CN103103167A

CN103103167A - 一种d-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN103103167A
Application number: CN2013100327127A
Authority: CN
Inventors: 鞠建松; 徐书景; 赵宝华; 李辉欣; 冯利伟
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103103167B

Abstract

本发明公开了一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列比对结果，通过定点突变技术将原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae,DSM15035)中D-氨基酸氧化酶的115、119及286三个位点分别突变，构建三点突变表达载体pET-E115A/N119D/T286A，通过原核表达、纯化获得酶蛋白。所获得的突变蛋白对底物D-Met的表观二级速率常数K_cat/K_m为1.39×10⁵s^-1·M^-1，是野生型DAAO的5.03倍，是猪肾来源的pKDAAO蛋白的55.96倍。可以提高对部分D-氨基酸的检测效率，有较好应用价值。

Description

一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种原核生物来源的D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase: Oxidoreductase, DAAO, EC 1.4.3.3) 是一种以黄素腺嘌呤(Flavin adenine dinucletide, FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨。反应如下所示：

RCHNH₂COOH + E-FAD → RC=NHCOOH + E-FADH₂

E-FADH₂ + O₂ → E-FAD + H₂O₂

RC=NHCOOH + H₂O → RCOCOOH + NH₃

D-氨基酸氧化酶对催化反应底物有高度的立体异构选择性和广谱性，可被广泛用于D-氨基酸的定性定量分析、生物传感器、L-氨基酸和α-酮酸的生产。20世纪90年代，DAAO在生物技术酶催化方面得以应用，主要用于两步酶法转化头孢菌素C (Cephalosporin C, CPC)生产7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA）。DAAO广泛存在于自然界中，在许多真核生物体中都发现存在DAAO，包括酵母、真菌、昆虫、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类。继猪肾D-氨基酸氧化酶（pig kidney D-amino acid oxidase , pkDAAO）第一个被提取并获得的纯化的黄素蛋白之后，1987年，科学家从纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)中纯化获得了D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，这也是首次从微生物中纯化得到黄素蛋白。目前已有猪肾pKDAAO、纤细红酵母RgDAAO和人源hDAAO等蛋白晶体结构得到解析。

有关原核生物DAAO的研究报道还很少，仅Birgit Geueke等人2006年首次也是唯一的一次报道了关于原核生物原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae, DSM 15035) 中apdaao基因的克隆和表达，酶蛋白ApDAAO具有较为广泛的底物特异性，其最适反应底物为D-甲硫氨酸，此外对D-赖氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸等具有一定活性。有关D-氨基酸氧化酶的商品还很少，目前仅有来自猪肾的D-氨基酸氧化酶pKDAAO得到了很好地开发和应用，然而由于该产品价格昂贵导致成本上升。因此，开发新型的、成本低廉的D-氨基酸氧化酶迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活力提高的原核生物来源的D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白。

本发明的目的还在于提供一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白的制备方法。

本发明的目的是这样实现的。本发明提供的一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其中：

（1）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第115位的谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）；

（2）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第119位的天门冬酰胺（N）突变为天门冬氨酸（D）；

（3）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第286位的苏氨酸（T）突变为丙氨酸（A）。

本发明还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有上述基因的载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述基因的工程菌。

本发明还提供上述突变体酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自原玻璃蝇节杆菌（DSM20168）的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在与同源蛋白序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；

所述的115位突变引物为：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense： 5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突变引物为：

119位anti-sense：5′-TCTGCCGGACGGCGCCCAC-3′；

119位sense： 5′-TGGGCGCCGTCCGGCAGAT-3′；

286位突变引物为：

286位anti-sense：5′-GAGCACGTCGCGGGCCAC-3′；

286位sense： 5′-GTGGCCCGCGACGTGCTC-3′；

（2）以携带D-氨基酸氧化酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物依次进行PCR扩增，将经限制内切酶DpnI酶切处理的PCR扩增产物转入大肠杆菌E.coli中，筛选获得突变质粒；

