CN109498802B

CN109498802B - 用于治疗碳氧血红蛋白血症的组合物和方法

Info

Publication number: CN109498802B
Application number: CN201811383281.8A
Authority: CN
Inventors: M·T·格拉德温; J·特赫罗布拉沃
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: US20190389937A1; AU2014237216B2; US20240083979A1; ES2691086T3; CA2904397C; HK1220374A1; CA2904397A1; EP3461492A1; US20180118810A1; US10421800B2; US11845785B2; CN105209060A; EP2968478B1; US20210070841A1; PL2968478T3; AU2017276274B2; AU2017276274A1; CN109498802A; DK2968478T3; EP2968478A1

Abstract

本文描述了用于从血红蛋白——包括脑、心脏和红细胞的血红蛋白——快速消除一氧化碳的新解毒剂。所公开的疗法涉及使用以极高亲和力结合一氧化碳的经修饰的人珠蛋白，特别是在第64位残基处被修饰的神经珠蛋白和在第81位残基处被修饰的细胞珠蛋白。将该单体突变珠蛋白输注至血液中，其在血液中快速并且不可逆地分离一氧化碳，并因此限制了一氧化碳对细胞呼吸以及氧运输和利用的毒性作用。

Description

用于治疗碳氧血红蛋白血症的组合物和方法

本申请是申请日为2014年3月11日、发明名称为“用于治疗碳氧血红蛋白血症的组合物和方法”的中国专利申请201480027725.8的分案申请。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2013年6月12日提交的美国临时申请No.61/834,035以及2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/799,155的优先权。上述申请通过引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本公开内容涉及重组珠蛋白分子，例如神经珠蛋白和细胞珠蛋白的以非常高的亲和力结合一氧化碳的突变形式，及其用于治疗碳氧血红蛋白血症和一氧化碳中毒的用途。

政府支持的确认

本发明是通过在由美国国立卫生研究院授予的基金号HL 103455的政府支持来完成的。美国政府对本发明享有某些权利。

背景技术

对一氧化碳的吸入暴露是环境中毒的主要原因。个体可在各种环境下暴露于空气中的一氧化碳，例如，房屋火灾、使用一氧化碳气体发生器(generator)或在房屋内使用户外烤肉烤架，或通过在封闭空间中运行汽车来试图自杀。一氧化碳结合细胞中的血红蛋白和血红素蛋白，特别是呼吸传递链的酶。与血红蛋白和其他血红素蛋白结合的一氧化碳的积累会损坏用于氧化磷酸化的氧递送和氧利用。这最终导致对重要器官(例如脑和心脏)的严重的低氧和局部缺血性损伤。血液中积累了大于15％的碳氧血红蛋白的个体具有脑损伤和神经认知机能障碍的风险。具有更高水平的碳氧血红蛋白的个体具有死亡的风险。具有非常高的碳氧血红蛋白水平的患者通常受到不可逆的脑损伤和脑死亡。

尽管存在用标准动脉和静脉血气体分析和一氧化碳-血氧定量法(co-oximetry)来快速诊断一氧化碳中毒的方法，并且尽管意识到了一氧化碳中毒的风险因素，但是没有针对该有毒暴露的可用的解毒剂。现有的疗法是通过面罩释放100％的氧，并且在可能的情况下使患者暴露于高压氧。用于高压氧疗法的机制是，氧将提高一氧化碳从血红蛋白和从组织释放的速率，并且加速一氧化碳的自然清除。然而，该疗法对一氧化碳的清除速率仅具有中等的(moderate)效果，并且基于高压氧设备的复杂性，该疗法在野外是不可用的。

发明内容

对用于治疗碳氧血红蛋白血症(也称为一氧化碳中毒)的有效、快速并且容易得到的疗法存在需求。本公开内容提供了经修饰的珠蛋白分子，例如神经珠蛋白或细胞珠蛋白的以非常高的亲和力结合一氧化碳的重组体形式，从而起到一氧化碳清除剂的作用。本文公开的数据证明，所述经修饰的珠蛋白可用于，例如从血液或组织中的血红蛋白中移除一氧化碳的方法，以及治疗碳氧血红蛋白血症的方法。

本文提供了一种治疗受试者中的碳氧血红蛋白血症的方法，其通过选择患有碳氧血红蛋白血症的受试者并将治疗有效量的以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子给予受试者来进行。在一些实施方案中，所述重组珠蛋白分子是具有第64位残基处的突变(例如H64Q、H64L、H64A或H64W突变)的重组人神经珠蛋白，或具有第81位残基处的突变(例如H81Q、H81A、H81L或H81W突变)的人重组细胞珠蛋白。在一些实例中，所述重组珠蛋白分子还包含一个或多个半胱氨酸置换，以得到提高的溶解度。提高的溶解度允许产生突变珠蛋白的高储液(stock)浓度，用于输注足以治疗碳氧血红蛋白血症的剂量。

本文还提供了一种从血液或组织中的血红蛋白中移除一氧化碳的方法，其通过使所述血液或组织与以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子接触来进行。在一些实施方案中，所述重组珠蛋白分子是具有第64位残基处的突变(例如H64Q、H64L、H64A或H64W突变)的重组人神经珠蛋白，或具有第81位残基处的突变(例如H81Q、H81A、H81L或H81W突变)的人重组细胞珠蛋白。在一些实例中，从血红蛋白的移除一氧化碳的所述方法是体外方法。在另一些实例中，所述方法是体内方法，其包括将所述重组珠蛋白分子给予需要治疗的受试者。

本文还提供了人重组神经珠蛋白，其包含第64位残基处的突变，并且还包含C46G突变、C55S突变和C120S突变。在一些实施方案中，所述第64位残基处的突变是H64Q、H64A、H64L或H64W突变。类似地，本公开内容提供了人重组细胞珠蛋白，其包含第81位残基处的突变，并且还包含C38S突变和C83S突变。在一些实施方案中，所述第81位残基处的突变是H81Q、H81A、H81L或H81W突变。本公开内容还提供了包含所述重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白以及可药用载体的组合物。

根据以下参照附图进行的详细说明，本发明的前述以及其他目的、特征和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1A至1B是示出羧化的红细胞(RBC)与缓冲液或脱氧神经珠蛋白(deoxyNgb)H64Q的反应的图。该实验是在厌氧条件下于PBS缓冲液中在21℃下进行。(图1A)示出了RBC级分的脱氧或羧化的物质：在RBC+Ngb实验期间的deoxyHb(菱形)；RBC+Ngb实验期间的HbCO(方形)；RBC+缓冲液实验期间的HbCO(X)；以及RBC+缓冲液实验期间的deoxyHb(三角形)。(图1B)示出了上清液(神经珠蛋白)级分的脱氧或羧化的物质：在RBC+Ngb实验期间的deoxyNgb(菱形)；RBC+Ngb实验期间的NgbCO(方形)。

图2是示出羧化的红细胞与deoxyNgb H64Q的反应的图。该实验是在厌氧条件下于PBS缓冲液中在21℃下进行。示出了RBC级分的脱氧或羧化的物质：deoxyHb(菱形)；HbCO(方形)；deoxyNgb(三角形)；和NgbCO(X)。

