CN107058256B - ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107058256B
CN107058256B CN201710308984.3A CN201710308984A CN107058256B CN 107058256 B CN107058256 B CN 107058256B CN 201710308984 A CN201710308984 A CN 201710308984A CN 107058256 B CN107058256 B CN 107058256B
Authority
CN
China
Prior art keywords
val
gly
ala
leu
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710308984.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058256A (zh
Inventor
黄�俊
谢东芳
方卉
梅乐和
王宏鹏
胡升
吕常江
赵伟睿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Banglin Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Science and Technology ZUST filed Critical Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority to CN201710308984.3A priority Critical patent/CN107058256B/zh
Publication of CN107058256A publication Critical patent/CN107058256A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058256B publication Critical patent/CN107058256B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了ω‑转氨酶突变体及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。本发明还提供了编码ω‑转氨酶突变体的基因、包含该基因的表达单元、重组质粒和转化子。本发明制备方法利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω‑转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω‑转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。

Description

ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
手性胺是一类有重要价值的医药及精细化工中间体，对手性胺类化合物的不对称合成进行深层次研究具有较大的经济效益和应用价值。目前，超过70％的药物都是手性胺及其衍生物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的合成都是以手性胺作为中间体。
转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)的参与，催化过程如下所示：
实验表明，ω-转氨酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，不利于应用到工业生产中，其热稳定性有待进一步提高。如CN 105441404 A、CN 105950581 A公开了利用定点突变技术对ω-转氨酶野生型进行改造，获得热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体，使其更适合工业应用。
在自然进化过程中，某一特定位置上出现频率较高的氨基酸一般是对蛋白质结构和功能是有利的，不合适的氨基酸逐渐消失，从而使该位点上的氨基酸慢慢趋于一致，那么把不一致的氨基酸突变成为一致性的氨基酸对于蛋白质的稳定性起着重要的作用。目前尚无通过将转氨酶序列中不一致的氨基酸突变成一致性的氨基酸来提高其热稳定性的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于序列一致性分析选择氨基酸突变位点制备生物酶突变体的方法，通过该方法获得酶活、热稳定性进一步提高的ω-转氨酶突变体。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种生物酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用BLAST比对筛选获得与野生型生物酶同源的氨基酸序列，通过分析序列一致性，选择与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为需要突变的位点；
(2)针对需要突变的位点设计定点突变引物，以野生型生物酶基因为模板，进行定点PCR扩增，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(3)从定点突变文库中筛选获得生物酶突变体。
本发明依据在自然进化过程中，同源蛋白质的氨基酸序列某些特定位置向蛋白质结构和功能有利的方面趋于一致的机制，利用生物信息学技术筛选出与待改造生物酶同源的序列，并进行序列一致性分析，确定待改造生物酶中与同源序列不一致的氨基酸残基位点作为突变对象，进而利用定点突变技术进行改造。
本发明利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与野生型生物酶同源的氨基酸序列，作为优选，步骤(1)中，BLAST比对的条件为：E-value最大值为10-3，序列冗余度不超过0.9。
作为优选，步骤(1)中，采用Weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)进行序列一致性分析，突变的保守性阈值为0.6，即在多序列比对中该位点氨基酸类型所占的比例达到60％以上。
基于序列一致性筛选定点突变位点，可有效提高突变位点选择的准确率，降低筛选工作量，节省时间，提高实验效率。采用上述方法获得的突变体比野生转氨酶具有更好的热稳定性，更好的酶活性，从而证明了本发明突变位点预测筛选方案的可行性。
作为优选，所述野生型生物酶为土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶。
本发明还提供了利用上述方法获得的ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。
氨基酸序列如SEQ ID NO.2的ω-转氨酶突变体是第77位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，该突变体(I77L)的半失活温度为42.8±0.7℃，比野生型ω-转氨酶提高了4.3℃，突变体(I77L)在40℃下的半衰期为17.0±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长10.1min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.4的ω-转氨酶突变体是第97位的氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸，该突变体(Q97E)的半失活温度为41.7±0.3℃，比野生型ω-转氨酶提高了3.2℃，突变体(Q97E)在40℃下的半衰期为16.5±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长9.6min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.6的ω-转氨酶突变体是第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺，该突变体(H210N)的半失活温度为44.9±0.7℃，比野生型ω-转氨酶提高了6.4℃，突变体(H210N)在40℃下的半衰期为32.7±1.3min，比野生型ω-转氨酶延长25.8min；酶活性约是野生型酶的1.7倍。
氨基酸序列如SEQ ID NO.8的ω-转氨酶突变体是第245位的氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，该突变体(N245D)的半失活温度为41.4±0.3℃，比野生型ω-转氨酶提高了2.9℃，突变体(N245D)在40℃下的半衰期为14.8±0.6min，比野生型ω-转氨酶延长7.9min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.10的ω-转氨酶突变体是第292位的氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸，该突变体(G292D)的半失活温度为41.3±0.5℃，比野生型ω-转氨酶提高了2.8℃，突变体(G292D)在40℃下的半衰期为14.8±0.8min，比野生型ω-转氨酶延长7.9min。
氨基酸序列如SEQ ID NO.12的ω-转氨酶突变体是第295位的氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸，该突变体(I295V)的半失活温度为38.7±0.2℃，比野生型ω-转氨酶提高了0.2℃，突变体(I295V)在40℃下的半衰期为9.3±0.5min，比野生型ω-转氨酶延长2.4min。
本发明还提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。
作为优选，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供了包含所述基因的表达单元、重组质粒和转化子。
表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，ω-转氨酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。
所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a(+)。
所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明还提供了所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。相较于野生型酶，突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性，更适合工业应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性、酶活性明显优于野生酶的突变酶。
