CN108892720B - 一种神经红突变体蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种神经红突变体蛋白及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种神经红突变体蛋白及其制备方法。本发明所述神经红突变体蛋白是基于基因工程和蛋白质工程技术，在人神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys15)，获得神经红突变体蛋白A15C Ngb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述神经红突变体蛋白A15C Ngb的pH稳定性、化学变性稳定性和热稳定性均比WT Ngb有显著提高，可以广泛用于研究人神经红蛋白的结构与功能关系，以及其他基于人神经红蛋白的血红素蛋白分子设计。

Description

一种神经红突变体蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种神经红突变体蛋白及其制备方法。
背景技术
神经红蛋白(Neuroglobin，Ngb)是2000首次由德国科学家在人和鼠中发现的一种血红素蛋白，主要在脑、视网膜等神经组织中表达.它由一条含151个氨基酸的肽链和血红素b组成,与脊椎动物的血红蛋白和肌红蛋白相比,其氨基酸序列的同源性很低(20％～25％)，通过序列分析，神经红蛋白比肌红蛋白更为古老。Ngb在低铁和高铁状态下都具有六配位结构，并含有一对二硫键和一个单独的120位半胱氨酸(Cys120)。至今已得知的Ngb生理功能有：①氧载体功能，Ngb较高的氧亲和力能可逆的结合氧；②在缺氧、缺血以及氧化损伤情况下，神经红蛋白会大量表达，保护神经元不受损害；③可以保护神经细胞对抗氧化应激；④可以清除神经细胞中的活性氧物种；⑤可以作为O2传感器，活化其他蛋白，具有调节功能。但是对Ngb的具体生理学功能仍然不确定，因此构建一种稳定性更好的神经红蛋白对于其结构-性质-功能之间的关系的进一步研究具有重要意义。
构建新型稳定的神经红蛋白，一直是一个探索性的路程。定点突变是研究蛋白质结构、性质与功能关系的有力手段，目前神经红蛋白的定点突变工作主要集中在蛋白质分子内二硫键及血红素轴向配体上。《神经红蛋白突变体(F28Y,F106Y)的构建、表达与表征》一文中报道了在28位和106位引入酪氨酸，构建了神经红蛋白F28Y、F106Y的两种突变体，结果发现神经红蛋白F28Y、F106Y两种单突变体的热稳定性比WT Ngb蛋白还低。另有文献报道在44位引入苯丙氨酸构建了神经红蛋白突变体并进行表征，结果其热稳定性和酸稳定性均较WT Ngb稍低。可见目前还没有提高神经红蛋白稳定性的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种稳定性高的神经红突变体蛋白及其制备方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用在人神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys15)，与人神经红蛋白分子内120位的半胱氨酸Cys120形成分子内二硫键，获得神经红突变体蛋白A15C Ngb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码所述的神经红突变体蛋白A15C Ngb的DNA分子。
由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的神经红突变体蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供了所述神经红突变体蛋白的制备方法，运用定点突变技术，将神经红蛋白15位突变为半胱氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。
作为优选，本发明所述制备方法所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个实施方案中，宿主细胞为BL21(DE3)菌株。
作为优选，本发明所述制备方法所述分离方法为超声破碎菌体。在一些实施方案中，所述超声破碎菌体具体为60W超声破碎1h。
作为优选，本发明所述制备方法所述纯化方法为盐析透析后柱层析纯化。
其中，所述盐析优选为依次进行176g/L、195g/L硫酸铵盐析。
进一步作为优选，所述柱层析纯化具体为依次经过DEAE阴离子交换柱、SephadexG-75凝胶柱、MonoQ阳离子交换柱分离。
在某一具体实施例中，本发明采用多次加入微量高浓度的盐酸溶液检测神经红突变体蛋白A15C Ngb的pH稳定性，结果显示神经红突变体蛋白A15CNgb的稳定性更强，pH稳定性提高了0.7pH单位。
在某一具体实施例中，本发明通过测定不同盐酸胍浓度下的神经红突变体蛋白A15CNgb紫外光谱来检测神经红突变体蛋白A15C Ngb的化学变性稳定性，结果显示，神经红突变体蛋白A15CNgb化学变性稳定性更强，盐酸胍变性浓度相对于WT Ngb提高了0.64M。
在某一具体实施例中，本发明采用圆二色光谱仪来检验神经红突变体蛋白A15CNgb的热稳定性，结果显示，神经红突变体蛋白A15CNgb热稳定更强，较WT Ngb提高约10℃左右。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种神经红突变体蛋白及其制备方法与应用。本发明所述神经红突变体蛋白是基于基因工程和蛋白质工程技术，在人神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys15)，获得神经红突变体蛋白A15C Ngb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述神经红突变体蛋白A15C Ngb的pH稳定性、化学变性稳定性和热稳定性均比WT Ngb有显著提高可以广泛用于研究人神经红蛋白的结构与功能关系，以及其他基于人神经红蛋白的血红素蛋白分子设计。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为WT Ngb(A)和A15C Ngb(B)酸滴定过程中紫外光谱变化图；
图2为WT Ngb和A15C Ngb的A413nm吸光值随pH变化的归一化图；
图3为WT Ngb(A)和A15C Ngb(B)盐酸胍诱导的紫外光谱变化；
图4为WT Ngb和A15C Ngb的A413nm吸光值随盐酸胍浓度变化的归一化图；
图5为WT Ngb(A)和A15C Ngb(B)的CD光谱随温度上升的变化图；