图3是示出羧化的红细胞与oxyNgb H64Q的反应的图。该实验是在好氧条件下于PBS缓冲液中在21℃下进行。示出了RBC级分的脱氧或羧化的物质：oxyHb(方形)；HbCO(三角形)；oxyNgb(X)；NgbCO(星号)。

图4是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO浓度的图。将小鼠暴露于1500ppm CO，持续60分钟，然后停止CO，并输注PBS(200μl)，持续5分钟。每5分钟至10分钟取血样(约10μl)，用连二亚硫酸盐进行化学还原并监测HbCO。血液中的其他Hb物质(oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示为脱氧Hb。

图5是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO浓度的图。将小鼠暴露于1500ppm CO，持续70分钟，然后停止CO，并输注浓缩的H64Q Ngb(200μl)，持续10分钟。每5分钟至10分钟取血样(约10μl)，用连二亚硫酸盐进行化学还原，并监测HbCO和NgbCO。血液中的其他Hb物质(oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示为脱氧Hb，并将Ngb物质(oxyNgb/metNgb/deoxyNgb)被表示为脱氧Ngb。

图6是示出CO-暴露的小鼠的血液中HbCO浓度的图。将小鼠暴露于1500ppm CO，持续70分钟，然后停止CO，并输注浓缩的H64Q Ngb(200μl)，持续5分钟。每5分钟至10分钟或20分钟取血样(约10μl)，用连二亚硫酸盐进行化学还原，并监测HbCO和NgbCO。血液中的其他Hb物质(oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示为脱氧Hb。

图7A至7B是示出在PBS或H64Q神经珠蛋白输注后CO-暴露的小鼠的血液中HbCO浓度衰减的一对图。图7A示出了绝对HbCO水平；图7B示出了HbCO水平的相对变化。将小鼠暴露于1500ppm CO，，持续60分钟至70分钟，然后停止CO，并输注浓缩的H64Q Ngb(200μl)，持续5分钟。输注的时刻被标记为t＝0。每5分钟至10分钟取血样(约10μl)，用连二亚硫酸盐进行化学还原，并监测HbCO和NgbCO。血液中的其他Hb物质(oxyHb/metHb/deoxyHb)被表示为脱氧Hb。点表示三次或更多次实验的平均值和标准差。

图8是示出PBS或H64Q神经珠蛋白输注后5分钟和10分钟CO-暴露的小鼠的血液中HbCO浓度衰减百分率的图。柱子从左至右表示：PBS输注5分钟；PBS输注10分钟；H64Q Ngb输注5分钟；以及H64Q Ngb输注10分钟。

图9A是显示H64Q神经珠蛋白作为经输注的小鼠的尿中的NgbCO被清除的图。示出了来自在CO暴露结束后约75分钟时处死的小鼠的膀胱的尿的吸光度。上方的三根迹线显示由神经珠蛋白导致的吸光度，其包含82％至91％的NgbCO。底部的迹线表示不是由Ngb导致的吸光度。图9B是H64Q Ngb治疗的小鼠的内部器官和具有包含NgbCO的红色尿的注射器的照片。

序列表

列于所附序列表中的氨基酸序列是使用根据37C.F.R.1.822定义的氨基酸的标准三字母代码来示出。该序列表作为创建于2014年2月20日的9.98KB的ASCII文本文档而提交，其通过引用的方式纳入本文。在所附的序列表中：

SEQ ID NO:1是人神经珠蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是包含一个或多个突变的重组人神经珠蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是包含第46、55、64和120位残基处的突变的重组人神经珠蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是人细胞珠蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是包含一个或多个突变的重组人细胞珠蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是包含第38、81和83位残基处的突变的重组人细胞珠蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

I.缩略词表

Cgb细胞珠蛋白

CO一氧化碳

Hb血红蛋白

HbCO碳氧血红蛋白

Ngb神经珠蛋白

NgbCO碳氧神经珠蛋白

RBC红细胞

II.术语和方法

除非另有注明，否则根据常规用法来使用技术术语根据。分子生物学中的常用术语的定义可在以下文献中找到：Benjamin Lewin，Genes V,Oxford University出版社出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(编)，The Encyclopedia of MolecularBiology,Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及RobertA.Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,VCH Publishers Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了便于浏览本公开内容的各实施方案，提供了以下的对特定术语的解释：

给药：通过有效的途径将药剂例如治疗剂(例如，重组多肽)提供或给予受试者。示例性的给药途径包括但不限于，注射或输注(例如，皮下、肌内、皮内、腹膜内、鞘内、静脉内、脑室内、纹状体内、颅内和脊髓内)、口服、管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

解毒剂：中和或抵消毒物作用的试剂。

一氧化碳(CO)：无色、无臭且无味的气体，当其以足够高的浓度遭遇时对人和动物有毒。在正常的动物代谢期间还以低水平产生CO。

碳氧血红蛋白(HbCO)：当吸入CO或在正常代谢期间产生CO时，在红细胞中形成的一氧化碳(CO)与血红蛋白(Hb)的稳定的络合物。

碳氧血红蛋白血症或一氧化碳中毒：因血液中存在过量的一氧化碳而导致的病症。通常而言，暴露于百万分之(ppm)100或更高的CO足以引起碳氧血红蛋白血症。轻度的急性CO中毒的症状包括头晕、意识错乱(confusion)、头痛眩晕和类流感效应；更大的暴露可导致对中枢神经系统和心脏的显著毒性，以及甚至死亡。在急性中毒后，常常发生长期后遗症。一氧化碳还可对孕妇的胎儿具有严重的影响。长期暴露于低水平的一氧化碳可导致抑郁、意识错乱和失忆。一氧化碳主要通过在血液中与血红蛋白组合以形成碳氧血红蛋白(HbCO)从而在人中导致不良反应。这阻止氧与血红蛋白的结合，降低血液的氧运载能力，从而导致低氧。此外，肌红蛋白和线粒体细胞色素氧化酶被认为会受到有害影响。碳氧血红蛋白可恢复成血红蛋白，但是该恢复花费时间，因为HbCO络合物非常稳定。现有的治疗CO中毒的方法包括给予100％的氧或提供高压氧疗法。

接触：置于直接的物理结合；包括固体形式和液体形式二者。当在体内方法的环境下中使用时，“接触”还包括给药。

细胞珠蛋白：在所有组织中广泛表达的珠蛋白分子。细胞珠蛋白是六配位的血红蛋白，其已经被报道为有利于使氧扩散通过组织，将亚硝酸盐还原成一氧化氮，并且在低氧条件下和在氧化胁迫下起到细胞保护性作用。人细胞珠蛋白的长度为190个氨基酸。本文中将一个示例性的人细胞珠蛋白氨基酸序列示出为SEQ ID NO:4。本文公开的的重组细胞珠蛋白突变体表现出对CO的非常高的亲和力，其包含第81位残基处的突变(组氨酸至谷氨酰胺、丙氨酸、色氨酸或亮氨酸)，并且任选地包含第38位处的半胱氨酸至丝氨酸的置换，和/或第83位处的半胱氨酸至丝氨酸的置换(参见SEQ ID NO:5)。在一个非限制性实例中，对CO具有高亲和力的细胞珠蛋白突变体包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