附图说明
图1为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱；
图2为ω-转氨酶序列一致性分析结果图；
图3为突变体在ω-转氨酶三级结构中的位置图(以球表示)及其序列一致性分析结果图；
图4为突变体酶和野生型酶的酶活性结果图；
图5为突变体酶和野生型酶的半失活温度T50 10；
图6为突变体酶和野生型酶的半衰期t1/2；
图7为突变体酶和野生型酶的最适温度结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书的保护范围。
实施例中未注明的实验方法，如感受态细胞制备、转化以及LB培养基配制等参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂译，科学出版社，2002)中的方法进行。
DpnI酶购自Thermo Scientific公司，PrimeStar Max DNA聚合酶购自TaKaRa公司。
寡核苷酸序列委托南京金斯瑞生物有限公司合成。
质粒提取、胶回收试剂盒以及PCR清洁试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪公司。
纯化用Ni柱介质、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、DNA和蛋白质Marker购自生工生物工程(上海)有限公司。
种子培养基为LB培养基，表达培养基为LB培养基，均含有50μg/mL卡那霉素。
一.生物信息学预测
根据NCBI数据库中Aspergillus terreus的ω-转氨酶基因序列(Genbank:XM_001209325)以及密码子使用数据(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中的Escherichiacoli密码子使用频率分布表，分析ω-转氨酶的密码子使用情况。密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-opt-TA基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其编码的蛋白质共325个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
通过BLAST比对，设置E-value最大值为10-3，序列冗余度不超过0.9，共筛选获得同源的氨基酸序列91条。依据序列一致性进行突变位点的筛选，筛选的原则是突变的保守性阈值为0.6，即在多序列比对中该位点氨基酸类型所占的比例达到60％以上，利用Weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)得到序列一致性分析结果，共筛选出6个突变位点：H210N、Q97E、G292D、N245D、I295V和I77L。
本发明中经密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-TA基因)委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用pET-28a质粒作为克隆载体，酶切位点分别为NdeI和Hind III。构建的重组质粒pET-28a-ω-opt-TA转入E.coli BL21(DE3)，获得重组菌。
二.克隆
采用定点突变PCR方法分别对ω-转氨酶基因位点的I77、Q97、H210、N245、G292、I295进行定点突变，定点突变的引物如表1所示。
表1ω-转氨酶中H210N位点定点突变引物的设计
以pET-28a-ω-opt-TA质粒为模板，进行定点PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，包含：Prime STAR Max DNA Polymerase 25μL，1μL上游引物(10μM)，1μL下游引物(10μM)，1μL质粒模板(100ng/μL)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。
PCR扩增程序为：98℃变性1min后，进入扩增循环，即98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环30次，最后再72℃延伸7min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。
所得定点PCR反应产物用Dpn I在37℃下酶解2h以消除父本模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞E.coli DH 5α，转化液涂布含有卡那霉素(50μg/μL)的LB固体平板得到定点突变文库，于37℃培养12h。
三.突变酶的表达和纯化
从定点突变文库中随机挑取1～3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至通用生物系统(安徽)有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变，测序引物为T7通用引物。引入预期突变的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的100mL的LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH 7.0)中，37℃、180r/min培养至OD600值为0.4～0.6时，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃、150r/min条件下诱导培养18h后收集菌体。
将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，后用10％发酵液体积的破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300W，工作3s，间歇6s，超声8分钟。破胞液于12 000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有的ω-转氨酶粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
所用缓冲液配制如下：
破胞缓冲液(20mM洗脱缓冲液)：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH8.0；50mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH8.0；100mM洗脱缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，100mM咪唑，pH 8.0；250mM洗脱缓冲液:50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH8.0。
四.突变酶活力的测定
以(R)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α甲基苄胺，2.5mM丙酮酸，0.1mM PLP)，20μL纯酶液(约0.3mg/mL)。利用酶标仪检测波长245nm处OD值随时间的变化曲线。
酶活计算方法如下：
ε为12,000M-1·cm-1，MD190酶标仪测定的数据是mAbs/min。
结果如图4所示，突变体酶的活性与野生型酶相比，均有所提高，其中突变体酶H210N的酶活性约是野生型酶的1.7倍。
五.突变酶热稳定性考察
半失活温度(T50 10)：酶在特定温度下孵育一定时间后，酶活力丧失一半的温度，这是表征酶热稳定性的一个重要参数。分别将野生酶和突变酶在25～55℃水浴中孵育10min，孵育结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以温度为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，计算半失活温度(T50 10)。
实验结果如下表2和图5所示，突变体酶的T50 10与野生型酶相比，均有所提高，其中突变体酶H210N的T50 10与野生型酶相比提高了6.4℃。
半衰期(t1/2)是指特定温度下酶活力丧失一半的时间，是表征酶热稳定性的另一个重要参数。将父本酶和突变酶在40℃下分别孵育2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50min，孵育结束后迅速放置在冰上冷却，然后测定酶的残余比活力。以时间为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，由图可以计算出酶活力降低为50％时所对应的保温时间(t1/2)。
结果如表2和图6所示。实验结果表明，突变酶的t1/2与野生型酶相比，均有所提高，其中突变体酶H210N的t1/2为野生型的4.7倍。
由此说明，这些突变体增强了该蛋白的热稳定性，减缓了酶的热失活速率，使得突变酶可以耐受更高的温度而不丧失活力。
表2ω-转氨酶及其突变体稳定性结果
六.最适温度
以(R)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)配制，200μL的反应体系中包括180μL底物溶(0.25％DMSO，2.5mM(R)-(+)-α甲基苄胺，2.5mM丙酮酸，0.1mM PLP)，加入20μL纯酶液(约0.3mg/mL)后(并做三组平行对照)，放入不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)的恒温混匀仪中进行反应(400r/min)，3min后放入100℃的水浴中煮沸10min，最后在冰上放置10min后，利用酶标仪检测波长245nm处的OD值。结果如图7所示，野生酶和突变体酶最适反应温度均为45℃，但是突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江科技学院
<120> ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体I77L基因
<400> 1
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatct gacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体I77L
<400> 2
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Thr Arg Leu
65 70 75 80
Leu Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg
85 90 95
Asp Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile
100 105 110
Arg Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val
