CN113699186A - 基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用。该基因表达盒包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron‑BCL11A‑shRNAmir以及多腺苷酸化信号；所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。本发明构建的基因表达盒，可在红系细胞中特异性的上调β珠蛋白和γ‑珠蛋白的表达，两种机理协同作用，治疗效果显著增强。

Description

基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用

技术领域

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及一种基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用。

背景技术

β地中海贫血症是由于编码β珠蛋白的基因出现突变而导致的隐性遗传性血液疾病。不同基因型β-地中海贫血患者的症状严重程度不同，无法产生任何β珠蛋白的基因称为β0基因，携带两个β0基因拷贝的患者症状最为严重。为了存活，输血依赖性β型地中海贫血症(TDT)患者需要终生频繁输血和铁螯合疗法排铁，TDT患者面临着因铁过量引起的进行性多器官衰竭等并发症的风险。目前，能够治愈TDT的治愈性疗法是进行异体造血干细胞移植(HSCT)，但HSCT很难找到合适的HLA配型，而且存在包括由治疗而导致的死亡、移植物衰竭、移植物抗宿主疾病和机会性感染等并发症的风险，特别是由非直系血亲提供的HSCT。因此，现有的疗法或者无法一次性治愈TDT患者，极大地影响了患者的生活质量，增加患者和国家的医疗负担；或者很难找到合适的HLA配型，只有很少的患者能够从中受益；即使找到了合适的HLA配型，也冒着多种并发症的风险。

理论上从基因层面增加细胞正常β-珠蛋白的表达，患者将获得终身的治疗。此外，提高患者体内γ-珠蛋白的表达，也可取得功能上代偿β珠蛋白生成不足的效果。目前获批的或者研究中的基因疗法通常采用在造血干细胞(HSC)中过表达正常β-珠蛋白/γ-珠蛋白的方法或者表达促进γ-珠蛋白表达的基因的方法，使患者的HSC可适宜的表达β-珠蛋白/γ-珠蛋白，从而部分治愈β-地中海贫血症患者或缓解β-地中海贫血症的症状，很大程度上提高了患者的生活质量。但仍无法一次性治愈重型β-地中海贫血症患者。

在生物体内，β-珠蛋白的表达具有红系特异性，研究表明β-LCR(Locus ControlRegion)控制着包括β-珠蛋白在内的一系列珠蛋白的时间和空间特异性表达。胎儿在出生6个月后，胎儿型HbF(α2γ2)的量小于总血红蛋白的5％，到两岁时小于1％。β-珠蛋白基因及调控γ-珠蛋白表达的基因BCL11A在HSC中组成性表达会损害HSC的功能及分化。因此，外源基因需要置于LCR的调控之下，抑制BCL11A基因的表达将有利于γ-珠蛋白的表达。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基因表达盒，其包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron-BCL11A-shRNAmir以及多腺苷酸化信号；

所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所示intron-BCL11A-shRNAmir的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。

可选的，如上所述的基因表达盒，所示启动子的上游还具有增强子。

可选的，如上所述的基因表达盒，所述增强子为来自β珠蛋白的LCR的HS3与HS2增强子，其中HS3位于HS2的上游。

在一些实施方式中，HS3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

可选的，如上所述的基因表达盒，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

可选的，如上所述的基因表达盒，所述多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。

本发明的第二目的在于提供一种包含如上所述的基因表达盒的载体。

本发明的第三目的在于提供一种慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的5’LTR和位于下游的3’LTR，所述基因表达盒反向插入所述5’LTR和所述3’LTR之间。

可选的，如上所述的慢病毒包装载体，所述慢病毒包装载体具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

本发明的第四目的在于提供一种慢病毒包装载体系统，其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒，其特征在于，包含如上所述的慢病毒包装载体。

可选的，如上所述的慢病毒包装载体系统，所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。

本发明的第五目的在于提供如上所述的慢病毒包装载体系统包装得到的慢病毒颗粒。

本发明的第六目的在于提供药物组合物，其包括如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

本发明的第七目的在于提供一种如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒在制备用于治疗β地中海贫血症的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明构建的基因表达盒，可在红系细胞中特异性的上调β珠蛋白和γ-珠蛋白的表达，两种机理协同作用，治疗效果显著增强。在表达外源性β珠蛋白的同时，使用嵌合于内含子的基于miRNA骨架的shRNA表达技术表达BCL11A的shRNA，使shRNA像内源性miRNA一样受控于II型启动子，跟HBB基因一起实现红细胞特异性的表达，可用于治疗β0/β0重型地贫患者，具有潜在的巨大经济效益和社会效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中红系特异性表达的“all-in-one”载体结构示意图；

