CN101348786A

CN101348786A - 一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体

Info

Publication number: CN101348786A
Application number: CNA2007100440406A
Authority: CN
Inventors: 谭孟群
Original assignee: 谭孟群
Current assignee: Shenzhen Zhenxing Medicine Technology Co., Ltd.
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2009-01-21
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: CN101348786B

Abstract

本发明公开了一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因及含有其的重组腺相关病毒载体，以及该重组载体的制备方法。该重组腺相关病毒载体在腺相关病毒的反向末端重复序列ITR之间插入有人β－珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段，以及该含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因序列。该重组载体转染效率高，介导的外源基因可在体内长期表达，且安全性好，可用于β地中海贫血的基因治疗。

Description

一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因及含有其的重组腺相关病毒载体，以及该重组载体的制备方法和在β地中海贫血的基因治疗中的应用。

背景技术

β地中海贫血(海洋性贫血)是一组以血红蛋白的β珠蛋白肽链合成减少或缺失为特征的遗传性血液病。该病在地中海流域及东南亚发病率高达10％。我国广东、广西地区检出率可达3-4％。重型β-地中海贫血严重威胁患儿生命，目前临床治疗主要依靠输血，而长期输血易引起体内铁负荷过度，过多吸收的铁超出血清转铁蛋白的能力沉积脏器，引起多器官病变，且不能达到根治的目的。造血干细胞移植虽能医治部分患者，但受供体来源及移植后并发症等影响，难于广泛应用。因此寻找有效治疗手段是临床医生和患者的急切愿望。

将β-珠蛋白基因导入患者的造血干细胞是最有希望的治疗形式之一。已有研究报道用逆转录病毒载体介导外源β珠蛋白基因转入小鼠体内，可检测到外源β珠蛋白基因的低表达，相继有报道，逆转录病毒载体整合具有随机性，可导致插入突变，激活原癌基因或抑癌基因失活引发恶性肿瘤(Proc.Natl.Acad.Sci USA，1995，92：6728-6732；Science，2003，302：415-419)。近年来，有研究报道用慢病毒载体能高效介导外源β珠蛋白基因在小鼠体内稳定长期表达，但其生物安全性仍有待改进(Nature.2000，406：82-86)。

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员，为无包膜的线性单链DNA病毒。由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点，人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望。但是，近来发现，这类载体在应用上有许多明显的缺陷，包括某些细胞膜上病毒受体数量极少，重组AAV载体位点特异性整合不足，AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应，载体容量小(Curr.Top.Microbiol.Immunol.1996，218：1-23；Proc.Natl.Acad.Sci USA，1990，87：2211-2215)，装载的目的基因片段大小受一定的限制等等。因此，能否将β-珠蛋白基因导入腺相关病毒载体并获得稳定的表达还是个未知数。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能在体内稳定长期表达，生物安全性更高的重组腺相关病毒载体及其制备方法，以及适于该载体的含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因。

由于用病毒载体介导外源正常的β-珠蛋白基因转导造血干/祖细胞，随造血干/祖细胞在体内的增殖和分化使外源β-珠蛋白基因得到持久而稳定的表达，以纠正血红蛋白β珠蛋白肽链合成减少或缺失，是β地中海贫血基因治疗的策略。本发明人曾选用与人类疾病无相关性、生物安全性较好的腺相关病毒作为载体，构建了包括腺相关病毒的反向末端重复序列ITR，人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段(HS234)，以及含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因序列(β-globin)的重组腺相关病毒载体。将上述重组腺相关病毒载体转染β地中海贫血小鼠的骨髓造血干/祖细胞，并将其移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人β-珠蛋白基因并有表达，可持续12个月(参见Tan Mengqun，Qing Keyun，ZhouShangzhen，et al.Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroidlineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene inhematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice.Mol Ther，2001，3(6)：940～946.)。然而，该重组载体中的β-globin序列，以及HS234核苷酸序列均克隆自含有其的质粒，这些质粒并非商业质粒，公众不能取得；且由于带有适于质粒的修饰片段，上述核苷酸序列，特别是β-globin序列较长(＞3kb)，表达效率低。

