KR101869432B1 - 케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체 및 이것을 이용한 광학활성 아민의 제조방법 - Google Patents

케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체 및 이것을 이용한 광학활성 아민의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 오메가 트랜스아미네이즈의 활성 부위의 점 돌연변이를 이용하여 활성을 증가시킨 오메가 트랜스아미네이즈 변이체에 관한 것으로서, 구체적으로 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 이용하여, 오메가 트랜스아미네이즈의 활성 및 기질 스펙트럼을 증대시키는 방법을 제공한다.

Description

케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체 및 이것을 이용한 광학활성 아민의 제조방법{OMEGA-TRANSAMINASE MUTANTS WITH ACTIVITY IMPROVEMENTS TOWARD KETONES AND METHODS FOR PRODUCING OPTICALLY PURE AMINES}
본 발명은 케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체에 관한 것으로서, 활성 부위의 특정 아미노산의 치환을 통해 제조된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체를 이용하여 케톤 기질에 대한 높은 활성을 나타내어, 다양한 광학활성 아민을 효율적으로 제조하는 방법을 제공한다.
생촉매 합성 방법에 의한 키랄 화합물의 비대칭 합성은 최근 의약 및 농화학산업 내에서 녹색공정에 대한 환경적, 사회적 요구와 맞물려 화학촉매적 방법에 대한 대안으로서 큰 관심을 불러모으고 있다. 이러한 생촉매 합성 방법을 최대로 활용하기 위해서는 안정성, 거울상 선택성(enantioselectivity), 이용 가능한 기질 스펙트럼과 같은 효소적 특성이 제조환경에 적합해야 한다. 그러나, 생촉매 합성 방법의 설계는 생물학적 적응을 위한 진화의 결과로 빚어진 효소의 복잡한 특성으로 인해 산업적 조건과는 맞지 않고, 대량 생산에 적용하기에는 제한적인 경우가 많다. 그 대표적인 예가 NADH와 같은 외부 보조인자의 도움 없이 1차 아민으로부터 카르보닐 화합물로 아미노기를 입체 선택적으로 전달할 수 있는 고유한 촉매적 능력을 가지는 오메가 트랜스아미네이즈이다. 광학활성 아민은 다수의 의약품과 정밀화학제품의 제조에 매우 유용하므로, 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 프로키랄 케톤으로부터 광학적으로 순수한 아민을 합성하는 방법에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 그러한 산업적 요구와는 달리, 오메가 트랜스아미네이즈는 다른 유형의 트랜스아미네이즈인 측쇄 아미노산 트랜스아미네이즈나 아스파르테이트 트랜스아미네이즈처럼 케톤이 아닌 소수의 케토산을 천연 아미노 수용체로 이용하도록 진화하였다. 이러한 생물학적 기질 특이성으로 인해 지금까지 알려진 모든 오메가 트랜스아미네이즈는 대부분의 케톤에 대해 매우 낮은 활성을 보인다. 예컨대, 오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi, 이하, 'OATA'라고도 한다)에서 유래하는 (S)-선택성 오메가 트랜스아미네이즈는 피루베이트에 비해 (대표적인 케톤 기질인) 아세토페논에 대하여 0.03 %의 낮은 활성을 보인다. 이처럼 낮은 기질 반응성을 상쇄하여 적절한 반응속도를 얻기 위해서는 다량의 효소를 사용해야 하므로, 대량 생산 공정 개발에 있어서 큰 걸림돌이 된다.
오메가 트랜스아미네이즈를 이용한 광학활성 아민의 합성을 개선하기 위해서는, 케톤에 대하여 훨씬 높은 반응성을 보이는 효소 변이체를 얻을 수 있는 방법을 개발하는 것이 급선무이다. 이와 관련하여, Savile 등은 27종의 아미노산 치환을 포함하는 방향적 진화에 의해 Arthrobacter sp.(ARTA)에서 유래하는 (R)-선택성 오메가 트랜스아미네이즈의 기질 특이성을 확대할 수 있음을 입증하였다(Science 2010, 329, 305-309). 그러나 기대와는 달리, 조작된 ARTA 변이체는 아세토페논에 대하여 높지 않은 활성을 보였다. 또한, 과도한 변이로 인해 일부 케톤에 대한 입체선택성이 크게 손상되었다. 따라서, 본 발명자들은 변이가 최소화된 활성부위 재설계를 통해 강한 입체선택성과 같은 본래적 성질에 영향을 주지 않고 구조적으로 다양한 케톤의 아민화 반응을 개선할 수 있는지를 모색하게 되었다. 이를 위하여, 산업적 용도에서 아미노 공여체로 이상적인 이소프로필아민에 대한 활성이 매우 큰 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 오크로박트럼 앤트로피를 선택하였다. 많은 시간을 요하는 반복적인 라이브러리 생성과 선택 대신에, 본 발명에서는 메커니즘에 기반한 분자 모델링에 의해 케톤의 반응성에 영향을 주는 핵심 잔기를 특정하고 포화 돌연변이화에 의해 해당 부위를 최적화하고자 하였다.
오메가 트랜스아미네이즈는 피리독살 5‘-포스페이트(PLP)를 보결기로 사용하여 아미노기의 전이를 매개한다. 전체적인 반응은 두 개의 반쪽반응(아미노 공여체의 산화적 탈아민화와 아미노 수용체의 환원적 아민화)으로 구성되며, 외부 알디민, 탄소음이온 중간체, 케티민과 같은 다수의 반응중간체가 관여한다. 일반적으로 탄소음이온 중간체가 가장 불안정하며 퀴노노이드 구조의 공명화에 의해 안정화되는 것으로 생각되고 있다. 그러므로, 활성부위의 퀴노노이드 구조를 효과적으로 안정화하는 것이 트랜스아미네이즈의 활성을 증대시키는데 있어 매우 중요한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 반응성이 없거나 반응속도가 매우 낮은 기질에 대해서 야생형에 비해 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 광학활성 아민의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 발현벡터에 재조합하고, 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 후, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 과발현시켜 정제하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아미노 공여체 및 케톤을 포함하는 기질 용액에, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 첨가하여 비대칭합성반응(asymmertic synthesis)을 시키는 단계를 포함하는 광학활성 아민의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아미노 수용체 및 라세믹 아민을 포함하는 기질 용액에, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 첨가하여 상기 라세믹 아민을 선택적으로 탈아민화반응을 시킴으로써, 광학활성 아민을 얻는 단계를 포함하는 동역학적 분할(kinetic resolution)을 이용한 광학활성 아민의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 오메가 트랜스아미네이즈 변이체는 야생형에 비하여 다양한 기질에 대하여 높은 반응성을 나타냄으로써 다양한 광학활성 아민을 용이하게 제조할 수 있는 방법을 제공한다.