图2为本发明一个实施例中所使用的β珠蛋白的结构示意图；

图3为本发明一个实施例中本发明所使用的慢病毒表达载体结构示意图；A.pCDH-miR E5-HS2-HS3；B.pCDH-βglobin-HS2-HS3；C.pCDH-intron-miR E5-βglobin-HS2-HS3；

图4为本发明一个实施例中各组诱导分化后细胞沉淀的颜色；

图5为本发明一个实施例中各处理组鼠BCL11A mRNA和鼠γ-globin mRNA的表达情况；

图6为本发明一个实施例中各处理组人β-globin mRNA的表达情况。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明涉及一种基因表达盒，其包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron-BCL11A-shRNAmir以及多腺苷酸化信号；

所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所示intron-BCL11A-shRNAmir的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。

LCR的全长超过15kb，现有且常用的慢病毒载体容量有限，无法携带复杂的LCR序列，而且较长的调控序列会导致病毒滴度和基因表达水平降低，容易发生基因重排现象。因此，需要对LCR区域的序列进行优化精简，但不能损害LCR的功能。

shRNA在生物实验中广泛应用，其可在细胞中大量表达，高效敲降目的基因。shRNA的表达通常由III型RNA聚合酶(Pol III)启动转录，miRNA的表达由Pol II启动转录。转录因子BCL11A对于多种类型的细胞都是十分重要的，去除BCL11A可能会引发不可想象的后果(比如白血病)，因此，靶向BCL11A必须限定于红系细胞中，只能采用可细胞组织特异性表达的II型启动子控制的miRNA进行BCL11A的敲降。此外，持续的外源miRNA的高表达会对内源RNAi造成很大的不利影响，对细胞产生一定的毒性。为了实现同时调控表达外源性的β-globin和BCL11AshRNA，需要将二者构建于同一个启动子的的控制下，由于miRNA的加工机制，会造成β-globin-BCL11A shRNA mRNA的不稳定，对β-globin的表达影响非常大。因此，该问题也需要妥善解决。

本发明构建的基因表达盒，可在红系细胞中特异性的上调β珠蛋白和γ-珠蛋白的表达，两种机理协同作用，治疗效果显著增强。

本发明的一个优点在于，采用intron-shRNAmir系统(嵌合于内含子的基于miRNA的shRNA表达技术)，将β珠蛋白基因和intron-BCL11AshRNAmir基因置于红系细胞的组织特异性II型启动子的控制下，构建“all-in-one”表达载体，可在红系细胞中特异性同时表达外源性β珠蛋白和BCL11A shRNA。

本发明的一个优点在于，优化精简了β-LCR，优化精简后的LCR大小适合于慢病毒的包装生产，且功能正常。LCR使其下游基因在红系细胞中特异性表达，避免了外源基因在不适宜的时间表达对细胞造成的不利影响。

本发明的一个优点在于，利用miRNA的加工机制，将shRNA嵌合于miRNA的框架中，即shRNAmir，使shRNA能够像miRNA一样由II型启动子控制表达，构建红系特异性的表达载体，避免了外源miRNA持续高表达对内源RNAi的干扰，且高效敲降BCL11A的表达，显著提高γ珠蛋白的表达。

本发明的一个优点在于，利用内含子的加工剪接机制，将shRNAmir置于内含子中，即intron-BCL11A-shRNAmir技术，减小BCL11A-shRNAmir的表达对其上游β珠蛋白的表达的影响，从而实现真正的“all-in-one”载体。

在本发明中，术语“红系细胞”指有核细胞，其能发育为红细胞，包括但不限于：红系定向祖细胞、原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和网织红细胞。

在一些实施方式中，所示启动子的上游还具有增强子。

增强子包括但不限于GATA-1、I8、HS增强子及其组合。在一些实施方式中，所述增强子为来自β珠蛋白的LCR的HS3与HS2增强子，其中HS3位于HS2的上游。

在一些实施方式中，HS3的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

β珠蛋白的LCR包括5个DNase I hypersensitive sites(HSs)，其中HS2、HS3和HS4有比较强的增强子活性。本发明所采用的HS3和HS2组合可驱动下游基因的高表达。