珠蛋白：涉及氧的结合和/或运输的包含血红素的蛋白质。珠蛋白包括例如，血红蛋白、肌红蛋白、神经珠蛋白和细胞珠蛋白。

血红蛋白(Hb)：脊椎动物和其他动物中的血液的红细胞中包含铁的氧运输金属蛋白。在人中，血红蛋白分子是四个球状蛋白亚基的组合体。每个亚基是由与非蛋白血红素基团紧密结合的蛋白质链构成。每条蛋白质链排列成一组在珠蛋白折叠布置中连接在一起的α-螺旋结构区段，珠蛋白折叠布置因其是其他血红素/珠蛋白蛋白质中使用的相同折叠基序而得名。该折叠模式可包含强力结合血红素基团的囊(pocket)。

神经珠蛋白(Ngb)：蛋白质的珠蛋白家族的一个成员。神经珠蛋白的生理学功能当前是未知的，但是其被认为在低氧或局部缺血性条件下提供保护作用。神经珠蛋白表达于中枢神经系统和末梢神经系统、脑脊液、视网膜和内分泌组织中。人神经珠蛋白的长度为151个氨基酸。本文中将一个SEQ ID NO:1形式的示例性的人神经珠蛋白提供。本文公开的的重组神经珠蛋白突变体表现出对CO的非常高的亲和力，其包含第64位残基处的突变(组氨酸至谷氨酰胺、丙氨酸、色氨酸或亮氨酸)，并且任选地包含第46位残基处的半胱氨酸至甘氨酸的置换，和/或第55位处的半胱氨酸至丝氨酸的置换，和/或第120位处的半胱氨酸至丝氨酸的置换(参见SEQ ID NO:2)。在一个非限制性实例中，对CO具有高亲和力的神经珠蛋白突变体包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

肽或多肽：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当所述氨基酸是α-氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体，L-异构体为优选的。本文中所用的术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列，并且包括经修饰的序列，包括经修饰的珠蛋白。术语“肽”和“多肽”特别旨在覆盖天然存在的蛋白质，以及以重组或合成的方式产生的蛋白质。

保守性氨基酸置换是这样的置换，即当进行该置换时，对初始蛋白质的性质干扰最小，即，所述蛋白质的结构和特别是功能是保守的，并且没有被这样的置换显著改变。下文示出了一些保守性置换的实例。

保守性置换一般维持(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如，作为折叠片(sheet)或螺旋构象，(b)所述分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。

一般期望产生蛋白质性质的最大变化的置换将是非保守性的，例如这样的变化，即其中(a)亲水性残基例如丝氨酸或苏氨酸置换(或被以下置换)疏水性残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被以下置换)任何其他残基；(c)具有正电侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换(或被以下置换)负电性残基例如谷氨酰胺或天冬氨酸；或(d)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸置换(或被以下置换)不具有侧链的残基例如甘氨酸。

可药用载体：所使用的可药用载体是常规的。Remington′s PharmaceuticalSciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA，第15版(1975)描述了适于本文描述的组合物的药物递送的组合物和制剂。

一般而言，所述载体的性质将取决于所采用的具体给药模式。除了生物学中性的载体外，待给药的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲液(例如，醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯)等。

重组体：重组的核酸或蛋白质是非天然存在的序列，或通过人工组合两个本应分离的序列片段而制成的序列。常常通过化学合成或通过对分离的核酸片段进行人工操作(例如，通过基因工程技术)来完成该人工组合。术语重组体包括已经通过添加、置换或缺失天然核酸分子或蛋白质的一部分而改变的核酸和蛋白质。

序列同一性/相似性：两条或更多条核酸序列或者两条或更多条氨基酸序列之间的同一性是以这些序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可测量为同一性百分率；百分率越高，则序列越相同。序列相似性可测量为相似性百分率(其将保守性氨基酸置换纳入考虑)；百分率越高，则序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物拥有相对较高程度的序列同一性/相似性。与亲缘关系更远的物种(例如，人序列和秀丽隐杆线虫(C.elegans)序列)相比，当直系同源的蛋白质或cDNA衍生自亲缘关系更近的物种(例如，人序列和小鼠序列)时，该同源性更显著。

用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。以下文献中描述了多种程序和对齐方法：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44，1988；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3，1989；Corpet et al.,Nuc.AcidsRes.16:10881-90,1988；Huang et al.,Computer Appls.in the Biosciences 8,155-65,1992；和Pearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990，示出了对序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

NCBI基础局部对齐检索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10，1990)可从几个来源得到，包括美国国家生物信息中心(National Center for Biological Information，NCBI)和互联网上，其与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联用。可在NCBI网站上找到额外的信息。

受试者：活的多细胞生物体，包括脊椎动物，该类别既包括人也包括非人哺乳动物。

治疗有效量：足以在所治疗的受试者中实现所需效果化合物或组合物(例如重组珠蛋白分子)的量。例如，其可为清除血液或组织中的一氧化碳、降低血液中的HbCO水平和/或减轻与一氧化碳中毒相关的一种或多种征象或症状所需的量。

除非另有解释，否则本文中所用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开内容所属领域中的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。除非上下文另有说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。“包含A或B”意为包含A，或者包含B，或者包含A和B。还应理解，对核酸或多肽所给出的所有碱基数或氨基酸数，以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并且被提供用于进行描述。虽然可使用与本文描述的方法和材料相似或相同的方法和材料来实施或测试本公开内容，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他文献都通过引用的方式全文纳入。在存在矛盾的情况下，以包括术语解释在内的本说明书为准。此外，这些材料、方法和实例仅仅是举例说明性的，而非意图限制。

III.详述

存在对用于治疗碳氧血红蛋白血症(包括一氧化碳中毒)的有效、快速并且容易得到的疗法需要。本文公开了一种新的解毒剂，其提供对血红蛋白中的一氧化碳的快速消除。所公开的疗法涉及使用以极高亲和力结合一氧化碳的经修饰的人珠蛋白，特别是在第64位残基(相对于SEQ ID NO:1)处修饰的神经珠蛋白和/或在第81位残基(相对于SEQ ID NO:4)处修饰的细胞珠蛋白。本文公开的数据首次证明，对CO具有高亲和力的突变珠蛋白可非常有效地从红细胞中移除CO；然后通过分泌于尿中来从系统清除CO。因此，本文描述的突变珠蛋白分子提供了用于碳氧血红蛋白血症的出人意料地有效的疗法。将该单体的突变体珠蛋白例如输注至受试者的血液中，其在血液中快速并且不可逆地分离一氧化碳，并因此限制一氧化碳对细胞呼吸以及氧运输和利用的毒性影响。

