CN113088567A - 一种长片段dna分子结构柔性的表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。本发明利用小分子DNA环化效率与其结构柔性正相关的特点，将长片段DNA分子随机打断为短片段DNA后进行环化反应，通过测定其环化效率来对其结构柔性进行判定，进而对长片段DNA结构柔性进行表征。该方法完全摆脱了原子力显微镜的依赖，可以实现快速、高通量的测定，同时有效表征长片段DNA分子结构柔性，结果能够满足科学研究和技术优化等工作需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。
背景技术
在真核细胞内，DNA深度折叠压缩同组蛋白组成核小体，并形成染色体。DNA的这种特性使其成为一种非常理想的数据存储介质，以指导所有已知生物和许多病毒的生长、发育和繁殖。DNA分子的结构柔性直接影响了DNA分子和染色质的可折叠性，进而影响了染色质空间结构的形成和变化特征。染色质空间结构及其变化模式在基因的表达和调控上发挥了非常重要的作用，染色质的空间折叠可在空间上拉近启动子和增强子，使得基因表达得以更高效的调控。此外，由于DNA双螺旋分子处于高度动态的状态中，许多重要的生物过程都涉及DNA分子的弯曲和折叠，比如DNA复制、RNA转录以及其他蛋白与DNA分子的互作等，因此DNA分子的结构柔性对许多生物学功能的行使都至关重要。
目前，为了测定DNA分子结构柔性，人们用到了各种不同的表征方法，除了采用原子力显微镜进行扯拉观察和测量(Faas et al.2009；Mazur and Maaloum.2014)，人们也利用DNA分子的环化效率对DNA分子结构柔性进行表征(Du et al.2005)。原子力显微镜通常用于对长片段DNA分子结构柔性进行测定，而DNA分子的环化则应用于短片段DNA分子的测定，一般采用荧光能量共振转移FRET的方式测量。
原子力显微镜法通常过程繁琐，时间和经济成本均较高，且需要专用设备。而在大部分的科学研究和技术优化等工作中，我们仅需要对DNA分子的结构柔性的相对值进行测定和比较，DNA分子环化效率的测定就可以满足这一需求，但是现有的方法存在两个主要的限制：(1)仅对短片段DNA分子有效；(2)测定方法涉及凝胶电泳或荧光共振能量转移显微镜技术等，过程繁琐，对设备要求高。因此，开发快速、简便的DNA分子柔性表征方法可以更大地促进相关工作的进展。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。本发明所述方法将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA后进行环化反应，通过荧光定量聚合酶链式扩增(RT-PCR)计算短片段DNA分子环化效率，继而表征长片段DNA分子结构柔性。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的短片段DNA分子的两端分别连接接头序列；
(3)将步骤(2)得到的带有接头的DNA分子进行限制性内切酶酶切，产生黏性末端；
(4)使用连接酶对步骤(3)得到的带有黏性末端的DNA分子进行环化连接；
(5)根据步骤(2)得到的短片段DNA分子中的接头序列设计相向延伸引物对和背向延伸引物对，采用相向延伸引物对和背向延伸引物对分别对步骤(4)得到的DNA分子进行荧光定量PCR，得到背向延伸引物对荧光定量结果和相向延伸引物对定量结果；
(6)计算步骤(4)得到的DNA分子环化效率，通过步骤(4)得到的DNA分子环化效率来表征长片段DNA分子结构柔性，DNA分子环化效率为步骤(5)得到的背向延伸引物对荧光定量结果与相向延伸引物对定量结果之比，如计算得到的DNA分子环化效率越高，则长片段DNA分子结构柔性越高。
优选地，所述步骤(1)中长片段DNA分子长度为1000～2100bp。
优选地，所述步骤(1)中片段化方法为酶切法或物理方法。
优选地，所述酶切法包括非特异的限制性内切酶剪切法，所述物理方法包括超声波法、喷雾法和水动力剪切法。
优选地，所述步骤(1)中短片段DNA长度为50～100bp。
优选地，所述步骤(1)中将短片段DNA分子末端补平。
优选地，所述末端补平采用T4 DNA聚合物(T4 DNA polymerase)、Taq酶或Klenow片段(Klenow Fragment)进行。
优选地，所述步骤(1)中将短片段DNA分子回收后稀释至0.05-0.15pmol/ml。
优选地，所述接头序列包括5’端接头和3’端接头，所述5’端接头的序列如SEQ IDNO:7所示，所述3’端接头的序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述步骤(5)中连接酶为T4连接酶(T4 ligase)。
优选地，所述步骤(5)中环化反应时间为5-10分钟。
优选地，所述步骤(6)中相向延伸引物对包括如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的序列，背向延伸引物对包括如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列。所述相向延伸引物对是指扩增线性短片段DNA分子时引物之间相向延伸的引物对。所述背向延伸引物对是指扩增线性短片段DNA分子时引物之间背向延伸的引物对。
有益效果：
本发明提供了一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法。该方法利用小分子DNA环化效率与其结构柔性正相关的特点，将长片段DNA分子随机打断为短片段DNA后进行环化反应，通过测定其环化效率来对其结构柔性进行判定，进而对长片段DNA结构柔性进行表征。该方法完全摆脱了原子力显微镜的依赖，可以实现快速、高通量的测定，同时有效表征长片段DNA分子结构柔性，结果能够满足科学研究和技术优化等工作需求。
附图说明