图6为WT Ngb和A15C Ngb在222nm处CD吸收值随温度变化图。
具体实施方式
本发明公开了一种神经红突变体蛋白及其制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
基于基因工程和蛋白质工程，运用定点突变技术，在神经红蛋白15位引入半胱氨酸(Cys)，将突变质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，通过60W超声破菌1h、依次进行176g/L、195g/L硫酸铵盐析透析以及DEAE阴离子交换、柱层分离G75、阳离子交换柱MonoQ方法，进行蛋白质的分离纯化，获得A15C Mb突变体蛋白。
A15C Mb的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
MERPEPELIRQSWRCVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNCRQFSSPEDCLSSPEFLDHIRKVMLVIDAAVTNVEDLSSLEEYLASLGRKHRAVGVKLSSFSTVGESLLYMLEKCLGPAFTPATRAAWSQLYGAVVQAMSRGWDGE
实施例2
分别将WT Ngb(野生型神经红蛋白)和A15C Ngb蛋白溶于的磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(pH 7.0)中，使蛋白溶液浓度为10μM。向两种蛋白溶液中多次加入微量高浓度的盐酸溶液使其pH值逐级降低，记录下各pH值对应的蛋白紫外可见光谱图，得到相应的全谱图(图1)以及soret峰413nm处紫外吸光值(A413nm)随pH值的降低变化图(图2)。通过方程拟合得到WT Ngb的变性中点为pH 3.3，而A15C Ngb的变性中点为pH 2.6，说明了突变体蛋白A15C的稳定性更强。
实施例3
分别调配浓度为2mM的WT Ngb蛋白和A15C Ngb蛋白200μL，分别取10μL 2mM的WTNgb蛋白和A15C Ngb蛋白样品加入到2mL一定梯度浓度的盐酸胍溶液(0-6.0M)混合均匀。在25℃条件下，混合均匀后静置30min，再依次测定不同盐酸胍浓度下的蛋白紫外光谱，记录全谱变化情况(图3)。所得的光谱数据用Origin软件作图，以不同盐酸胍浓度为横坐标，蛋白Soret峰吸光值为纵坐标，并用玻尔兹曼方程进行拟合得到变性中点的盐酸胍浓度，处理得到归一化图(图4)。通过方程拟合得到WT Ngb的变性中点对应盐酸胍浓度为3.75，而A15CNgb的变性中点对应的盐酸胍浓度为4.39，说明了突变体蛋白A15C的稳定性更强。
实施例4
分别将WTNgb、A15C Ngb蛋白溶于磷酸二氢钾-氢氧化钾的缓冲溶液(pH7.0)中，使蛋白溶液浓度为10μM。采用圆二色光谱仪来检验蛋白的热稳定性，扫描范围为190～250nm，蛋白溶液在每个测量温度下恒温10min，确保达到平衡状态。测量并记录各个不同温度下蛋白的CD谱图(图5)。将222nm处的CD值进行拟合(图6)，从图中可以发现WT Ngb在222nm处随温度上升至70℃之后的变化幅度较A15C Ngb的吸收值变化幅度大，在80℃附近出现较大的变化，而A15C Ngb在90℃附近出现较大的变化。由此可以看出A15C Ngb的热稳定较WT Ngb强，提高约10℃左右。
综合上述，A15C Ngb的稳定性(pH稳定性、化学变性稳定性和热稳定性)均比WTNgb有显著提高。
序列表
<110> 南华大学
<120> 一种神经红突变体蛋白及其制备方法
<130> MP1809898
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu Ile Arg Gln Ser Trp Arg Cys Val
1 5 10 15
Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Cys Arg Gln
35 40 45
Phe Ser Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp His
50 55 60
Ile Arg Lys Val Met Leu Val Ile Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu
65 70 75 80
Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His
85 90 95
Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Ser
100 105 110
Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Cys Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala
115 120 125
Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met
130 135 140
Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu
145 150

Claims (9)

1.一种神经红突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述的神经红突变体蛋白的DNA分子。
3.权利要求1所述神经红突变体蛋白的制备方法，运用定点突变技术，将神经红蛋白15位突变为半胱氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述分离方法为超声破碎菌体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超声破碎菌体具体为60W超声破碎1h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纯化方法为盐析透析后柱层析纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述盐析为依次进行176g/L、195g/L硫酸铵盐析。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述柱层析纯化具体为依次经过DEAE阴离子交换柱、Sephadex G-75凝胶柱、MonoQ阳离子交换柱分离。
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