在一些实施方式中，HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

红系细胞特异性的II型启动子包括但不限于α-spectrin启动子、ankyrin-1启动子、ζ-globin启动子、β-globin启动子；在一些实施方式中，所述启动子为来自β-LCR(β-Locus control regions)的启动子，进一步地，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在一些实施方式中，所述多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还请求保护包含如上所述的基因表达盒的载体。

在本发明中术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用于外源DNA转移的常规的基于病毒的系统包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关和单纯疱疹病毒载体；上述病毒通常是复制缺陷的。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明还涉及一种慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的5’LTR和位于下游的3’LTR，所述基因表达盒反向插入所述5’LTR和所述3’LTR之间。

在一些实施方式中，所述慢病毒包装载体为pCDH。

在一些实施方式中，所述慢病毒包装载体具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

另外，需要说明的是，在一个方面，本发明中所涉及的有用的序列包括与SEQ IDNO：1～10所示的核酸片段具有大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。

此外，本发明所涉及的基因或蛋白通常来着哺乳动物，例如大鼠、小鼠，优选灵长类动物，更优选人。

本发明还涉及一种慢病毒包装载体系统，其能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒，其特征在于，包含如上所述的慢病毒包装载体。

在一些实施方式中，所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的慢病毒包装载体系统包装得到的慢病毒颗粒。

用于包装慢病毒颗粒的宿主细胞通常为哺乳动物细胞或禽类动物细胞。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为啮齿类动物细胞，例如大鼠、小鼠、仓鼠。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为灵长类动物细胞，优选为人。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为细胞系；

常见的细胞系例如：

来源于人的细胞系：

293、IMR-90、W1-38、A549、A431、BHL-100、BeWo、Caco-2、Chang、HCT-15、HeLa、HEp-G2、HEp-2、HT-1080、HT-29、JEG-2、MCF7、KB、Saos-2、WI-38、WISH、WS1、HUVEC、EB-3、Raji、IM-9、Daudi、H9、HL-60、Jurkat、K-562、U937、KG-1；

来源于小鼠的细胞系：

McCoy、BALB/3T3、3T6、A9、AtT-20、Clone M-3、I-10、Y-1、WEHI-3b、ES-D3、F9；

来源于仓鼠的细胞系：

BHK-21、HaK、CHO-K1；

来源于大鼠的细胞系：

AR42J、BRL3A、Clone 9、H4--Ⅱ-E-C3、GH1、GH3、IEC-6、L2、XC、LLC-WRC 256、Jensen、Rat2(TK-)、PC12、L6；

来源于其他动物的细胞系：

D-17、BT、MARC-145、CV-1、COS-1、COS-3、COS-7、Vero、B95-8、CRFK。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及药物组合物，其包括如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的慢病毒包装载体系统和/或如上所述的慢病毒颗粒在制备用于治疗β地中海贫血症的药物中的应用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

载体构建

由广州艾基生物技术有限公司分别合成HS3-HS2-promoter DNA序列、miR E5(E5-shRNAmir)DNA序列和intron-miR E5 DNA序列；并连接构建至慢病毒载体中。本发明所涉及的主要序列为下表所示：

名称	长度	序列
			HS3	1202bp	SEQ ID NO：6
HS2	1411bp	SEQ ID NO：7
			βglobin promoter	265bp	SEQ ID NO：3
shRNAmir	316bp	SEQ ID NO：8
			PolyA	395bp	SEQ ID NO：4
β-globin基因	1052bp	SEQ ID NO：1
			Intron-shRNAmir	356bp	SEQ ID NO：2
pCDH-miR E5-HS2-HS3	9597bp	SEQ ID NO：9
			pCDH-βglobin-HS2-HS3	10369bp	SEQ ID NO：10
pCDH-inron-miR E5-βglobin-HS2-HS3	10757bp	SEQ ID NO：5
			βglobin蛋白	147aa	SEQ ID NO：11

E5-shRNA的序列为：passenger strand(gcgcgatcgagtgttgaataa)，guide strand(ttattcaacactcgatcgcgc)。

实施例2

慢病毒包装采用四质粒系统，具体步骤如下：

(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的E5-shRNAmir表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；

(2)将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养6h；

(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。

(4)使用慢病毒滴度(HIV P24)ELISA检测试剂盒(北京博奥龙，货号BF06203)检测病毒滴度。

实施例3

E5-shRNAmir慢病毒感染MEL细胞

1.小鼠murine erythroleukemia(MEL细胞)，培养于完全培养基(1640+10％FBS+1％P/S)中，每2-3天以1：5～1：10的比例进行传代。

