JP2024034839A - リパーゼの探索方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、及び／又は界面活性剤存在下での優れた洗浄力を示すリパーゼを効率的に探索できるリパーゼの探索方法の提供。【解決手段】リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、を含むリパーゼの探索方法。【選択図】なし

Description

本発明は、リパーゼの探索方法に関する。
リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼはトリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
現行の洗浄組成物や洗浄環境は、リパーゼの活性や洗浄効果を阻害する様々な成分を含んでおり、そのような条件下で機能するリパーゼが求められている。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａ ｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード（Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード）に属するリパーゼである。
バクテリアリパーゼは８つのファミリーに分類される（非特許文献１）。そのうちサブファミリーＩ．１又はＩ．２に属するグラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし（非特許文献２）、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている（非特許文献３）が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、サブファミリーＩ．１のリパーゼのうちＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するバクテリアリパーゼの一部は特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ（非特許文献４、５）。以上のように、異種発現による安価製造が可能であり、様々な洗浄環境で機能を発揮するリパーゼの探索が精力的に行われている。
特表２０１５－５２３０７８号公報 国際公開公報第２０２０／０４６６１３号 特表２０１５－５２５２４８号公報
Arpigny JL, Jaeger KE. The Biochemical journal 343 Pt 1(Pt 1) (1999): 177-183. Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686. Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12. Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547. Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
リパーゼは洗浄組成物中に含まれる界面活性剤によってその活性が阻害されることが知られている。実際に本発明者らが検証した限り、洗浄への適性が開示されている公知のリパーゼは、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８のいずれもが界面活性剤の共存によって大きな活性阻害を受けた。界面活性剤による活性阻害は洗浄用リパーゼの大きな課題である。また、リパーゼは洗浄用途に限らずパルプ処理などの産業用途においても界面活性剤と共に使用されることが多く、界面活性剤による活性阻害は産業用リパーゼ全体の課題でもある。したがって、界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、及び／又は界面活性剤存在下での優れた洗浄力を示すリパーゼを効率的に探索する方法が求められている。
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計することで、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を有するリパーゼを効率的に取得できることを見出した。
一般に祖先型の酵素は、高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や低温における洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、上記結果は予想外のものであった。
すなわち、本発明は、リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、を含むリパーゼの探索方法を提供する。
本発明の探索方法を用いることで、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を有するリパーゼを効率的に取得することができる。
ＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイル。 Ｐｒｏｔｅｕｓ／ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイル。 洗浄用リパーゼのＳＤＳ溶液中でのリパーゼ活性。 洗浄用リパーゼのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液中でのリパーゼ活性。 洗浄用リパーゼのモデル洗浄液中でのリパーゼ活性。 洗浄用リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力。 Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード近縁のリパーゼ配列群の系統樹。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ１、２、３及び４の各リパーゼのＳＤＳ溶液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ１、２、３及び４の各リパーゼのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ１、２、３及び４の各リパーゼのモデル洗浄液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ１、２、３及び４の各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力。 ＱＧＬＰクレード近縁のリパーゼ配列群の系統樹。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ５及び６の各リパーゼのＳＤＳ溶液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ５及び６の各リパーゼのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ５及び６の各リパーゼのモデル洗浄液中でのリパーゼ活性。 Ｌｉｐｒ１３９並びにＧｒｏｕｐ５及び６の各リパーゼのモデル洗浄液中での洗浄力。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、「配列群」とは、少なくとも２配列のアミノ酸配列を含む配列の集団であって、最も同一性の低い配列間の同一性が９８％以下、好ましくは９５％以下、より好ましくは９０％以下、さらに好ましくは８０％以下である配列の集団を指す。
本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の参考例１に詳述されている。
本明細書において、「現存するリパ―ゼ」とは、現存する生物が有するリパーゼを指す。以下、現存するリパーゼのアミノ酸配列をリパーゼの現存配列とも称する。リパーゼの現存配列は、公共配列データベースや自然界からのスクリーニングなどによって取得することができる。
本明細書において、「祖先型リパーゼ」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹に基づいて、共通祖先に由来する各生物のリパーゼの現存配列から導き出される該共通祖先が有していたと推定されるアミノ酸配列からなるリパーゼを指す。以下、祖先型リパーゼのアミノ酸配列をリパーゼの祖先配列とも称する。リパーゼの祖先配列は、リパーゼの現存配列をもとに、祖先配列設計法（Ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ＡＳＲ）により決定することができる。
本明細書において、「クレード」とは、共通祖先における祖先配列と共通祖先から派生したすべての子孫における配列（現存配列及び現存配列と共通祖先における祖先配列の中間的な祖先配列）とから構成される集団である（evolution.berkeley.edu/evolibrary/article/0_0_0/evo_06）。クレードは系統樹として視覚化することができる。系統樹のクレード内で一群を形成する分岐群をサブクレードといい、あるサブクレードにおける配列同志は、同クレード内の異なるサブクレードの配列よりも近縁の関係にある。
本明細書において、「ＱＧＬＰクレード」とは、バクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１に属するリパーゼ及びサブファミリーＩ．１に属するリパーゼに近縁のリパーゼの配列群からなるクレードを指す。
ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列は、［ＱＨ］［ＧＡ］［ＬＶＭＩ］［ＰＳＡＱ］ＸＸ［ＷＲＰＣ］［ＧＣＤＲ］［ＧＥＳＡＤ］ＸＧ（配列番号５７）として表されるモチーフを含む配列として定義することができる。ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。同モチーフをもつ配列を親とする変異体もまたＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列に含まれ得る。
あるいは、ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列は、図１に示す隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ；ＨＭＭ）プロファイルに対して全長で３５０以上のＨＭＭスコアを有する配列としても定義することができる。図１のＨＭＭプロファイルは、ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列群を用いてＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１のデフォルトパラメーターによって構築したマルチプルアラインメントをもとに生成した。マルチプルアラインメントからのＨＭＭ生成にはＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２（http://hmmer.org/）を用い、パラメーターとして――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅを指定した。ｈｍｍｐｒｅｓｓを用いてＨＭＭプロファイルをバイナリ化し、ｈｍｍｓｃａｎを用いて相同性検索を行うことで、生成したＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイルに対する任意の配列のＨＭＭスコアを計算することができる。ＱＧＬＰクレードを定義するＨＭＭプロファイルの作成に用いたリパーゼ配列群のＮＣＢＩアクセッション番号は、後述の表４に示す。
ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列は、好ましくは分泌シグナルを含まない。分泌シグナル配列とは、ここではＳｅｃ分泌経路におけるシグナル配列を指す。Ｓｅｃ分泌シグナルの有無は、例えば、ＳｉｇｎａｌＰ－５．０（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）などのシグナル予測ツールを用いることで判定することができる。
本明細書において、「Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード」とは、ＱＧＬＰクレードのサブクレードを指し、Ｐｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼ配列を含む。Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼ配列は、図２に示すＨＭＭプロファイルに対して全長で６００以上のＨＭＭスコアを有する配列として定義することができる。図２のＨＭＭプロファイルは、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼ配列群を用いてＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１によって構築したマルチプルアラインメントをもとに生成した。パラメーターには――ｌｏｃａｌｐａｉｒ ――ｍａｘｉｔｅｒａｔｅ １６を用いた。マルチプルアラインメントからのＨＭＭ生成にはＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２を用い、パラメーターとして――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅを指定した。ｈｍｍｐｒｅｓｓを用いてＨＭＭプロファイルをバイナリ化し、ｈｍｍｓｃａｎを用いて相同性検索を行うことで、生成したＰｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルに対する任意の配列のＨＭＭスコアを計算することができる。Ｐｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルの作成に用いたリパーゼ配列群のＮＣＢＩアクセッション番号は、後述の表６に示す。
本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と基準配列とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより基準配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
後記実施例に示すように、リパーゼの現存配列群を用いて祖先配列設計法により設計した祖先配列からなる祖先型リパーゼは、現存するリパーゼよりも高確率で、異種発現可能であり、界面活性剤存在下でもリパーゼ活性がよく保持されており、すなわち界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有しており、界面活性剤存在下でも優れた洗浄力を示した。斯かる祖先型リパーゼがＱＧＬＰクレードに属する祖先配列からなる祖先型リパーゼである場合、特にＱＧＬＰクレードに属する祖先配列からなる祖先型リパーゼであってＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列からなる祖先型リパーゼである場合、さらに高確率で界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄力を示した。よって、リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計すれば、該祖先配列からなる祖先型リパーゼは、現存するリパーゼよりも高確率で、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を示すリパーゼであり、換言すれば、界面活性剤による活性阻害に対する耐性及び界面活性剤存在下での優れた洗浄力の少なくとも一方を示すリパーゼを効率よく探索することができる。
したがって、本発明は、リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、選択した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、を含むリパーゼの探索方法を提供する。
本発明の方法に用いられるリパーゼ配列群は、リパーゼの現存配列群であり、その由来は特に限定されないが、好ましくは原核生物由来のバクテリアリパーゼ配列群であり、より好ましくはバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼの配列を少なくとも１配列含む配列群であり、さらに好ましくはバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼの配列群であり、さらに好ましくはＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列群である。
リパーゼ配列群に含まれるリパーゼ配列数は、少なくとも２配列であればよく、好ましくは１０配列以上、より好ましくは５０配列以上、さらに好ましくは１００配列以上である。リパーゼ配列数の上限は、特に制限されず、適宜設定すればよい。また、リパーゼ配列群に含まれるリパーゼ配列数の例としては、２～１０００配列、１０～１０００配列、５０～１０００配列、１００～１０００配列、２～３０００配列、１０～３０００配列、５０～３０００配列、１００～３０００配列が挙げられる。
「リパーゼの祖先配列を設計する」とは、祖先型リパーゼのアミノ酸配列を決定することを意味する。リパーゼの祖先配列は、祖先配列設計法により、具体的には、リパーゼの現存配列を公共データベースなどから取得し、得られたリパーゼの現存配列群を用いてマルチプルアラインメント、次いで有根系統樹を作成し、ＡＳＲプログラムを用いて祖先型リパーゼのアミノ酸配列を推定することで設計することができる。