本发明人在上述试验基础上，直接从人β-珠蛋白基因Genomic DNA中分别克隆了HS2、HS3和HS4核苷酸序列，以及含有人β珠蛋白基因启动子的β-globin序列，将其导入腺相关病毒构建重组载体。本发明人惊奇地发现，由于导入的β-globin序列＜3kb，为2472kb，更适合现有腺相关病毒载体。将该重组载体转染缺乏人β-珠蛋白基因表达的K562细胞株，可检测到外源人β-珠蛋白基因在该细胞的表达；用该重组腺相关病毒载体转染β地中海贫血小鼠的骨髓造血干/祖细胞或流产β地中海贫血胎儿造血细胞，将其移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人β-珠蛋白基因并有表达，且持续稳定表达一年以上。

因此，本发明提供的一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

而本发明的一种重组腺相关病毒载体，其在腺相关病毒的反向末端重复序列ITR之间插入有人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段(HS234)，以及上述含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因的核苷酸序列。

较佳地，所述HS2、HS3和HS4片段也分别从人β-珠蛋白基因GenomicDNA中直接克隆得到，HS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(386bp)，HS3片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(225bp)，HS4片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(279bp)。

根据本发明，所述的腺相关病毒选用现常用的AAV2型。

而本发明一较佳实施例的重组腺相关病毒载体的制备方法，可以包括下列步骤：

①将人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段依次插入pCR II-TOPO载体，构成载体pCR II-HS234；

②将含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因序列(β-globin)插入经EcoR I酶切的质粒pBSII-SK，构建成载体pBSII-hβ-globin；

③用EcoRV与Not I将β-globin从pBSII-hβ-globin上切出，与用同样酶切的pCRII-HS234连接，构建成载体pCRII-HS234-β-globin；

④用Sac I与Not I将人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS234片段及β-globin序列(HS234-β-globin)从pCR II-HS234-β-globin上切出，与质粒pAAV-IRES-hrGFP用Not I酶切后形成的片段连接，构建成质粒pAAV-HS234-hβ-globin，即重组腺相关病毒载体pAAV/β-globin；

上述构建过程如图1所示。

其中，步骤①、②中的载体还可以选择其它适用的载体，可以是根据文献自行构建，也可以是商业化产品，主要考虑酶切位点，便于插入即可；而步骤④中的腺相关病毒载体可以是现有任何含有反向末端重复序列ITR的AAV载体，特别是AAV2，如pAAV-rGFP等。

同常规，本发明制备方法还包括包装纯化该重组腺相关病毒载体pAAV/β-globin的步骤：将pAAV/β-globin及辅助质粒pAAV-RC、pHelper共三种质粒共转染至包装细胞，经常规氯化铯超速离心纯化方法制得纯化病毒载体rAAV/β-globin。

根据本发明，所述的包装细胞可以是现有技术中常用的包装细胞，例如人胚肾细胞HEK293或者金黄地鼠胚胎肾细胞BHK-21等，本发明以前者为例。

而所述的转染优选采用磷酸钙共沉淀法。

本发明重组腺相关病毒载体转染缺乏人β-珠蛋白基因表达的K562细胞株，可检测到外源人β-珠蛋白基因在该细胞的表达；用该重组腺相关病毒载体转染β地中海贫血小鼠的骨髓造血干/祖细胞或流产β地中海贫血胎儿造血细胞，将其移植入受体小鼠，在该小鼠体内可检测到外源人β-珠蛋白基因并有表达，且持续稳定表达一年以上。

因此，本发明重组腺相关病毒载体可以用于制备基因疗法治疗β地中海贫血的药物。

另外，本发明还提供一种转染有上述重组腺相关病毒载体的造血干/祖细胞。较佳地，造血干/祖细胞在转染前采用羟基脲预处理过，可明显地提高表达效率。所述的造血干/祖细胞可移植入患体，用于治疗β地中海贫血，故而可用于制备治疗β地中海贫血的药物。

