CN106554945B - 一种热稳定性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶工程领域，公开了一种果糖基肽氧化酶及其编码基因，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。本发明还公开了具有所述基因的重组载体及含有该重组载体的转化子。本发明还公开了所述果糖基肽氧化酶、基因、重组载体或转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。此外，本发明公开了一种增强果糖基肽氧化酶的热稳定性的方法，包括将来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的氨基酸残基进行置换，所述置换的方式包括第29位精氨酸置换为赖氨酸、第85位苯丙氨酸置换为酪氨酸和第94位甲硫氨酸置换为赖氨酸中的至少一种。通过上述技术方案，本发明获得了热稳定性明显提高的果糖基肽氧化酶，使得该酶更适合推广应用。

Description

一种热稳定性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体地，涉及一种热稳定性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途。

背景技术

糖尿病在中国属于高发病率慢性疾病，平均十个人就有一人是糖尿病患者。目前中国已成为全球糖尿病患病人数最多、患病率最高的国家。糖尿病严重危害到患者的健康，影响其生活质量，因此对糖尿病的治疗和监测显得十分重要。

在人体红细胞120天生命周期内，血红蛋白可以持续被糖基化，而糖化血红蛋白形成的速率与血糖浓度成正比，因此糖化血红蛋白的含量反映了2-3个月血糖控制的情况。研究发现，与单纯的血糖水平相比，糖化血红蛋白的水平用于诊断糖尿病能更好地反映长期血糖控制和慢性并发症的风险，具有生物变异性较小、无需空腹采血等优点。

临床上检测糖化血红蛋白的方法有很多，其中基于果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)或果糖基肽氧化酶(FPOD)的酶法检测因具有操作简单、快速、价廉、精密度高等优点引起越来越多的关注。

酶法检测糖化血红蛋白的原理是：首先糖化血红蛋白在蛋白酶的作用下分解释放出果糖基缬氨酸(Fructosyl-^aN-valine，f-^αVal)或果糖基二肽(f-^αVal-His)，然后果糖基缬氨酸或果糖基二肽在FAOD或FPOD的作用下分解，反应过程中会产生双氧水，双氧水在过氧化物酶的作用下与特定的发色底物发生反应，颜色变化的程度与糖化血红蛋白的量呈正相关。

目前研究发现的适用于酶法检测糖化血红蛋白的果糖基肽氧化酶大多来源于真菌，这些真菌都不属于耐热菌或嗜热菌，因此其产生的酶一般不具有耐热性，这极大地限制了果糖基肽氧化酶的应用，也就限制了酶法检测糖化血红蛋白试剂盒的应用和推广。

发明内容

本发明的目的是针对现有果糖基肽氧化酶热稳定性不高的缺点，提供一种热稳定性高的酶突变体及其编码基因和相关用途。

为了实现上述目的，本发明的发明人利用生物技术手段对来源于土正青霉(Eupenicillium terrenum)的果糖基肽氧化酶进行了改造，发现突变(置换)其第29、85和94位氨基酸残基中的至少一个可有效改变其热稳定性，因此，第一方面，本发明提供了一种果糖基肽氧化酶，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的果糖基肽氧化酶的基因。

第三方面，本发明提供了具有第二方面所述的基因的重组载体。

第四方面，本发明提供了含有第三方面所述的重组载体的转化子。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的果糖基肽氧化酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。

第六方面，本发明提供了一种增强果糖基肽氧化酶的热稳定性的方法，该方法包括将来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的氨基酸残基进行置换，所述置换的方式为：

第94位甲硫氨酸置换为赖氨酸；或

第29位精氨酸置换为赖氨酸和第85位苯丙氨酸置换为酪氨酸；或

第29位精氨酸置换为赖氨酸、第85位苯丙氨酸置换为酪氨酸和第94位甲硫氨酸置换为赖氨酸。

通过上述技术方案，本发明获得了热稳定性明显提高的果糖基肽氧化酶，使得该酶更适合推广应用。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为野生型果糖基肽氧化酶及本发明获得的果糖基肽氧化酶经纯化后的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本发明中酶单位的定义是：在37℃、pH 8的条件下，每分钟产生1μmol氨基酸产物所需要的酶量定义为一个酶单位，即1U＝1μmol/min；“酶的比活力”代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白；“热稳定性”是指果糖基肽氧化酶对温度的敏感性，能够反应酶对热处理的耐受力，热稳定性高是指经加热处理一段时间酶仍具有较高的比活力。