도 1은 오크로박트럼 앤트로피 유래 오메가 트랜스아미네이즈의 활성 부위 내의 아세토페논-퀴노노이드 중간체의 분자모델을 나타낸 그림이다. 진한 막대는 퀴노노이드 중간체를, 황색은 기질 부위를, 얇은 막대는 활성 부위의 잔기를 나타낸다.
도 2는 활성부위 잔기에 대하여 알라닌 스캔 돌연변이화를 수행한 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 반응속도를 비교한 그래프이다.
도 3은 실시예 5 및 실시예 11에서 야생형 오메가 트랜스아미네이즈와 W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 반응속도를 비교한 그래프이다.
도 4는 실시예 9에서 W58L 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체와 야생형 오메가 트랜스아미네이즈를 이용한 (S)-α-메틸벤질아민(이하, '(S)-α-MBA'라고도 한다)의 비대칭 합성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 9에서 야생형 오메가 트랜스아미네이즈와 W58L 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 효소 안정성을 비교한 그래프이다.
오메가 트랜스아미네이즈(이하 'ω-TA'라고도 한다)를 이용한 케톤의 비대칭 환원적 아민화는 화학촉매를 통한 광학활성 아민 합성의 유력한 대안이다. 하지만 ω-TA를 이용한 광학활성 아민의 비대칭 합성은 불리한 반응평형과 매우 낮은 케톤에 대한 효소 활성(예컨대, 피루베이트 대비 1 % 미만)이라는 두 가지 기술적인 문제가 있다. 첫 번째 문제의 해결을 위한 광범위한 연구의 결과, 공생성물의 효소적 또는 물리화학적 제거를 통해 평형을 이동시킬 수 있음이 확인되었다. 그러나, 두 번째 문제에 대한 해결방법은 제한적이었다.
본 발명자들은 ω-TA에 의한 케톤의 비효율적인 환원적 아민화가 ω-TA를 진화시킨 미생물의 생물학적 적응과 대사적으로 관련이 있을 것으로 생각하였다. 따라서, 본 발명자들은 활성부위 재설계를 통해 천연 ω-TA를 케톤 기질에 대해 최적화함으로써 케톤에 대한 활성을 증가시키고자 하였다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체에 관한 것이다.
상기 야생형 오메가 트랜스아미네이즈는 바람직하게는 오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi)에서 유래한 것이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈이다.
상기 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 활성을 증대시켜 아민화 반응의 속도를 높이고, 아민화가 가능한 기질 스펙트럼을 증대시키기 위하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 활성 부위를 점 돌연변이를 통해 조작하였다.
본 발명자들은 상기 야생형 오메가 트랜스아미네이즈가 천연기질에 비해 아세토페논에 대하여 매우 낮은 활성을 보이는 이유는 퀴노노이드 구조가 효과적으로 안정화되지 못하기 때문이라고 생각하였다. 따라서 아세토페논과 피루베이트에 의해 형성된 두 퀴노노이드 구조의 컴퓨터 모델링을 통해, 퀴노노이드 중간체 주위의 분자적 환경의 구조적 차이를 가시화하였다.
도 1은 오크로박트럼 앤트로피에서 유래한 야생형 오메가 트랜스아미네이즈(이하, 'OATA WT'라고도 한다)의 활성부위 내의 아세토페논-퀴노노이드 중간체의 분자모델을 나타낸 그림이다. 진한 막대는 퀴노노이드 중간체를, 황색은 기질 부위를, 얇은 막대는 활성 부위의 잔기를 나타낸다.
분자모델에서, 58번 위치의 트립토판(이하, 'W58'라고도 한다)을 포함하는 9개의 활성 부위를 도출하였고, 그 중에서 아세토페논에 의해 형성된 퀴노노이드의 기질부위와의 거리가 3-Å 이내인 측쇄를 가지는 6개의 활성부위 잔기(L57, W58, Y151, A230, I261, T324)를 확인하였다(도 1). 이웃하는 잔기들 중에서, W58이 아세토페논의 페닐 치환기와 상당한 입체적 간섭을 일으키는 것으로 확인되었다. 반면, 피루베이트에 의해 형성된 퀴노노이드의 경우에는 인접 활성부위 잔기와의 입체적 간섭이 관찰되지 않았다.
상기 분자 모델링 결과에 의할 때, W58에 의한 입체장애가 부피가 큰 기질로부터 형성된 퀴노노이드 중간체를 불안정하게 하여 아세토페논에 대한 낮은 활성을 유도하는 것으로 생각되었다. 따라서, W58을 입체적 요구가 적은 아미노산(sterically less demand), 부피가 큰 기질에 의해 형성된 퀴노노이드 중간체의 입체장애를 피할 수 있는 더 작은 곁사슬을 가지는 아미노산이 활성을 증가시킬 것으로 기대하였다.
이를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 A230을 제외한 8개의 활성부위 잔기(도 1)에 대하여 알라닌 스캔 돌연변이화를 수행한 후, 예측된 모델이 실험결과와 일치하는지 확인하였다. 실제로, 58번 위치의 트립토판을 알라닌으로 치환하여 변이시킨 변이체의 경우(이하, 'W58A' 또는 'W58A 변이체)라고도 한다)에는 활성이 크게 증가하였으나(L-알라닌을 아미노 공여체로 한 경우 활성이 41배 증가), 다른 부위는 알라닌 치환에 의해 활성이 그다지 증가하지 않았다(도 2). W58A 변이체 내의 아세토페논-퀴노노이드 분자 모델링 결과가, 이러한 활성 증가가 야생형 효소에서 발견되는 입체장애의 제거로 인한 것이라는 점을 뒷받침해 주었다.