2.200g离心5-10min收集细胞，用含200nM的感染增强剂B的完全培养基重悬细胞，于培养箱中孵育2h。

3.2h后，200g离心5-10min收集细胞，用完全培养基重悬细胞，调整密度为5×10⁶个/mL，接种100uL(5×10⁵个/孔)至48孔板中。

4.加入适量的慢病毒，使MOI为15，然后加入感染增强剂A，使感染增强剂A的终浓度为10uM，然后轻轻混匀细胞。

5.将细胞放入培养箱过夜培养。

6.将过夜培养的细胞用PBS洗2遍。

7.然后将细胞用完全培养基重悬，接种至新的48孔板，进行扩增。

实施例4

MEL的诱导分化

1.E5-shRNAmir慢病毒感染的MEL细胞扩增后，200g离心5-10min收集细胞。

2.用红系诱导分化培养基(1640+10％FBS+1％P/S+2％DMSO)重悬细胞。

3.诱导分化期间，每2-3天进行以1：2的比例进行传代。

4.诱导分化7天后，可进行相应的检测。

5.将细胞收集至1.5mL离心管中，200g离心5min，然后用PBS洗一遍；

6.拍照观察细胞沉淀的颜色。

结果如图4所示，诱导分化组的细胞沉淀呈现泛红色，而未进行诱导分化的细胞沉淀均为淡黄色。

从图可知，各组MEL细胞经过7天的诱导分化培养，成功分化为红系细胞。

实施例5

RT-qPCR检测鼠BCL11A mRNA、鼠γ珠蛋白mRNA和人β-珠蛋白mRNA的表达水平

按照RNA提取试剂盒RNAeasy Mini Kit(QIAGEN，货号74104)的操作步骤，提取各组细胞的总RNA。然后于微量分光光度计上检测RNA的浓度。接着使用One Step TB

PrimeScript^TMRT--PCR Kit I II(Perfect Real Time)(TAKARA，货号RR86A)进行RT-qPCR，鼠GAPDH作为内参基因，检测鼠BCL11A mRNA、鼠γ珠蛋白mRNA和人β-珠蛋白mRNA的表达量。简单的操作如下：

PCR反应体系的配制(一次反应用量)：

试剂	使用量	终浓度
			2X One Step TB Green RT-PCR Buffer 4	10uL	1x
PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2	0.8uL
			PCR Forward Primer(10μM)	0.8uL	0.4uM
PCR Reverse Primer(10μM)	0.8uL	0.4uM
			Total RNA	2.5uL
RNase Free dH<sub>2</sub>O	5.1uL
			总计	20uL

配制好反应体系后，于荧光定量PCR仪(Biorad)上进行检测。

设置反应程序如下：

反应结束后，使用采用比较Ct法(ΔΔCt)计算表达差异。实验使用的特异性引物如下表所示：

从图5A可知，未诱导分化的各组BCL11A的表达没有显著差异，而诱导分化的Induced-Control和induced-Hbb组BCL11A的表达与未诱导分化的各组相比也没有显著差异。但是induced-miR E5和induced-Hbb-miR E5组BCL11A的表达显著下调。这些结果提示BCL11A shRNA只在诱导分化的MEL细胞中表达，且能够高效敲降BCL11A的表达。

从图5B可知，对于鼠γ-globin mRNA，未诱导分化的各组与对照组相比均无显著差异。诱导分化的各组中，鼠γ-globin mRNA的表达均显著上调，其中induced-miR E5和induced-Hbb-miR E5组鼠γ-globin mRNA的表达量比其他组的更高。这些结果提示miR E5和Hbb-miR E5可特异性地在红系诱导分化的MEL细胞中敲降BCL11A，从而提高γ-珠蛋白的表达。

从图6中可知，induced-Hbb和induced-Hbb-miR E5组人β-globin的表达量远远高于其他组。这些结果提示Hbb和Hbb-miR E5可特异性地在红系诱导分化的MEL细胞中表达，从而大量表达正常的人β珠蛋白。

综上所述，本发明利用内含子剪接加工机制、miRNA表达机制以及β珠蛋白的控制表达机制所构建的BCL11A shRNA和β珠蛋白同时表达的“all-in-one”载体可特异性的在红系细胞中表达治疗基因，显著提高红细胞中β珠蛋白和γ珠蛋白的表达，将有更大的希望一次性治愈β0/β0重型β-地中海贫血症患者。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 基因表达盒、慢病毒载体及其在治疗β地中海贫血症的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1052