A.治疗碳氧血红蛋白血症或CO中毒的方法

本文提供了一种治疗受试者中的碳氧血红蛋白血症的方法，其通过选择患有碳氧血红蛋白血症的受试者并将治疗有效量的以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子给予受试者来进行。在一些实施方案中，所述重组珠蛋白分子是具有第64位残基处的突变(氨基酸置换)(例如H64Q、H64L、H64A或H64W突变)的重组人神经珠蛋白，或具有第81位残基处的突变例如(H81Q、H81A、H81L或H81W突变)的人重组细胞珠蛋白。本公开内容通篇中，人重组神经珠蛋白和人重组细胞珠蛋白的氨基酸位置是分别基于本文中描述为SEQ ID NO:1的野生型人神经珠蛋白序列和描述为SEQ ID NO:4的野生型人细胞珠蛋白序列。

所述重组珠蛋白分子还可包含一个或多个半胱氨酸氨基酸置换，以得到提高的溶解度。提高的溶解度允许产生突变珠蛋白的高储液浓度，用于输注足以治疗碳氧血红蛋白血症的剂量。在一些实施方案中，人重组神经珠蛋白还包含C46G突变、C55S突变、C120S突变，或它们的任何组合。在具体实例中，所述重组神经珠蛋白包含所有三个半胱氨酸置换。在一个非限制性实例中，所述人重组神经珠蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，人重组细胞珠蛋白还包含C38S突变，或C83S突变，或同时包含C38S和C83S突变。在一个非限制性实例中，所述人重组细胞珠蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。

在备选的实施方案中，包含第64位残基处的突变以及任选的一个、两个或三个半胱氨酸置换(即，C46G、C55S和C120S突变中的一个、两个或所有三个)的人重组神经珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性的氨基酸置换。类似地，包含第81位残基处的突变以及任选的一个或两个半胱氨酸置换(即，C38S和C83S突变中的一个或两个)的人重组细胞珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性的氨基酸置换。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个保守性氨基酸置换，或者一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个非保守性氨基酸置换，或保守性置换与非保守性置换的任何组合，只要该重组珠蛋白保留以高亲和力结合一氧化碳的能力即可。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含缺失，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失，同时仍然保持以高亲和力结合一氧化碳的能力。

在一些实例中，含第64位残基处的突变以及任选的一个、两个或三个半胱氨酸置换(即，C46G、C55S和C120S突变中的一个、两个或所有三个)的人重组神经珠蛋白与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在一些实例中，包含第81位残基处的突变以及任选的一个或两个半胱氨酸置换(即，C38S和C83S突变中的一个或两个)的人重组细胞珠蛋白与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在一些实施方案中，所述受试者的血液中具有至少3％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的碳氧血红蛋白(HbCO)。

在一些实施方案中，经静脉内给予所述重组珠蛋白分子，例如通过静脉输注。

可由执业医师确定合适的重组神经珠蛋白或重组细胞珠蛋白的剂量。在一些实施方案中，所述剂量是将HbCO降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的重组珠蛋白的量。一般而言，约136克神经珠蛋白或约184克细胞珠蛋白的剂量足以实现HbCO的20％降低。

因此，在一些实施方案中，人重组神经珠蛋白的治疗有效剂量为约25克至约1000克、约50克至约500克、约50克至约200克，或约60克至约140克。在具体实例中，所述人重组神经珠蛋白的治疗有效剂量为约50克、约75克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约450克或约500克。在一些实施方案中，所述人重组细胞珠蛋白的治疗有效剂量为约25克至约1000克，或约50克至约800克。在具体实例中，所述人重组细胞珠蛋白的治疗有效剂量为约50克、约75克、约100克、约150克、约200克、约250克、约300克、约350克、约400克、约450克、约500克、约550克、约600克、约650克、约700克、约750克或约800克。

在一些实施方案中，给予受试者的神经珠蛋白或细胞珠蛋白浓度为约70克每升至约200克每升，对于500毫升或1升的治疗其相当于约35克至200克。

根据需要，可将具有对一氧化碳的高亲和力的经修饰的珠蛋白以单一剂量或多个剂量给予受试者，以将HbCO降低至无毒水平。

在一些实施方案中，给予所述受试者的剂量是将所述受试者的血液和/或组织中的HbCO降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％(与治疗前的HbCO水平相比)所需的重组珠蛋白的量。

B.从血红蛋白移除一氧化碳的方法

本文还提供了一种从血液或组织中的血红蛋白移除一氧化碳的方法，其通过使所述血液或组织与以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子接触来进行。在本公开内容的上下文中，“移除”不需要将一氧化碳从血液或组织中完全消除，而是表示从血液或组织中的血红蛋白分子中移除CO，以使得样品或受试者的血液或组织中的HbCO的总水平降低。例如，可将血液和/或组织中的HbCO降低至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％(与治疗前的HbCO水平相比)。

在所述方法的一些实施方案中，所述重组珠蛋白分子是具有第64位残基处的突变(例如H64Q、H64L、H64A或H64W突变)的重组人神经珠蛋白，或具有第81位残基处的突变(例如H81Q、H81A、H81L或H81W)突变的人重组细胞珠蛋白。

所述重组珠蛋白分子还可包含一个或多个半胱氨酸置换，以得到提高的溶解度。提高的溶解度允许产生突变珠蛋白的高储液浓度，用于输注足以有效地从血液移除CO的剂量。在一些实施方案中，人重组神经珠蛋白还包含C46G突变、C55S突变、C120S突变，或它们的任何组合。在具体实例中，所述重组神经珠蛋白包含所有三个半胱氨酸置换。在一个非限制性实例中，所述人重组神经珠蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，人重组细胞珠蛋白还包含C38S突变，或C83S突变，或同时包含C38S和C83S突变。在一个非限制性实例中，所述人重组细胞珠蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一些备选的实施方案中，包含第64位残基处的突变以及任选的一个、两个或三个半胱氨酸置换(即，C46G、C55S和C120S突变中的一个、两个或所有三个)的人重组神经珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性的氨基酸置换。类似地，包含第81位残基处的突变以及任选的一个或两个半胱氨酸置换(即，C38S和C83S突变中的一个或两个)的人重组细胞珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性的氨基酸置换。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个保守性氨基酸置换，或者一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个非保守性氨基酸置换，或保守性置换与非保守性置换的任何组合，只要该重组珠蛋白保留以高亲和力结合一氧化碳的能力即可。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含缺失，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失，同时仍然保持以高亲和力结合一氧化碳的能力。

在一些实例中，从血红蛋白的移除一氧化碳的所述方法是体外方法。例如，所述方法可包括使血液或组织样品与所述重组珠蛋白分子接触。在一些实例中，使足量的重组珠蛋白与血液或组织样品接触，以使得将样品中的HbCO降低至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。

在另一些实例中，所述方法是体内方法，其包括将所述重组珠蛋白分子给予需要治疗的受试者。在一些情况下，所述受试者(在给药之前)的血液中具有至少3％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的HbCO。所述重组珠蛋白分子可使用任何合适的给药途径来给予，例如，静脉内给药，例如静脉输注。