모델링 및 실험 결과를 고려하여 생각해 볼 때, W58이 기질부위에 부피가 큰 치환기를 갖는 퀴노노이드 중간체와의 입체장애에 있어 중요한 역할을 하였다.
그러므로 트립토판보다 작은 소수성 잔기(즉, 메치오닌, 발린, 이소로이신 및 로이신)를 이용하여 W58을 부분 포화 돌연변이화를 통해 조작하였다. 이러한 치환이 W58A 치환에서와 마찬가지로 퀴노노이드의 입체장애를 줄여줄 것으로 분자 모델링을 통해 예측되었다.
W58의 인돌기가 이웃 잔기(M54, L57, V233, I261, I380)의 측쇄와 함께 소수성 패치를 형성하므로 친수성 잔기의 사용은 바람직하지 않았다. W58A를 포함하는 이들 변이체의 효소 활성을, 아세토페논 및 L-알라닌 기질 쌍을 이용한 반응과 그 역반응인 (S)-α-메틸벤질아민((S)-α-MBA) 및 피루베이트 기질 쌍을 이용한 반응에서 야생형 효소의 활성과 비교하였다(도 3). 이를 통해 두 기질 쌍에 대하여 측정된 효소 활성 사이에 양의 상관관계가 있음이 확인되었다(피어슨 상관계수 = 0.86).
이러한 결과는 W58 변이가 가역 반응의 두 방향, 즉 정방향 및 역방향 모두에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 의미하는데, 이는 두 반응이 동일한 반응경로를 따르지만 서로 반대 방향으로 진행되기 때문으로 생각된다. 또한 모든 변이가 케톤 아민화의 반응속도를 역반응보다 훨씬 빠르게 증가시키는 것으로 나타났는데, 이러한 결과는 변이에 의해 아세토페논의 아민화가 (S)-α-MBA의 탈아민화보다 더 선택적으로 촉진될 수 있음을 의미한다.
아미노산 서열 정렬 결과는 케톤의 아민화에 있어 입체장애의 원인이 되는 핵심잔기인 W58이 (S)-선택성 ω-TA 내에 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었다(표 1). W58는 서열정렬에 이용된 14종의 ω-TA 중에서, 11종의 ω-TA 내에 완벽하게 보존되어 있었고 나머지 3종의 ω-TA 내에서는 트립토판과 같은 수소결합 공여체로 작용할 수 있는 타이로신으로 치환되어 있었다. 이것은 W58이 ω-TA들 사이에서 공통적으로, 카르복실레이트와 케토산 기질 사이의 강한 상호작용에 있어 역할을 함을 의미한다. 효과적인 케톤의 아민화를 위한 변이체 생성의 관점에서 볼 때, 이러한 사실은 본 발명이 대부분의 (S)-선택성 ω-TA에 대해 일반적으로 적용 가능함을 시사한다. 본 발명을 통해 하나의 점돌연변이에 의해서도 아세토페논에 대한 ω-TA의 촉매전환 효율(k cat )을 피루베이트에 대한 야생형 효소의 촉매전환 효율 대비 20 %까지 증가시킬 수 있음이 확인되었는데, 이는 천연 ω-TA의 케톤에 대한 낮은 활성이 조작을 통해 개선될 수 있음을 분명하게 보여준다.
Figure 112016033267305-pat00001
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체에 관한 것이다.
상기 58번 위치의 트립토판이 치환되는 다른 아미노산은 트립토판에 비해 입체적 요구가 적은(sterically less demanding) 즉 입체장애가 적은 아미노산이 바람직하고, 더 바람직하게는 야생형 오메가 트랜스아미네이즈 고유의 아미노산에 비해 적은 분자량을 갖는 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 중성 아미노산 또는 음이온성 아미노산이다. 더욱더 바람직하게는 소수성 아미노산 또는 극성 비전하 아미노산과 같은 중성 아미노산일 수 있고, 가장 바람직하게는 소수성 아미노산이다.
상기 소수성 아미노산은 소수성을 띄는 것이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린, 글라이신, 페닐알라닌 및 메치오닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는 OATA의 야생형 오메가 트랜스아미네이즈 고유의 아미노산에 비해서 분자량이 작은 아미노산이 입체 장애의 감소에 유리하다.
상기 극성 비전하 아미노산은 극성에 전하를 띄지 않는 것이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 세린, 트레오닌, 시스테인, 글루타민, 아스파라긴 및 티로신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산일 수 있고, 바람직하게는 OATA의 야생형 오메가 트랜스아미네이즈 고유의 아미노산에 비해서 분자량이 작은 아미노산이 입체 장애의 감소에 유리하다. 상기 극성 비전하 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환하는 것에 비해서 활성 부위의 소수성 패치를 형성하는데에는 불리하지만, 선택적으로 기질의 활용성을 조절하기 위해 이용될 수 있다.
상기 음이온성 아미노산은 아스파르트 산 및 글루탐산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산일 수 있고, 상기 음이온성 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환하는 것에 비해서 활성 부위의 소수성 패치를 형성하는데에는 불리하지만, 선택적으로 기질의 활용성을 조절하기 위해 이용될 수 있다.
또한 상기 메가 트랜스아미네이즈 변이체는 서열번호 2 내지 17로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이이외에 다른 위치의 아미노산이 함께 치환되었을 때 다양한 아민화 활성이 증대되는지를 확인하였다.
58번 위치의 트립토판의 점 돌연변이와 함께 점 돌연변이를 실시할 위치는 도 1의 9개의 활성 부위 중에서 58번 위치의 트립토판을 제외한 8개의 활성 부위(Y20, L57, F86, Y151, V154, A230, I261, T324), 그 중에서도 바람직하게는 아세토페논에 의해 형성된 퀴노노이드의 기질부위와의 거리가 3-Å 이내인 측쇄를 가지는 5개의 활성 부위 잔기(L57, Y151, A230, I261, T324)를 점 돌연변이시킬 수 있고, 또는 58번 위치의 트립토판의 인돌기와 함께 소수성 패치를 형성하는 이웃 잔기들(M54, L57, V233, I261, I380)를 점 돌연변이 시킬 수 있다. 바람직하게는 L57 및 I261를 점 돌연변이 시키는 것으로 기대되었다.
이를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 알라닌 스캔 돌연변이화를 수행한 후, 예측된 모델이 실험결과와 일치하는지 확인하였다.