（3）将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该突变体酶蛋白。

所述制备方法的优选条件：步骤（2）中所述表达载体为pET系列中的任意一种；

步骤（3）中所述工程菌为BL21(DE3)。

本发明进一步提供上述突变体酶蛋白的应用，具体是将突变体酶蛋白用

于检测D-氨基酸，如D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-鸟氨酸、D-缬氨酸、D-脯氨酸和D-组氨酸等。

具体地，本发明是从原核生物原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae, DSM20168）中获得D-氨基酸氧化酶基因(daao，GenBank ID.JX855922.1)，在与原玻璃蝇节杆菌（DSM 15035）中D-氨基酸氧化酶（apdaao，GenBank ID. AY306197）的氨基酸序列比对的基础上确定突变位点，基于快速定点突变技术（QuickChange Site-directed Mutagenesis）依次取代原有氨基酸位点，构建突变质粒pET-E115A/N119D/T286A；该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于突变体酶蛋白表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET-E115A/N119D/T286A，在37℃和0.5mM IPTG条件下获得了较好的表达。以二级表观速率常数K_cat/K_m表示，突变体E115A/N119D/T286A的催化效率是野生型D-氨基酸氧化酶的5.03倍,是文献报道的ApDAAO的13.43倍，是商品化的猪肾来源的pKDAAO的55.96倍；突变体的K_cat/K_m提高的倍数：

原玻璃蝇节杆菌D-氨基酸氧化酶的突变体核苷酸序列为：SEQ ID NO：2，氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

本发明取得的有益效果如下：本发明基于同源序列比对结果确定突变位点，通过快速定点突变技术（QuickChange Site-directed Mutagenesis）取代，获得D-氨基酸氧化酶突变体蛋白E115A/N119D/T286A，以表观二级速率常数K_cat/K_m表示，突变体蛋白的活性得到了提高。

附图说明

图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱。

1为基因daao的PCR产物

2为基因apdaao的PCR产物

图2为定点突变PCR产物电泳图谱。

1为115位突变PCR产物

2为115/119双点突变PCR产物

3为115/119/286三点突变PCR产物

图3为突变体质粒双酶切电泳图。

1为pET-DAAO的双酶切结果图

2为pET-ApDAAO的双酶切结果图

3为pET-E115A的双酶切结果图

4为pET-E115A/N119D的双酶切结果图

5为pET-E115A/N119D/T286A的双酶切结果图。

图4为纯化蛋白SDS-PAGE图。

1为纯化蛋白DAAO电泳图

2为纯化蛋白ApDAAO电泳图

3为突变体蛋白E115A电泳图

4为突变体蛋白E115A/N119D电泳图

5为突变体蛋白E115A/N119D/T286A电泳图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 D-氨基酸氧化酶基因daao获得及表达载体构建

（1）daao基因获得

依据原玻璃蝇节杆菌（Arthrobacter protophormiae，DSM20168）中D-氨基酸氧化酶基因(GenBank ID. JX855922.1)设计引物，以A. protophormiae基因组DNA为模板，PCR扩增获得1个特异片段（图1，lane1）。daao扩增引物为：

Sense: 5′-TCCCATATGCCCACAGCACCGTTGAG-3′（下划线为NdeI酶切位点）;

Anti-sense: 5′-ATACTCGAGGCTGGCCGGCTCGCCA-3′（下划线为XhoI酶切位点）;

PCR扩增反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，55℃退火1min，72℃延伸2min，循环25次；72℃延伸10min。

扩增得到的PCR片段，经胶回收后，与载体pMD18-T连接，并将连接产物转化至大肠杆菌E. coli DH5α，经蓝白斑筛选，挑选白色克隆提取质粒pMD-DAAO，送北京华大基因测序鉴定。序列比对发现daao基因(GenBank ID. JX855922.1)与Arthrobacter protophormiae（DSM 15035）中D-氨基酸氧化酶（GenBank ID. AY306197）的核苷酸同源性为98.7%，氨基酸同源性为98.5%，有五个氨基酸位点不一致。

以原玻璃蝇节杆菌A. protophormiae (DSM15035)基因组为模板，按照上述条件扩增获得apdaao基因片段（图1，lane2），PCR产物与载体pMD18-T连接，测序筛选获得质粒pMD-ApDAAO。