在上文的A部分中讨论了重组神经珠蛋白和重组细胞珠蛋白的合适的、治疗有效的剂量。在一些实例中，人重组神经珠蛋白的治疗有效剂量为约25克至约1000克，或约50克至约500克。在一些实例中，人重组细胞珠蛋白的治疗有效剂量为约25克至约1000克，或约50克至约800克。根据需要，可将具有对一氧化碳的高亲和力的经修饰的珠蛋白以单一剂量或多个剂量给予受试者，以将HbCO降低至无毒水平。

在所述体内方法的一些实施方案中，给予受试者的剂量是将所述受试者的血液和/或组织中的HbCO降低至少1％、至少2％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的重组珠蛋白的量。

C.重组神经珠蛋白突变体和重组细胞珠蛋白突变体

本文提供了人重组神经珠蛋白，其包含第64位残基处(相对于SEQ ID NO:1)的突变，并且还包含C46G突变、C55S突变和C120S突变。在一些实施方案中，所述第64位残基处的突变是H64Q、H64A、H64L或H64W突变。类似地，本公开内容提供了人重组细胞珠蛋白，其包含第81位残基处(相对于SEQ ID NO:4)的突变，并且还包含C38S突变和C83S突变。在一些实施方案中，所述第81位残基处的突变是H81Q、H81A、H81L或H81W突变。本公开内容还提供了包含本文公开的的重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白以及可药用载体的组合物。

本文公开的数据(参见实施例2)首次证明，包含H64L或H64Q突变的神经珠蛋白分子具有野生型蛋白质的自氧化速率的1/23的自氧化速率。较低的氧化速率是合乎需要的性质，因为其降低对突变珠蛋白结合CO以及将氧递送至组织的能力有害的副反应。

下文示出了野生型人神经珠蛋白的氨基酸序列和野生型人细胞珠蛋白的氨基酸序列，以及本公开内容提供的示例性的重组神经珠蛋白突变体和细胞珠蛋白突变体。

人神经珠蛋白(SEQ ID NO:1；GenBank^TM登录号No.NP_067080.1)

对CO具有高亲和力的重组神经珠蛋白(SEQ ID NO:2)

X₁＝C或G

X₂＝C或S

X₃＝Q、L、A或W

具有四种氨基酸置换的重组神经珠蛋白(SEQ ID NO:3)

人细胞珠蛋白(SEQ ID NO:4；GenBank^TM登录号No.NP_599030)

具有高CO亲和的重组细胞珠蛋白(SEQ ID NO:5)

X₁＝C或S

X₂＝Q、L、A或W

具有三种氨基酸置换的重组细胞珠蛋白(SEQ ID NO:6)

本文提供的人重组神经珠蛋白和细胞珠蛋白可包含上文所示的序列(并且在本文中描述为SEQ ID NO:2、3、5和6)中的一条，或者所述重组珠蛋白还可包含一个或多个保守性或非保守性氨基酸置换。例如，具有第46、55、64和120位残基处的突变的人重组神经珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性氨基酸置换。类似地，具有第38、81和83位残基处的突变的人重组细胞珠蛋白可包含其他残基处的一个或多个保守性或非保守性氨基酸置换。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个保守性氨基酸置换，或者一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个非保守性氨基酸置换，或保守性置换与非保守性置换的任何组合，只要所述重组珠蛋白保留以高亲和力结合一氧化碳的能力即可。在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白或细胞珠蛋白包含缺失，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的缺失，同时仍然保持以高亲和力结合一氧化碳的能力。

在一些实例中，所述人重组神经珠蛋白与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，并且保持第64位残基处的修饰(H64Q、H64A、H64W或H64L)，以及C46G、C55S和C120S突变。

在一些实例中，所述人重组细胞珠蛋白与SEQ ID NO:6至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，并且保持第81位残基处的修饰(H81Q、H81A、H81W或H81L)，以及C38S和C83S突变。

本公开内容还提供了包含本文公开的任何重组珠蛋白分子和可药用载体的组合物。

提供以下实施例用于阐述某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本公开内容限制于所描述的特定特征或实施方案。

实施例

实施例1：通过神经珠蛋白H64Q突变体从血红蛋白清除一氧化碳(CO)

该实施例显示，H64Q突变体神经珠蛋白从位于红细胞内的羧化的血红蛋白快速移除CO。

背景

神经珠蛋白(Ngb)是近期在哺乳动物和其他物种中发现的血红素蛋白(Burmesteret al.，Nature 407(6803):520-523,2000)。Ngb在序列和结构上与肌红蛋白和血红蛋白非常相似，但是与这些蛋白质不同的是，其包含六-配位的血红素以及与血红素结合的两个组氨酸基团，而肌红蛋白和血红蛋白是五-配位的并且仅具有一个与血红素永久结合的组氨酸。该血红素蛋白的功能是未知的。来自血红素基团的铁原子的反应可被描绘为如下：

其中k_on和k_off分别是CO的结合速率和解离速率。Ngb示出了对配体(例如氧或一氧化碳)的高亲和力，并且当远侧的组氨酸(His64)被其他侧链替换时，该亲和力甚至更高(表1)。

表1.神经珠蛋白和血红蛋白的结合常数和解离常数

这些值是在25℃下确定。

神经珠蛋白数据来自Dewilde et al.,J Biol Chem 276(42):38949-38955,1998。

血红蛋白数据来自Unzai et al.，J Biol Chem 273(36):23150-23159,1998。

基于以前的表征(Tiso et al.,J Biol Chem 286(20):18277-18289，2011)和后续研究，H64Q突变体和H64L突变体的CO结合性能被认为非常相似，因此，所报道的H64L的值是对H64Q的合理估计。表1中的数据表示，在存在足够的清除剂的情况下，在25℃下，CO从血红蛋白的解离将导致HbCO络合物的半衰期为约3.5秒(T-状态)或70秒(R-状态)。在37℃下更高的速率可导致甚至更短的时间。这些短时间为治疗方法提供了一个机会。但是，在不存在CO清除剂的情况下，解离的CO最终将再次与血红蛋白结合，导致HbCO的持续时间比该解离速率所提示的长得多。

神经珠蛋白的结合速率和解离速率(表1)说明其对CO的亲和力比血红蛋白对CO的亲和力高得多。因此，假设神经珠蛋白将是用于HbCO或其他羧化化合物上的CO的合适清除剂。下文描述的结果证实了该假设。

材料与方法

试剂

所使用的血液是新鲜的或是从健康志愿者采集后最多2周。如以前的描述(Huanget al.，J Clin Invest 115(8):2099-2107，2005)来制备红细胞(RBC)和血红蛋白。除非另有说明，否则所有化学品都购自Sigma(St.Louis,MO)。使用Cary 50和HP8453UV-可见光分光光度计(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)以及SX20停流光谱仪(SX20Stopped-Flow Spectrometer)(Applied Photophysics Limited，Leatherhead,UK)来收集可见光吸收光谱和动力学数据。所有实验都是在磷酸盐缓冲盐水(Sigma)中进行。通过用CO气体对20mL PBS鼓泡至少15分钟来制备一氧化碳(CO)-饱和的缓冲液。通过将以氩气穿流脱气的PBS添加至干燥连二亚硫酸钠的脱气小瓶中来制备连二亚硫酸钠储液。