58번 위치의 트립토판을 알라닌으로 치환하는 점 돌연변이에, 추가로 57번 위치의 로이신을 알라닌으로 치환하는 점 돌연변이를 포함하는 변이체(이하, 'OATA L57A/W58A'라고도 한다)는 부티로페논 및 이소프로필아민을 이용한 반응에서 58번 위치의 트립토판을 알라닌으로 치환하여 변이시킨 변이체(이하 'OATA W58A'라고도 한다)에 비해 아민화 활성이 37 배 이상 증가하였고, 58번 위치의 트립토판을 알라닌으로 치환하는 점 돌연변이에, 추가로 57번 위치의 로이신을 알라닌으로 그리고 154번 위치의 발린을 알라닌으로 치환하는 점 돌연변이를 포함하는 변이체(이하, 'OATA L57A/W58A/V154A'라고도 한다)는 OATA W58A에 비해 아민화 활성이 93 배 정도 증가하였다.
또한 야생형 오메가 트랜스아미네이즈(이하, 'OATA WT'라고도 한다)에서는 활성이 매우 낮았던 기질인 2-메틸-1-페닐프로필아민 및 (S)-α-프로필벤질아민에 대해서는 OATA L57A/W58A의 탈아민화 활성이 나타났고, OATA L57A/W58A/V154A에서는 그 활성이 더욱 증가하였다.
따라서 본 발명의 오메가 트랜스아미네이즈 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이; 및 20번 위치의 티로신, 54번 위치의 메치오닌, 57번 위치의 로이신, 86번 위치의 페닐알라닌, 151번 위치의 티로신, 154번 위치의 발린, 230번 위치의 알라닌, 233번 위치의 발린, 261번 위치의 이소로이신, 324번 위치의 트레오닌 및 380번 위치의 이소로이신으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이;를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체, 즉 2 개 이상의 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체에 관한 것이다. 상기 2 개 이상의 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체는 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 하나의 점 돌연변이로 이루어진 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 아민화 활성을 더욱 증대시키거나 활용할 수 있는 기질 스펙트럼을 확장시킬 수 있다.
상기 2 개 이상의 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체에서, 상기 다른 아미노산은 야생형 오메가 트랜스아미네이즈 고유의 아미노산에 비해서 입체적 요구가 적은(sterically less demanding) 즉 입체장애가 적은 아미노산이 바람직하고, 더 바람직하게는 야생형 오메가 트랜스아미네이즈 고유의 아미노산에 비해 적은 분자량을 갖는 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 중성 아미노산 또는 음이온성 아미노산이다. 더욱더 바람직하게는 소수성 아미노산 또는 극성 비전하 아미노산과 같은 중성 아미노산일 수 있고, 가장 바람직하게는 소수성 아미노산이다.
또한 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체는 서열번호 18 내지 30의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 발현벡터에 재조합하고, 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 후, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 발현시켜 정제하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아미노 공여체 및 케톤을 포함하는 기질 용액에, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 첨가하여 비대칭합성반응(asymmertic synthesis)을 시키는 단계를 포함하는 광학활성 아민의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아미노 수용체 및 라세믹 아민을 포함하는 기질 용액에, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 첨가하여 상기 라세믹 아민을 선택적으로 탈아민화반응을 시킴으로써, 광학활성 아민을 얻는 단계를 포함하는 동역학적 분할(kinetic resolution)을 이용한 광학활성 아민의 제조방법을 제공한다.
< 실시예 1: 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 재조합 벡터의 제조>
오크로박트럼 앤트로피(Ochrobactrum anthropi)을 LB 배지(또는 브로쓰)(트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, pH 7)중에서 37 ℃ 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 야생형 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 증폭하여 수득하였다. 상기 증폭된 유전자는 발현 벡터 pET28a(+)에 Nco1, Eag1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
구분 염기서열
정방향 프라이머 5'-GATATACCATGGNNACTGCTCAGCCAAACTCT-3'
역방향 프라이머 5'-CGAGTGCGGCCGTCCTGGTGAGGCTTGC-3'
< 실시예 2: 58번 위치 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체의 재조합 벡터의 제조 및 스크리닝 검증>
58번 위치에 돌연변이를 도입하기 위해 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 실시하였다. 58번 위치에 점 돌연변이를 가지는 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 재조합벡터는 실시예 1에서 수득된 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 증폭된 플라스미드를 Dpn1 제한효소 처리한 후 E. coli XL10-Gold를 형질전환시켰다. 이를 가나마이신을 함유하는 LB-한천 배지 (트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, 한천 15 g/L pH 7)중에서 37℃ 15 시간 배양하였다. 각각의 콜로니를 가나마이신을 함유하는 LB-브로쓰 중에서 37 ℃ 15 시간 배양한 후 각각의 세포로부터 플라스미드를 추출하였다. DNA 시퀀싱을 통해 돌연변이를 확인하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
구분 염기서열
정방향 프라이머 5'-CGAAGCGATGTCAGGACTGVTKAGTGTTGGCGTGGGCTTTT-3'
역방향 프라이머 5'-AAAAGCCCACGCCAACACTMABCAGTCCTGACATCGCTTCG-3'
< 실시예 3: 복수개의 위치의 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체의 재조합 벡터의 제조 및 스크리닝 검증>
복수개 위치에 돌연변이를 도입하기 위해 위치선택적 돌연변이를 실시하였다. 58번 위치를 포함하여 복수개 위치에 점 돌연변이를 가지는 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 재조합벡터는 실시예 1에서 수득된 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 증폭된 플라스미드를 Dpn1 제한효소 처리한 후 E. coli XL10-Gold를 형질전환시켰다. 이를 가나마이신을 함유하는 LB-한천 배지 (트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L, 한천 15 g/L pH 7)중에서 37℃ 15 시간 배양하였다. 각각의 콜로니를 가나마이신을 함유하는 LB-브로쓰 중에서 37 ℃ 15 시간 배양한 후 각각의 세포로부터 플라스미드를 추출하였다. DNA 시퀀싱을 통해 돌연변이를 확인하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.