组成蛋白质的20种氨基酸，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和脯氨酸(Pro，P)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)和酪氨酸(Tyr，Y)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。本发明中使用的缩写“R29K”是指第29位的R残基突变为K残基，依此类推；单位M＝mol/L，相应地，mM＝mmol/L，依此类推。

第一方面，本发明提供的果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:1或2所示。

MAHSRASTKVVVVGGGGTIGSSTALHLIKSGYTPSNITVLDVYKTPSLQSAGHDLNKIMGIRLRNGPDLQLSLESLDMWQNDE LYKPFFHQVGXIDCSSSKEGIENLRRKYQTLLDAGIGLEKTNVWLESEDEILAKAPNFTREQVKGWKGLFCTDGGWLAAAKAI NAIGIFLQDKGVKFGFGGAGTFQQPLFAADGKTCIGLETTDGTKYFADKVVLAAGAWSPTLVDLEDQCVSKAWVFAHIQLTPK EADAYKNVPVVYDGEYGFFFEPNEYGVIKVCDEFPGFSRFKLHQPYGAASPKMISVPRSHAKHPTDTYPDASEVTIRKAIARF LPEFKDKELFNRTMCWCTDTADANLLICEHPKWKNFILATGDSGHSFKLLPNIGKHVVELLEGSLSQEMAGAWRWRPGGDALR SRRGAPAKDLAEMPGWKHDAHL(SEQ IDNO:1，其中X＝M或K)

MAHSRASTKVVVVGGGGTIGSSTALHLIRSGYTPSNITVLDVYKTPSLQSAGHDLNKIMGIRLRNGPDLQLSLESLDMWQNDE LFKPFFHQVGKIDCSSSKEGIENLRRKYQTLLDAGIGLEKTNVWLESEDEILAKAPNFTREQVKGWKGLFCTDGGWLAAAKAI NAIGIFLQDKGVKFGFGGAGTFQQPLFAADGKTCIGLETTDGTKYFADKVVLAAGAWSPTLVDLEDQCVSKAWVFAHIQLTPK EADAYKNVPVVYDGEYGFFFEPNEYGVIKVCDEFPGFSRFKLHQPYGAASPKMISVPRSHAKHPTDTYPDASEVTIRKAIARF LPEFKDKELFNRTMCWCTDTADANLLICEHPKWKNFILATGDSGHSFKLLPNIGKHVVELLEGSLSQEMAGAWRWRPGGDALR SRRGAPAKDLAEMPGWKHDAHL(SEQ IDNO:2)

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的果糖基肽氧化酶的基因。本发明提供的基因的序列为SEQ ID NO:3的第85-87位碱基(CGC)、第253-255位碱基(TTC)或第280-282位碱基(ATG)分别置换为如下所示碱基的序列(参照王镜岩等主编的《生物化学》第三版下册第511页的表37-5遗传密码字典获得)。