附图说明

图1为本发明重组腺相关病毒载体pAAV/β-globin的构建图。

图2显示本发明重组AAV DNA拯救、复制的经0.8％琼脂糖胶电泳印迹杂交放射自显影图。

图3显示了用slot blot检测纯化重组病毒载体rAAV/β-globin的滴度。

图4显示了用PCR和RT-PCR检测导入的外源β-globin基因在K562细胞的表达。

图5显示了用PCR和RT-PCR检测经ex vivo途径转入小鼠体内的人β-globin基因。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下面实施例中所采用的分子生物学技术可参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》；所使用的工具酶均购自New England Biolab公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书；所使用的胶回收试剂盒购自博大泰克生物基因公司，使用方法参考商品说明书。

实施例1构建重组腺相关病毒载体pAAV-HS234-hβ-globin

(1)HS234片段：

根据现有HS2、HS3及HS4片段序列(Nucl Acid Res 1994.22：1006-1011；EMBO J 1993.12：1077-1085；Nucl Acid Res 1990.9：2159-2167；Nucl AcidRes 1991.19：1413-1419；PNAS 1995.92：6728-6732)分别设计引物①、②和③。

引物①P5：5’-ttaaataagcttcagtttttccttagttcc-3’(如SEQ ID NO.5所示)，

P3：5’-tctagaatatgtcacattctgtct-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

引物②P5：5’-tggtgtgccagatgtgtctatcag-3’(如SEQ ID NO.7所示)，

P3：5’-gatatcgctgctatgctgtgcctccccca-3’(如SEQ ID NO.8所示)；

EcoRV

引物③P5：5’-ggaccccagtacacaagaggggacgca-3’(如SEQ ID NO.9所示)，

P3：5’-gatatcggaatgggagggagagtctctg-3’(如SEQ ID NO.10所示)。

EcoRV

从来源于正常人外周血单个核细胞提取的人β-珠蛋白基因GenomicDNA[基因库登录号：U01317，提取工艺来自Molecule Biology(the secondedition)：9.16 Analysis and Cloning of Eukaryatic Genomic DNA]中，用引物①、②、③经PCR方法分别获得相应产物HS2(386bp，如SEQ ID NO.2所示)、HS3(去除3’端引物带入的EcoRV酶切位点，225bp，如SEQ ID NO.3所示)、HS4(去除3’端引物带入的EcoRV酶切位点，279bp，如SEQ ID NO.4所示)片段。其中PCR体系和条件为：模板DNA(100ng)1μl，10×Buffer 5μl，dNTP4μl，primer1 1μl，primer2 1μl，H₂O 37μl，Tag enzyme 0.5-1μl；94℃ 5min，(94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 40s)30次，72℃ 10min，4℃。将HS2用T/A克隆方法插入用EcoR I酶切的pCRII-TOPO载体(购自Invitrogen)，构建成载体pCRII-HS2；将在3’端带有EcoRV酶切位点的HS3插入用EcoRV酶切的pCR II-HS2，构建成载体pCR II-HS23，再将同样3’端带有EcoRV酶切位点的HS4插入用EcoRV酶切的pCR II-HS23，构建成载体pCR II-HS234。

(2)含有β-globin启动子的β-globin基因片段：

用引物：

上游：5’-ccaaatattacgtaaatacac-3’(如SEQ ID NO.11所示)，

下游：5’-tgaaagagtgatagttccggga-3’(如SEQ ID NO.12所示)；

从人β-珠蛋白基因Genomic DNA经PCR扩增获得含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因序列(β-globin)产物(2472bp，如SEQ ID NO.1所示)。其中，PCR体系：DNA(100ng)0.5-1μl，10×Advantage Genomic LAbuffer 2.5μl，dNTP 1μl，primer1 1μl，primer2 1μl，H₂O18.5μl，AdvantageGenomic LA Polymerase Mix 0.25；条件：94℃ 3min，(94℃ 1min、68℃ 3min、94℃ 1min)30次，68℃ 10min，4℃。将β-globin引物在5’磷酸化后获得的产物直接插入经EcoR I酶切的pBS II-SK载体质粒(购自Stratagene)，构建成载体pBSII-hβ-globin。