돌연변이체 염기서열
L57A/W58A 5'-CGAAGCGATGTCAGGAGCGTGGAGTGTTGGCGTG-3'
5'-CGATGTCAGGAGCGGCGAGTGTTGGCGTGGG-3'
L57A/W58A/V154A 5'-CGAAGCGATGTCAGGAGCGTGGAGTGTTGGCGTG-3'
5'-CGATGTCAGGAGCGGCGAGTGTTGGCGTGGG-3'
5'-CGGCTATCACGGTGCGACGATTGCCTCTG-3'
W58D/I261A
L57Q/W58N/I261L
L57C/W58L/I261A		 5'-AAGCGCTATATCGAAGCGATGTCAGGANNNNNNAGTGTTGGCGTGGGCTTTTCCGAAC-3'
5'-TCTGCTGATCGCCGACGAGGTTNNNTGCGGCTTCGGA-3'
< 실시예 4: 형질전환 균주로부터 효소의 과발현 및 정제>
상기 실시예 1 내지 실시예 3 에서 수득된 재조합 벡터로 E. coli BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 가나마이신(50 μg/mL)을 함유하는 LB-브로쓰 1 L에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 0.1 mM)를 현탁도(OD) 0.4에서 첨가하였다. 이후 6 시간 이상 37 ℃에서 배양한 후 10,000×g 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 50 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 0.02 % 아지드화나트륨, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 0.5 mM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 얼음에 냉각시키면서 초음파 처리를 한 다음 17,000×g 4 ℃에서 30 분간 원심 분리하여 세포 잔사를 제거하였다. 각각의 야생형 오메가 트랜스아미네이즈(이하, 'OATA' 또는 'OATA WT'라고 한다), 및 오메가 트랜스아미네이즈 변이체(OATA W58A, W58V, W58L, W58I, W58M, L57A/W58A, L57A/W58A/V154A, W58D/I261A, L57C/W58L/I261A 및 L57Q/W58N/I261L)는 AKTAprime plus(GE Healthcare, Piscataway, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 조추출물은 HP 컬럼(GE Healthcare)에서 20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, 0.5 mM PLP, pH 7.4 완충액에서 이미다졸 농도를 0.05-0.5 M로 변화시키면서 용출시켰다. 잔류된 이미다졸은 HiTrap 탈염 컬럼(Ge Healthcare)에서 50 mM 인산나트륨, 0.15 M 염화나트륨, 0.5 mM PLP, pH 7 완충액으로 용출시켜 제거하였다.
< 실시예 5: W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 다양한 케톤에 대한 활성>
OATA W58L을 이용한 합성의 유용성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 이소프로필아민을 아미노 공여체로 사용하여 다양한 구조의 케톤에 대하여 W58L 치환으로 인한 효소 활성의 증가를 조사하였으며, 이의 결과는 상기 표 5에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00002
OATA W58L은 시험한 모든 케톤(9종의 아릴알킬 케톤(1a~i)과 6종의 알킬 케톤(1j~o))에 대하여 41~760 배의 반응속도 증가라는 놀라운 활성 증가를 보였다. 이러한 현저한 활성 증가는 야생형 효소로는 반응이 진행되지 않던 케톤(1c 및 1g~h)에 대해서도 상당한 반응성을 보일 만큼 충분히 높았다.
한편 Savile 등에 의해 조작된 ARTA 변이체와는 달리((S)-1-메틸-3-페닐프로필아민의 ee값 68 %, Advanced Synthesis & Catalysis, 2015, 357, 1732-1740), OATA W58L의 경우 모든 케톤에 대해서 입체적으로 순수한 아민이 합성되었다(ee 값 > 99 %). W58L 변이로 인해 나프틸(1i) 및 n-헥실(1l) 치환기를 갖는 부피가 큰 케톤의 아민화도 효과적으로 가능하였다.
OATA W58L 변이체 이외에도 OATA W58A, OATA W58M, OATA W58V, OATA W58I의 케톤에 대한 반응성 증대를 확인하기 위해 아세토페논 10 mM, L-알라닌 10 mM에서 효소 반응시킨 결과 하기 도 3와 같이 OATA WT에 비해 모두 40배 이상의 반응성 향상을 보였다.
또한 W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용하여 광학적으로 순수한 아민의 합성의 유용성을 평가하기 위하여 여러 케톤에 대한 기질 특이성을 알데하이드 디하이드로게네이즈를 이용한 효소 분석법으로 측정하였다. 50 mM 벤질아민, 5 mM 케톤, 2 mM NAD+ 10% DMSO, 50 mM Tris Cl 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 오메가 트렌스아미네이즈 변이체 및 알데하이드 디하이드로제네이즈를 첨가하여 반응하여 생성된 NADH를 340 nm에서 마이크로플레이트 분광광도계(PowerWave X 340, Biotek, USA)로 측정하였고, 이의 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00003
4종의 W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체(W58A, W58V, W58I, W58M)는 케톤에 대한 기질특이성이 서로 유사하였고, 어떠한 W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용하더라도 다양한 케톤으로부터 광학활성 아민을 합성할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 6: 복수개 위치의 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 다양한 케톤에 대한 활성>
58번 위치의 돌연변이를 포함하는 복수개 위치의 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 광학적으로 순수한 아민의 합성의 유용성을 평가하기 위하여 케톤에 대한 기질 특이성 변화를 측정하였다. 500 mM 이소프로필아민 (OATA W58D/I261A 의 경우는 L-알라닌, OATA L57Q/W58N/I261L 및 OATA L57C/W58L/I261A 의 경우는 벤질아민 사용), 50 mM 케톤, 15% DMSO, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 오메가 트렌스아미네이즈 변이체를 첨가하여 반응하였고, 이의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00004
복수개 위치의 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 경우에도 W58 점 돌연변이체와 동일하게 케톤에 대한 활성이 크게 증대된 것을 확인할 수 있었고, 특히 OATA L57A/W58A 및 OATA L57A/W58A/V154A는 OATA W58A에 비해서 부티로페논에 대하여 38~93배의 반응속도 증가라는 놀라운 활성 증가를 보였다. OATA L57A는 야생형과 같이 케톤에 대해 낮은 활성을 나타내었기 때문에 OATA L57A/W58A 및 OATA L57A/W58A/V154A의 증대된 아민화 활성은 W58 점 돌연변이로 인한 성질임을 확인하였다.