重组神经珠蛋白的表达和纯化

通过基于以前工作(Tiso et al.,Biol Chem 286(20):18277-18289,2011)的改良方法从大肠杆菌(E.coli)培养物中纯化重组神经珠蛋白(Ngb)H64Q蛋白质。使包含pET28-NgbH64Q质粒的SoluBL21大肠杆菌细胞(Genlantis)在添加有30μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中生长。通过添加1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷来在OD_600nm＝0.8时诱导表达，并在37℃下进行24小时。在诱导时添加δ-氨基乙酰丙酸(0.4mM)以增强血红素辅因子的产生。收集细胞，并重悬于裂解缓冲液(50mM MOPS，pH 7.0，1mM EDTA，1mg/ml溶菌酶，1mM PMSF，0.5mM DTT)，并通过超声处理来裂解。将上清液上样至经缓冲液A(50mM MOPS pH7.0，10mM NaCl)平衡的DEAE-琼脂糖柱中。用3倍柱体积的缓冲液A冲洗样品，并通过至100％缓冲液B(50mM MOPS pH 7.0，100mM NaCl)的线性梯度来洗脱。合并Ngb级分，并进行浓缩。为了进一步纯化，将浓缩的样品在凝胶过滤柱(Sephacryl S-200HR,GE Healthcare)中纯化。通过SDS-PAGE和UV-Vis光谱法来评估纯度。

与神经珠蛋白混合的羧化的Hb的动力学

通过将过量的连二亚硫酸钠添加于融化的Hb，并以至少4:1的比例与CO饱和的缓冲液混合，从而制备羧化的Hb(HbCO)。通过穿过手套箱(glove box)内的脱盐柱来移除过量的CO。对于厌氧实验，然后将过量的连二亚硫酸钠添加至HbCO。使融化的Ngb-H64Q与过量的铁氰化钾混合，并穿过脱盐柱，以得到其氧化形式。在一些实例中，已经将Ngb-H64Q以氧化形式储存于-80℃下。通过添加过量的连二亚硫酸钠至该氧化形式来得到脱氧的Ngb-H64Q。对于好氧实验，通过使该脱氧形式在好氧条件下穿过脱盐柱在。然后立即与HbCO混合来得到氧合形式。

为了用Cary 50或HP8453分光光度计测量动力学，将1cm光程长度的比色杯(cuvette)内的HbCO放置于比色皿座(cell holder)中，并使其处于25℃或37℃下。使用分光光度计旁边的水浴使脱氧或氧合的Ngb-H64Q快速平衡至相同的温度。通过将Ngb-H64Q注射至HbCO溶液中使这两种蛋白质的终浓度为40μM，从而起始反应。以1秒至10秒的延时开始收集吸光度，并在持续搅拌混合物的同时继续收集最多至20分钟。在厌氧反应中，存在1mM至5mM终浓度的连二亚硫酸钠。对于使用SX20停流光谱仪测量的动力学，首先洗涤仪器的样品线，用纯PBS洗涤用于好氧实验，并且用包含5mM连二亚硫酸钠的PBS洗涤用于厌氧实验。使该装置的样品线和注射器平衡至25℃或37℃。然后将HbCO和Ngb-H6Q上样至该装置的装有5mM连二亚硫酸钠的2.5ml注射器中，用于厌氧实验。使HbCO和Ngb-H64Q以1:1混合，失效时间小于2毫秒，两种蛋白质的终浓度为25μM至30μM。跟踪反应混合物的吸光度，持续不多于200秒。

与神经珠蛋白混合的羧化的RBC的动力学

通过用PBS洗涤50μL至100μL的血液5至7次，于1000×g下离心5分钟至10分钟，来获得红细胞。将洗涤的红细胞稀释于1ml至2ml的PBS中，并进行脱氧，同时使其处于冰上并通过通入氩气流来缓慢搅拌，持续最多至1小时。对于厌氧实验，短暂地通入氩气，并将相对于Hb过量的连二亚硫酸钠添加至该红细胞。羧化的红细胞-包封的Hb是通过以至少4:1的比率稀释脱氧的红细胞溶液来得到。通过用脱气的PBS(包含5mM至10mM连二亚硫酸盐用于厌氧实验)洗涤红细胞2次，在脱气的并且具有隔帽(septum-capped)的15mL离心管中以1000×g下离心5分钟，从而移除过量的CO。在洗涤后，将红细胞重悬至100μM至200μM的终浓度，过量的连二亚硫酸钠用于厌氧实验。

按照与所述用于使用纯Hb进行的实验的方法相同的方法来制备氧合或脱氧的Ngb-H64Q。在一些实验中，在起始反应后，从Ngb-H64Q分离红细胞以测量吸收光谱。在这种情况下，用ISOTEMP^TM加热搅拌器(stirring hotplate)和水浴组合(Fisher Scientific)来调控反应温度。在分离的玻璃小瓶中，将红细胞包封的HbCO以及氧合或脱氧的Ngb-H64Q平衡至25℃至37℃。通过将Ngb-H64Q注射至红细胞溶液中使这两种蛋白质的终浓度为40μM，从而起始反应。将等体积的PBS(含有或不含连二亚硫酸盐)注射至羧化的红细胞的对照样品中。周期性地取0.5ml反应样品和对照样品，并于5000×g下1.5mL微量离心管中离心30秒至60秒。将包含Ngb-H64Q的上清液移除(在好氧实验中添加5mM连二亚硫酸钠以防止蛋白质的自氧化)，并于冰上储存。

将0.5％NP40的PBS溶液(在厌氧实验中一直包含5mM连二亚硫酸钠，并且在好氧实验中有时包含5mM连二亚硫酸钠)添加至红细胞沉淀，以裂解细胞。用Cary 50分光光度计于1cm光程长度的比色杯中测量裂解的红细胞中的Hb吸光度。每1.5分钟至5分钟重复该循环，总共重复6次，得到六个HB的吸光度测量值。持续搅拌对照样品和反应样品。在反应中测量血红蛋白的吸光度的时间被假定为注射Ngb-H64Q后至开始离心后15秒至30秒(分别针对30秒或60秒的离心持续时间)经过的时间。在测量最后的(第6个)时刻点后，还记录储存的反应混合物和对照混合物的上清液样品吸光度。在一些实验中，不将红细胞从Ngb-H64Q分离；相反，使用Cary 100分光光度计的积分球附加器(Integrating Sphere attachment)来记录整个混合物的吸光度。该装置收集由红细胞散射的光，从而提供精确到足以进行光谱去卷积的吸收谱。用于这些实验的方法与用于在制备羧化的红细胞后在Cary 50中将Ngb-H64Q与纯HbCO混合的方法相同。