(3)用EcoRV与Not I将β-globin从pBSII-β-globin上切出，与用同样EcoRV与Not I酶切的pCR II-HS234连接，构建成载体pCR II-HS234-β-globin。

(4)用Sac I与Not I将HS234-β-globin从pCR II-HS234-β-globin上切出，亚克隆至用Not I酶双切的载体pAAV-IRES-hrGFP(购自Stratagene)中，构建成重组腺相关病毒载体pAAV-HS234-hβ-globin，简称pAAV/β-globin。

上述构建过程如图1所示。

采用人胚肾HEK293细胞(购自ATCC)2×10⁶/皿来验证重组AAV DNA的复制：用磷酸钙共沉淀法，同时转染重组AAV载体质粒(pAAV-HS234-hβ-globin 10μg)和辅助质粒pAAV2-RC(购于Stratagene公司)、pHelper(购于Stratagene公司)各10μg，分别于24、48、72小时后收集细胞，用Hirt’s溶液提取小分子量DNA，经Dpn I消化，0.8％琼脂糖凝胶电泳，Southern转移至硝酸纤维素滤膜，然后与³²P标记β-globin基因探针进行杂交，结果如图2所示，检测到基因组的两种复制形式(单体型M、二倍体型D)，表明pAAV-HS234-hβ-globin结构完整，能够在细胞内有效介导病毒基因组的拯救、复制。

实施例2纯化重组腺相关病毒载体rAAV/β-globin的获得

将HEK293细胞作为包装细胞，用DMEM培养液、10％新生牛血清传代培养，细胞生长至80％-85％融合，采用磷酸钙共沉淀法将实施例1制得的pAAV-HS234-β-globin和辅助质粒pAAV2-RC、pHelper共三质粒共转染HEK293细胞，各质粒10μg/皿(10cm)，取5ml的1.5mol/L的CaCl₂，加水至20ml，混匀，逐滴加2xBuffer A(50mM Hepes，1.5mM Na₂HPO₄，280mMNaCl，pH 7.05)25ml，混匀静置5分钟，出现白色云雾状，即开始转染293细胞，2ml/皿，继续置二氧化碳培养箱5％CO₂、37℃、饱和湿度培养65-70小时，收集细胞放入-70℃冰箱冻存。接下来进行纯化，将冻存的细胞物从-70℃取出置37℃水浴箱中30分钟，反复冻溶两次，加氯化铯用超速离心(速度35,000转/分，15℃、48小时)，分离出重组病毒，再经透析(透析袋型号10000 MWCO)、浓缩离心管10000 MWCO(millipore.com)离心获取纯化重组病毒rAAV/β-globin。

用³²P标记的β-globin为探针通过狭缝杂交(slot blotting)检测rAAV/β-globin滴度(见图3)。具体操作：以AAV2标准质粒为对照，待测纯化重组病毒rAAV/β-globin计微升数(μl)上样，分别以1∶2对倍稀释连续上样于硝酸纤维素膜上，用³²P标记β-globin基因为探针进行杂交。图中第1、2排为对照组，上样浓度第1排按顺序依次为10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl……递减，第2排按顺序依次为1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl……递减；第3、4排为本发明纯化重组病毒rAAV/β-globin样品1，第3排上样量按顺序依次为10μl、5μl、2.5μl……递减，第4排上样量按顺序依次为1μl、0.5μl、0.25μl……递减；第5、6排为本发明纯化重组病毒rAAV/β-globin样品2，上样顺序同样品1，可见，样品1和2滴度相差较大，样品2未作进一步离心浓缩处理。记算结果：如图可见本发明纯化的重组腺相关病毒载体rAAV/β-globin滴度第4排第1号相当于第一排第二号；5ng/1μl×2×10⁸particles/μl＝1.0x10¹²particles./ml。