图1为扩增得到的不同柔性DNA分子的电泳图，其中(A)：DNA片段1在不同比例5hm-dUTP(20％、40％、60％、80％)的PCR体系扩增之后的条带，(B)：DNA片段2在不同比例5hm-dUTP(20％、40％、60％、80％)的PCR体系扩增之后的条带，每组三个重复。Lane M：DNAMarker；Lane 1-3：5hm-dUTP含量为20％的PCR体系；Lane 4-6：5hm-dUTP含量为40％的PCR体系；Lane7-9：5hm-dUTP含量为60％的PCR体系；Lane 10-12：5hm-dUTP含量为80％的PCR体系。
图2为本发明提供的DNA分子结构柔性的表征方法的一种实施例的流程图。
图3为不同5hmU含量的DNA片段1(A)和片段2(B)被打断后的短片段DNA的环化效率。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1、实验序列选取
随机选取两段pBluescript载体中的片段，序列长度分别1014bp(DNA片段1)(SEQID NO:1)和2085bp(DNA片段2)(SEQ ID NO:2)。根据DNA片段1和DNA片段2的序列信息分别设计扩增引物，分别是F1(5’-CAGTCGGGAAACCTGTCGTG-3’)和R1(5’-GTTTTCGTTCCACTGAGCGTC-3’)以及F2(5’-CCAACGTCAAAGGGCGAAAA-3’)和R2(5’-AAGCCCTCCCGTATCGTAGT-3’)。
2、不同柔性DNA分子的制备
5-hydroxymethyluracil(5hmU)是胸腺嘧啶(T)的一种修饰碱基，这种修饰可一定程度上增加DNA分子的柔性。DNA分子中5hmU的含量越高，其结构柔性越高。通过向dNTP溶液中加入不同比例的5hm-dUTP，然后进行PCR扩增，可获得柔性不同的DNA分子。
配制含有不同比例5hm-dUTP(20％、40％、60％、80％)的dTTP溶液，分别与dATP、dCTP和dGTP溶液等比例混合以后，以步骤(1)中的DNA为模板，分别利用F1和R1以及F2和R2来进行扩增，获得5hm-dUTP不同含量的DNA分子，每组设置三个重复。参照表1配制PCR反应体系，将混合液置于PCR仪中，按照如下程序运行PCR反应：
表1 PCR反应体系
制备1％的琼脂糖凝胶，使用Axygen PCR产物回收试剂盒将PCR产物回收纯化后加至上样孔跑胶，得到单一条带(图1)。
3、DNA分子片段化
使用Covaris LE220非接触式超声波破碎仪将纯化的DNA分子打断成50～100bp的片段，具体参数为表2。
表2 Covaris LE220参数设置
接着按照本发明所描述的方法步骤进行DNA片段结构柔性的测定，如图2所示。
4、DNA分子末端补平
利用Klenow Fragment的方法将DNA分子末端补平。参照NEB试剂盒方法介绍，首先按照表3配制反应体系。设置好反应体系后，轻轻混匀(可用移液器吹打混匀或用Vortex低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。继续将反应体系于37℃孵育10分钟，接着在75℃孵育10分钟并终止反应。
表3 Klenow Fragment反应体系的配制
5、DNA溶液稀释
将步骤(4)中产生的DNA片段回收后稀释至0.1pmol/ml。
6、接头序列连接
首先设计带有黏性末端(HindIII识别位点)的接头序列，分别是5’端接头(接头F，表4)和3’端接头(接头R，表4)。向步骤(4)所得的带有平末端的DNA片段加入1μl的5’端和3’端接头，然后加入连接缓冲液以及T4 ligase，混匀，PCR仪中4℃过夜。
表4接头序列
7、限制性内切酶酶切
向步骤(5)中产生的带有接头的DNA中加入酶反应缓冲液与去离子水，并加入限制性内切酶HindIII酶液，混合均匀。然后将反应体系于37℃孵育2-3小时，使酶切反应完全。
8、DNA分子环化
使用T4 ligase对步骤(7)中准备的DNA分子进行环化连接，加入连接反应液，16℃孵育5-10分钟后立即终止反应。
9、荧光定量PCR
在开始荧光定量PCR实验之前，根据环化前线性短片段DNA分子中连接接头设计相向延伸引物对和背向延伸引物对，如表5所示。其中，相向延伸引物包括P1F和P1R，背向延伸引物则包括P2F和P2R。然后利用相向延伸引物对和背向延伸引物对分别进行荧光定量PCR，参照Bio-Rad的iTaq UniverSYBR Green SMX1000方法准备反应液，如表6。
表5引物序列
表6荧光定量PCR反应体系的配制
设置荧光定量PCR仪，首先在95℃条件下预变性3分钟，接着进行45个循环，每个循环包括95℃变性20秒、57℃退火30秒以及72℃延伸20秒，最后运行熔解曲线。
10、长片段DNA分子结构柔性计算与结果
计算短片段DNA分子环化效率，得到的结果与预期一致，如图3所示，5hm-dUTP含量越高，所测得的DNA分子结构的环化效率越高，即长片段DNA分子结构柔性与其被打断后得到的短片段DNA的环化效率呈正相关，所以，长片段DNA分子的结构柔性可以通过计算其被打断后得到的短片段的环化效率表征，具体公式为：
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
<120> 一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 780
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 840
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 900
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 960
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaa 1014
<210> 2
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