K：AAA或AAG

Y：TAT或TAC

ATGGCTCATTCGCGTGCAAGCACCAAAGTCGTCGTGGTTGGGGGAGGTGGTACGATCGGGTCTTCGACGGCTCTGCACTTAAT CCGCTCTGGATATACCCCCTCAAATATCACCGTGCTTGACGTATACAAGACCCCTTCATTGCAATCTGCAGGACATGATTTGA ACAAGATCATGGGCATTCGATTGCGCAACGGGCCTGACTTGCAGCTTTCGCTGGAATCACTCGACATGTGGCAAAACGATGAG TTGTTCAAGCCATTCTTTCACCAAGTGGGCATGATTGATTGTTCGTCATCCAAAGAGGGTATTGAAAATCTTCGACGAAAATA CCAGACCCTCCTCGATGCGGGCATTGGGCTGGAGAAGACGAACGTTTGGCTGGAATCTGAAGATGAGATCCTCGCCAAAGCGC CGAATTTCACGCGTGAACAAGTCAAGGGGTGGAAAGGCTTATTTTGCACTGATGGAGGCTGGCTTGCTGCAGCCAAGGCTATC AATGCGATCGGAATTTTCCTCCAGGACAAAGGTGTCAAGTTTGGCTTTGGAGGTGCTGGAACATTTCAGCAACCTCTGTTCGC CGCTGATGGAAAAACTTGCATCGGACTTGAAACTACAGACGGAACCAAGTACTTTGCTGACAAGGTTGTCTTGGCTGCTGGTG CGTGGAGTCCCACCTTGGTGGATCTAGAAGATCAGTGTGTTTCAAAGGCCTGGGTTTTCGCTCATATTCAACTCACACCCAAA GAAGCGGACGCGTACAAGAATGTGCCTGTGGTCTATGATGGTGAATATGGGTTCTTTTTTGAGCCCAACGAGTATGGGGTGAT CAAAGTCTGTGACGAGTTCCCTGGTTTCTCTCGCTTCAAACTGCATCAACCGTACGGGGCTGCATCTCCCAAGATGATATCCG TACCGCGATCACACGCCAAGCATCCCACAGATACCTACCCTGATGCCTCCGAAGTCACCATACGCAAAGCGATCGCAAGGTTC CTGCCAGAATTTAAAGACAAGGAGCTCTTCAACCGTACCATGTGCTGGTGTACAGATACGGCCGATGCTAACTTATTGATTTG CGAACACCCGAAGTGGAAGAATTTCATTCTGGCCACTGGAGATAGCGGACATTCCTTCAAGCTGTTGCCAAACATCGGGAAAC ACGTTGTTGAGCTTTTAGAGGGATCTCTATCGCAGGAAATGGCTGGTGCCTGGAGATGGAGACCCGGAGGTGATGCTCTTAGA TCTAGACGCGGTGCTCCGGCAAAGGATCTTGCTGAGATGCCGGGATGGAAGCATGATGCACATTTGTGA(SEQ ID NO:3)

第三方面，本发明提供了具有第二方面所述的基因的重组载体。所述重组载体既可以为重组克隆载体，也可为重组表达载体。根据本发明的一种实施方式，所述重组载体可以为pET22b载体的多克隆位点(如BamHI和XhoI)或pET28a载体的多克隆位点(如NdeI和XhoI)间插入有所述基因的重组载体。

第四方面，本发明提供了含有第三方面所述的重组载体的转化子。所述转化子可以为含有本发明的重组载体的菌株，例如，可以通过将本发明的重组载体转入感受态菌株(如大肠杆菌感受态菌株Top10、TG1、DH5a或BL21(DE3))中而获得。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的果糖基肽氧化酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的转化子在酶法检测糖化血红蛋白中的应用。本发明的果糖基肽氧化酶的热稳定性高，从而能够用于更方便地检测糖化血红蛋白。

第六方面，本发明提供了一种增强果糖基肽氧化酶的热稳定性的方法，该方法包括将来源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的氨基酸残基进行置换，所述置换的方式为：

第94位M置换为K；或

第29位R置换为K和第85位F置换为Y；或

第29位R置换为K、第85位F置换为Y和第94位M置换为K。

根据本发明的最优选实施方式，所述置换的方式为第29位R置换为K、第85位F置换为Y和第94位M置换为K。本发明的发明人发现，通过该优选实施方式得到的果糖基肽氧化酶的热稳定性最强。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，基因测序委托金唯智生物科技有限公司完成；引物合成委托生工生物工程股份有限公司完成；酶的纯度经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过Bandscan分析目的条带的灰度和Marker的灰度比后估算得到；酶的浓度通过BCA蛋白定量试剂盒(Sigma)测得；f-^αVal委托中国科学院生物物理研究所合成得到，结构式为：；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用来说明表达果糖基肽氧化酶的编码基因和转化子的构建。

以BamHI和XhoI酶切位点之间携带有果糖基肽氧化酶的编码序列(SEQ ID NO:3)的pET22b载体质粒为模板，对其进行突变，得到突变体R29K、F85Y和M94K的编码序列。

采用QuikChange定点突变试剂盒(Stratagene公司)进行PCR，具体突变和使用的引物如表1所示，PCR反应体系如下：

5×缓冲液 10μl

dNTPs(10mM) 1μl

上游引物(F，10μM) 1μl

下游引物(R，10μM) 1μl

质粒模板 1μl

高保真酶 0.5μl

灭菌双蒸水 35.5μl

PCR条件如下：

预变性：98℃ 30sec；变性：98℃ 10sec，退火：60℃ 30sec，延伸：72℃ 4min，25个循环；最后延伸：72℃ 10min。

表1

向50μl的PCR产物中加入1μl的DpnI酶，37℃消化3小时。从消化后的混合液中取10μl直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(购自天根生化科技有限公司)中，涂布LB氨苄平板，倒置于37℃培养箱培养12h。从平板上挑取单克隆，接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养9h。采用Omega质粒小量提取试剂盒抽取质粒，经基因测序证实突变成功的质粒(R29K、F85Y和M94K)分别转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(购自天根生化科技有限公司)中。