实施例3用PCR和RT-PCR检测导入的外源β-globin基因在K562细胞中的表达

无菌条件下，取12×10⁶个悬浮于含10％新生牛血清的RPMI 1640培养液中生长状态良好的K562细胞，分为未经预处理对照组(8×10⁶细胞)与用羟基脲预处理组(4×10⁶细胞)，未经预处理对照组加适量用于溶解羟基脲的溶液1×PBS；预处理组加入终浓度为15mmol/L羟基脲，置二氧化碳培养箱5％CO₂、37℃、饱和湿度培养4小时，分别收集细胞，用1×PBS洗细胞一次，未预处理对照组又分为对照组与实验组，分别用无血清RPMI 1640培养液150-200μl重悬细胞，对照组加16μl RPMI 1640培养液、实验组与预处理组分别加16μl(相当于50MOI)实施例2获得的重组腺相关病毒载体rAAV/β-globin，在上述条件下培养，每隔10-15分钟摇匀一次，转染2小时后，用1×PBS洗细胞，再用含10％新生牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞，继续在上述条件下培养72小时，收集细胞分别提取DNA和RNA，完成PCR和RT-PCR检测(具体步骤参见Tan Mengqun，Qing Keyun，ZhouShangzhen，et al.Adeno-associated virus 2-mediated transduction and erythroidlineage-restricted long-term expression of the human beta-globin gene inhematopoietic cells from homozygous beta-thalassemic mice.Mol Ther，2001，3(6)：940～946.)。结果如图4所示，图中泳道1、5号为对照K562细胞组，2、3、4、6、7、8号为K562细胞被rAAV/β-globin转染组，其中4、8号为加羟基尿预处理再转染组。结果提示K562细胞存在β-globin但不表达，转染后的K562细胞，能检测到外源β-globin的表达，并且羟基尿预处理可提高表达效率。

实施例4用PCR和RT-PCR检测经ex vivo途径导入的外源人β-globin基因在受体小鼠中的表达

处死5只β地中海贫血小鼠，冲取其四肢骨骨髓细胞，用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，用抗体标记(Sca-1⁺Lin-标记抗体：B220、CD4、CD8aMac-1、GR-1、Fitc isotype 2a、PE-Sca-1、PE-isotype 2b)，经流式细胞仪分选造血干/祖细胞(Pettersson et al Leukoc Biol.2000 67(3)：423.-431)，将其分为未预处理对照组与羟基脲预处理组，分别用50MOI rAAV/β-globin转染2小时，收集细胞洗后悬浮于RPMI 1640培养液中，调整细胞浓度至8×10⁴/ml。经尾静脉注入受亚致死剂量(7.0Gy)照射的受体小鼠(与β地中海贫血小鼠同品系)，用未预处理对照细胞与经羟基脲预处理细胞各5只，每只注0.3ml含细胞2×10⁴，移植后3个月，取外周血来源的血细胞DNA，用PCR扩增，人β-globin基因作探针，Southern blot分析其中5只阳性，未预处理对照组2只，经羟基脲预处理组3只。移植后6个月同上检测，仍5只阳性。处死各组阳性小鼠1只，提取骨髓细胞来源的DNA和RNA，用PCR和RT-PCR检测示人β-globin基因存在，且有表达。移植后一年仍维持有3只阳性小鼠，处死后检测人β-globin基因存在且发现有红系特异性表达，结果如图5所示。

序列表

<110>谭孟群

<120>一种人β珠蛋白基因及其重组腺相关病毒载体

<130>P4-071217C

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2472

<212>DNA

<213>人(human)