最小平方去卷积

得到血红蛋白(Hb)和神经珠蛋白H64Q(Ngb-H64Q)的氧化(met)、脱氧(deoxy)、氧合(O₂)和羧化(CO)形式的标准参照光谱。在冰上熔化蛋白质后，通过与过量的铁氰化钾混合并穿过ECONO-PAC^TM 10DG脱盐柱(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)来得到所述氧化形式的光谱。在将过量的连二亚硫酸钠添加至所述氧化形式后记录脱氧物质的光谱。在好氧条件下使脱氧物质穿过脱盐柱后立即记录所述氧合形式的光谱。在将所述脱氧物质与CO饱和的缓冲液以1:4的比率混合后测量所述羧化形式的光谱。所有标准光谱都在Cary 50分光光度计上于20℃、25℃和37℃下收集。

用Microsoft Excel中的最小平方拟合程序来进行实验光谱的去卷积。因为动力学实验的吸光度的变化不大，所以总是在450nm至700nm、490nm至650nm以及510nm至600nm之间，在将Hb和Ngb-H64Q浓度限制成彼此相等和不限制成彼此相等的情况下进行对由Hb和Ngb-H64Q二者构成的所有光谱的拟合，以确认去卷积的精确性。使用Hb和Ngb-H64Q的羧化的和脱氧的标准品来对来自厌氧实验的吸收光谱进行去卷积。使用Hb和Ngb-H64Q的氧化的、羧化的和氧合的形式的标准品来对来自好氧实验的吸收光谱进行去卷积。在红细胞实验中，从Ngb-H64Q分离Hb并且随后将连二亚硫酸盐添加至好氧实验中的红细胞或厌氧实验中的上清液，对于红细胞实验而言，在去卷积中使用脱氧标准品来替代氧合和氧化形式。在对用停流分光光度计收集的光谱以及有时是用HP8453收集的光谱进行去卷积之前，使用MATLAB^TM的插值l函数并采用分段三次埃尔米特插值(piecewise cubic hermiteinterpolation)，将吸光度值重新映射(remap)至与Cary 50分光光度计使用的波长相同的波长。

结果

研究了羧化的红细胞(RBC)与缓冲液或脱氧H64Q神经珠蛋白溶液的反应(图1)。当将RBC与缓冲液混合时，没有发生HbCO比率的可感知变化(图1，左图)。当使细胞与deoxyNgb突变体混合时，所有CO在约15分钟内被从RBC移除。神经珠蛋白级分中的变化与CO从Hb至Ngb的传递一致。

图2中示出了使用相似条件的另一个实验。该反应在仅10分钟内即完成，与之前在图1中示出的结果相似。

此外，评价了羧化的红细胞与oxy H64Q神经珠蛋白的反应(图3)。如针对deoxyNgb所观察到的，氧合形式也能够以比在之前的实验中所观察到的速率甚至更快的速率从红细胞清除CO。该过程在不到5分钟内完成。神经珠蛋白级分中的变化与CO从Hb至Ngb的传递一致。

综上所述，这些结果显示，神经珠蛋白能够在5分钟至10分钟内从位于红细胞内的羧化的血红蛋白中移除CO(跨隔室)，该时间尺度适于临床治疗。

实施例2：WT神经珠蛋白和突变神经珠蛋白的自氧化速率

血红素蛋白中的亚铁-二氧络合物具有固有的自氧化速率，其中氧分子可从血红素铁取得电子，以形成氧化的血红素和超氧自由基：

自氧化是可对期望的神经珠蛋白应用(例如，使CO结合血红蛋白以及从血红蛋白移除CO)有害的副反应。对于治疗碳氧血红蛋白血症的目的，将神经珠蛋白以亚铁二氧络合物形式(氧基形式，Fe²⁺-O₂)输注，该络合物能够：i)结合CO，以及ii)将氧递送至组织。氧基神经珠蛋白的氧化会导致形成三价铁形式(met形式，Fe³⁺)，其不能完成上述两个功能中的任一个。该反应还形成超氧自由基物质(O₂ ^-·)，这将引起升高的氧化胁迫。

确定了野生型神经珠蛋白和一些神经珠蛋白His64突变体的自氧化速率，并总结于表2中。

表2.野生型神经珠蛋白和突变体的自氧化速率

这些值都是在37℃下于pH 7.4的100mM磷酸钠中确定的。

t_1/2：亚铁二氧络合物的半衰期的计算值。

野生型神经珠蛋白具有快速的自氧化速率；每三分钟任何存在的亚铁-二氧络合物中的一半会被氧化。但是，神经珠蛋白突变体H64L和H64Q具有野生型蛋白质的自氧化速率的1/23的自氧化速率。基于这些发现，选择H64Q突变体用于实施例3中描述的体内研究。

实施例3：重组H64Q神经珠蛋白是体内碳氧血红蛋白血症的解毒剂

该实施例显示，以高亲和结合一氧化碳的重组珠蛋白分子的给药可有效地从CO暴露的小鼠的血液中清除HbCO，并且因此该重组珠蛋白分子代表一种用于碳氧血红蛋白血症和/或一氧化碳中毒的解毒剂。在下文描述的实验中，在输注重组突变神经珠蛋白H64Q五分钟后，CO被从红细胞中移除。用于以下研究中的H64Q突变神经珠蛋白还包含三个半胱氨酸残基处的突变(C46G/C55S/C120S)。

在以下实验中，以介于13.6mg至27.2mg(4mM至8mM)的范围内的剂量来给予H64Q神经珠蛋白。人的血量为约5000倍以上，因此该剂量范围相当于68克至136克的人体剂量范围。

在CO暴露的小鼠中评价重组H64Q神经珠蛋白从体内血液中移除HbCO的能力。将小鼠暴露于1500ppm CO，持续60分钟至70分钟，然后停止CO，输注PBS(200μl)或浓缩的H64Q神经珠蛋白(200μl)，持续5分钟(PBS-图4；H64Q神经珠蛋白-图6)或10分钟(H64Q神经珠蛋白-图5)。每5分钟至10分钟取血样(约10μl)，洗涤红细胞，裂解并用连二亚硫酸盐进行化学还原，并监测HbCO和NgbCO。该测定法证明了在进行体内H64Q NgB输注之前和之后红细胞中的CO的量。如图5和6所示，H64Q神经珠蛋白的输注在5分钟或10分钟的输注时间内快速从血液中移除HbCO。

图7A和7B中示出了在5分钟输注PBS或H64Q神经珠蛋白后CO暴露的小鼠的血液中HbCO浓度的衰减。图7A示出了随时间推移的绝对HbCO水平；图7B示出了随时间推移的HbCO水平的相对变化。这些图中示出的结果清楚显示，输注H64Q神经珠蛋白导致从血液中更快地清除HbCO，以及与PBS输注相比，随时间推移的HbCO的更大的相对变化。类似地，图8示出了，与相同时间段的PBS输注相比，输注H64Q 5分钟或10分钟都导致更大的HbCO百分率的衰减。

为了证实神经珠蛋白作为经输注小鼠的尿中的NgbCO被清除，确定来自在CO暴露结束后约75分钟时处死的小鼠的膀胱的尿的吸光度。结果在图9A中示出。上方的三根迹线示出了由神经珠蛋白导致的吸光度，其包含82％至91％的NgbCO。下方的迹线表示不是由Ngb导致的吸光度。此外，通过这些小鼠中红色尿的存在(参见图9B中的注射器)来确认CO暴露的小鼠的尿中NgbCO的存在。