（2）表达载体构建

质粒pMD-DAAO、pMD-ApDAAO与质粒pET-22b（+）分别经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切，目的DNA片段经胶回收后，用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E. coli DH5α，筛选阳性克隆，获得表达质粒pET-dAAO和pET-ApDAAO（图3，lane1和2）。

实施例2 突变体E115A/N119D/T286A表达载体构建

（1）设计突变引物

参照根据原玻璃蝇节杆菌中D-氨基酸氧化酶待突变变位点115、119和286周边核苷酸序列，设计以下3对定点突变引物：

115位突变引物为：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense： 5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突变引物为：

119位anti-sense：5′-TCTGCCGGACGGCGCCCAC-3′；

119位sense： 5′-TGGGCGCCGTCCGGCAGAT-3′；

286位突变引物为：

286位anti-sense：5′-GAGCACGTCGCGGGCCAC-3′；

286位sense： 5′-GTGGCCCGCGACGTGCTC-3′；

（2）突变体E115A表达载体构建

基于快速PCR突变技术（QuickChange Site-Directed Mutagenesis），以重组表达载体pET-DAAO为模板,以115位突变引物进行第一轮PCR反应，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测（图2，lane1）。

PCR产物经DpnI消化，转化至大肠杆菌E. coli DH5α，挑取单一菌落培养后提取质粒并通过测序及双酶切验证（图3，lane3），获得突变质粒pET-E115A。

（3）双点突变体E115A/N119D表达载体构建

以质粒pET-E115A为PCR反应模板，以119位突变引物为引物，按照第一轮PCR反应条件进行第二轮PCR反应（图2，lane2），构建双点突变体表达载体pET-E115A/N119D（图3，lane4）。

（4）三点突变体E115A/N119D/T286A表达载体构建

以质粒pET-E115A/N119D为PCR模板，以286位突变引物为引物，按照第一轮PCR反应条件进行第三轮PCR反应（图2，lane3），构建三点突变体表达载体pET-E115A/N119D/T286A（图3，lane5）。

实施例3 突变体酶及野生型酶蛋白的表达与和纯化

将质粒pET-DAAO、pET-ApDAAO及各突变体表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选转化子在LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）37℃过夜培养；培养液以1:100接种于100mL LB液体培养基（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5，加入0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）,30℃诱导表达过夜。于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，超声波破碎。用Ni-NTA亲和层析柱(Ni-NTA affinity chromatography)纯化，洗脱液中咪唑浓度为250mM，得到纯化的野生型蛋白DAAO、ApDAAO、突变体蛋白E115A、E115A/N119D和E115A/N119D/T286A。

纯化后的酶蛋白经SDS-PAGE（12.5%）鉴定，在分子量约38kDA处均有一特异性很高的条带（图4），说明蛋白纯化效果较好。SDS-PAGE显示蛋白质的分子量大小约为38kDa，与通过氨基酸序列计算的分子量大小相一致。

实施例4 D-氨基酸氧化酶及各突变体的活性检测

（1）相对酶活测定

将由实施例3得到的酶蛋白DAAO、ApDAAO、E115A、E115A/N119D以及E115A/N119D/T286A各取5μL，与含有50mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 0.1 mg·mL^-1 4-aminoantipyrine, 0.1 mg·mL^-1 N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium salt (TOOS), 2 units Peroxidase及底物D-甲硫氨酸（D-Met，终浓度50 mM）的混合溶液195 μL（37°C预热20 min）迅速混合，混合液于37 °C反应20 min，用酶标仪（SpectraMax 190 Microplate Reader, Molecular Devices Corp. USA）测定550 nm下的吸光值，每组做3个平行实验，取平均值计算酶活。以Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）替代酶蛋白作为阴性对照，猪肾来源的D-氨基酸氧化酶pKDAAO（Sigma公司，产品货号为A5222）作为阳性对照。以野生型酶蛋白DAAO为100%，与之相比，突变体E115A/N119D/T286A的相对酶活最高，约为308.44%，ApDAAO为43.11%，pKDAAO的相对活性最低，仅为18.66%（表1）。