<400>1

ccaaatatta cgtaaataca cttgcaaagg aggatgtttt tagtagcaat ttgtactgat 60

ggtatggggc caagagatat atcttagagg gagggctgag ggtttgaagt ccaactccta 120

agccagtgcc agaagagcca aggacaggta cggctgtcat cacttagacc tcaccctgtg 180

gagccacacc ctagggttgg ccaatctact cccaggagca gggagggcag gagccagggc 240

tgggcataaa agtcagggca gagccatcta ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg 300

ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg tgcacctgac tcctgaggag aagtctgccg 360

ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt 420

tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggca tgtggagaca 480

gagaagactc ttgggtttct gataggcact gactctctct gcctattggt ctattttccc 540

acccttaggc tgctggtggt ctacccttgg acccagaggt tctttgagtc ctttggggat 600

ctgtccactc ctgatgctgt tatgggcaac cctaaggtga aggctcatgg caagaaagtg 660

ctcggtgcct ttagtgatgg cctggctcac ctggacaacc tcaagggcac ctttgccaca 720

ctgagtgagc tgcactgtga caagctgcac gtggatcctg agaacttcag ggtgagtcta 780

tgggaccctt gatgttttct ttccccttct tttctatggt taagttcatg tcataggaag 840

gggagaagta acagggtaca gtttagaatg ggaaacagac gaatgattgc atcagtgtgg 900

aagtctcagg atcgttttag tttcttttat ttgctgttca taacaattgt tttcttttgt 960

ttaattcttg ctttcttttt ttttcttctc cgcaattttt actattatac ttaatgcctt 1020

aacattgtgt ataacaaaag gaaatatctc tgagatacat taagtaactt aaaaaaaaac 1080

tttacacagt ctgcctagta cattactatt tggaatatat gtgtgcttat ttgcatattc 1140

ataatctccc tactttattt tcttttattt ttaattgata cataatcatt atacatattt 1200

atgggttaaa gtgtaatgtt ttaatatgtg tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt 1260

gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc ttttaatata cttttttgtt tatcttattt 1320

ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct 1380

ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa tttctgggtt aaggcaatag caatatttct 1440

gcatataaat atttctgcat ataaattgta actgatgtaa gaggtttcat attgctaata 1500

gcagctacaa tccagctacc attctgcttt tattttatgg ttgggataag gctggattat 1560

tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat catgttcata cctcttatct tcctcccaca 1620

gctcctgggc aacgtgctgg tctgtgtgct ggcccatcac tttggcaaag aattcacccc 1680

accagtgcag gctgcctatc agaaagtggt ggctggtgtg gctaatgccc tggcccacaa 1740

gtatcactaa gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa 1800

gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat 1860

aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa 1920

aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc 1980

ttgggaaaat acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat 2040

gcacattggc aacagccctg atgcctatgc cttattcatc cctcagaaaa ggattcaagt 2100

agaggcttga tttggaggtt aaagttttgc tatgctgtat tttacattac ttattgtttt 2160

agctgtcctc atgaatgtct tttcactacc catttgctta tcctgcatct ctcagccttg 2220

actccactca gttctcttgc ttagagatac cacctttccc ctgaagtgtt ccttccatgt 2280

tttacggcga gatggtttct cctcgcctgg ccactcagcc ttagttgtct ctgttgtctt 2340

atagaggtct acttgaagaa ggaaaaacag ggggcatggt ttgactgtcc tgtgagccct 2400

tcttccctgc ctcccccact cacagtgacc cggaatctgc agtgctagtc tcccggaact 2460

atcactcttt ca 2472

<210>2

<211>386

<212>DNA

<213>人(human)

<400>2

ttaaataagc ttcagttttt ccttagttcc tgttacattt ctgtgtgtct ccattagtga 60

cctcccatag tccaagcatg agcagttctg gccaggcccc tgtcggggtc agtgccccac 120

ccccgccttc tggttctgtg taaccttcta agcaaacctt ctggctcaag cacagcaatg 180

ctgagtcatg atgagtcatg ctgaggctta gggtgtgtgc ccagatgttc tcagcctaga 240

gtgatgactc ctatctgggt ccccagcagg atgcttacag ggcagatggc aaaaaaaagg 300

agaagctgac cacctgacta aaactccacc tcaaacggca tcataaagaa aatggatgcc 360

tgagacagaa tgtgacatat tctaga 386

<210>3

<211>225

<212>DNA

<213>人(human)

