CN113106098A - 一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、表达人β珠蛋白的重组序列及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具有高效及红系特异性启动功能基因表达的特点。本发明还提供了一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列，为人的β珠蛋白基因座控区HS3～1‑β珠蛋白基因启动子‑β珠蛋白基因‑β珠蛋白基因增强子。通过构建表达所述重组序列的重组载体，在红系细胞中验证表明，所述重组序列能够高效特异表达人β珠蛋白基因，为β地中海贫血基因治疗提供了基础和实验参考，对治疗地中海贫血具有重要意义，同时对研究β珠蛋白的表达调控研究提供方法支持。

Description

一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用。

背景技术

β地中海贫血(Thalassemia)，是由于编码β珠蛋白的基因簇突变引起的血液性疾病。地中海、非洲、东南亚、印度大陆及我国西南、华南地区是高发区。中国广西、广东、福建、台湾、香港、云南、贵州、海南等省区为高发区域。地中海贫血是一种常见的遗传性疾病，不仅会影响患者的生命健康，同时会影响下一代的健康。

β地中海贫血是由于位于第11号染色体短臂1区5带4亚带(11p15.4)的β珠蛋白基因簇突变引起的。β珠蛋白基因簇含有五个结构基因分别是β、δ、Aγ、Gγ和ε基因，对应编码的血红蛋白分别是HBB、HBD、HBG1、HBG2和HBE。在人体血红蛋白的发育过程，这几个结构基因并不是持续表达的，存在一个血红蛋白的转换过程，胎儿期主要是HBG1、HBG2基因表达，编码γ珠蛋白链，出生后转变为HBB基因表达，编码β珠蛋白链，γ和β链与α珠蛋白基因编码的α链聚合形成血红蛋白，最终携带氧气到全身各个器官。正常情况下，体内的β和α珠蛋白链的量本一致，当编码β珠蛋白链的HBB基因发生突变时，相应的β链合成减少或缺如，导致成人血红蛋白HbA(α2β2的四聚体)合成减少或缺如、α链在细胞内沉积，细胞失去稳定性，骨髓中红细胞前体过早破坏，成熟红细胞寿命缩短，引物溶血、慢性溶血、铁超载、肝脾肿大、髓外造血及骨骼发育异常等表现，严重者可并发心脏、肝脏和内分泌功能障碍。

目前，临床上治疗儿童β地中海贫血的方法主要包括长期高量输血联合规范性去铁治疗。重型患儿如不治疗，多于5岁前死亡，本病严重威胁地贫患儿及家庭的健康。部分中间型和重型地贫患者需要长期的红细胞输注维持生存和预防严重的并发症，但频繁输血容易引起心功能衰竭和铁过载，铁沉积可引起多脏器官功能损害，甚至发生多器官功能衰竭。尤其是重型β地贫患儿需长期依赖输血以纠正严重贫血，但只有很少部分的患者能坚持规范治疗，且长期的治疗给家庭和社会带来严重的负担。异基因造血干细胞移植是目前唯一可治愈β地中海贫血的手段，据报道其治疗地中海贫血的治愈率可达80％以上，有的甚至可达90％。但据报道只有不到30％的地贫患儿可以获得适合的配型。羟基脲为一种DNA复制抑制剂，在镰刀状贫血和地中海贫血患者服用后可以增加正常胎儿血红蛋白的表达，从而部分替代了异常的β珠蛋。但是这种治疗并不能在所有的病人体内得到很好的效果，并且羟基脲会产生一定的毒性。因此，需要寻求一种高效、安全的地贫治疗方式，从而使更多的地贫患儿获益。

近年来，通过β珠蛋白基因增加进行基因治疗β地中海贫血病，2000年β珠蛋白基因增加治疗β地贫小鼠模型已成功创建，但随后由于载体的有效性及安全性问题使β珠蛋白基因增加治疗β地贫的研究停滞不前。2006年，法国的一项名为LG001的临床试验使用HPV569作为载体进行骨髓造血干细胞编辑后移植治疗1例β0/β+地贫病人，使得该病人从中获益，停止输血。随后，许多中心开始开展基于慢病毒载体的β珠蛋白基因增加的实验研究及I、II期临床试验研究。2016年在意大利进行的由GLOBE载体介导的体CD34⁺细胞移植也取得较好的疗效。直至2018年新英格兰杂志上报道的BB305慢病毒载体转导造血干细胞治愈β地贫患者取得突破性进展，让研究者们再一次看到了基于病毒载体的β珠蛋白基因增加策略可能成为治愈β地贫患儿的新手段。2018年新英格兰杂志报道：自2013年开始在美国、法国、澳大利亚及泰国等进行的HGB-204、HGB-205临床试验中，由BB305载体介导的自体CD34⁺细胞移植治愈了68％(15/22例)的重型β地中海贫血患者，其余6例患者的输血需求也有不同程度的减少，且长达5年的随访未发生与药物制品有关的严重不良事件。以上多中心临床研究表明越来越多的β地中海贫血患者可从β珠蛋白基因增加的基因治疗载体中获益，表明基于慢病毒载体的β珠蛋白基因增加造血干细胞移植治疗策略有望成为治愈β地贫的新措施，但由于β珠蛋白表达的调控非常复杂，如何在体外获得高效的β珠蛋白表达序列对β地中海贫血的基因治疗至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子，所述启动子能在红系细胞中高效并特异启动编码人β珠蛋白基因的表达。

本发明的目的还在于提供一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用，在红系细胞中能够高效表达β珠蛋白，可用于构建治疗β地中海贫血的慢病毒载体，从而有效提高β地中海贫血基因增加治疗的成功率。

本发明提供了一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列，所述重组序列为人的β珠蛋白基因座控区HS3～1-人β珠蛋白基因启动子-β珠蛋白基因-β珠蛋白基因增强子；

所述人β珠蛋白基因启动子为所述红系特异性的人β珠蛋白基因的启动子。

优选的，所述β珠蛋白基因增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述β珠蛋白基因座控区HS3～1依次包括β珠蛋白基因座控区HS3、β珠蛋白基因座控区HS2和β珠蛋白基因座控区HS1；

所述β珠蛋白基因座控区HS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述β珠蛋白基因座控区HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述β珠蛋白基因座控区HS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