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60

gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt 120

aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg 180

cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc 240

ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg 300

caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc 360

tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct 420

gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc 480

ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacacacata 540

ttgaccaaat cagggtaatt ttgcatttgt aattttaaaa aatgctttct tcttttaata 600

tacttttttg tttatcttat ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa 660

tgatacaatg tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg 720

ttaaggcaat agcaatatct ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt 780

aagaggtttc atattgctaa tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttat 840

ggttgggata aggctggatt attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca 900

tacctcttat cttcctccca cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc 960

actttggcaa agaattcacc ccaccagtgc aggctgccta tcagaaagtg gtggctggtg 1020

tggctaatgc cctggcccac aagtatcact aa 1052

<210> 2

<211> 356

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gtaagtttga atgaggcttc agtactttac agaatcgttg cctgcacatc ttggaaacac 60

ttgctgggat tacttcgact tcttaaccca acagaaggct cgagaaggta tattgctgtt 120

gacagtgagc ggcgcgatcg agtgttgaat aatagtgaag ccacagatgt attattcaac 180

actcgatcgc gctgcctact gcctcggact tcaaggggct agaattcgag caattatctt 240

gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa 300

atggtataaa ttaaatcact tttcctgacc attcatcctc tttctttttc ctgcag 356

<210> 3

<211> 265

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gtaaatacac ttgcaaagga ggatgttttt agtagcaatt tgtactgatg gtatggggcc 60

aagagatata tcttagaggg agggctgagg gtttgaagtc caactcctaa gccagtgcca 120

gaagagccaa ggacaggtac ggctgtcatc acttagacct caccctgtgg agccacaccc 180

tagggttggc caatctactc ccaggagcag ggagggcagg agccagggct gggcataaaa 240

gtcagggcag agccatctat tgctt 265

<210> 4

<211> 395

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 180

gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 240

acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 300

aacagcccct gatgcatatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg 360

atttggaggt taaagttttg ctatgctgta tttta 395

<210> 5

<211> 10757

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

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attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

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tttatcgata aggatctgcg atcgccatga ggacagctaa aacaataagt aatgtaaaat 1980

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tctttatgtt ttaaatgcac tgacctccca cattcccttt ttagtaaaat attcagaaat 2220

aatttaaata catcattgca atgaaaataa atgtttttta ttaggcagaa tccagatgct 2280

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ctgtggcttc actattattc aacactcgat cgcgccgctc actgtcaaca gcaatatacc 2640

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tt 1202

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gtaccagtgg ggcctctaag actaagtcac tctgtctcac tgtgtcttag ccagttcctt 60

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aatgtgctct gtcccccagg ctggagtgca gtggcacgat ctcagctcac tgcaacctcc 4680