<400>3

tggtgtgcca gatgtgtcta tcagaggttc cagggagggt ggggtggggt cagggctggc 60

caccagctat cagggcccag atgggttata ggctggcagg ctcagatagg tggttaggtc 120

aggttggtgg tgctgggtgg agtccatgac tcccaggagc caggagagat agaccatgag 180

tagagggcag acatgggaaa ggtgggggag gcacagcata gcagc 225

<210>4

<211>279

<212>DNA

<213>人(human)

<400>4

ggaccccagt acacaagagg ggacgcaggg tatatgtaga catctcattc tttttcttag 60

tgtgagaata agaatagcca tgacctgagt ttatagacaa tgagcccttt tctctctccc 120

actcagcagc tatgagatgg cttgccctgc ctctctacta ggctgactca ctccaaggcc 180

cagcaatggg cagggctctg tcagggcttt gatagcacta tctgcagagc cagggccgag 240

aaggggtgga ctccagagac tctccctccc attccccga 279

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>5

ttaaataagc ttcagttttt ccttagttcc 30

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>6

tctagaatat gtcacattct gtct 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>7

tggtgtgcca gatgtgtcta tcag 24

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>8

gatatcgctg ctatgctgtg cctccccca 29

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>9

ggaccccagt acacaagagg ggacgca 27

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>10

gatatcggaa tgggagggag agtctctg 28

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>11

ccaaatatta cgtaaataca c 21

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物

<400>12

tgaaagagtg atagttccgg ga 22

Claims

1、一种含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、一种重组腺相关病毒载体，其在腺相关病毒的反向末端重复序列ITR之间插入有人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段，以及如权利要求1所述的人β珠蛋白基因的核苷酸序列。

3、如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述的HS2片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，HS3片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，HS4片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4、如权利要求2或3所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述的腺相关病毒为AAV2型。

5、一种如权利要求4所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，其包括下列步骤：

①将人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段依次插入pCRII-TOPO载体，构成载体pCRII-HS234；

②将含有人β珠蛋白基因启动子的人β珠蛋白基因的核苷酸序列插入经EcoR I酶切的质粒pBS II-SK，构建成载体pBS II-hβ-globin；

③用EcoR V与Not I将人β珠蛋白基因的核苷酸序列从pBS II-hβ-globin上切出，与用同样酶切的pCR II-HS234连接，构建成载体pCR II-HS234-β-globin；

④用Sac I与Not I将人β-珠蛋白基因簇增强子核心序列HS2、HS3和HS4片段，以及人β珠蛋白基因的核苷酸序列从pCRII-HS234-β-globin上切出，与质粒pAAV-IRES-hrGFP用Not I酶切后形成的片段连接，构建成质粒pAAV-HS234-hβ-globin，即重组腺相关病毒载体pAAV/β-globin；

上述构建过程如图1所示。

6、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于其还包括包装纯化该重组腺相关病毒载体pAAV/β-globin的步骤：将pAAV/β-globin及辅助质粒pAAV-RC、pHelper共三种质粒共转染至人胚肾细胞HEK293包装，经常规纯化方法，制得纯化病毒载体rAAV/β-globin。

7、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的转染采用磷酸钙共沉淀法。

8、如权利要求2～4任一项所述的重组腺相关病毒载体在制备基因疗法治疗β地中海贫血的药物中的应用。

9、一种转染有权利要求2～4任一项所述的重组腺相关病毒载体的造血干/祖细胞。

10、如权利要求9所述的造血干/祖细胞，其特征在于其在转染前采用羟基脲预处理过。