OATA L57C/W58L/I261A는 이용되는 케톤의 구조에 따라 아민화 활성이 선택적으로 증대되는 성질을 보였다. 즉 2-옥타논을 제외한 알킬케톤에 대하여는 아민화 활성이 나타나지 않았지만, 아릴알킬케톤에 대하여는 OATA W58L에서와 마찬가지로 OATA WT에 비해 아민화 활성이 크게 증대되었다.
58번 위치의 트립토판이 친수성 아미노산으로 변이된 변이체 OATA W58D/I261A는 케톤에 대한 아민화 활성이 야생형과 비교해 6배 증대되었지만 소수성 아미노산으로 변이된 다른 변이체들과 비교하였을 때 증대폭이 낮았다.
< 실시예 7: W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 기질에 따른 반응속도 분석>
OATA W58L의 활성 증가의 메커니즘을 이해하기 위하여 4종의 대표적인 기질을 사용하여 반응속도 분석을 수행하였으며, 이의 수행 조건은 상기 표 8에, 결과는 상기 표 9에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00005
Figure 112016033267305-pat00006
모델링 결과와 일치하게, OATA W58L은 아세토페논 대하여 55.7 배의 전환수(k cat ) 증가를 보였다. 또한, W58L 치환으로 인해 미카엘리스 복합체의 형성이 촉진되었는데(6.1 배 강한 결합), 이것은 아세토페논의 활성부위에 대한 결합 역시 W58에 의해 방해 받기 때문인 것으로 생각된다. 실제로 도킹 시뮬레이션 결과, 미카엘리스 복합체 내부에서 W58와 아세토페논의 페닐 치환기 사이의 입체적 간섭이 상당한 것으로 나타났다. 이러한 결합의 촉진과 전환수 증가로 인해 아세토페논에 대한 OATA W58L의 특이성 상수(k cat /K M )가 340 배 증가하였다.
아세토페논과는 달리, W58L 변이체의 피루베이트에 대한 결합은 OATA WT에 비하여 훨씬 약하였다(K M 17.5 배 감소). 이러한 결과는 수소결합 공여체(즉 W58의 인돌기)가 W58L 치환으로 사라지기 때문에 피루베이트의 카르복실레이트와의 상호작용이 약해지기 때문으로 생각된다. 그러나, OATA W58L의 피루베이트의 촉매 전환은 OATA WT보다 더 빠르게 촉진되었다(k cat 가 7.1 배 증가).
아세토페논과와 피루베이트 모두에 대해서 k cat 가 증가한 사실은 W58L 치환으로 인한 촉매 전환 증가가 기질의 소수성 특성과는 무관하다는 것을 의미한다. 이러한 촉매 전환의 증가에도 불구하고, 피루베이트에 대한 결합 친화도(k cat /K M )는 W58L 치환으로 인해 60 %나 감소하였다. OATA W58L의 소수성 기질(아세토페논)에 대한 결합 촉진은 (S)-α-메틸벤질아민의 경우 더욱 뚜렷하게 나타났다(K M 이 207 배 감소).
예상과는 달리, OATA W58L은 이소프로필아민에 대하여 더 강한 결합을 보였다(K M 이 8.9 배 감소). 이러한 결과는 메틸 치환기를 가지는 기질도 W58에 의해 방해를 받는다는 것을 의미한다. 아미노 수용체에 대하여 k cat 가 증가한 것과는 달리, W58 치환에 의한 촉매 전환은 두 아미노 공여체(즉, (S)-a-MBA 및 이스프로필아민)에서 크게 달라지지 않았다. 이러한 결과는 W58L 변이가 탈아민화에 비해서 아민화를 선택적으로 향상시킨다는 것을 의미한다. 아세토페논에 대해서 k cat /K M 이 크게 증가할 뿐 아니라 이소프로필아민에 대한 k cat /K M 도 8.6 배 증가하므로, OATA W58L은 낮은 압력에서 이소프로필아민의 탈아민화 생성물(아세톤)의 신속한 제거를 통해 불리한 열역학적 평형을 변화시키므로 이소프로필아민을 아미노 공여체로 사용하는 대규모 공정에 더 적합하다.
< 실시예 8: W58L 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 (S)-a-MBA의 비대칭 합성>
OATA W58L가 카이랄 아민의 비대칭 합성에 적합한 것인지 확인하기 위하여, 아세토페논 (50 mM), 이소프로필아민 (500 mM), PLP (0.1 mM), phosphate 버퍼 (50 mM, pH 7) 및 DMSO (15 % v/v) 조건에서 OATA WT 또는 OATA W58L (5 mg/mL)를 첨가하였다. (S)-α-MBA를 37 ℃, 대기압 하에서 경시적으로 모니터링하였다(도 4).
예상한 대로, 입체선택성의 손실 없이(생성된 (S)-α-MBA의 ee > 99 %) 아세토페논의 아민화 효율을 크게 개선하였다. OATA WT와 OATA W58L 모두 전 반응에 걸쳐 활성 손실을 보이지 않았는데, 이는 W58L 변이로 인해 효소의 안정성에 영향을 주지 않았음을 나타낸다(도 5). 반면, ARTA 변이체는 야생형 ARTA에 비해 상당한 효소 안정성의 감소를 보인 바 있다(Advanced Synthesis & Catalysis, 2015, 357, 1732-1740). 대기압하에서 OATA W58L를 이용한 (S)-α-MBA의 비대칭적 합성이 37%에서 더 이상 상승하지 않았다. 즉, 높은 안정성에도 불구하고 3시간째부터 7시간째까지 전환율이 단 1 %만 증가하였다(도 4).
이것은 반응평형이 불리하기 때문으로 생각된다. 선행 연구에 의하면, DMSO 부존재 하에 아세토페논/이소프로필아민 반응의 평형상수는 5.86×10-2로 계산되므로, 주어진 반응조건에서 (S)-α-MBA의 농도는 25.9 mM을 넘지 못한다. 실제로, OATA W58L의 경우 300 torr의 진공에서 아세톤을 제거하여 평형을 변화시키자 전환율이 7 시간에서 94 %에 달하였으며 ee는 99 %가 넘었다. 반면, ARTA 변이체의 경우에는 동일한 반응조건 하에서 7 시간에서의 전환율이 19 %에 불과하였다(Advanced Synthesis & Catalysis, 2015, 357, 1732-1740).