リパーゼの祖先配列の設計には、一般的な手法を用いることができ、例えばＭｅｒｋｌ Ｒ，Ｓｔｅｒｎｅｒ Ｒ．，Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１６；３９７（１）：１－２１やＳｃｏｓｓａ Ｆ，Ｆｅｒｎｉｅ ＡＲ．，Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．２０２１；１９：１５７９－１５９４などに記載されている手法を用いることができる。また、ＪＳＢｉ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，２（１），３０－５７（２０２１）に記載されている系統解析の一般的な手法も用いることができる。リパーゼの現存配列のデータセットは、例えばＮＣＢＩ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢといった公共のデータベースからＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）によって取得することができる。または、ＩｎｔｅｒＰｒｏやＰｆａｍといったドメインデータベースからファミリーとして一括で取得することもできる。マルチプルアラインメントの作成には例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，２００４）、ＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ，２０１３）、ＭＡＦＦＴ－ＤＡＳＨ（Ｒｏｚｅｗｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、ＰＲＡＮＫ（Ｌｏｙｔｙｎｏｊａ，２０１４）、Ｔ－ＣＯＦＦＥＥ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）などのプログラムを用いることができる。作成されたマルチプルアラインメントは、ＧＢＬＯＣＫＳ（Ｃａｓｔｒｅｓａｎａ，２０００）やｔｒｉｍＡｌ（Ｃａｐｅｌｌａ－Ｇｕｔｉeｒｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００９）などのプログラムによって適切にトリミングされたあと、系統樹の推定に用いられる。系統樹の推定には最節約法やベイズ法、最尤法の手法を用いることができ、例えばＭｒＢａｙｅｓ（Ｒｏｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＢＥＡＳＴ（Ｂｏｕｃｋａｅｒｔ ｅｔａｌ．，２０１９）、ＦａｓｔＴｒｅｅ（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＰｈｙＭＬ（Ｇｕｉｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０），ＲＡｘＭＬ（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＩＱ－ＴＲＥＥ（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）などのプログラムを用いることができる。系統樹推定に用いる適切な進化モデルは、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ－ＮＧ（Ｄａｒｒｉｂａ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．，２０２０）やＭｏｄｅｌＦｉｎｄｅｒ（Ｋａｌｙａａｎａｍｏｏｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７）などのプログラムを使用して選択することができる。祖先配列設計には専用のプログラムを用いることができ、ＦａｓｔＭＬ（Ｐｕｐｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＰｒｏｔＡＳＲ２（Ａｒｅｎａｓ Ｍ ａｎｄ Ｂａｓｔｏｌｌａ，２０２０）、ＧＲＡＳＰ（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）などのプログラムを用いることができる。また、系統樹推定プログラムの一部の機能として祖先配列設計が含まれているものもあり、ＰＡＭＬ（Ｙａｎｇ，１９９７）、ＲＡｘＭＬ、ＩＱ－ＴＲＥＥなどのプログラムを用いることもできる。これらの系統解析から祖先配列設計を一括で行う統合環境としてＭＥＧＡ（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）を用いることもできる。
設計したリパーゼの祖先配列は、探索母集団を形成する。リパーゼの祖先配列の設計数、すなわち探索母集団のサイズは、特に制限されず、当業者が適宜設定すればよい。リパーゼの祖先配列の設計数は、祖先配列決定法に供するリパーゼ配列群に含まれる配列数、作成した有根系統樹上でどの分岐点まで遡って祖先配列を設計するかなどに応じて変化し得る。
本発明の方法においては、上述の祖先配列設計法により設計したリパーゼの祖先配列を改変して改変祖先配列を設計し、該改変祖先配列を探索母集団に加えてもよい。この場合、本発明の方法の以降の工程において、改変祖先配列は祖先配列と同様に扱えばよい。改変としては、祖先配列における１個～数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、又は挿入、祖先配列のキメラ化などが挙げられ、好ましくは祖先配列における１個～数個のアミノ酸残基の置換又は祖先配列のキメラ化である。ここで、「１個～数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個又は２個を意味し得る。アミノ酸残基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１個～数個のアミノ酸残基の付加が含まれる。また、祖先配列のキメラ化とは、ある祖先配列の一部を別の祖先配列又は現存配列における該一部に相当する位置のアミノ酸配列と置き換えることを意味する。キメラ化に用いる配列数は、キメラ化の対象となる祖先配列を含めて少なくとも２配列であり、好ましくは２～１１配列、より好ましくは２～６配列、さらに好ましくは２～４配列、さらに好ましくは２～３配列を意味し得る。キメラ化する位置は、少なくとも１か所であり、好ましくは１～１０か所、より好ましくは１～５か所、さらに好ましくは１～３か所、さらに好ましくは１～２か所を意味し得る。改変の具体的手順としては、リパーゼの祖先配列において１個～数個のアミノ酸残基を置換、欠失、付加、又は挿入させた改変祖先配列を作成するか、リパーゼの祖先配列においてその一部を別の祖先配列又は現存配列における該一部に相当する位置のアミノ酸配列と置き換えた改変祖先配列を作成するか、あるいはこれらを組み合わせることが挙げられる。改変祖先配列は、改変前の祖先配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列であり得る。ここで、「少なくとも６０％の同一性」とは、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性をいう。
好ましい一実施形態においては、設計したリパーゼの祖先配列からＱＧＬＰクレードに属する祖先配列を選択する。リパーゼの祖先配列がＱＧＬＰクレードに属するか否かは、該祖先配列における配列番号５７で示されるモチーフの有無に基づいて判定することができる。具体的には、祖先配列が配列番号５７で示されるモチーフを含む場合、該祖先配列はＱＧＬＰクレードに属すると判定することができる。一方、祖先配列が配列番号５７で示されるモチーフを含まない場合、該祖先配列はＱＧＬＰクレードに属さないと判定することができる。あるいは、祖先配列がＱＧＬＰクレードに属するか否かは、下記表４のリパーゼ配列群を用いて作成したＨＭＭプロファイル、すなわち図１に示すＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイルに対する該祖先配列のＨＭＭスコアに基づいて判定することができる。具体的には、図１に示すＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイルに対する祖先配列の配列全長のＨＭＭスコアが３５０以上である場合、該祖先配列はＱＧＬＰクレードに属すると判定することができる。一方、図１に示すＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイルに対する祖先配列の配列全長のＨＭＭスコアが３５０未満である場合、該祖先配列はＱＧＬＰクレードに属さないと判定することができる。本実施形態では、上記いずれかの基準によりＱＧＬＰクレードに属すると判定された祖先配列が選択される。
ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列としては、Ｐｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列に相当する配列であることが探索効率の点から好ましい。「ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼの祖先配列がＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列に相当する」とは、有根系統樹上で、該ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列の子孫にあたる現存配列にＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列が少なくとも１配列含まれることを意味する。リパーゼの現存配列がＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するか否かは、下記表６のリパーゼ配列群を用いて作成したＨＭＭプロファイル、すなわち図２に示すＰｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルに対する該現存配列のＨＭＭスコアに基づいて判定することができる。具体的には、図２に示すＰｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルに対する現存配列の配列全長のＨＭＭスコアが６００以上である場合、該現存配列はＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属すると判定することができる。一方、図２に示すＰｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルに対する現存配列の配列全長のＨＭＭスコアが６００未満である場合、該現存配列はＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属さないと判定することができる。