115 120 125
Arg Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val
130 135 140
Gln Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile
165 170 175
Asp Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met
180 185 190
Phe Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly
195 200 205
Asp Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys
210 215 220
Asp Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr
225 230 235 240
Arg Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg
245 250 255
Val Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe
260 265 270
Met Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly
275 280 285
Met Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp
290 295 300
Asp Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile
305 310 315 320
Asp Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 3
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体Q97E基因
<400> 3
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatga agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 4
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体Q97E
<400> 4
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Glu Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 5
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体H210N基因
<400> 5
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgaat ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 6
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体H210N
<400> 6
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala Asn Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 7
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体N245D基因
<400> 7
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcgatgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 8
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体N245D
<400> 8
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asp Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 9
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体G292D基因
<400> 9
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatgatgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 10
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体G292D
<400> 10
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Asp Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 11
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶突变体I295V基因
<400> 11
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aagtggggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 12
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶突变体I295V
<400> 12
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325
<210> 13
<211> 978
<212> DNA
<213> ω-转氨酶基因
<400> 13
atggccagta tggataaggt ttttgcaggc tatgctgccc gtcaagcaat cttagaaagt 60
accgaaacta cgaacccgtt tgccaaagga attgcctggg tcgaagggga actcgttcct 120
ttagctgaag cacgcattcc actcctcgat cagggcttca tgcactccga tctgacctac 180
gacgtaccgt ctgtttggga tgggcgattt tttcgtttag atgatcatat tacacgcctg 240
gaagcaagct gcaccaagct gaggctgcgt ctacccttac cacgtgatca agttaaacaa 300
atcctggtgg aaatggtcgc aaaatctggt attcgggatg catttgttga attgatagtc 360
acccgcggtc ttaaaggggt gcgaggaact cgtccggaag atatagtgaa caacctgtac 420
atgtttgtgc agccgtacgt gtgggttatg gagccggata tgcagcgcgt aggcggcagc 480
gcagtggtgg ctaggaccgt ccgccgggta ccaccgggcg ctattgatcc gaccgtcaag 540
aatcttcagt ggggtgatct tgttcgtgga atgtttgaag cggctgatcg tggcgcaaca 600
tatcccttcc ttaccgacgg cgatgcgcac ctgactgaag gatcgggttt taatatagta 660
ttagtcaaag atggcgtcct gtatacgcca gatcgcgggg tgctgcaggg agtgactcgc 720
aagtccgtta tcaacgctgc tgaagccttt ggaatagaag tgcgggttga gttcgttcca 780
gttgagctgg cctaccggtg tgacgagatt ttcatgtgca cgacggcggg tggcattatg 840
cctatcacaa cattggacgg tatgcctgta aatggtgggc aaattgggcc tattacgaaa 900
aaaatatggg acggttattg ggcgatgcat tatgacgccg cgtattcgtt cgagatcgac 960
tataatgaga gaaattag 978
<210> 14
<211> 325
<212> PRT
<213> ω-转氨酶
<400> 14
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala
20 25 30
Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser
50 55 60
Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp
85 90 95
Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg
100 105 110
Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg
115 120 125
Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln
130 135 140
Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp
165 170 175
Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe
180 185 190
Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp
195 200 205
Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp
210 215 220
Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val
245 250 255
Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met
260 265 270
Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met
275 280 285
Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Arg Asn
325