表1 酶蛋白的相对酶活及动力学常数

（2）酶动力学参数测定

酶活定义：每分钟降解1μmolD-氨基酸所需要的酶量定义为1单位（U）。

在含50mM Tris-HCl buffer（pH 9.4）、0.1 mg.mL^-1 4-aminoantipyrine、 0.1 mg.mL^-1 N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium salt (TOOS)及2 units peroxidase反应体系中（总体系为200 μL）,改变底物D-甲硫氨酸的浓度（0.5mM-50mM），加入由实施例3得到的酶蛋白后迅速混合，30 °C下反应15min，用酶标仪测定550 nm下的吸光值，计算D-氨基酸降解量，每组做3个平行实验，取平均值做曲线，根据Graphpad软件提供的非线性拟合的方法计算各酶蛋白的动力学常数K_m、Vmax、K_cat及K_cat/K_m值(表1)。以表观二级速率常数K_cat/K_m表示，突变体E115A/N119D/T286A的催化效率是野生型DAAO的5.03倍,是ApDAAO蛋白的13.43倍，是已经商品化的pKDAAO的55.96倍。具体数值见表1。

实施例5 酶蛋白对不同底物的相对酶活

将由实施例3得到的酶蛋白DAAO、突变体酶蛋白E115A/N119D/T286A和pKDAAO分别取5μL，与含有50mM Tris-HCl buffer (pH 9.0), 0.1 mg.mL^-1 4-aminoantipyrine, 0.1 mg.mL^-1 N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium salt (TOOS), 2 units Peroxidase溶液充分混合，分别加入各种D-氨基酸（终浓度为50mM），反应总体系为200 μL，于37 °C反应20 min，用酶标仪测定550 nm下的吸光值，每组做3个平行实验，用蒸馏水代替D-氨基酸作为空白对照，取平均值计算相对酶活。从表2可以看出，以对D-Met的相对活性为100%，尽管酶蛋白DAAO和突变体酶蛋白E115A/N119D/T286A与猪肾来源的pKDAAO对不同底物的相对活性有所不同，但它们均能定性或定量检测多种D-氨基酸，具备一定的应用价值。

表2 酶蛋白的底物特异性分析

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

序列一：D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No.1）

SEQUENCE LISTING

<110> 河北师范大学

<120> 一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> Arthrobacter protophormiae

<400> 1

Met Pro Thr Ala Pro Leu Arg Ile Thr Val Ile Gly Ser Gly Val Ile

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Ala His Glu Leu Ala Ala Ala Gly His Gln Val Thr

20 25 30

Val Ala Tyr Asp Gln Glu Leu Ala Glu Cys Val Ser Ser Val Ala Ala

35 40 45

Ala Ile Trp Phe Pro Tyr His Ser Glu Asn Ser Pro Ala Ala Asp Lys

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Ser Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ser Glu His Pro