設計したリパーゼの祖先配列からなるリパーゼ、又は設計及び選択したリパーゼの祖先配列からなるリパーゼ（祖先型リパーゼ）は、例えば、該祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、祖先型リパーゼは、該祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した該祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドから該祖先型リパーゼが生産される。生産された該祖先型リパーゼを該培養物から単離又は精製することにより、該祖先型リパーゼを取得することができる。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドは、該祖先型リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、該祖先型リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社などより提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニングなどにより増幅することもできる。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、祖先型リパーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチド（すなわち祖先型リパーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。
上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
あるいは、上記ベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
あるいは、祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
祖先型リパーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して該祖先型リパーゼが生成される。該形質転換体の培養に使用する培地は、該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
あるいは、祖先型リパーゼは、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された祖先型リパーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
本発明の方法においては、斯くして得られる祖先型リパーゼを用いて、該祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する。現存するリパーゼ及び祖先型リパーゼにおいて、界面活性剤存在下のリパーゼ活性は界面活性剤存在下の洗浄力とよく相関しており、少なくともいずれか一方を測定すればもう一方を類推可能である。
ここで、界面活性剤は、特に限定されず、リパーゼの使用目的、使用条件などに応じて適宜選択すればよい。例えば、リパーゼの配合を所望する洗浄剤組成物が含有する界面活性剤を好ましく用いることができる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせであり、より好ましくはスルホコハク酸エステル又はその塩、ＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の１種又は組み合わせであり、さらに好ましくはＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の１種又は組み合わせである。
スルホコハク酸エステル又はその塩は、洗浄剤組成物に配合される成分として知られている（例えば、特開２０１９－１８２９１１号公報）。スルホコハク酸エステル又はその塩は、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、炭素数１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましい。また、スルホコハク酸エステル又はその塩は、スルホコハク酸ジ分岐鎖アルキルエステル又はその塩であって、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましく、ビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩がさらに好ましい。
塩としては、例えばアルカリ金属塩、アルカノールアミン塩などが挙げられ、アルカリ金属塩又はアルカノールアミン塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、及びモノエタノールアミン塩から選ばれる塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。
祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性の測定は、当該技術分野において周知の方法に従って行えばよい。例えば、祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性は、祖先型リパーゼを含む上述した界面活性剤溶液中のオクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度に基づき測定することができる。測定する活性は、絶対活性であっても相対活性であってもよいが、複数のリパーゼの比較の観点から、溶媒中の活性の影響を排除した相対活性を測定することが好ましい。祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性が高い程、該祖先型リパーゼは界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性が高いと評価することができる。界面活性剤存在下のリパーゼ活性の測定の具体的手順の例を以下に示す。
＜界面活性剤存在下のリパーゼ活性の測定＞
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を基質溶液として用いる。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）添加したものを界面活性剤溶液として用いる。２ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液５μＬと界面活性剤溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定する。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とする。界面活性剤溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた際の活性値（バッファー中での活性）で界面活性剤溶液中での活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求める。
あるいは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いる。モデル洗浄液として、下記表１記載の水性媒体を用いる。４ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液２μＬと試験液（モデル洗浄液又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定する。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを求める。別途、濃度既知の４－ニトロフェノールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１０μＬを各試験液１００μＬと混合し、４０５ｎｍの吸光度を測定し検量線を作成する。各試験液の検量線とΔＯＤ／ｍｉｎの値から、一分間あたりの４－ニトロフェノールの遊離速度（μＭ／ｍｉｎ）を活性値として算出する。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を試験液とした際の活性値（バッファー中での活性）で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求める。
「洗浄力」とは、汚れ、とりわけ油性汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。祖先型リパーゼの界面活性剤存在下の洗浄力の測定は、当該技術分野において周知の方法に従って行えばよい。例えば、祖先型リパーゼの界面活性剤存在下の洗浄力は、所定の指標物質（例えば、スダンIIIなどの脂肪に対する溶解性の高い染色剤）を含むモデル汚れに祖先型リパーゼ及び上述した界面活性剤を含む洗浄液を添加して所定の条件で洗浄処理し、洗浄液の一部を分取し、洗浄処理により洗浄液に可溶化したモデル汚れ中の指標物質の濃度を測定し、ブランクとの差分を洗浄力の指標として測定することができる。ここで、洗浄液には、洗剤組成物に通常使用される成分がさらに含まれ得る。測定時の温度は特に制限されないが、低温が好ましい。ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、かつ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。洗浄力の測定の具体的手順の例を以下に示す。