优选的，所述重组序列包括以下DNA序列中的至少一种：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的DNA序列；

2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重组蛋白的DNA序列。

本发明提供了一种包含所述重组序列的重组载体。

优选的，所述重组序列的骨架载体包括哺乳动物表达载体和慢病毒载体。

本发明提供了所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、所述重组序列或所述重组载体在制备基因治疗β地中海贫血的药物中的应用。

本发明提供了一种用于基因治疗β地中海贫血的药物，所述药物包括所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、所述重组序列或所述重组载体。

本发明提供了一种在红系细胞中特异性激活功能基因表达的人β珠蛋白基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明基于已经报道的地中海贫血发病机制以及基因治疗的方法，通过生物信息学的方法预测得到几种长度的β珠蛋白的启动子序列，选取β珠蛋白外显子1前152bp，266bp和422bp的片段作为启动子序列分别与表达EGFP序列的载体连接后构建重组载体，在红系细胞及其它细胞中进行特异性及有效性的验证，结果表明，含长度266bp的启动子的K562细胞中荧光基因蛋白表达量明显高于其它几组，且其它几组中表达量极低，这表明SEQ ID NO:1所示的启动子不仅具有高效启动功能基因表达的特点，还能够在红系细胞中特异性表达目的基因。

本发明还提供了一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列，所述重组序列为人的β珠蛋白基因座控区HS3～1-人β珠蛋白基因启动子-β珠蛋白基因-β珠蛋白基因增强子；所述人β珠蛋白基因启动子为所述在红系细胞中特异人β珠蛋白基因的启动子。本发明首先在体外利用所述启动子启动功能基因表达，将其与哺乳动物表达载体进行重组，在不同细胞系中验证特异性，在红系细胞中进行表达效率的比较研究，然后体外扩增含不同序列的β珠蛋白的调控序列，首次引入了HS1序列，并首次对β珠蛋白调控序列进行不同组合的调控效率比较研究，对调控序列进行优化，与获得的β珠蛋白表达序列进行重组，并在红系细胞中进行表达效率的验证，最终获得高效特异的表达人β珠蛋白基因的重组序列。本发明所获得的重组序列能够在红系细胞中特异并高效表达β珠蛋白，为β地中海贫血基因治疗提供了基础和实验参考，对治疗β地中海贫血具有重要的临床意义，同时对研究β珠蛋白的表达调控研究提供方法支持。

附图说明

图1为不同长度启动子PCR产物及连接后质粒酶切电泳图，其中图1A：152bp、266bp、422bp长度的启动子PCR产物电泳分别对应为8005质粒、8004质粒、8006质粒；图1B：构建的不同长度的启动子质粒双酶切鉴定结果；

图2为8004质粒测序及比对结果；

图3为不同长度启动子质粒转染K562细胞后活性检测结果，图3A为12h检测结果；图3B为24h检测结果；

图4为8004启动子质粒转染不同细胞后特异性检测结果(24h)；

图5为8019质粒构建及转染K562细胞后β珠蛋白表达检测结果；图5A为8019质粒AseI及NotI双酶切电泳图；图5B为8019质粒测序比对结果总结；图5C为8019质粒电转K562细胞后β珠蛋白mRNA检测结果；图5D为8019质粒电转K562细胞后β珠蛋白蛋白检测结果；

图6为含不同HS的反向β珠蛋白质粒构建及K562细胞中有效性比较结果；图6A为8023，8405，8406质粒KpnI酶切电泳结果；图6B为8023，8405，8406质粒电转K562细胞后β珠蛋白WB检测结果；图6C为8023，8405，8406质粒电转K562细胞后β珠蛋白WB检测结果总结；

图7为8405质粒片段测序及比对结果；

图8为不同细胞中8023重组质粒特异性初步验证结果。

具体实施方式

本发明提供了一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1

(ATCGTAAATACACTTGCAAAGGAGGATGTTTTTAGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGGGGCCAAGAGATATATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGTTTGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTT)所示。

在本发明中，根据软件预测不同长度的人β珠蛋白基因启动子，分别构建含三种不同长度(152bp、266bp和422bp)的启动子的重组质粒，结果表明长度266bp的启动子能够特异、高效在红系细胞中启动目标基因表达，而其他两种启动子启动表达的目标基因表达量较低，且呈显著性差异。

本发明提供了一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列，所述重组序列为人的β珠蛋白基因座控区HS3～1-人β珠蛋白基因启动子-β珠蛋白基因-β珠蛋白基因增强子；所述人β珠蛋白基因启动子为所述红系特异性的人β珠蛋白基因的启动子。在本发明中，所述β珠蛋白基因增强子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。所述β珠蛋白基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。所述β珠蛋白基因座控区HS3～1优选依次包括β珠蛋白基因座控区HS3、β珠蛋白基因座控区HS2和β珠蛋白基因座控区HS1；所述β珠蛋白基因座控区HS1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4所示；所述β珠蛋白基因座控区HS2的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5所示；所述β珠蛋白基因座控区HS3的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6所示。所述重组序列包括以下DNA序列中的至少一种：1)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的DNA序列；2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重组蛋白的DNA序列。本发明对所述重组序列的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的重组序列来源即可，例如人工合成或PCR扩增得到。

在本发明中，通过选择不同的调控区域表达人β珠蛋白基因，结果表明，相对于HS4～1的调控区域，不含HS4的HS3～1调控区域使β珠蛋白质粒β珠蛋白表达量最高，因此，选择不含HS4的HS3～1调控区域作为重组序列的一部分用于高效调控人β珠蛋白的表达。

本发明提供了一种包含所述重组序列的重组载体。所述重组载体的骨架载体优选包括哺乳动物表达载体和慢病毒载体。所述哺乳动物表达载体优选包括pEGFP-N1、pUC57载体。所述慢病毒载体优选包括pLV-EF1a-OCT4-IRES-eGFP载体。本发明对所述哺乳动物表达载体和慢病毒载体的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的载体来源即可。

本发明提供了所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、所述重组序列或所述重组载体在制备基因治疗β地中海贫血的药物中的应用。