65 70 75 80

Glu Thr Gly Ile Asp Leu Arg Arg Gly Leu Asn Val Asp His Leu Pro

85 90 95

Gly Ala Asp Arg Ser Trp Thr Arg Ile Val Ala Gly Thr Glu Glu Ala

100 105 110

Ser Arg Ala Asp Leu Pro Asp Gly Ala His Ala Gly Val Trp Ala Thr

115 120 125

Val Pro Ile Ile Thr Met Ser Thr Tyr Leu Gly Trp Leu Arg Gly Arg

130 135 140

Val Glu Glu Leu Gly Ala Asp Phe Ala Lys Gly Thr Val Thr Asp Leu

145 150 155 160

Ala Gln Leu Lys Gly Gly Ala Asp Leu Val Val Leu Ala Ala Gly Leu

165 170 175

Arg Gly Gly Glu Leu Leu Gly Asp Asp Asp Thr Val Tyr Pro Ile Arg

180 185 190

Gly Gln Val Val Arg Leu Ala Asn Thr Lys Asn Leu Thr Gln Trp Leu

195 200 205

Cys Asp Asp Asn Tyr Pro Asp Gly Val Ser Tyr Ile Ile Pro Arg Arg

210 215 220

Glu Asp Ile Ile Val Gly Gly Thr Asp Thr Ala Asn Asp Trp Asn Arg

225 230 235 240

Glu Val Glu Pro Gln Thr Ser Ile Asp Ile Leu Glu Arg Ala Ala Thr

245 250 255

Leu Val Pro Glu Leu Glu Gly Leu Glu Val Leu Glu His Lys Val Gly

260 265 270

Leu Arg Pro Ala Arg Glu Thr Ile Arg Leu Glu His Val Ala Gly His

275 280 285

Pro Leu Pro Val Ile Ala Ala Tyr Gly His Gly Gly Ala Gly Val Thr

290 295 300

Leu Ser Trp Gly Thr Ala Gln Arg Val Ala Glu Leu Ala Ala Gln Leu

305 310 315 320

Ala Gly Glu Pro Ala Ser

325

序列二：编码D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋基因的核苷酸序列（SEQ ID No.2）

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> Arthrobacter protophormiae

<400> 2

atgcccacag caccgttgag aatcaccgtg atcggttccg gcgtcatcgg cctgtccgcg 60

gcccacgagc tggccgccgc cgggcaccag gtcaccgtcg cctacgacca ggagctcgcc 120

gagtgcgtct cctcggtcgc ggccgccatc tggttcccct accattcgga gaactccccg 180

gccgccgaca agctgctggc ggattcgctg gcccgcttcg agcagctgtc cgagcacccc 240

gagaccggca tcgacctgcg ccgcggcttg aatgtggacc acctgccggg cgcggaccgc 300

agctggaccc gcatcgtcgc cggcaccgag gaagcctccc gggcggatct gccggacggc 360

gcccacgcgg gcgtgtgggc gacggtgccg atcattacca tgagcaccta cctgggctgg 420

ctgcgcggcc gggtcgagga gctgggcgcg gacttcgcca agggcacggt cacggatctg 480

gcgcagctta agggcggcgc ggatctggtg gtgctggcag cgggcctgcg cggcggcgag 540

ctgctgggcg acgacgatac cgtctacccg atccgcgggc aggtggtgcg cctggccaac 600

acgaagaacc tgacgcagtg gctgtgcgac gacaactacc cggatggtgt cagctacatc 660

atcccccgcc gcgaggacat catcgtggga ggcaccgaca ccgcgaacga ctggaaccgc 720

gaagtcgaac cgcagacctc catcgacatc ctggaacgcg ctgccacgct ggtgccggag 780

ctggaaggac tggaggtcct ggagcacaag gtgggcctgc gcccggcgcg cgagaccatc 840

cggctggagc acgtcgcggg ccacccgctg ccggtgatcg ccgcctatgg gcacggcggt 900

gccggcgtca cgctgtcctg gggcaccgca cagcgggtcg cagagctggc tgcacaactg 960

gctggcgagc cggccagcct cgagcaccac caccaccac 999

SEQUENCE LISTING

<110> 河北师范大学

<120> 一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> Arthrobacter protophormiae

<400> 1

Met Pro Thr Ala Pro Leu Arg Ile Thr Val Ile Gly Ser Gly Val Ile

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Ala His Glu Leu Ala Ala Ala Gly His Gln Val Thr

20 25 30

Val Ala Tyr Asp Gln Glu Leu Ala Glu Cys Val Ser Ser Val Ala Ala

35 40 45

Ala Ile Trp Phe Pro Tyr His Ser Glu Asn Ser Pro Ala Ala Asp Lys

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Ser Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ser Glu His Pro