＜界面活性剤存在下の洗浄力の測定＞
牛脂（ＳＩＧＭＡ，０３－０６６０）とナタネ油（ＳＩＧＭＡ，２３－０４５０）を重量比９：１で混合し、３倍量のクロロホルムに溶解した後に０．２ｗｔ％のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとする。ポリプロピレン製の９６穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを１０μＬずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとする。下記表１記載のモデル洗浄液に、１／１００容量の２４０ｐｐｍのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とする。汚れプレートに洗浄液を３００μＬずつ緩やかに添加し、室温（約２２℃）で１５分間静置して浸漬洗浄を行う。底部の汚れに触れないように洗浄液を１００μＬずつ分取し、新しい９６穴プレートに移す。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、５００ｎｍの吸光度（Ａ５００）を測定する。洗浄後のＡ５００から洗浄前のＡ５００を差し引いた値ΔＡ５００は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。
次いで、本発明の方法においては、祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方の測定結果を、標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する。好ましくは、さらに、比較結果に基づいて、界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方が標準リパーゼより向上した祖先型リパーゼを選択する。祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性が、同条件下の標準リパーゼのリパーゼ活性より高ければ、好ましくは５％、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２０％高ければ、該祖先型リパーゼを界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して耐性を有するリパーゼと評価でき、該祖先型リパーゼを目的のリパーゼとして選択することができる。また、祖先型リパーゼの界面活性剤存在下の洗浄力が、同条件下の標準リパーゼの洗浄力より高ければ、好ましくは５％、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２０％高ければ、該祖先型リパーゼを界面活性剤存在下での優れた洗浄力を有するリパーゼと評価でき、該祖先型リパーゼを目的のリパーゼとして選択することができる。また、祖先型リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性が、同条件下の標準リパーゼのリパーゼ活性より高く、好ましくは５％、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２０％高く、かつ祖先型リパーゼの界面活性剤存在下の洗浄力が、同条件下の標準リパーゼの洗浄力より高ければ、好ましくは５％、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２０％高ければ、該祖先型リパーゼを界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して耐性を有し、かつ界面活性剤存在下での優れた洗浄力を有するリパーゼと評価でき、該祖先型リパーゼを目的のリパーゼとして選択することができる。ここで、標準リパーゼとしては、公知のリパーゼを用いることができる。種々の産業用リパーゼが文献から公知であり、配列番号２、４、６又は８で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼなどが標準リパーゼとして好適に用いられる。好ましい一例では、標準リパーゼは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである。あるいは、標準リパーゼとして、一定の界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び一定の界面活性剤存在下の洗浄力を有するモデルリパーゼを設定し、これを用いることもできる。モデルリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力は、探索したいリパーゼの性能を基準に適宜設定すればよい。モデルリパーゼの例としては、界面活性剤としてＳＤＳを用い、上記手順でリパーゼ活性を測定した場合の相対活性が７％、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用い、上記手順でリパーゼ活性を測定した場合の相対活性が３０％、モデル洗浄液を用い、上記手順でリパーゼ活性を測定した場合の相対活性が３０％、上記手順で洗浄力を測定した場合の洗浄力の指標であるΔＡ５００が０．０５であるリパーゼが挙げられる。
斯くして選択されるリパーゼは、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、
設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
を含むリパーゼの探索方法。
＜２＞界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方が標準リパーゼより向上したリパーゼを選択する工程をさらに含む、＜１＞記載の方法。
＜３＞リパーゼ配列群が、バクテリアリパーゼ配列群であり、好ましくはバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼ配列を少なくとも１配列含む配列群であり、より好ましくはバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼの配列群であり、さらに好ましくはＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列群である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞設計した祖先配列からＱＧＬＰクレードに属する祖先配列を選択する工程をさらに含み、選択した祖先配列からなるリパーゼが界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程に供されるものである、＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列が、配列番号５７で示されるモチーフを含む配列であるか、図１に示すＱＧＬＰクレードのＨＭＭプロファイルに対する配列全長のＨＭＭスコアが３５０以上の配列である、＜４＞記載の方法。
＜６＞ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列がＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列に相当する、＜４＞又は＜５＞記載の方法。
＜７＞Ｐｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列が、図２に示すＰｒｏｔｅｕｓ/ＹｅｒｓｉｎｉａクレードのＨＭＭプロファイルに対する配列全長のＨＭＭスコアが６００以上の配列である、＜６＞記載の方法。
＜８＞界面活性剤が、スルホコハク酸エステル又はその塩、ＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００から選択される少なくとも１種であり、好ましくはＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００から選択される少なくとも１種である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞標準リパーゼが、公知のリパーゼであり、好ましくは配列番号２、４、６又は８で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼであり、より好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、＜１＞～＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞洗浄力が低温での洗浄力である、＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞洗浄力が４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、かつ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での洗浄であるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での洗浄である、＜１０＞記載の方法。
＜１２＞設計した祖先配列を改変して改変祖先配列を設計する工程、
設計した改変祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