本发明还提供所述红系特异性人β珠蛋白基因启动子、所述重组序列或所述重组载体在基因治疗β地中海贫血中的应用。

在本发明中，所述基因治疗β地中海贫血的方法，优选包括以下步骤：将所述重组序列插入哺乳动物表达载体中得到哺乳动物重组表达载体或将所述重组序列插入慢病毒载体中得到重组慢病毒载体，将哺乳动物表达载体或重组慢病毒载体导入患者体内，实现β珠蛋白在患者体内重组表达，增加β珠蛋白基因表达量，实现治疗β地中海贫血的目的。

本发明提供了一种用于基因治疗β地中海贫血的药物，所述药物包括所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、所述重组序列或所述重组载体。所述药物优选还包括医学上可接受的辅料。所述药物通过使重组序列在患者细胞中重组表达，增加β珠蛋白含量，实现治疗β地中海贫血的目的。

下面结合实施例对本发明提供的一种在红系细胞中特异表达的人β珠蛋白的重组序列及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

不同长度启动子质粒的构建和活性最佳的启动子确定

1.从http://www.genomatix.de/网址预测β珠蛋白的启动子核心区域，结合文献查询结果既往不同载体中的启动子长度，最终选取β珠蛋白外显子1前152bp，266bp和422bp的片段。

2.在pEGFP-N1骨架质粒启动子上下游选出单一酶切位点，上游为Vsp I,下游为NheI。根据NCBI基因序列及所预测的启动子区域设计上下游引物，并于5'端添加酶切位点和保护碱基，合成引物序列，上游引物FP(Forward Primer)，共用下游引物命名为Exon-RP(Reverse Primer)，具体如表1所示。

表1 3个启动子片段的扩增用引物一览表

3.提取正常人血液基因组DNA(货号：DP304)，具体步骤如下；

①取血液200μL或上述细胞悬液，3000rpm×5min离心，弃上清；

②加200μL Buffer GA，吹混；

③加20μL的Proteinase K，上下颠倒混匀；

④加200μL Buffer GB，上下颠倒混匀，70℃金属浴10min，溶液应变清亮，瞬时离心；

⑤加200μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，瞬时离心；

⑥将上述溶液转移至提前标记好的CB3吸附柱中，12000rpm×1min，弃滤液；

⑦加500μL Buffer GD，12000rpm×1min离心，弃滤液；

⑧加600μL Buffer PW，12000rpm×1min离心，弃滤液；

⑨重复⑧，然后12000rpm×2min离心，弃滤液，并将吸附柱转移至提前标记好的干净的1.5ml epp管中，开盖晾干5-10min；

⑩向吸附柱中央加100μL的纯净水，55℃孵育5min，12000rpm×2min离心，收集EP管中的液体。

4.PCR扩增启动子片段(Q5酶，货号：M0491S)，具体步骤如下：

①根据所需扩增的目的片段设计并合成其上下游引物，将引物稀释成10mM后使用；

②准备冰盒，实验操作均佩戴手套，准备0.2ml PCR管，不同样不同试剂谨记更换枪头。加样遵从：量多到量少，酶类最后加，加样时再取出。提前做好标记；

③PCR反应体系及参数如表2所示(体系可倍比增加，以实验目的而定)。

表2反应体系

PCR反应程序：

step1预变性：95℃3min；

step2变性：95℃30sec，

step3退火：60℃30sec，

step4延伸：72℃30sec，40个循环；

step 5再延伸：72℃5min。

5.PCR产物纯化(货号：DP204-02)：

①柱平衡：向CB3吸附柱中加500μL的buffer BL，12000rpm×1min离心，弃滤液；

②向PCR产物中加5倍体积的buffer PB，充分混匀；

③将2中的液体转移至平衡过得CB3中(需提前做好标记)，12000rpm×1min，弃滤液；

④加600μL PW,室温静置2-5min，12000rpm×1min离心，弃滤液；

⑤重复4；

⑥12000rpm×2min离心，弃滤液，可室温静置数分钟晾干；

⑦将CB3转移至提前标记好的新的1.5mL EPP管中，向吸附膜中间悬空滴加50μL以上的洗脱液，12000rpm×2min离心，收集滤液，进行浓度测定。

6.VspI和NheI双酶切骨架及目的片段(货号：VspI：FD0914；NheI:FD0947)：酶切体系如表3所示(可成比例减少或增加)。

表3酶切反应体系

7.PCR产物割胶回收切除酶切位点后的条带，骨架质粒割胶回收酶切后较长的含有EGFP的片段(割胶回收试剂盒，货号：K0691)，具体步骤如下：

①清洗电泳槽等物品，配制1％琼脂糖凝胶；

②上样：Mark加样5μL，酶切产物全部加入加样孔中，并隔孔加样；

③120V电泳30min，同时取1.5mL EPP管，做好标记，并称重；

④割取含有目的条带的凝胶并收集于EPP管中；

⑤称总重，减去管重，计算出胶重；

⑥加入与胶重1:1体积的bindingbuffer，55℃金属浴10min，直至胶片完全溶解；

⑦加入与胶重1:1体积的异丙醇吹混；

⑧将上述液体转移至提前标记好的吸附柱中，12000rpm×1min离心，弃滤液，加100μL的binding buffer，12000rpm×2min离心，弃滤液；

⑨加700μL的wash buffer，12000rpm×2min离心，弃滤液，12000rpm×2min离心，弃滤液，并将柱子转移至新的提前标记好的EPP管中，晾干5min；

⑩加30μL纯水，55℃金属浴5min，12000rpm×2min离心，收集滤液，取2μL测定浓度。

8.连接(T4 DNA ligase，货号：EL0011)，具体步骤如下：

片段：骨架＝3：1(质量比)，故片段(ng)＝骨架(ng)×3×片段长度/骨架片段长度，具体连接体系如表4，加样完成后室温连接2h或过夜连接。

表4连接反应体系

9.转化(货号：CB101-02)：

①取出质粒放冰上，取出感受态放冰上融化；

②将5μL质粒加入50μL感受态中，冰上静置30min；

③热休克：42℃，90sec热击；

④立即放冰上静置5min；

⑤复苏：加入150μL无抗性液体性培养基37℃，160rpm培养1h；

⑥涂板:取出复苏菌液，通过灭菌珠子涂布在LB带抗性的固体培养基上；

⑦37℃过夜培养，观察菌落生长情况；

10.单克隆菌落的扩增：

取15mL离心管，加5mL无抗性液体性培养基，加入kana，使其终浓度为50μg/mL，高压后的枪头挑取单个菌落打入离心管中，在37℃、160rpm条件下过夜培养。