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cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
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taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcaa 720
gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc cagcttttgt tccctttagt 780
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atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 900
cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 960
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caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1320
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ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 1560
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 1620
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ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 1800
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 1860
aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 1920
aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 1980
gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 2040
gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accat 2085
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaacgtcaa agggcgaaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<400> 7
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<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 15
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtactatgc agtcg 15
Claims (10)
1.一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的短片段DNA分子的两端分别连接接头序列；
(3)将步骤(2)得到的带有接头的DNA分子进行限制性内切酶酶切，产生黏性末端；
(4)使用连接酶对步骤(3)得到的带有黏性末端的DNA分子进行环化连接；
(5)根据步骤(2)得到的短片段DNA分子中的接头序列设计相向延伸引物对和背向延伸引物对，采用相向延伸引物对和背向延伸引物对分别对步骤(4)得到的DNA分子进行荧光定量PCR，得到背向延伸引物对荧光定量结果和相向延伸引物对定量结果；
(6)计算步骤(4)得到的DNA分子环化效率，通过步骤(4)得到的DNA分子环化效率来表征长片段DNA分子结构柔性，DNA分子环化效率为步骤(5)得到的背向延伸引物对荧光定量结果与相向延伸引物对定量结果之比，如计算得到的DNA分子环化效率越高，则长片段DNA分子结构柔性越高。
2.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中长片段DNA分子长度为1000～2100bp。
3.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中片段化方法为酶切法或物理方法。
4.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中短片段DNA长度为50～100bp。
5.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中将短片段DNA分子末端补平；优选地，所述末端补平采用T4 DNA聚合物、Taq酶或Klenow片段进行。
6.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(3)中将短片段DNA分子回收后稀释至0.05-0.15pmol/ml。
7.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述接头序列包括5’端接头和3’端接头，所述5’端接头的序列如SEQ ID NO:7所示，所述3’端接头的序列如SEQ ID NO:8所示。
8.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(5)中连接酶为T4连接酶。
9.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(5)中环化反应时间为5-10分钟。
