据权利要求 13所述的片断 DNA检测试剂盒在体外检测 DNA突变中的应用
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