11.扩增的质粒提取(货号：AP-MN-P-50)，具体步骤如下：

①取1～4ml细菌培养物,12000rpm×2min离心，弃净上清，(菌液可以通过多次离心将菌体沉淀收集到1个离心管中)；

②向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL Buffer S1(如果为第1次使用，使用前先加入RNaseA)，吹吸重悬，至不留有小菌块；

③向离心管中加入250μL Buffer S2，温和地上下转6～8次，使菌体充分裂解(注意:混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏)；

④向离心管中加入350u1 Buffer S3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀；12000rpm×10min离心，小心地将上清转移到提前标记好的吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中；

⑤向吸附柱中加入500μL漂洗液W1，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；

⑥向吸附柱中加700μL漂洗液W2(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)，12000rpm×1min离心，弃滤液，将吸附柱放回收集管中；

⑦重复⑥；

⑧12000rpm×2min离心，并将吸附柱转移至新的提前标记好的EPP管中，敞口置于室温数分钟，去除吸附柱中残余的漂洗液；

⑨向吸附膜中央悬空滴加60～80μL ddH₂O，55℃孵育8min，12000rpm×2min离心，收集滤液即为提取的质粒DNA。

12.验证重组质粒是否连接正确：重组质粒命名为pEGFP-βp(Exon152bp)，编号为8005；pEGFP-βp(Exon266bp)，编号为8004；pEGFP-βp(Exon422bp)，编号为8006。

①双酶切后电泳验证：酶切体系同前，可用较小的10μL或5μL体系，酶切后进行电泳验证条带大小，如图1B所示，8005、8004、8006质粒酶切后条带大小分别为：4148bp+152bp，4148bp+266bp，4148bp+422bp。

②测序验证：取提取后的质粒外送测序插入片段进一步验证质粒是否构建成功，8005、8004、8006质粒片段测序正确，8004测序结果如图2所示。

13.重组的启动子质粒活性检测和特异性验证：

①不同长度的重组启动子质粒活性检测：

细胞转染：采用脂质体转染K562细胞(货号：L3000015)，具体步骤如下：

准备培养板，离心收集细胞，PBS洗1遍，将细胞接种至6孔板或12孔板中，放回培养箱继续培养，然后加转染体系：A管：稀释脂质体：250μL opti-MEM+7.5μL lipofectation，B管：稀释DNA：250μL opti-MEM+5μL P3000+1μg重组质粒DNA+1μg带红色荧光的mCherry质粒，A+B混匀，室温孵育15min，将孵育液加至K562细胞孔中，培养箱中培养，12h及24h后观察红色荧光中的绿色荧光细胞数，进行启动子活性检测，活性检测结果如图3所示，无论是12h(图3A)还是24h(图3B)，8005重组质粒，即启动子长度为266bp时启动子活性最佳。

②8004重组启动子质粒特异性检测：

细胞转染：采用脂质体转染不同细胞系(货号：L3000015)，具体步骤如下：

准备培养板，离心收集细胞，PBS洗1遍，将细胞接种至6孔板或12孔板中，放回培养箱继续培养，然后加转染体系：A管：稀释脂质体：250μL opti-MEM+7.5μL lipofectation，B管：稀释DNA：250μL opti-MEM+5μL P3000+1μg重组质粒DNA+1μg带红色荧光的mCherry质粒，A+B混匀，室温孵育15min，将孵育液加至K562、Huvec、293T、293、HL60细胞孔中，培养箱中培养，12h或24h后观察红色荧光中的绿色荧光细胞数，进行启动子特异性检测，特异性检测结果如图4所示，K562细胞中表达量明显高于其它几组，且其它几组中表达量极低。

实施例2

采用筛选出的启动子长度进行不含β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的质粒构建

1.从http://www.genomatix.de/网址预测β珠蛋白的增强子核心区域，结合文献查询结果既往不同载体中的启动子长度，扩增从活性最佳的启动子开始(第1外显子前266bp)到β珠蛋白增强子的不含β珠蛋白基因座控区LCR(HS)，命名为：pβp(Exon266 bp)-βglobin-βE-713，编号为8019。

2.在骨架质粒选出单一酶切位点，上游为Vsp I,下游为NotI，根据NCBI基因序列及所预测的启动子区域设计上下游引物，并于5’端添加酶切位点和保护碱基。

表5本发明保护的启动子扩增用引物序列信息

3.提取正常人血液基因组DNA(货号：DP304)，具体步骤同实施例1。

4.PCR扩增不含β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的β珠蛋白片段(Phusion酶，货号：F530S)，具体步骤如下：PCR扩增反应体系见表6，其中Phusion酶，货号：F530S。

表6β珠蛋白基因片段PCR扩增反应体系

PCR反应程序：

step1预变性：98℃2min

step2变性：98℃10sec

step3退火：63℃30sec；

step4延伸：72℃30s～5min依据扩增长度而定，40个循环；

step 5再延伸：72℃5min

step6暂存：4℃30min左右，视自己的时间而定

5.扩增的PCR产物纯化：(普通DNA产物纯化试剂盒，货号：DP-204-02)，具体步骤同实施例1。

6.VspI和NotI双酶切骨架及目的片段(货号：VspI：FD0914；NotI:FD0594)：酶切体系如表7所示(可成比例减少或增加)。

表7VspI和NheI双酶切反应体系

7.割胶回收目的片段和713质粒骨架，(割胶回收试剂盒，货号：K0691)，具体步骤同实施例1。

8.连接(T4 DNAligase，货号：EL0011)，具体步骤同实施例1。

9.转化(货号：CB101-02)，具体步骤同实施例1。

10.单克隆菌落的扩增：具体步骤同实施例1。

11.扩增的质粒提取(货号：AP-MN-P-50)，具体步骤同实施例1。

12.验证不含LCR的β珠蛋白重组质粒是否连接正确：重组质粒命名为：pβp(Exon266bp)-βglobin-βE-713，编号为8019。

①双酶切后电泳验证：酶切体系同前，可用较小的10μL或5μL体系，酶切后进行电泳验证条带大小，如图5A所示，8019质粒酶切后条带大小为2718bp和3339bp。