< 실시예 9: W58L 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 카이랄 아민의 비대칭 합성>
OATA W58L을 이용한 다양한 광학활성 아민의 합성의 유용성을 입증하기 위하여, 5 종의 케톤에 대하여 아민의 비대칭 합성을 수행하였다. 50 mM 케톤, 500 mM 이소프로필아민, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 15 % (v/v) DMSO, 300 토르 진공, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 OATA WT 또는 OATA W58L 5 mg/mL를 첨가하여 시간에 따라 생성된 카이랄 아민을 각각 측정하였으며, 이의 enantiomeric excess (ee)를 구하였다. 그 결과 광학적으로 순수한 (S)-아민(>99%)을 얻었다. 이의 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00007
OATA WT의 경우에 비해 OATA W58L 에서 전환율이 훨씬 높았다(1-아세토나프톤을 제외하고 15 시간 이내에 90 % 이상). 상기 케톤 중 하나, 즉 벤질아세톤은 이소프로필아민(8.6 mL, 100 mmol), OATA W58L(5 μmol), DMSO(15 mL) 및 phosphate 버퍼(50 mM, pH 7)를 포함하는 100 mL 반응 혼합액 내에서 300 torr의 진공 하에 대량(preparative scale) 합성을 수행하였다. 전환율은 18 시간에서 92 %에 달하였으며, (S)-1-메틸-3-페닐프로필아민(이하, (S)-1-M-3-PPA'라고도 한다)의 ee는 99 % 이상이었다. 이때 반응 혼합물에 5 N HCl을 첨가하여 pH를 1.0으로 조정하여 단백질을 침전시켰고 유리-프릿 필터 깔대기를 통해 혼합물을 여과해서 단백질 침전물을 제거하였다. 여과액을 Dowex 50WX8 양이온-교환 수지(40 g)로 충전된 유리 컬럼에 로딩하고, 이어서 물(200 mL)로 세척한 후 컬럼을 10% 암모니아 용액 150 mL로 용출시켰다. 용출액 분획들을 모아서 50 ℃ 및 0.25 bar에서 증발시켜 1.22 g (수득률 81.3 %, > 99 % ee)의 (S)-1-M-3-PPA를 얻었고 구조분석을 수행하여 순도를 확인하였다.
< 실시예 10: W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 동역학적 분할을 통한 아민의 생산>
상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용하여 동역학적 분할을 통해 광학적으로 순수한 아민을 생산하기 위하여 여러 아민에 대한 기질 특이성 변화를 측정하였다.
50 mM (S)-아민 (또는 100 mM 라세믹 아민), 50 mM 피루베이트, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 OATA WT, OATA W58A 또는 OATA W58L 를 첨가하여 10 분간 반응하였고, 이의 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00008
W58 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체들은 아민에 대해 OATA WT와 다른 기질 특이성을 나타내었고, 특히 OATA WT에서 반응성이 낮았던 (S)-1,2,3,4-테트라히드로-1-나프틸아민 및 1,3-다이메틸부틸아민에 대하여 반응성이 크게 증가하였다.
OATA W58L 변이체 이외에도 OATA W58A, OATA W58M, OATA W58V, OATA W58I의 아민에 대한 활성 증대를 확인하기 위해 (S)-α-메틸벤질아민 10 mM, 파이루베이트 10 mM에서 반응시켰다. 그 결과 도 3과 같이 OATA WT에 비해 탈아민화 활성이 2-10 배의 증가되었다.
또한 10 mM (S)-아민 (또는 20 mM 라세믹 아민), 10 mM 피루베이트, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 복수개 위치의 점 돌연변이를 갖는 오메가 트렌스아미네이즈를 첨가하여 반응시켰다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00009
복수개 위치의 점 돌연변이 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 경우에도 W58 점 돌연변이체와 동일하게 아민에 대한 기질 특이성이 변화한 것을 확인할 수 있었고, 특히 W58A을 포함한 복수개 위치의 점 돌연변이를 가진 OATA L57A/W58A 및 OATA L57A/W58A/V154A는 OATA W58A 에서 활성이 낮았던(즉, OATA WT와 비교해서 (S)-a-MBA에 대한 상대 활성이 각각 20% 및 6%) (S)-α-프로필벤질아민 및 rac-2-메틸-1-페닐프로필아민에 대하여 활성이 크게 증대되었다.
OATA L57C/W58L/I261A는 이소프로필아민에 대하여는 활성이 오히려 감소하였지만, 아릴알킬아민((S)-α-MBA 및 벤질아민)에 대하여는 OATA W58L에서와 마찬가지로 OATA WT에 비해 활성이 크케 증대되었다(즉, OATA WT와 비교한 (S)-a-MBA에 대한 상대 활성이 각각 900% 및 792%).
58번 위치의 트립토판이 친수성 아미노산으로 변이된 OATA W58D/I261A는 아민에 대한 활성이 크게 감소하였다(즉, OATA WT와 비교한 (S)-a-MBA에 대한 상대 활성이 17%).
위의 결과를 바탕으로 OATA W58L를 이용하여 동역학적 분할을 통해 광학적으로 순수한 아민을 생산하였다.
100 mM 라세믹 아민, 100 mM 피루베이트, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 OATA W58L 2 mg/mL를 첨가하였다. 시간에 따라 아민의 양을 각각 측정하였으며, 이의 enantiomeric excess (ee)를 구하였다.
그 결과 OATA W58L가 첨가되었을 때 광학적으로 순수한 (R)-아민을 얻었다(>99% ee). 이의 결과를 표 13에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00010
< 실시예 11: W58 점 돌연변이를 포함한 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 다양한 케토산에 대한 활성>
상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 광학적으로 순수한 아미노산의 합성의 유용성을 평가하기 위하여 (S)-α-메틸벤질아민을 아미노 공여체로 사용하여 다양한 케토산에 대한 활성을 측정하였다.