gcctcccggg ttcaagcaat tctcctgcct cagccaccct aatagctggg attacaggtg 4740

cacaccacca tgccaggcta atttttgtac tttttgtaga ggcagggtat caccatgttg 4800

tccaagatgg tcttgaactc ctgagctcca agcagtccac ccacctcagc ctcccaaagt 4860

gctgggatta caggtgtgag acaccatgcc cagattttcc atatttaata gaggtattta 4920

tgggatgggg gaaaagaatg tttctctcac tgtggattat tttagagagt ggagaatggt 4980

caagattttt ttaaaaatta agaaaacata agttggacct tgagaaatga aaatttattt 5040

ttttgttgga ggatacccat tctctatctc ccatcagggc aagctgtaag gaactggcta 5100

agacacagtg agacagagtg acttagtctt agaggcccca ctggtacaag ctttcattaa 5160

aaaaagtcta accagctgca ttcgactttg actgcagcag ctggttagaa ggttctactg 5220

gaggagggtc ccagcccatt gctaaattaa catcaggctc tgagactggc agtatatctc 5280

taacagtggt tgatgctatc ttctggaact tgcctgctac attgagacca ctgacccata 5340

cataggaagc ccatagctct gtcctgaact gttaggccac tggtccagag agtgtgcatc 5400

tcctttgatc ctcataataa ccctatgaga tagacacaat tattactctt actttataga 5460

tgatgatcct gaaaacatag gagtcaaggc acttgcccct agctgggggt ataggggagc 5520

agtcccatgt agtagtagaa tgaaaaatgc tgctatgctg tgcctccccc acctttccca 5580

tgtctgccct ctactcatgg tctatctctc ctggctcctg ggagtcatgg actccaccca 5640

gcaccaccaa cctgacctaa ccacctatct gagcctgcca gcctataacc catctgggcc 5700

ctgatagctg gtggccagcc ctgaccccac cccaccctcc ctggaacctc tgatagacac 5760

atctggcaca ccagctcgca aagtcaccgt gagggtcttg tgtttgctga gtcaaaattc 5820

cttgaaatcc aagtccttag agactcctgc tcccaaattt acagtcatag acttcttcat 5880

ggctgtctcc tttatccaca gaatgattcc tttgcttcat tgccccatcc atctgatcct 5940

cctcatcagt gcagcacagg gcccatgagc agtagctgca gagtctcaca taggtctggc 6000

actgcctctg acatgtccga ccttaggcaa atgcttgact cttctgagct cagtcttgtc 6060

atggcaaaat aaagataata atagtgtttt tttatggagt tagcgtgagg atggaaaaca 6120

atagcaaaat tgattagact ataaaaggtc tcaacaaata gtagtagatt ttatcgtcca 6180

ttaatccttc cctctcctct cttactcatc ccatcacgta tgcctcttaa ttttccctta 6240

cctataataa gagttattcc tcttattata ttcttcttat agtgattctg gatattaaag 6300

tgggaatgag gggcaggcca ctaacgaaga agatgtttct caaagaagcg tcgacaatca 6360

acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 6420

tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 6480

tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 6540

cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 6600

gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 6660

cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 6720

cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg 6780

tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 6840

agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 6900

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggta cctttaagac 6960

caatgactta caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg 7020

aagggctaat tcactcccaa cgaagataag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct 7080

ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc 7140

ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg 7200

gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt 7260

catgtcatct tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga 7320

ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 7380

caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 7440

cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 7500

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 7560

cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 7620

agacttttgc agagaccaaa ttcgtaatca tgtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 7680

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 7740

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 7800

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 7860

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 7920

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 7980

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 8040

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 8100

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 8160

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 8220

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 8280

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 8340

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 8400

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 8460

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 8520

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 8580

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 8640

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 8700

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 8760

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agtcagaaga 8820

actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa 8880

gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca 8940

acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa 9000

agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat 9060

cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct 9120

gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc 9180

gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca 9240

gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca 9300

ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa 9360

cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct 9420

cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc 9480

cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt 9540

catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt 9600

caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc 9660

agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag 9720

agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct 9780

atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg 9840

tccagatagc ccagtagctg acattcatcc cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 9900

ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 9960

tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 10020

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 10080

gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 10140

agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 10200

gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 10260

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 10320

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagctg 10369

<210> 11

<211> 147

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 11

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65 70 75 80

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145

Claims (13)

1.基因表达盒，其特征在于，包括顺次连接的启动子、β珠蛋白基因、intron-BCL11A-shRNAmir以及多腺苷酸化信号；

所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所示intron-BCL11A-shRNAmir的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述启动子为红系细胞特异性的II型启动子。

2.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所示启动子的上游还具有增强子。

3.根据权利要求2所示的基因表达盒，其特征在于，所述增强子为来自β珠蛋白的LCR的HS3与HS2增强子，其中HS3位于HS2的上游。

4.根据权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

5.根据权利要求1～4任一项所示的基因表达盒，其特征在于，所述多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.包含权利要求1～5任一项所述的基因表达盒的载体。

7.慢病毒包装载体，沿病毒基因组表达方向设置有位于上游的5’LTR和位于下游的3’LTR，所述基因表达盒反向插入所述5’LTR和所述3’LTR之间。

8.根据权利要求7所述的慢病毒包装载体，其特征在于，所述慢病毒包装载体具有SEQID NO：5所示的核苷酸序列。

9.慢病毒包装载体系统，其特征在于，能产生只有一次感染能力而无复制能力的HIV载体颗粒，其特征在于，包含权利要求7或8所述的慢病毒包装载体。

10.根据权利要求9所述的慢病毒包装载体系统，其特征在于，所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统。

11.权利要求9或10所述的慢病毒包装载体系统包装得到的慢病毒颗粒。

12.药物组合物，其特征在于，包括权利要求9或10所述的慢病毒包装载体系统和/或权利要求11所述的慢病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

13.权利要求9或10所述的慢病毒包装载体系统和/或权利要求11所述的慢病毒颗粒在制备用于治疗β地中海贫血症的药物中的应用。

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