Claims (7)

1.ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示。
2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的表达单元。
5.一种包含权利要求4所述表达单元的重组质粒。
6.一种包含权利要求5所述重组质粒的转化子。
7.如权利要求1所述的ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。
CN201710308984.3A 2017-05-04 2017-05-04 ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用 Active CN107058256B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710308984.3A CN107058256B (zh) 2017-05-04 2017-05-04 ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710308984.3A CN107058256B (zh) 2017-05-04 2017-05-04 ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058256A CN107058256A (zh) 2017-08-18
CN107058256B true CN107058256B (zh) 2019-10-18

Family

ID=59596562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710308984.3A Active CN107058256B (zh) 2017-05-04 2017-05-04 ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058256B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486778B (zh) * 2018-10-22 2020-08-25 浙江科技学院 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用
CN109486783B (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 江南大学 一种可催化西他沙星五元环中间体的ω-转氨酶突变体
CN109486785B (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 江南大学 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体及其应用
CN109486784B (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 江南大学 一种能催化西他沙星五元环关键中间体的ω-转氨酶突变体
CN110982801B (zh) * 2019-12-27 2020-10-30 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 转氨酶突变体及其构建方法和应用
CN111549011B (zh) * 2020-06-03 2023-05-23 卡柔恩赛生物技术湖北有限公司 来源于土曲霉菌的转氨酶突变体及其应用
CN111826362B (zh) * 2020-07-13 2022-05-10 李元源 一种ω-转氨酶突变体、基因及应用
CN111733195B (zh) * 2020-07-14 2023-06-30 宁波酶赛生物工程有限公司 制备(1r，3s)-3-氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用
CN111996222A (zh) * 2020-09-09 2020-11-27 赣江新区生鸿企业管理中心(有限合伙) 采用酶突变技术制备药物中间体(r)-2-(氨乙基)-4-氯苯酚的方法
CN112481230B (zh) * 2020-12-04 2021-12-07 浙江科技学院 一种通过DNA合成改组组合突变获得的ω-转氨酶突变体及应用
CN114875005B (zh) * 2021-02-05 2023-11-24 上海交通大学 一种对映选择性翻转的ω-转氨酶突变体的构建及应用
CN114645030B (zh) * 2022-04-08 2023-11-17 浙江科技学院 一种ω-转氨酶突变体及其在制备西塞卡纳药物中间体的应用
CN116486903B (zh) * 2023-04-17 2023-12-29 深圳新锐基因科技有限公司 基于同源蛋白序列进化方向结合自由能变提高蛋白稳定性的方法及装置

