JP7401116B2 - 新規なl-アミノ酸オキシダーゼ及びd-アミノ酸又はその誘導体の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)大腸菌発現系にて大量発現が可能であるため、簡単且つ低コストにL-アミノ酸オキシダーゼを得ることができる。それゆえ、工業利用も可能である。
(2)基質選択性が広いため、アミノ酸の種類を問わず作用させることができ、汎用性が高い。さらに、アミノ酸だけでなく、アミノ酸誘導体に対しても高い活性で作用することができる。
(3)反応系中に共存するラセミ化触媒である還元剤からの影響を受けることなく、効率の良い動的光学分割をワンポットで行うことができ、高純度の光学活性体を高収率で得ることができる。
(1)至適pHは7~8である。
(2)至適温度は25℃~35℃である。
(3)等電点(pI)は5.01である。
(4)分子量は74.27kDaである。
(1)至適pHは6.5~7.0である。
(2)等電点(pI)は4.9である。
(3)分子量は74.1kDaである。
(1)至適pHは6.0である。
(2)等電点(pI)は5.1である。
(3)分子量は73.9kDaである。
本発明のタンパク質、すなわちArtLAAOは、常法に従い、このタンパク質をコードする遺伝子を用いて、大腸菌等を宿主としたタンパク質発現等により製造することができる。また、化学合成によりArtLAAOを製造することも可能であるが、本発明のArtLAAOは、従来のLAAOと異なり、組換えタンパク質の大量発現を実現できた新規なタンパク質であるため、遺伝子組換え技術を用いて製造することが好ましい。
本発明のArtLAAOは、DL-アミノ酸又はその誘導体をD-アミノ酸又はその誘導体に変換する動的光学分割に利用でき、工業的なD-アミノ酸又はD-アミノ酸誘導体の製造を実現することができる。本発明のArtLAAOを利用した動的光学分割方法は、以下順序で行われる。DL-アミノ酸又はその誘導体に対し、ArtLAAOを作用させると、ArtLAAOとD-アミノ酸等とは反応しないが、L-アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される(上記の化学式1参照)。このイミノ酸は、還元剤等のラセミ化触媒を作用させることによって再びラセミ体に変換される。ここで、再び生じたラセミ体のうち、L-アミノ酸等は再度L-アミノ酸オキシダーゼと反応してイミノ酸を形成するが、D-アミノ酸等は反応せずに残存する。この繰り返しによって、最終的にDL-アミノ酸等はD-アミノ酸等に変換され、高純度の光学活性体として得られる。
上述した動的光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではない1組のエナンチオマー又はL-アミノ酸等とした場合においても、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるL-アミノ酸等がD-アミノ酸又はその誘導体に変換される。
本発明のArtLAAOは、DL-アミノ酸又はその誘導体をD-アミノ酸又はその誘導体とケト酸とに変換する光学分割に利用することも可能である。この場合には、ラセミ化触媒である還元剤の添加は不要となる。本発明のArtLAAOを利用した光学分割方法は、以下順序で行われる。DL-アミノ酸又はその誘導体に対し、ArtLAAOを作用させると、ArtLAAOとD-アミノ酸等とは反応しないが、L-アミノ酸等は酸化され、中間体としてイミノ酸が形成される。このイミノ酸は、ラセミ化触媒が無い条件下では、水系反応液中で自然に加水分解されて、ケト酸に変換される。反応せずに残存したD-アミノ酸等と、酵素反応及び加水分解により生じたケト酸とを分離することにより、D-アミノ酸等とケト酸とをそれぞれ得ることができる。なお、D-アミノ酸等とケト酸との分離は、例えば酸性水溶液中での選択的沈殿方法、又は、イオン交換クロマトグラフィー法等により行うことができる。
上述した光学分割反応条件において、反応原料をラセミ体ではなく、例えば、L-アミノ酸等とした場合には、上述と同様の反応により、反応原料に含まれるL-アミノ酸等がケト酸に変換される。ケト酸は有機合成し難い化合物であることから、酵素を用いた工業的なケト酸の合成も実現することができる。
1.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)の設計
基質選択性の広いLAAOを人工的に設計するため、以下の操作を行った。報告のあるL-アルギニン酸化酵素(AROD)のアミノ酸配列について、BLASTプログラムのBlastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins)で解析した。その後、発明者らの研究室で開発したタンパク質配列マイニング法により検討した結果、以下表1に示す6つのARODホモログ配列を抽出した。
2.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)の製造
実施例1で得た655残基のアミノ酸からなるArtLAAO1をコードする遺伝子(配列番号2)を人工遺伝子合成により作成した。下記表3にその遺伝子配列を示す。作成したArtLAAO1遺伝子をpET-28bベクター(Novagen社製品)のT7プロモーター下流にクローニングし、ArtLAAO1遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したArtLAAO1発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)株に導入して形質転換を行い、ArtLAAO1生産株を得た。
3.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)の活性測定
20種類のL-アミノ酸及び2種類のL-アミノ酸誘導体、並びに2種類のDL-アミノ酸及び16種類のDL-アミノ酸誘導体について、実施例2で得られた人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)の比活性測定を行った。本実施例におけるL-アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法は、具体的には、次のとおりである。表4に示す活性測定用反応液をマイクロチューブに量りとり、これをウォーターバスにて30℃の条件で30分インキュベートした。活性測定用反応液を石英セルに90μL量りとり、実施例2で得られた酵素液を10μL添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計(UV-2450、株式会社島津製作所)で505nmの吸光度変化を測定して酵素活性を求めた。
4.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)による動的光学分割(1)
次にDL-フェニルアラニン及びその誘導体について、以下化学式2に示す、ArtLAAOを用いた動的光学分割(DKR)を試みた。以下化学式2では、本実施例4における、本発明の新規なL-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO)を用いたDL-フェニルアラニン誘導体の動的光学分割により、D-フェニルアラニン誘導体が製造されるフローが示されている。DL-フェニルアラニン及びその誘導体として、下記表7に示す10種類の反応原料(DL-1a~DL-1j)を準備した。DKRは、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH=8.0)、5mMの各反応原料、150mMのアンモニアボラン(NH3:BH3)及び10UのArtLAAO1の反応液を調製したのち、30℃で約20時間反応させることで実施した。
5.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)による動的光学分割(2)
さらに、DL-トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体について、実施例4と同様の方法にてArtLAAO1を用いた動的光学分割(DKR)を試みた。DL-トリプトファン及びその誘導体、並びにグリシン誘導体として、下記表9に示す8種類の反応原料(DL-2a~DL-2h)を準備し、DKRを行った。DKR及びその結果の分析は実施例4と同様の方法で行った。表9に各化合物のキラルHPLCの分析条件及び保持条件を示す。
6.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)の設計
実施例1~5で得られた人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表1に示すARODホモログ配列に基づいて新たな人工L-アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