②测序验证：取提取后的质粒外送测序插入片段进一步验证质粒是否构建成功，如图5B所示，测序结果提示含8个与NCBI序列不一致的位点，但均位于ORF阅读框外。

实施例3

不含LCR的β珠蛋白重组质粒有效性检测，重组质粒电转染K562细胞，并设置未转染及空白转染细胞作为对照组，通过qPCR检测β珠蛋白mRNA相对表达量，通过WB检测β珠蛋白蛋白表达含量，结果如图5C、图5D所示，与对照组相比，无论是从mRNA水平还是蛋白水平看β珠蛋白表达量较空白组均无明显改变，差异无统计学意义。

(1)电转K562细胞(电极管套装，货号：No.1207)，具体步骤如下：

准备培养板，向培养孔中加入全培，放培养箱中孵育。离心收集细胞，PBS洗1遍，向细胞中加入20μL电转液和4μg的重组质粒，吹吸混匀，转移至电转杯中，然后据不同细胞的电转条件进行电转，将电转后的体系加入至放培养箱孵育的培养板对应孔中，培养箱中培养，48h后进行RNA及蛋白提取实验，然后进行β珠蛋白含量的检测。

(2)qPCR检测β珠蛋白mRNA相对表达量：具体方法如下：

①RNA提取(RNA提取试剂盒，货号：R1058)，具体步骤如下：

A:重悬细胞，PBS洗涤一次；

B:进行细胞计数；

C:留取洗涤后的细胞沉淀，向其中加入300μL细胞裂解液，吹匀；

D:转移裂解后的细胞于黄色吸附柱中，12000rpm×2min离心，留滤液，弃吸附柱；

E:向滤液中加入150μL无水乙醇，混匀后转移至绿色吸附柱中，12000rpm×2min离心，弃滤液；

F:向吸附柱中加入400μL wash buffer，离心去滤液；

G:取1无酶EPP管，将75μL DNA digestion buffer与5μL DNase混匀后加至吸附柱中，室温孵育15min；

H:孵育结束后，向柱中加入400μL RNAprep buffer，12000rpm×2min离心，弃滤液；

I:向柱中加入700μL RNA WASH BUFFER，12000rpm×2min离心，弃滤液，加400μLRNA WASH BUFFER，12000rpm，3min，弃滤液；

J:取无酶EP管，将绿色吸附柱转移至EP管中，向中央加入100μL DNase/RNaseFree Water，12000rpm×2min离心，离心获得的RNA，取出适量分装，以备测定浓度、电泳检测使用，目的是减少RNA的反复冻融，RNA储存在-80℃。(RNA电泳：提前更换电泳液，取100～500ng的RNA与loading和无酶水混匀，加样，10V/cm进行电泳)

②逆转录合成cDNA(逆转录试剂盒:Thermo:RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit，货号：K1621)，具体步骤如下：

A:计算RNA所需的量，20μL体系，一般用1μg的RNA，体系可适当放大或缩小(RNA可用0.1ng～5μg不等)；

B:取出逆转录试剂盒中除酶外的试剂放于冰上；

C:取0.2ml的无酶EPP管做好标记，放于冰上；

D:加样：无酶水XμL+RNA 1μg+Random Primer 1μL；

无酶水体积＝20μL的体系-8μL的步骤⑥所加的试剂量-RNA-Random Primer 1μL

E:65℃金属浴5min，放回冰上；

F:按顺序加下列试剂：共8μL。

表8逆转录反应体系

G:瞬离，42℃金属浴60min；

H:25℃×5min预合成；

I:70℃×5min终止反应；

J:-80℃保存或进行后续实验。

③q-PCR检测珠蛋白水平：

q-PCR体系：实验组：无酶水6.8μL+2×SYBR 10μL+cDNA 1.6μL+上游引物0.8μL+下游引物0.8μL(上游引物：mRNA-F-2：CTGAGGAGAAG TCTGCCGTTA，SEQ ID NO：14，下游引物：mRNA-R-2：GAGGTTGTCC AGGTGAGCCA，SEQ ID NO：15)。空白对照组：无酶水8.4μL+2×SYBR10μL+上游引物0.8μL+下游引物0.8μL(每组需重复3个孔，故可提前将水和cDNA混合后再平均分配至各孔中)。

q-PCR程序设置：详见仪器说明书，但需提前了解引物的退火温度，内参引物和实验组引物退火温度不能相差太大，一般取平均值；

(3)WB检测β珠蛋白水平(βglobin一抗、二抗，货号：SC-21757、62-6520)，具体步骤如下：

①收集细胞：离心收集细胞，PBS洗涤1遍，细胞计数板计数细胞；

②提取细胞总蛋白：加入裂解液(强裂解液+PMSF＝100：1)，按3～5×106个细胞加50～100μL的比例，冰上振荡裂解1h；

③蛋白变性：向蛋白样品内加入5×蛋白上样缓冲液，使其终浓度为1×，裹上封口胶金属浴100℃×10min变性；

④预冷离心机后，12000rpm×20min，4℃离心，上清即为蛋白样品；

⑤配胶；

⑥取离心上清上样电泳；

⑦转膜和封闭；

⑧一抗孵育：室温孵育1h或4℃过夜孵育，然后PBST洗涤三遍，每遍10min；

⑨二抗孵育：室温孵育1h或4℃过夜孵育，然后PBST洗涤三遍，每遍10min；

⑩1:1配制曝光液，将曝光液滴加至洗涤好的膜上，Bio-rad曝光机曝光。

实施例3

采用筛选出的启动子长度进行含不同β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的反向β珠蛋白质粒构建及有效性、特异性检测，最终获得一种高效特异的携带人β珠蛋白基因的重组序列。