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074309A (zh) * 2012-09-11 2013-05-01 河北师范大学 一种l-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法
CN103103167A (zh) * 2013-01-29 2013-05-15 河北师范大学 一种d-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法
CN105441404A (zh) * 2015-12-08 2016-03-30 浙江科技学院 ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法
CN105462949A (zh) * 2015-12-17 2016-04-06 浙江大学宁波理工学院 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途
CN105950581A (zh) * 2016-06-21 2016-09-21 浙江科技学院 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101869432B1 (ko) * 2015-04-08 2018-06-20 연세대학교 산학협력단 케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체 및 이것을 이용한 광학활성 아민의 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074309A (zh) * 2012-09-11 2013-05-01 河北师范大学 一种l-丙氨酸脱氢酶的突变体酶蛋白及其制备方法
CN103103167A (zh) * 2013-01-29 2013-05-15 河北师范大学 一种d-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法
CN105441404A (zh) * 2015-12-08 2016-03-30 浙江科技学院 ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法
CN105462949A (zh) * 2015-12-17 2016-04-06 浙江大学宁波理工学院 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用途
CN105950581A (zh) * 2016-06-21 2016-09-21 浙江科技学院 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
conserved hypothetical protein [Aspergillus terreus NIH2624]，NCBI Reference Sequence: XP_001209325.1;Birren,B. et al.;《Genbank》;20080331;第1-2页 *
Construction of stabilized (R)-selective amine transaminase from Aspergillus terreus by consensus mutagenesis;Dong-Fang Xie et al.;《Journal of Biotechnology》;20190128;第293卷;第8-16页 *
定点突变技术在转氨酶改造中的应用;许伟等;《盐城工学院学报（自然科学版）》;20041231;第17卷(第4期);第55-58页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058256A (zh) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107058256B (zh) ω-转氨酶突变体及其制备方法和应用
CN105441404B (zh) ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法
CN108913671B (zh) 一种ω-转氨酶突变体及其应用
CN109486778B (zh) 一种基于共进化网络的ω-转氨酶突变体以及制备方法和应用
CN105950581B (zh) 一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体及其应用
CN110592059B (zh) 麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体
CN112626057B (zh) 一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用
CN113151198B (zh) 一种γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用
CN104774813B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶及其制备方法和应用
RU2669996C2 (ru) Новый мутантный белок орнитиндекарбоксилаза и его применение
CN108795912A (zh) 赖氨酸脱羧酶突变体及其应用
CN110846291A (zh) 热稳定性提高的胺脱氢酶突变体及其基因工程菌的构建和应用
WO2023098453A1 (zh) 腈水合酶突变体及其应用
You et al. Characterization of a prodigiosin synthetase PigC from Serratia marcescens jx-1 and its application in prodigiosin analogue synthesis
CN114525268B (zh) 一种pH耐受性提高的谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸合成中的应用
EP2058394B1 (en) Method for designing mutated enzyme, method for preparing the same and mutated enzyme
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
JP2017108740A (ja) 改変型ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素
CN111808829B (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
TW202128992A (zh) 經修飾的daao酶及其應用
CN109182319B (zh) 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用
CN116676280A (zh) 一种谷胱甘肽双功能合成酶突变体及其应用
Li et al. Characterization and mutagenesis of a novel Mycobacterium smegmatis-derived glutamate decarboxylase active at neutral pH
Zhang et al. Characterization of alkaline Bacillus amyloliquefaciens γ-glutamyltranspeptidase expressed in Bacillus subtilis and its application in enzymatic synthesis of L‑Theanine
CN106434612B (zh) 一种天冬酰胺酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211208

Address after: 201403 3rd floor, building 11, 6055 Jinhai Road, Fengxian District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Banglin Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 310023 No. 318 stay Road, Xihu District, Zhejiang, Hangzhou

Patentee before: ZHEJIANG University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

TR01 Transfer of patent right