10.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(6)中相向延伸引物对包括如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的序列，背向延伸引物对包括如SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示的序列。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000031536A2 (en) * | 1998-11-23 | 2000-06-02 | President And Fellows Of Harvard College | Detecting structural or synthetic information about chemical compounds |
| CN102628079A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-08-08 | 盛司潼 | 一种通过环化方式构建测序文库的方法 |
| CN102864498A (zh) * | 2012-09-24 | 2013-01-09 | 天津工业生物技术研究所 | 一种长片段末端文库的构建方法 |
| WO2014008635A1 (zh) * | 2012-07-11 | 2014-01-16 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 片断dna检测方法、片断dna检测试剂盒及其应用 |
| CN104388548A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-04 | 江汉大学 | 一种高通量环状rna测序的方法 |
| JP2016077180A (ja) * | 2014-10-10 | 2016-05-16 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ＲｅｃＡ組換え酵素および組換え活性をもつ蛋白質を用いた直鎖二重鎖ＤＮＡ多量体形成技術 |
| WO2016169431A1 (zh) * | 2015-04-20 | 2016-10-27 | 深圳华大基因研究院 | 一种长片段dna文库构建方法 |
| CN111379031A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 深圳华大智造科技有限公司 | 核酸文库构建方法、得到的核酸文库及其用途 |
-
2021
- 2021-03-29 CN CN202110333527.6A patent/CN113088567B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000031536A2 (en) * | 1998-11-23 | 2000-06-02 | President And Fellows Of Harvard College | Detecting structural or synthetic information about chemical compounds |
| CN102628079A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-08-08 | 盛司潼 | 一种通过环化方式构建测序文库的方法 |
| WO2014008635A1 (zh) * | 2012-07-11 | 2014-01-16 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | 片断dna检测方法、片断dna检测试剂盒及其应用 |
| CN102864498A (zh) * | 2012-09-24 | 2013-01-09 | 天津工业生物技术研究所 | 一种长片段末端文库的构建方法 |
| JP2016077180A (ja) * | 2014-10-10 | 2016-05-16 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ＲｅｃＡ組換え酵素および組換え活性をもつ蛋白質を用いた直鎖二重鎖ＤＮＡ多量体形成技術 |
| CN104388548A (zh) * | 2014-10-31 | 2015-03-04 | 江汉大学 | 一种高通量环状rna测序的方法 |
| WO2016169431A1 (zh) * | 2015-04-20 | 2016-10-27 | 深圳华大基因研究院 | 一种长片段dna文库构建方法 |
| CN111379031A (zh) * | 2018-12-28 | 2020-07-07 | 深圳华大智造科技有限公司 | 核酸文库构建方法、得到的核酸文库及其用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HAORONG CHEN等: "Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of Their Folding and Unfolding Reconfiguration", 《J. AM. CHEM. SOC.》 * |
| 刘杉等: "短双链DNA分子成环及微环缺陷结构研究", 《四川大学学报(自然科学版)》 * |
| 邵冰等: "ＨＩＶ转录激活复制过程中差异表达ＬｎｃＲＮＡ和 ｍＲＮＡ筛选及初步分析", 《中国病毒病杂志》 * |
| 魏利洁;苏建辉;轩淑欣;王彦华;申书兴;赵建军;: "大白菜单拷贝序列的长片段PCR体系优化", 华北农学报 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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