1.含HS4～1的反向β珠蛋白质粒合成：从http://www.genomatix.de/网址预测β珠蛋白的LCR区域，结合相关文献结果，HS4～1对β珠蛋白的表达均有增强作用，且大部分文章中将β珠蛋白反向插入重组质粒，这可能对β珠蛋白表达有增强作用，故将HS4～1与实施例2中的β珠蛋白序列相连，因实施例2中构建的8019重组质粒中含突变序列，故设计无突变的含β珠蛋白基因座控区HS4～1、β珠蛋白基因启动子、β珠蛋白编码序列、β珠蛋白基因增强子序列的重组β珠蛋白序列，具体序列如下所示，并在生工进行合成，合成的序列与pUC57载体相连，命名为pHS(4～1)-βp(Exon266bp)-βglobin-βE-pUC57，编号为：8023，然后进行酶切及测序。8023酶切结果如图6A所示经比对，序列正确。

2.不含HS4的重组反向β珠蛋白质粒，以8023为模板进行构建，构建的质粒命名为pHS(3～1)-βp(Exon266bp)-βglobin-βE-pUC57，编号为8405，具体方法为：在HS3的上游设计正向引物，并加KpnI酶切位点，引物为：HS3-pUC57-F：CTTggtac caagactgagctcagaaga(SEQ ID NO：16)，在enhancer的下游设计反向引物，并加SalI酶切位点，引物为lv-R-2：GCCGTCGACtggtaacactatgctaataac(SEQ ID NO：17)，以8023为模板进行PCR，然后进行产物纯化，DpnI、kpnI、SaII酶切PCR产物，kpnI、SaII酶切骨架(DpnI货号：FD1703，kpnI货号：FD0524，SaII货号：FD0644)割胶回收目的片段，割胶回收目的片段，T4 DNA连接酶连接，转化扩增，酶切和测序验证，酶切及测序验证片段序列正确，酶切结果如图6A所示，测序结果如图7所示，构建中涉及的详细实验方法同前。

3.不含HS1的重组反向β珠蛋白质粒构建，以8023为模板，构建的质粒命名为pHS(4～2)-βp(Exon266bp)-βglobin-βE-pUC57，编号为8406，具体方法为：在HS1的下游设计正向引物，在HS2的下游设计反向引物，并在上下游引物的5’端加相同的BgIII酶切位点，引物为：

BgIII-E266-F:GCGagatct

ATCGTAAATACACTTGC(SEQ ID NO：18)；BgIII-HS2-R:GCGagatctTTCAG

GAAATAATATATTC(SEQ ID NO：19)，以8023为模板进行PCR，然后进行产物纯化，DpnI、BgIII酶切过夜(BgIII货号:FD0084)，割胶回收目的片段，T4 DNA连接酶连接，转化扩增，酶切和测序验证，KpnI酶切及测序验证片段序列正确，酶切结果如图6A所示，构建中涉及的详细实验方法同前。

4.用8023质粒4μg电转染K562和293T细胞系，验证重组质粒的特异性，具体方法同实施例2，结果如图8所示，转染相同的β珠蛋白后293T细胞中β珠蛋白表达量仍无明显升高，表明该序列是相对特异的，结合启动子特异性检测结果，考虑构建的质粒具有一定的红系特异性。

5.检测以上三种含不同β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的反向β珠蛋白序列的有效性，具体方法为：

①电转K562细胞(电极管套装，货号：No.1207)，具体步骤同实施例2。

②qPCR检测β珠蛋白mRNA相对表达量：具体步骤同实施例2。

③WB检测β珠蛋白水平(βglobin一抗、二抗，货号：SC-21757、62-6520)，具体步骤具体步骤同实施例2。

④WB检测结果如图6B、图6C所示，为编号为8405的重组质粒β珠蛋白表达量最高，即不含HS4的HS(3～1)-βp(Exon266bp)-βglobin-βE-puc57的反向β珠蛋白质粒β珠蛋白表达量最高，表明HS3～1-βp(Exon266bp)-βglobin-βE序列能高效表达β珠蛋白。

由上述实施例可知，本发明首先构建人β珠蛋白基因启动子质粒并进行优化，构建3种长度的启动子-EGFP质粒，采用与Mcherry质粒共转染的方法筛选出活性佳、特异性强、长度为266bp的启动子区域。本发明采用筛选出的启动子长度进行不含β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的质粒构建及有效性检测；然后采用筛选出的启动子长度进行含不同β珠蛋白基因座控区LCR(HS)的反向β珠蛋白质粒构建及有效性、特异性检测，最终获得依次含HS3～1的调控区域、人β珠蛋白基因266bp启动子和增强子的重组序列，所述重组序列能够高效特异表达人β珠蛋白基因，为后续基因治疗地中海贫血提供了基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵州医科大学

<120> 一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcgtaaata cacttgcaaa ggaggatgtt tttagtagca atttgtactg atggtatggg 60

gccaagagat atatcttaga gggagggctg agggtttgaa gtccaactcc taagccagtg 120

ccagaagagc caaggacagg tacggctgtc atcacttaga cctcaccctg tggagccaca 180

ccctagggtt ggccaatcta ctcccaggag cagggagggc aggagccagg gctgggcata 240

aaagtcaggg cagagccatc tattgctt 268

<210> 2

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgctagtctc ccggaactat cactctttca cagtctgctt tggaaggact gggcttagta 60

tgaaaagtta ggactgagaa gaatttgaaa ggcggctttt tgtagcttga tattcactac 120

tgtcttatta ccctgtcata ggcccacccc aaatggaagt cccattcttc ctcaggatgt 180

ttaagattag cattcaggaa gagatcagag gtctgctggc tcccttatca tgtcccttat 240

ggtgcttctg gctctgcagt tattagcata gtgttacca 279

<210> 3

<211> 2167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 60

tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 120

ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca 180

atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt ttctgatagg cactgactct 240

ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 300

aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 360

gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 420

aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 480

cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt ttctttcccc ttcttttcta 540

tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg tacagtttag aatgggaaac 600

agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt ttagtttctt ttatttgctg 660

ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct ttttttttct tctccgcaat 720

ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca aaaggaaata tctctgagat 780

acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct agtacattac tatttggaat 840

atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt attttctttt atttttaatt 900

gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa tgttttaata tgtgtacaca 960

tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa aaaatgcttt cttcttttaa 1020

tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat 1080

aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg 1140

ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat 1200

gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt 1260

atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt 1320

catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca 1380

tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg 1440

tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct 1500

attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc 1560

ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt cattgcaatg atgtatttaa 1620

attatttctg aatattttac taaaaaggga atgtgggagg tcagtgcatt taaaacataa 1680

agaaatgaag agctagttca aaccttggga aaatacacta tatcttaaac tccatgaaag 1740

aaggtgaggc tgcaaacagc taatgcacat tggcaacagc ccctgatgca tatgccttat 1800

tcatccctca gaaaaggatt caagtagagg cttgatttgg aggttaaagt tttgctatgc 1860

tgtattttac attacttatt gttttagctg tcctcatgaa tgtcttttca ctacccattt 1920

gcttatcctg catctctcag ccttgactcc actcagttct cttgcttaga gataccacct 1980

ttcccctgaa gtgttccttc catgttttac ggcgagatgg tttctcctcg cctggccact 2040

cagccttagt tgtctctgtt gtcttataga ggtctacttg aagaaggaaa aacaggggtc 2100

atggtttgac tgtcctgtga gcccttcttc cctgcctccc ccactcacag tgacccggaa 2160

tctgcag 2167

<210> 4

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcctggta tcctaggact tgcaagttat ctggtcactt tagccctcac gttttgatga 60

taatcacata tttgtaaaca caacacacac acacacacac acacacatat atatatatat 120

aaaacatata tatacataaa cacacataac atatttatcg ggcatttctg agcaactaat 180

catgcaggac tctcaaacac taacctatag ccttttctat gtatctactt gtgtagaaac 240

caagcgtggg gactgagaag gcaatagcag gagcattctg actctcactg cctttagcta 300

ggcccctccc tcatcacagc tcagcatagt cctgagctct tatctatatc cacacacagt 360

ttctgacgct gcccagctat caccatccca agtctaaaga aaaaaataat gggtttgccc 420

atctctgttg attagaaaac aaaacaaaat aaaataagcc cctaagctcc cagaaaacat 480

gactaaacca gcaagaagaa gaaaatacaa taggtatatg aggagactgg tgacactagt 540

gtctgaatga ggcttgag 558

<210> 5

<211> 470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgaatgat tactatactt tttacaagct cagctccctc tatcccttcc agcatcctca 60

tctctgatta aataagcttc agtttttcct tagttcctgt tacatttctg tgtgtctcca 120

ttagtgacct cccatagtcc aagcatgagc agttctggcc aggcccctgt cggggtcagt 180

gccccacccc cgccttctgg ttctgtgtaa ccttctaagc aaaccttctg gctcaagcac 240

agcaatgctg agtcatgatg agtcatgctg aggcttaggg tgtgtgccca gatgttctca 300

gcctagagtg atgactccta tctgggtccc cagcaggatg cttacagggc agatggcaaa 360

aaaaaggaga agctgaccac ctgactaaaa ctccacctca aacggcatca taaagaaaat 420

ggatgcctga gacagaatgt gacatattct agaatatatt atttcctgaa 470

<210> 6

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagactgagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg gacatgtcag aggcagtgcc 60

agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct gtgctgcact gatgaggagg 120

atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt ggataaagga gacagccatg 180

aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta aggacttgga tttcaaggaa 240

ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc gagctggtgt gccagatgtg 300

tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc tggccaccag ctatcagggc 360

ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta ggtcaggttg gtggtgctgg 420

gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca tgagtagagg gcagacatgg 480

gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc tactactaca tgggactgct 540

cccctatacc cccagctagg ggcaagtgcc ttgactccta tgttttcagg atcatcatct 600

ataaagtaag agtaataatt gtgtctatct catagggtta ttat 644

<210> 7

<211> 4386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagactgagc tcagaagagt caagcatttg cctaaggtcg gacatgtcag aggcagtgcc 60

agacctatgt gagactctgc agctactgct catgggccct gtgctgcact gatgaggagg 120

atcagatgga tggggcaatg aagcaaagga atcattctgt ggataaagga gacagccatg 180

aagaagtcta tgactgtaaa tttgggagca ggagtctcta aggacttgga tttcaaggaa 240

ttttgactca gcaaacacaa gaccctcacg gtgactttgc gagctggtgt gccagatgtg 300

tctatcagag gttccaggga gggtggggtg gggtcagggc tggccaccag ctatcagggc 360

ccagatgggt tataggctgg caggctcaga taggtggtta ggtcaggttg gtggtgctgg 420

gtggagtcca tgactcccag gagccaggag agatagacca tgagtagagg gcagacatgg 480

gaaaggtggg ggaggcacag catagcagca tttttcattc tactactaca tgggactgct 540

cccctatacc cccagctagg ggcaagtgcc ttgactccta tgttttcagg atcatcatct 600

ataaagtaag agtaataatt gtgtctatct catagggtta ttatgctgaa tgattactat 660

actttttaca agctcagctc cctctatccc ttccagcatc ctcatctctg attaaataag 720

cttcagtttt tccttagttc ctgttacatt tctgtgtgtc tccattagtg acctcccata 780

gtccaagcat gagcagttct ggccaggccc ctgtcggggt cagtgcccca cccccgcctt 840

ctggttctgt gtaaccttct aagcaaacct tctggctcaa gcacagcaat gctgagtcat 900

gatgagtcat gctgaggctt agggtgtgtg cccagatgtt ctcagcctag agtgatgact 960

cctatctggg tccccagcag gatgcttaca gggcagatgg caaaaaaaag gagaagctga 1020

ccacctgact aaaactccac ctcaaacggc atcataaaga aaatggatgc ctgagacaga 1080

atgtgacata ttctagaata tattatttcc tgaatttcct ggtatcctag gacttgcaag 1140

ttatctggtc actttagccc tcacgttttg atgataatca catatttgta aacacaacac 1200

acacacacac acacacacac atatatatat atataaaaca tatatataca taaacacaca 1260

taacatattt atcgggcatt tctgagcaac taatcatgca ggactctcaa acactaacct 1320

atagcctttt ctatgtatct acttgtgtag aaaccaagcg tggggactga gaaggcaata 1380

gcaggagcat tctgactctc actgccttta gctaggcccc tccctcatca cagctcagca 1440

tagtcctgag ctcttatcta tatccacaca cagtttctga cgctgcccag ctatcaccat 1500

cccaagtcta aagaaaaaaa taatgggttt gcccatctct gttgattaga aaacaaaaca 1560

aaataaaata agcccctaag ctcccagaaa acatgactaa accagcaaga agaagaaaat 1620

acaataggta tatgaggaga ctggtgacac tagtgtctga atgaggcttg agatcgtaaa 1680

tacacttgca aaggaggatg tttttagtag caatttgtac tgatggtatg gggccaagag 1740

atatatctta gagggagggc tgagggtttg aagtccaact cctaagccag tgccagaaga 1800

gccaaggaca ggtacggctg tcatcactta gacctcaccc tgtggagcca caccctaggg 1860

ttggccaatc tactcccagg agcagggagg gcaggagcca gggctgggca taaaagtcag 1920

ggcagagcca tctattgctt acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca 1980