先进行单突变，双突变是在单突变体的基础上再进行另一个位点的突变叠加，三突变是在双突变体的基础上进行第三个位点的突变叠加，突变方法均按上述方法进行，从而得到R29K/F85Y双突变体、M94K单突变体和R29K/F85Y/M94K三突变体。

实施例2

本实施例用来说明果糖基肽氧化酶的表达。

将实施例1中转化有正确突变基因的BL21菌株按照1:1000比例接种至100ml的LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。然后将过夜培养的菌液按照1:100的比例接种至含800ml LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素)的大瓶中，37℃、200rpm培养3小时，至OD值达0.8，向大瓶中加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，16℃诱导表达18h，4℃、4000rpm离心30分钟收集菌体。

实施例3

本实施例用来说明果糖基肽氧化酶的纯化。

参照Ni-NTA产品使用说明书，采用镍离子金属鳌合亲和层析方法纯化酶：将实施例2收集的菌体用裂解缓冲液(Lysis buffer)重悬，超声破碎，破碎液离心后上清与Ni-NTABeads(购自QIAGEN公司)在4℃下结合1小时，经过不同浓度(10mM、50mM、100mM、300mM和500mM)的咪唑洗脱液洗脱，获得较纯的果糖基肽氧化酶，纯度大于95％，SDS-PAGE电泳图见图1(其中，泳道1-4分别表示WT、R29K/F85Y、M94K和R29K/F85Y/M94K)。

裂解缓冲液成分：10mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，pH 8。

实施例4

本实施例用来说明果糖基肽氧化酶的酶活性及热稳定性。

(1)测活试剂A的配制：

磷酸钾缓冲液(pH 8) 100mM

4-氨酰安替比林(4-Aminoantipyrine) 0.45mM

N-乙基-间甲苯胺丙磺酸钠(TOOS) 0.5mM

过氧化物酶(Peroxidase) 900U/L

f-^αVal 15mM

(2)酶液的稀释：用20mM磷酸钾缓冲液(pH 8)将实施例3中纯化的酶稀释到合适浓度，如0.05-0.1mg/ml。

(3)取792μl上述测活试剂A于1ml石英比色皿中，37℃孵育5min，加入8μl稀释后的酶液，迅速搅动混匀，于37℃下反应，开始计时3min并连续读取555nm吸光度的值，然后按照如下公式计算酶的比活力：

其中，ΔA/min：每分钟吸光度的变化值

Vt：反应液总体积

D：酶液稀释倍数

ε：生成的苯醌在555nm下的消光系数，取39.2(cm²/μmol)

Vs：加入反应体系的酶液体积

d：比色杯光径(1cm)

(4)酶的热稳定性检测：即取一定量纯化后的酶在42℃稀释放置15分钟，然后将热处理后的酶按照上述步骤(1)-(3)进行比活力检测，检测结果如表2所示。

表2

将野生型果糖基肽氧化酶(WT)和实施例4获得的各果糖基肽氧化酶热处理前后对f-^αVal的比活力相比，可以看出本发明获得的突变体的热稳定性得到了提高。特别地，R29K/F85Y/M94K经热处理后的比活力最高，热稳定性最强。

此外，经检测，R29K或F85Y的热稳定性均未得到有效提高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种果糖基肽氧化酶，其特征在于，该果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。

2.编码权利要求1所述的果糖基肽氧化酶的基因。

3.一种重组载体，该重组载体具有权利要求2所述的基因。

4.一种转化子，该转化子含有权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的果糖基肽氧化酶、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的转化子在制备用于酶法检测糖化血红蛋白的产品中的应用。

6.一种增强果糖基肽氧化酶的热稳定性的方法，其特征在于，该方法包括将来源于土正青霉(Eupenicillium terrenum)的果糖基肽氧化酶的氨基酸残基进行置换，所述置换的方式为：

第94位甲硫氨酸置换为赖氨酸；或

第29位精氨酸置换为赖氨酸和第85位苯丙氨酸置换为酪氨酸；或

第29位精氨酸置换为赖氨酸、第85位苯丙氨酸置换为酪氨酸和第94位甲硫氨酸置换为赖氨酸。