考虑到所公开的本发明的原理所适用的许多可能的实施方案，应认识到，所举例说明的实施方案仅仅是本发明的优选实施方案，并且不应被认为限制本发明的范围。相反，本发明的范围是由所附的权利要求所限定。因此，本发明人要求保护所有落在这些权利要求的范围和精神内的方案作为本发明人的发明。

序列表

<110> 高等教育联邦系统-匹兹堡大学

<120> 用于治疗一氧化碳中毒的一氧化碳清除治疗

<130> 8123-90555-03

<150> US 61/799,155

<151> 2013-03-15

<150> US 61/834,035

<151> 2013-06-12

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 151

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val

1 5 10 15

Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Cys Arg Gln

35 40 45

Phe Ser Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp His

50 55 60

Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His

85 90 95

Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Ser

100 105 110

Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Cys Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met

130 135 140

Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu

145 150

<210> 2

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (46)..(46)

<223> Xaa = Cys 或 Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (55)..(55)

<223> Xaa = Cys 或 Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (64)..(64)

<223> Xaa = Gln, Leu, Ala, Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (120)..(120)

<223> Xaa = Cys 或 Ser

<400> 2

Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val

1 5 10 15

Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Xaa Arg Gln

35 40 45

Phe Ser Ser Pro Glu Asp Xaa Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp Xaa

50 55 60

Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His

85 90 95

Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Ser

100 105 110

Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Xaa Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met

130 135 140

Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu

145 150

<210> 3

<211> 151

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组多肽

<400> 3

Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val

1 5 10 15

Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe

20 25 30

Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Gly Arg Gln

35 40 45

Phe Ser Ser Pro Glu Asp Ser Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp Gln

50 55 60

Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu

65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His

85 90 95

Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Ser

100 105 110

Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Ser Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met

130 135 140

Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu

145 150

<210> 4

<211> 190

<212> PRT

<213> 人类

<400> 4

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu Ile Glu Arg Arg Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met Trp Ala

20 25 30

Arg Leu Tyr Ala Asn Cys Glu Asp Val Gly Val Ala Ile Leu Val Arg

35 40 45

Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe Ser Gln Phe Lys

50 55 60

His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser Pro Gln Leu Arg Lys

65 70 75 80

His Ala Cys Arg Val Met Gly Ala Leu Asn Thr Val Val Glu Asn Leu

85 90 95

His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala

100 105 110

His Ala Leu Lys His Lys Val Glu Pro Val Tyr Phe Lys Ile Leu Ser

115 120 125

Gly Val Ile Leu Glu Val Val Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro

130 135 140

Pro Glu Thr Gln Arg Ala Trp Ala Lys Leu Arg Gly Leu Ile Tyr Ser

145 150 155 160

His Val Thr Ala Ala Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro

165 170 175

Asn Ala Thr Thr Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro

180 185 190

<210> 5

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa = Cys 或 Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (81)..(81)

<223> Xaa = Gln, Leu, Ala 或 Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (83)..(83)

<223> Xaa = Cys 或 Ser

<400> 5

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu Ile Glu Arg Arg Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met Trp Ala

20 25 30

Arg Leu Tyr Ala Asn Xaa Glu Asp Val Gly Val Ala Ile Leu Val Arg

35 40 45

Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe Ser Gln Phe Lys

50 55 60

His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser Pro Gln Leu Arg Lys

65 70 75 80

Xaa Ala Xaa Arg Val Met Gly Ala Leu Asn Thr Val Val Glu Asn Leu

85 90 95

His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala

100 105 110

His Ala Leu Lys His Lys Val Glu Pro Val Tyr Phe Lys Ile Leu Ser

115 120 125

Gly Val Ile Leu Glu Val Val Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro

130 135 140

Pro Glu Thr Gln Arg Ala Trp Ala Lys Leu Arg Gly Leu Ile Tyr Ser

145 150 155 160

His Val Thr Ala Ala Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro

165 170 175

Asn Ala Thr Thr Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro

180 185 190

<210> 6

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组多肽

<400> 6

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu Ile Glu Arg Arg Glu Arg Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met Trp Ala

20 25 30

Arg Leu Tyr Ala Asn Ser Glu Asp Val Gly Val Ala Ile Leu Val Arg

35 40 45

Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe Ser Gln Phe Lys

50 55 60

His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser Pro Gln Leu Arg Lys

65 70 75 80

Gln Ala Ser Arg Val Met Gly Ala Leu Asn Thr Val Val Glu Asn Leu

85 90 95

His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala

100 105 110

His Ala Leu Lys His Lys Val Glu Pro Val Tyr Phe Lys Ile Leu Ser

115 120 125

Gly Val Ile Leu Glu Val Val Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro

130 135 140

Pro Glu Thr Gln Arg Ala Trp Ala Lys Leu Arg Gly Leu Ile Tyr Ser

145 150 155 160

His Val Thr Ala Ala Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro

165 170 175

Asn Ala Thr Thr Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro

180 185 190

Claims

1.以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子在制备用于通过以下方法治疗受试者中的碳氧血红蛋白血症的药物中的用途，所述方法包括：

选择患有碳氧血红蛋白血症的受试者；以及

将治疗有效量的所述药物给予所述受试者，从而治疗所述受试者中的碳氧血红蛋白血症，

其中所述重组珠蛋白分子包括：

相对于SEQ ID NO:1具有H64Q突变、C46G突变、C55S突变和C120S突变的人重组神经珠蛋白。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少3％的碳氧血红蛋白。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少5％的碳氧血红蛋白。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少10％的碳氧血红蛋白。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少15％的碳氧血红蛋白。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少20％的碳氧血红蛋白。

7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中通过静脉输注来给予所述重组珠蛋白分子。

8.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中所述重组珠蛋白分子的治疗有效量为50克至800克。

9.一种从血液或组织中的血红蛋白中移除一氧化碳的体外方法，其为非诊断和非治疗方法，其包括使所述血液或组织与以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子接触，从而从所述血液或组织中的血红蛋白去除一氧化碳，其中所述重组珠蛋白分子包括：

10.以高亲和力结合一氧化碳的重组珠蛋白分子在制备用于通过以下方法从血液或组织中的血红蛋白中移除一氧化碳的药物中的用途，所述方法包括使所述血液或组织与所述药物接触，从而从所述血液或组织中的血红蛋白去除一氧化碳，其中使所述血液或组织与重组珠蛋白分子接触包括将所述重组珠蛋白分子给予受试者，其中所述重组珠蛋白分子包括：

11.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少3％的碳氧血红蛋白。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少5％的碳氧血红蛋白。

13.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少10％的碳氧血红蛋白。

14.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少15％的碳氧血红蛋白。

15.如权利要求10所述的用途，其中所述受试者的血液中具有至少20％的碳氧血红蛋白。

16.如权利要求10-15任一项所述的用途，其中通过静脉输注来给予所述重组珠蛋白分子。

17.如权利要求10-15任一项所述的用途，其中以50克至800克的剂量来给予所述重组珠蛋白分子。