aacagacacc atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg 2040

caaggtgaac gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggttggtat caaggttaca 2100

agacaggttt aaggagacca atagaaactg ggcatgtgga gacagagaag actcttgggt 2160

ttctgatagg cactgactct ctctgcctat tggtctattt tcccaccctt aggctgctgg 2220

tggtctaccc ttggacccag aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg 2280

ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg 2340

atggcctggc tcacctggac aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact 2400

gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact tcagggtgag tctatgggac gcttgatgtt 2460

ttctttcccc ttcttttcta tggttaagtt catgtcatag gaaggggata agtaacaggg 2520

tacagtttag aatgggaaac agacgaatga ttgcatcagt gtggaagtct caggatcgtt 2580

ttagtttctt ttatttgctg ttcataacaa ttgttttctt ttgtttaatt cttgctttct 2640

ttttttttct tctccgcaat ttttactatt atacttaatg ccttaacatt gtgtataaca 2700

aaaggaaata tctctgagat acattaagta acttaaaaaa aaactttaca cagtctgcct 2760

agtacattac tatttggaat atatgtgtgc ttatttgcat attcataatc tccctacttt 2820

attttctttt atttttaatt gatacataat cattatacat atttatgggt taaagtgtaa 2880

tgttttaata tgtgtacaca tattgaccaa atcagggtaa ttttgcattt gtaattttaa 2940

aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa 3000

tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag 3060

aataacagtg ataatttctg ggttaaggca atagcaatat ctctgcatat aaatatttct 3120

gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc 3180

taccattctg cttttatttt atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag 3240

gcccttttgc taatcatgtt catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg 3300

ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc 3360

tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc acaagtatca ctaagctcgc 3420

tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact 3480

gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt 3540

cattgcaatg atgtatttaa attatttctg aatattttac taaaaaggga atgtgggagg 3600

tcagtgcatt taaaacataa agaaatgaag agctagttca aaccttggga aaatacacta 3660

tatcttaaac tccatgaaag aaggtgaggc tgcaaacagc taatgcacat tggcaacagc 3720

ccctgatgca tatgccttat tcatccctca gaaaaggatt caagtagagg cttgatttgg 3780

aggttaaagt tttgctatgc tgtattttac attacttatt gttttagctg tcctcatgaa 3840

tgtcttttca ctacccattt gcttatcctg catctctcag ccttgactcc actcagttct 3900

cttgcttaga gataccacct ttcccctgaa gtgttccttc catgttttac ggcgagatgg 3960

tttctcctcg cctggccact cagccttagt tgtctctgtt gtcttataga ggtctacttg 4020

aagaaggaaa aacaggggtc atggtttgac tgtcctgtga gcccttcttc cctgcctccc 4080

ccactcacag tgacccggaa tctgcagtgc tagtctcccg gaactatcac tctttcacag 4140

tctgctttgg aaggactggg cttagtatga aaagttagga ctgagaagaa tttgaaaggc 4200

ggctttttgt agcttgatat tcactactgt cttattaccc tgtcataggc ccaccccaaa 4260

tggaagtccc attcttcctc aggatgttta agattagcat tcaggaagag atcagaggtc 4320

tgctggctcc cttatcatgt cccttatggt gcttctggct ctgcagttat tagcatagtg 4380

ttacca 4386

<210> 8

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65 70 75 80

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgattaatag tgccagaaga gccaagga 28

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgattaatcg taaatacact tgcaaaggag g 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgattaatcg taaatacact tgcaaaggag g 31

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atattgctag caagcaatag atggctctgc c 31

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcggccgc tggtaacact atgctaataa 30

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgaggagaa gtctgccgtt a 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaggttgtcc aggtgagcca 20

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttggtacca agactgagct cagaaga 27

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gccgtcgact ggtaacacta tgctaataac 30

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgagatcta tcgtaaatac acttgc 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgagatctt tcaggaaata atatattc 28

Claims (10)

1.一种红系特异性的人β珠蛋白基因启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种在红系细胞中特异表达人β珠蛋白的重组序列，其特征在于，所述重组序列为人的β珠蛋白基因座控区HS3～1-人β珠蛋白基因启动子-β珠蛋白基因-β珠蛋白基因增强子；

所述人β珠蛋白基因启动子为权利要求1所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子。

3.根据权利要求2所述重组序列，其特征在于，所述β珠蛋白基因增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求2所述重组序列，其特征在于，所述β珠蛋白基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。

5.根据权利要求2所述重组序列，其特征在于，所述β珠蛋白基因座控区HS3～1依次包括β珠蛋白基因座控区HS3、β珠蛋白基因座控区HS2和β珠蛋白基因座控区HS1；

所述β珠蛋白基因座控区HS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述β珠蛋白基因座控区HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述β珠蛋白基因座控区HS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

6.根据权利要求2～5任意一项所述重组序列，其特征在于，所述重组序列包括以下DNA序列中的至少一种：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的DNA序列；

2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的重组蛋白的DNA序列。

7.一种包含权利要求2～6任意一项所述重组序列的重组载体。

8.根据权利要求7所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括哺乳动物表达载体和/或慢病毒载体。

9.权利要求1所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、权利要求2～6任意一项所述重组序列或权利要求8或9所述重组载体在制备基因治疗β地中海贫血的药物中的应用。

10.一种用于基因治疗β地中海贫血的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述红系特异性的人β珠蛋白基因启动子、权利要求2～6任意一项所述重组序列或权利要求7或8所述重组载体。

Images