10 mM (S)-α-MBA, 10 mM 케토산, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7, 37 ℃ 조건에서 상기 실시예 4에서 정제된 W58 점 돌연변이를 포함한 오메가 트렌스아미네이즈 변이체를 첨가하여 반응하였고, 이의 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
Figure 112016033267305-pat00011
OATA L57A 에 추가로 W58 점 돌연변이가 도입되었을 때 다양한 케토산에 대해서 반응성이 증대되었고, 특히 2-옥소부탄산의 경우에는 OATA L57A 에 비해 OATA L57A/W58A 및 OATA L57A/W58A/V154A에서 각각 8 및 25배의 반응속도 증가를 보였다. 또한 OATA L57A/W58A/V154A는 OATA WT에서는 반응이 진행되지 않던 3-메틸-2-옥소부탄산에 대해서도 활성을 나타내었다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> OMEGA-TRANSAMINASE MUTANTS WITH ACTIVITY IMPROVEMENTS TOWARD KETONES AND METHODS FOR PRODUCING OPTICALLY PURE AMINES <130> HPC6645 <150> KR 2015/0049656 <151> 2015-04-08 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Ochrobactrum anthropi <400> 1 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Trp Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 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345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 2 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA W58L <400> 2 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Leu Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu 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Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Ala Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln 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400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 5 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA W58V <400> 5 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Val Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu 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Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 7 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA W58P <400> 7 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Pro Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 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Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Ala Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 26 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA W58A/I380A <400> 26 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Ala Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ala Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 27 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA L57A/W58A/V154A <400> 27 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Ala Ala Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr 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Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 28 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA L57Q/W58N/I261L <400> 28 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Gln Asn Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Leu Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 29 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA L57C/W58L/I261A <400> 29 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Cys Leu Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ala Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455 <210> 30 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OATA W58D/I261A <400> 30 Met Thr Ala Gln Pro Asn Ser Leu Glu Ala Arg Asp Ile Arg Tyr His 1 5 10 15 Leu His Ser Tyr Thr Asp Ala Val Arg Leu Glu Ala Glu Gly Pro Leu 20 25 30 Val Ile Glu Arg Gly Asp Gly Ile Tyr Val Glu Asp Val Ser Gly Lys 35 40 45 Arg Tyr Ile Glu Ala Met Ser Gly Leu Asp Ser Val Gly Val Gly Phe 50 55 60 Ser Glu Pro Arg Leu Ala Glu Ala Ala Ala Arg Gln Met Lys Lys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Tyr His Thr Phe Ser Tyr Arg Ser His Gly Pro Val Ile Asp 85 90 95 Leu Ala Glu Lys Leu Val Ser Met Ala Pro Val Pro Met Ser Lys Ala 100 105 110 Tyr Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Val Val Lys Leu 115 120 125 Ile Trp Tyr Arg Ser Asn Ala Leu Gly Glu Pro Glu Arg Lys Lys Ile 130 135 140 Ile Ser Arg Lys Arg Gly Tyr His Gly Val Thr Ile Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 Leu Thr Gly Leu Pro Asn Asn His Arg Ser Phe Asp Leu Pro Ile Asp 165 170 175 Arg Ile Leu His Thr Gly Cys Pro His Phe Tyr Arg Glu Gly Gln Ala 180 185 190 Gly Glu Ser Glu Glu Gln Phe Ala Thr Arg Leu Ala Asp Glu Leu Glu 195 200 205 Gln Leu Ile Ile Ala Glu Gly Pro His Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly 210 215 220 Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Val Val Pro Pro Lys Thr Tyr 225 230 235 240 Trp Glu Lys Val Gln Ala Val Leu Lys Arg Tyr Asp Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Ala Asp Glu Val Ala Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Leu Phe Gly 260 265 270 Ser Gln Thr Phe Asp Met Lys Pro Asp Ile Leu Val Met Ser Lys Gln 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Pro Ile Ser Ala Phe Leu Ile Asn Glu Arg 290 295 300 Val Tyr Ala Pro Ile Ala Glu Glu Ser His Lys Ile Gly Thr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Leu Ala Ile Ile Glu Glu Arg Asp Leu Val Ala Asn Ala Arg 340 345 350 Asp Arg Gly Thr Tyr Met Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His 355 360 365 Pro Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Val Gly Leu Ile Ala Gly Val Glu 370 375 380 Leu Val Thr Asp Lys Gln Ala Lys Thr Gly Leu Glu Pro Thr Gly Ala 385 390 395 400 Leu Gly Ala Lys Ala Asn Ala Val Leu Gln Glu Arg Gly Val Ile Ser 405 410 415 Arg Ala Met Gly Asp Thr Leu Ala Phe Cys Pro Pro Leu Ile Ile Asn 420 425 430 Asp Gln Gln Val Asp Thr Met Val Ser Ala Leu Glu Ala Thr Leu Asn 435 440 445 Asp Val Gln Ala Ser Leu Thr Arg 450 455

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체로서,
    상기 다른 아미노산은 알라닌, 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 메치오닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린 및 티로신 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체의 돌연변이는 상기 점 돌연변이 하나이며,
    케톤 및 아미노 공여체를 포함하는 기질 용액으로부터 상기 케톤의 아민화 반응 활성을 증대시켜 광학활성아민을 생산하기 위한 용도로 사용되는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 오메가 트랜스아미네이즈 변이체는 서열번호 2 내지 6, 서열번호 9 및 서열번호 11 내지 15 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 58번 위치의 트립토판이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 포함하는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체로서,
    상기 야생형 오메가 트랜스아미네이즈의 57번 위치의 로이신, 126번 위치의 이소로이신 및 154번 위치의 발린 중에서 어느 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되는 점 돌연변이를 추가로 포함하며,
    서열번호 20 및 서열번호 27 내지 서열번호 30 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지고,
    케톤 및 아미노 공여체를 포함하는 기질 용액으로부터 상기 케톤의 아민화 반응 활성을 증대시켜 광학활성아민을 생산하기 위한 용도로 사용되는 오메가 트랜스아미네이즈 변이체.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 케톤 및 아미노 공여체를 포함하는 기질 용액에, 청구항 제1항, 제8항 및 제9항 중에서 선택되는 어느 한 항의 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 케톤의 아민화 반응 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈 변이체를 이용한 광학활성아민의 제조방법.
  16. 삭제
KR1020160042226A 2015-04-08 2016-04-06 케톤에 대한 활성이 증대된 오메가 트랜스아미네이즈의 변이체 및 이것을 이용한 광학활성 아민의 제조방법 KR101869432B1 (ko)

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