65 70 75 80

Glu Thr Gly Ile Asp Leu Arg Arg Gly Leu Asn Val Asp His Leu Pro

85 90 95

Gly Ala Asp Arg Ser Trp Thr Arg Ile Val Ala Gly Thr Glu Glu Ala

100 105 110

Ser Arg Ala Asp Leu Pro Asp Gly Ala His Ala Gly Val Trp Ala Thr

115 120 125

Val Pro Ile Ile Thr Met Ser Thr Tyr Leu Gly Trp Leu Arg Gly Arg

130 135 140

Val Glu Glu Leu Gly Ala Asp Phe Ala Lys Gly Thr Val Thr Asp Leu

145 150 155 160

Ala Gln Leu Lys Gly Gly Ala Asp Leu Val Val Leu Ala Ala Gly Leu

165 170 175

Arg Gly Gly Glu Leu Leu Gly Asp Asp Asp Thr Val Tyr Pro Ile Arg

180 185 190

Gly Gln Val Val Arg Leu Ala Asn Thr Lys Asn Leu Thr Gln Trp Leu

195 200 205

Cys Asp Asp Asn Tyr Pro Asp Gly Val Ser Tyr Ile Ile Pro Arg Arg

210 215 220

Glu Asp Ile Ile Val Gly Gly Thr Asp Thr Ala Asn Asp Trp Asn Arg

225 230 235 240

Glu Val Glu Pro Gln Thr Ser Ile Asp Ile Leu Glu Arg Ala Ala Thr

245 250 255

Leu Val Pro Glu Leu Glu Gly Leu Glu Val Leu Glu His Lys Val Gly

260 265 270

Leu Arg Pro Ala Arg Glu Thr Ile Arg Leu Glu His Val Ala Gly His

275 280 285

Pro Leu Pro Val Ile Ala Ala Tyr Gly His Gly Gly Ala Gly Val Thr

290 295 300

Leu Ser Trp Gly Thr Ala Gln Arg Val Ala Glu Leu Ala Ala Gln Leu

305 310 315 320

Ala Gly Glu Pro Ala Ser

325

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> Arthrobacter protophormiae

<400> 2

atgcccacag caccgttgag aatcaccgtg atcggttccg gcgtcatcgg cctgtccgcg 60

gcccacgagc tggccgccgc cgggcaccag gtcaccgtcg cctacgacca ggagctcgcc 120

gagtgcgtct cctcggtcgc ggccgccatc tggttcccct accattcgga gaactccccg 180

gccgccgaca agctgctggc ggattcgctg gcccgcttcg agcagctgtc cgagcacccc 240

gagaccggca tcgacctgcg ccgcggcttg aatgtggacc acctgccggg cgcggaccgc 300

agctggaccc gcatcgtcgc cggcaccgag gaagcctccc gggcggatct gccggacggc 360

gcccacgcgg gcgtgtgggc gacggtgccg atcattacca tgagcaccta cctgggctgg 420

ctgcgcggcc gggtcgagga gctgggcgcg gacttcgcca agggcacggt cacggatctg 480

gcgcagctta agggcggcgc ggatctggtg gtgctggcag cgggcctgcg cggcggcgag 540

ctgctgggcg acgacgatac cgtctacccg atccgcgggc aggtggtgcg cctggccaac 600

acgaagaacc tgacgcagtg gctgtgcgac gacaactacc cggatggtgt cagctacatc 660

atcccccgcc gcgaggacat catcgtggga ggcaccgaca ccgcgaacga ctggaaccgc 720

gaagtcgaac cgcagacctc catcgacatc ctggaacgcg ctgccacgct ggtgccggag 780

ctggaaggac tggaggtcct ggagcacaag gtgggcctgc gcccggcgcg cgagaccatc 840

cggctggagc acgtcgcggg ccacccgctg ccggtgatcg ccgcctatgg gcacggcggt 900

gccggcgtca cgctgtcctg gggcaccgca cagcgggtcg cagagctggc tgcacaactg 960

gctggcgagc cggccagcct cgagcaccac caccaccac 999

Claims

1.一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中：

2.一种编码如权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种制备如权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自原玻璃蝇节杆菌的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在与同源蛋白的氨基酸序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；

所述的115位的突变引物为：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense： 5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突变引物为：

119位anti-sense：5′-TCTGCCGGACGGCGCCCAC-3′；

119位sense： 5′-TGGGCGCCGTCCGGCAGAT-3′；

286位突变引物为：

286位anti-sense：5′-GAGCACGTCGCGGGCCAC-3′；

286位sense： 5′-GTGGCCCGCGACGTGCTC-3′；

（2）以携带D-氨基酸氧化酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物，利用快速PCR突变技术，构建115/119/286三个氨基酸位点突变的突变质粒；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中表达载体为pET系列中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中工程菌为BL21(DE3)。

6.根据权利要求1所述突变体酶蛋白的应用，其特征在于用于对D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-鸟氨酸、

D-缬氨酸、D-脯氨酸和D-组氨酸中D-氨基酸的定性定量检测。