7.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)の製造
実施例6で得た656残基のアミノ酸からなるArtLAAO4をコードする遺伝子(配列番号4)を人工遺伝子合成により作成した。下記表12にその遺伝子配列を示す。作成したArtLAAO4遺伝子をpET-28bベクター(Novagen社製品)のT7プロモーター下流にクローニングし、ArtLAAO4遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したArtLAAO4発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)株に導入して形質転換を行い、ArtLAAO4生産株を得た。
8.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)の活性測定
20種類のL-アミノ酸について、実施例7で得られた人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)の比活性測定を行った。L-アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例3と同様の方法で行った。ArtLAAO4の20種類のL-アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表13に示す。
9.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)の設計
実施例1~5で得られたArtLAAO1及び実施例6~8で得られたArtLAAO4と同様の機能を有する酵素をさらに得るべく、上述した表1に示すARODホモログ配列に基づいて新たな人工L-アミノ酸オキシダーゼの設計を試みた。
10.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)の製造
実施例9で得た655残基のアミノ酸からなるArtLAAO5をコードする遺伝子(配列番号6)を人工遺伝子合成により作成した。下記表16にその遺伝子配列を示す。作成したArtLAAO5遺伝子をpET-28bベクター(Novagen社製品)のT7プロモーター下流にクローニングし、ArtLAAO5遺伝子を含む組換えベクターを得た。構築したArtLAAO5発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)株に導入して形質転換を行い、ArtLAAO5生産株を得た。
11.人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)の活性測定
20種類のL-アミノ酸について、実施例10で得られた人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)の比活性測定を行った。L-アミノ酸オキシダーゼ活性の測定は、上述した実施例3と同様の方法で行った。ArtLAAO5の20種類のL-アミノ酸についての酵素活性測定結果を以下表17に示す。
上述の実施例で得られた3種類の人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1、ArtLAAO4及びArtLAAO5)について、それぞれの耐熱性及び耐久性を調べた。耐熱性については、次のようにして試験を行った。30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃及び80℃に各々設定したヒートブロックで人工L-アミノ酸オキシダーゼの酵素液を10分間インキュベートし、氷浴した。以下表19に示す活性測定用反応液を調製し、ウォーターバスにて30℃で10分間インキュベートした。この活性測定用反応液を石英セルに90μL量りとり、熱処理後の各酵素液を10μL添加して、反応を開始し、直ちに紫外可視分光光度計(UV-2450、株式会社島津製作所)で505nmの吸光度変化を測定して残存する酵素活性を求めた。結果を図7(A)に示す。
配列番号2:人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO1)をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号3:人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)のアミノ酸配列
配列番号4:人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO4)をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号5:人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)のアミノ酸配列
配列番号6:人工L-アミノ酸オキシダーゼ(ArtLAAO5)をコードする遺伝子の塩基配列
Claims (9)
- 下記の(1)~(4)のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
(1)配列番号1、配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
(2)配列番号1、配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、
(3)配列番号1で表わされるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列、又は
(4)配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列に対して98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。 - 下記の(5)~(8)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
(5)配列番号1、配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
(6)配列番号1、配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
(7)配列番号1で表わされるアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
(8)配列番号3又は配列番号5で表わされるアミノ酸配列に対して98%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アミノ酸オキシダーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードする遺伝子又は請求項2に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
- L-アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項1に記載のタンパク質をL-アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、
前記イミノ酸に対し、還元剤を作用させる工程と、を有することを特徴とするD-アミノ酸又はその誘導体の製造方法。 - L-アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項1に記載のタンパク質をL-アミノ酸オキシダーゼとして作用させて、イミノ酸を生じさせる工程と、
前記イミノ酸を加水分解させる工程と、を有することを特徴とするケト酸の製造方法。 - DL-アミノ酸又はその誘導体に対し、請求項1に記載のタンパク質をL-アミノ酸オキシダーゼとして作用させる工程を有することを特徴とする光学分割方法。
- 前記DL-アミノ酸又はその誘導体が、DL-フェニルアラニン、DL-トリプトファン、DL-メチオニン、DL-ロイシン、DL-グルタミン、DL-グルタミン酸、DL-チロシン、DL-イソロイシン、DL-アルギニン及びそれらの誘導体からなる群から選択される化合物であることを特徴とする請求項7に記載の光学分割方法。
- 前記L-アミノ酸オキシダーゼが前記DL-アミノ酸又はその誘導体に作用することにより生じたイミノ酸に対し、
アンモニアボラン、水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム及びシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムからなる群から選択される還元剤を作用させる工程を有することを特徴とする請求項7又は8に記載の光学分割方法。
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