をさらに含む、＜１＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方が標準リパーゼより向上したリパーゼを選択する工程をさらに含む、＜１２＞記載の方法。
＜１４＞改変が、祖先配列におけるアミノ酸残基の置換、欠失、付加、若しくは挿入、又は祖先配列のキメラ化であり、好ましくは祖先配列におけるアミノ酸残基の置換又は祖先配列のキメラ化である、＜１２＞又は＜１３＞記載の方法。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１：Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、Ｌｉｐｒ１３８及びＴＬＬの評価
（１）リパーゼ発現プラスミドの構築
リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９の配列番号２６に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含むＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子全長に対応する領域に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を導入することでｓｐｏＶＧプロモーターに連結されたリパーゼ発現コンストラクトを構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、Ｌｉｐｒ１３８（それぞれ配列番号３、５、７のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号４、６、８のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３９、ｐＨＹ－ＰｖＬｉｐ、ｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３８を構築した。枯草菌ａｍｙＥ遺伝子に由来するシグナル配列（配列番号５５のポリヌクレオチド、配列番号５６のアミノ酸配列をコードする）がＮ末端側に付与されたリパーゼＴＬＬ遺伝子（配列番号１のポリヌクレオチド、配列番号２のアミノ酸配列をコードする、以下ａｍｙＥｓｉｇ-ＴＬＬと称する）についても同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によってｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ-ＴＬＬを構築した。
（２）リパーゼ溶液の調製
リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、２日間培養した後、リパーゼを含む培養上清を遠心分離により回収した。培養上清を透析によって１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンド強度からリパーゼ濃度を定量した。
（３）界面活性剤溶液中での活性測定
オクタン酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を基質として用いた。リパーゼの作用による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）添加したものを界面活性剤溶液として用いた。２ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液５μＬと界面活性剤溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とした。各リパーゼについて、界面活性剤溶液の代わりに２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた際の活性値（バッファー中での活性）で界面活性剤溶液中での活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた。
図３及び４に結果を示す。ＴＬＬ、並びに特許文献１、２及び３において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８は、ＳＤＳの存在下で著しく活性が阻害された。同様に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の存在下でも著しく活性が阻害された。
（４）モデル洗浄液中での活性測定
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。モデル洗浄液として、表１の水性媒体を用いた。４ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液２μＬと試験液（モデル洗浄液又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。３１～５００μＭの４－ニトロフェノールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１０μＬを各試験液１００μＬと混合し、４０５ｎｍの吸光度を測定し検量線を作成した。各試験液の検量線とΔＯＤ／ｍｉｎの値から、一分間あたりの４－ニトロフェノールの遊離速度（μＭ／ｍｉｎ）を活性値として算出した。各リパーゼについて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を試験液とした際の活性値（バッファー中での活性）で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた。
Figure 2024034839000001
結果を図５に示す。ＴＬＬ、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８はモデル洗浄液中で著しく活性が阻害され、活性が確認できなかった。Ｌｉｐｒ１３９は活性が検出されたが、ＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００存在下よりもさらに活性が阻害されていた。
（５）モデル洗浄液中での洗浄評価
牛脂（ＳＩＧＭＡ，０３－０６６０）とナタネ油（ＳＩＧＭＡ，２３－０４５０）を重量比９：１で混合し、３倍量のクロロホルムに溶解した後に０．２ｗｔ％のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとした。ポリプロピレン製の９６穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを１０μＬずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとした。
表１記載のモデル洗浄液に、１／１００容量の２４０ｐｐｍのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とした。汚れプレートに洗浄液を３００μＬずつ緩やかに添加し、室温（約２２℃）で１５分間静置して浸漬洗浄を行った。底部の汚れに触れないように洗浄液を１００μＬずつ分取し、新しい９６穴プレートに移した。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、５００ｎｍの吸光度（Ａ５００）を測定した。洗浄後のＡ５００から洗浄前のＡ５００を差し引いた値ΔＡ５００は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。
各リパーゼの洗浄力ΔＡ５００を図６に示す。上記（４）においてモデル洗浄液中での活性が最も高かったＬｉｐｒ１３９は、ＴＬＬ、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８と比較してモデル洗浄液中で高い洗浄力を示した。
実施例１：Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレード近縁の現存するリパーゼと祖先型リパーゼの評価
（１）祖先型リパーゼの設計
Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８に相同性のあるバクテリアリパーゼ配列群を用いて系統解析を行った。該バクテリアリパーゼ配列群の各リパーゼ配列は、図７の系統樹の各末端節に相当する。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１のデフォルトパラメーターを用いてマルチプルアラインメントを構築したのち、ｔｒｉｍＡｌ ｖ１．４．ｒｅｖ１５によって保存領域を抽出し、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ－ＮＧ ｖ０．１．７を用いて進化モデルを選択した。系統解析にはＩＱ－ＴＲＥＥ ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．３を用い、進化モデルにはＬＧ＋Ｉ＋Ｇ４を指定した。祖先配列の推定にはＧＲＡＳＰ（https://github.com/bodenlab/GRASP）を用いた。Ｆｉｇｔｒｅｅ（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/FigTree/）を用いて可視化した系統樹を図７に示す。
Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８（図７のアスタリスク）はＰｒｏｔｅｕｓ属細菌やＹｅｒｓｉｎｉａ属細菌に由来するリパーゼ配列を含むＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属していた。系統樹より、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列群Ｇｒｏｕｐ１（Ｌｉｐ５、Ｌｉｐ６、Ｌｉｐ７、Ｌｉｐ８、図７の黒の矢じり）と、その祖先に相当する祖先配列群Ｇｒｏｕｐ２（Ａｎｃ１、Ａｎｃ４，Ａｎｃ５、Ａｎｃ６、Ａｎｃ７、Ａｎｃ８、図７の黒丸）、及びＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードには属さない現存配列群Ｇｒｏｕｐ３（Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４、図７の白の矢じり）と、その祖先に相当する祖先配列群Ｇｒｏｕｐ４（Ａｎｃ２、Ａｎｃ３、図７の白丸）を無作為に選択した。
（２）リパーゼ発現プラスミドの構築
参考例１の（１）と同様の方法で、人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４、Ｌｉｐ５、Ｌｉｐ６、Ｌｉｐ７、Ｌｉｐ８、Ａｎｃ１、Ａｎｃ２、Ａｎｃ３、Ａｎｃ４、Ａｎｃ５、Ａｎｃ６、Ａｎｃ７、Ａｎｃ８（それぞれ配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐ１、ｐＨＹ－Ｌｉｐ２、ｐＨＹ－Ｌｉｐ３、ｐＨＹ－Ｌｉｐ４、ｐＨＹ－Ｌｉｐ５、ｐＨＹ－Ｌｉｐ６、ｐＨＹ－Ｌｉｐ７、ｐＨＹ－Ｌｉｐ８、ｐＨＹ－Ａｎｃ１、ｐＨＹ－Ａｎｃ２、ｐＨＹ－Ａｎｃ３、ｐＨＹ－Ａｎｃ４、ｐＨＹ－Ａｎｃ５、ｐＨＹ－Ａｎｃ６、ｐＨＹ－Ａｎｃ７、ｐＨＹ－Ａｎｃ８を構築した。
（３）各リパーゼの評価
参考例１の（２）と同様の方法で、リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、リパーゼを含む培養上清を回収、透析した。Ｇｒｏｕｐ１、２、３及び４の配列群について、枯草菌上清中のＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの有無を確認した。確認できたものについては、参考例１の（３）、（４）及び（５）と同様の方法で、界面活性剤（ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）溶液中での相対活性、モデル洗浄液中での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力を評価した。結果を図８～１１にＬｉｐｒ１３９の結果と共に示し、表２にまとめる。
Figure 2024034839000002
Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列群であるＧｒｏｕｐ１は、同じく現存配列群であるＧｒｏｕｐ３と比較してＳＤＳ－ＰＡＧＥでバンドが確認できる割合、つまり枯草菌での異種発現成功率が高かった。異種発現が成功したものの中には、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性がＬｉｐｒ１３９より高いものも存在していたが、ＳＤＳ溶液での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００がＬｉｐｒ１３９より高いものは存在しなかった。また、一定の基準値でみると、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性がそれぞれ７％、３０％、３０％を超えるものは存在しなかった。また、モデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００が０．０５を超えるものも存在しなかった。
一方、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先に相当する祖先配列群Ｇｒｏｕｐ２では、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列群であるＧｒｏｕｐ１より高い異種発現成功率を示した。加えて、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００がＬｉｐｒ１３９を超えるものがそれぞれＧｒｏｕｐ１、３より高い確率で取得できた。一定の基準値でみると、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性がそれぞれ７％、３０％、３０％を超えるもの、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００が０．０５を超えるものがそれぞれ６配列中４配列以上の高い確率で取得できた。Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先には相当しない祖先配列であるＧｒｏｕｐ４では、異種発現成功率は高かったものの、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００がＬｉｐｒ１３９より高い配列が取得できる確率は現存配列群であるＧｒｏｕｐ１、３と同等であった。一定の基準値でみると、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性がそれぞれ７％、３０％、３０％を超えるもの、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００が０．０５を超えるものは存在しなかった。
以上より、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先に相当する配列を設計し、評価することで、界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄効果を示すリパーゼを高効率に取得できることが示された。種々の界面活性剤溶液中での相対活性は洗浄力とよく相関しており、少なくともいずれか一方を評価することで有用なリパーゼを選抜することができる。
実施例２：ＱＧＬＰクレードに属する祖先型リパーゼの評価
（１）祖先型リパーゼの設計
バクテリアリパーゼのサブグループＩ．１及びＩ．２に含まれるより遠縁のリパーゼを含む配列群を用いて系統解析を行った。該リパーゼ配列群の各リパーゼ配列は、図１２の系統樹の各末端節に相当する。図１２のＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列群のＮＣＢＩアクセッション番号は、後述の表４に示す。ＭＡＦＦＴ－ＤＡＳＨ（https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/）を用いてマルチプルアラインメントを構築したのち、ｔｒｉｍＡｌ ｖ１．４．ｒｅｖ１５によって保存領域を抽出し、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ－ＮＧ ｖ０．１．７を用いて進化モデルを選択した。系統解析にはＩＱ－ＴＲＥＥ ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．３を用い、進化モデルにはＬＧ＋Ｇ４＋Ｆを指定した。祖先配列の推定にはＧＲＡＳＰを用いた。Ｆｉｇｔｒｅｅを用いて可視化した系統樹を図１２に示す。
Ｐｒｏｔｅｕｓ／ＹｅｒｓｉｎｉａクレードはＱＧＬＰクレードに含まれていた。ＱＧＬＰクレードの中で実施例１のＧｒｏｕｐ２よりもさらに祖先的な配列群を評価した。図１２の系統樹より、ＱＧＬＰクレードに属し、かつＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先に相当する祖先配列群Ｇｒｏｕｐ５（Ａｎｃ９、Ａｎｃ１０、Ａｎｃ１１、Ａｎｃ１２、図１２中の黒丸）と、ＱＧＬＰクレードに属するが、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先には相当しない祖先配列群Ｇｒｏｕｐ６（Ａｎｃ１３、Ａｎｃ１４、Ａｎｃ１５、図１２中の白丸）を無作為に選択した。
参考例１の（１）と同様の方法で、人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Ａｎｃ９、Ａｎｃ１０、Ａｎｃ１１、Ａｎｃ１２、Ａｎｃ１３、Ａｎｃ１４、Ａｎｃ１５（それぞれ配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－Ａｎｃ９、ｐＨＹ－Ａｎｃ１０、ｐＨＹ－Ａｎｃ１１、ｐＨＹ－Ａｎｃ１２、ｐＨＹ－Ａｎｃ１３、ｐＨＹ－Ａｎｃ１４、ｐＨＹ－Ａｎｃ１５を構築した。
（２）各リパーゼの評価
参考例１の（２）と同様の方法で、リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、リパーゼを含む培養上清を回収、透析した。Ｇｒｏｕｐ５及び６の配列群について、枯草菌上清中のＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの有無を確認した。確認できたものについては、参考例１の（３）、（４）及び（５）と同様の方法で、界面活性剤（ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）溶液中での相対活性、モデル洗浄液中での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力を評価した。結果を図１３～１６にＬｉｐｒ１３９の結果と共に示し、表３にまとめる。
Figure 2024034839000003
ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列群Ｇｏｕｒｐ５及び６は、実施例１の現存配列群であるＧｒｏｕｐ１及び３と比較して高い異種発現成功率を示した。加えて、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００がＬｉｐｒ１３９より高いものがＧｒｏｕｐ１及び３と比較して高い確率で取得できた。一定の基準値でみても同様に、、ＳＤＳ溶液、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液、モデル洗浄液中での相対活性がそれぞれ７％、３０％、３０％を超えるもの、及びモデル洗浄液中での洗浄力の指標ΔＡ５００が０．０５を超えるものが高い確率で取得できた。特にＱＧＬＰクレードに属し、かつＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先に相当する祖先配列群Ｇｒｏｕｐ５では、評価した全ての配列でＬｉｐｒ１３９より高く、かつ一定の基準値より高い界面活性剤溶液中での相対活性と、モデル洗浄液中での洗浄力を示した。
よって、界面活性剤による活性阻害に対して耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄効果を示すリパーゼを高効率に取得するには、ＱＧＬＰクレード属する祖先配列を設計し、評価するのがよいことが示された。中でも特に、ＱＧＬＰクレードに含まれ、かつＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する現存配列の祖先に相当する祖先配列を設計し、評価するのがよいことが示された。
参考例２：ＨＭＭプロファイルを用いたＱＧＬＰクレード、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼ配列群の特定
（１）ＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列群の特定
表４のリパーゼ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＱＧＬＰ．ｆａｓｔａを用意した。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１でｍａｆｆｔ ――ａｕｔｏ ＱＧＬＰ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａ＞ＱＧＬＰ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、マルチプルアラインメントを構築した。次に、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２を用いて、ｈｍｍｂｕｉｌｄ ――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅ ＱＧＬＰ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ ＱＧＬＰ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、図１に示すＨＭＭプロファイルを作成し、さらにｈｍｍｐｒｅｓｓ ＱＧＬＰ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍのコマンドを実行してバイナリ化した。次に、配列番号２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４で表される祖先配列をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＡｎｃ１－１５．Ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＱＧＬＰ．ｔｂｌｏｕｔ ＱＧＬＰ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ａｎｃ１－１５．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＱＧＬＰクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対して祖先配列の相同性検索を行った。結果の例を表５に示す。Ａｎｃ１－１５は全て３５０以上のＨＭＭスコアを持っており、ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列であると言える。このように任意のリパーゼ配列がＱＧＬＰクレードに属するリパーゼ配列かどうかを確認することができる。
Figure 2024034839000004
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Figure 2024034839000006
Figure 2024034839000007
Figure 2024034839000008
Figure 2024034839000009
（２）Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼ配列群の特定
表６のリパーゼ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ．ｆａｓｔａを用意した。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１でｍａｆｆｔ ――ｌｏｃａｌｐａｉｒ ――ｍａｘｉｔｅｒａｔｅ １６ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ．ｆａｓｔａ＞ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、マルチプルアラインメントを構築した。次に、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２を用いて、ｈｍｍｂｕｉｌｄ ――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、図２に示すＨＭＭプロファイルを作成し、さらにｈｍｍｐｒｅｓｓ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍのコマンドを実行してバイナリ化した。次に、図１２記載のリパーゼ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＬｉｐａｓｅ．ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ．ｔｂｌｏｕｔ ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ｌｉｐａｓｅ．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対して現存配列の相同性検索を行った。結果の例を表７に示す。ＷＰ＿２１０８１３８２６．１、Ｌｉｐｒ１３９、ＷＰ＿０２６８２２４９７．１は全長で６００以上のＨＭＭスコアを有しており、Ｐｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属する。一方で、同スコアが６００未満であるＷＰ＿０１９６５０４４２．１やＷＰ＿１６７４０４７３２．１はＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属さないと言える。図７や図１２においてＰｒｏｔｅｕｓＹｅｒｓｉｎｉａクレードとされている現存配列は全て６００以上のスコアを持つ。このように任意のリパーゼ配列がＰｒｏｔｅｕｓ／Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼ配列かどうかを確認することができる。
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Figure 2024034839000011

Claims (8)

  1. リパーゼ配列群を用いて祖先配列設計法によりリパーゼの祖先配列を設計する工程、
    設計した祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
    測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
    を含むリパーゼの探索方法。
  2. リパーゼ配列群がバクテリアリパーゼ配列群である、請求項１記載の方法。
  3. リパーゼ配列群がバクテリアリパーゼのサブファミリーＩ．１又はサブファミリーＩ．２に属するリパーゼ配列を少なくとも１配列含む、請求項１記載の方法。
  4. 設計した祖先配列からＱＧＬＰクレードに属する祖先配列を選択する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
  5. ＱＧＬＰクレードに属する祖先配列がＰｒｏｔｅｕｓ/Ｙｅｒｓｉｎｉａクレードに属するリパーゼの現存配列の祖先配列に相当する、請求項４記載の方法。
  6. 洗浄力が低温での洗浄力である、請求項１記載の方法。
  7. 設計した祖先配列を改変して改変祖先配列を設計する工程、
    設計した改変祖先配列からなるリパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方を測定する工程、及び
    測定した結果を標準リパーゼの界面活性剤存在下のリパーゼ活性及び界面活性剤存在下の洗浄力の少なくとも一方と比較する工程、
    をさらに含む、請求項１記載の方法。
  8. 改変が祖先配列におけるアミノ酸置換又は祖先配列のキメラ化である、請求項７記載の方法。
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