WO2023199945A1 - 新規リパーゼ - Google Patents
新規リパーゼ Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023199945A1 WO2023199945A1 PCT/JP2023/014862 JP2023014862W WO2023199945A1 WO 2023199945 A1 WO2023199945 A1 WO 2023199945A1 JP 2023014862 W JP2023014862 W JP 2023014862W WO 2023199945 A1 WO2023199945 A1 WO 2023199945A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- lipase
- identity
- seq
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 306
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 303
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 300
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 300
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 395
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 91
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 38
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 38
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 claims description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 33
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 68
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 32
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 27
- -1 sulfosuccinic acid ester Chemical class 0.000 description 27
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 24
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 19
- ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N Sulfobutanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(C(O)=O)S(O)(=O)=O ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 11
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 4
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 4
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 4
- AENHALKKLSPWBC-UHFFFAOYSA-N 2,2-bis(2-propylheptyl)-3-sulfobutanedioic acid Chemical compound CCCCCC(CCC)CC(C(O)=O)(C(C(O)=O)S(O)(=O)=O)CC(CCC)CCCCC AENHALKKLSPWBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 3
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N Sudan III Chemical compound OC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N=NC(C=C1)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 FHNINJWBTRXEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 3
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940099373 sudan iii Drugs 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710166469 Endoglucanase Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 2
- 241001205929 Snodgrassella Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical class OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005529 alkyleneoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000323 aluminium silicate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical class OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000011086 high cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- FRPJTGXMTIIFIT-UHFFFAOYSA-N tetraacetylethylenediamine Chemical compound CC(=O)C(N)(C(C)=O)C(N)(C(C)=O)C(C)=O FRPJTGXMTIIFIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108700016332 Bacillus subtilis SpoVG Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000046135 Cedecea Species 0.000 description 1
- 241001443513 Cedecea sp. Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 241000963840 Chania multitudinisentens Species 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000019030 Enterobacillus tribolii Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000071349 Juncus subtilis Species 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N Lithium ion Chemical compound [Li+] HBBGRARXTFLTSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-O Methylammonium ion Chemical compound [NH3+]C BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229930182556 Polyacetal Natural products 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000982939 Proteus terrae Species 0.000 description 1
- 241001670039 Pseudomonas lundensis Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001227058 Snodgrassella alvi Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000063704 Yersinia aleksiciae Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 241001321500 Yersinia nurmii Species 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000288 alkali metal carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008041 alkali metal carbonates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052910 alkali metal silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001420 alkaline earth metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ZXVOCOLRQJZVBW-UHFFFAOYSA-N azane;ethanol Chemical compound N.CCO ZXVOCOLRQJZVBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001422 barium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013398 bayesian method Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N benzo[d]isothiazol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NSC2=C1 DMSMPAJRVJJAGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-O bis(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCC[NH2+]CCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N diphenyl ether Chemical compound C=1C=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 USIUVYZYUHIAEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PMPJQLCPEQFEJW-HPKCLRQXSA-L disodium;2-[(e)-2-[4-[4-[(e)-2-(2-sulfonatophenyl)ethenyl]phenyl]phenyl]ethenyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC=CC=C1\C=C\C1=CC=C(C=2C=CC(\C=C\C=3C(=CC=CC=3)S([O-])(=O)=O)=CC=2)C=C1 PMPJQLCPEQFEJW-HPKCLRQXSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002169 ethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003875 gradient-accelerated spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 108010059345 keratinase Proteins 0.000 description 1
- 238000004900 laundering Methods 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001416 lithium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- KFSJBNDOHHPTFF-UHFFFAOYSA-N manganese;pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Mn] KFSJBNDOHHPTFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010003855 mesentericopeptidase Proteins 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000011164 primary particle Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910000031 sodium sesquicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000018341 sodium sesquicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L sodium;oxido carbonate Chemical compound [Na+].[O-]OC([O-])=O MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical class [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 101150006127 tll gene Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-O triethanolammonium Chemical compound OCC[NH+](CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydrogen carbonate;carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC([O-])=O.[O-]C([O-])=O WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D17/00—Detergent materials or soaps characterised by their shape or physical properties
- C11D17/06—Powder; Flakes; Free-flowing mixtures; Sheets
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D17/00—Detergent materials or soaps characterised by their shape or physical properties
- C11D17/08—Liquid soap, e.g. for dispensers; capsuled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Definitions
- the present invention relates to a novel lipase.
- Lipases are useful in a variety of applications, including laundry detergents, dishwashing detergents, oil and fat processing, pulp processing, feed, and pharmaceutical intermediate synthesis. In cleaning, lipases contribute to the removal of oil-containing soils by hydrolyzing triglycerides to produce fatty acids.
- TLL lipase derived from Thermomyces lanuginosus
- LIPOLASE registered trademark
- Patent Document 1 discloses that lipase Lipr139 derived from Cedecea sp-16640 strain has superior cleaning performance compared to TLL.
- US Pat. No. 5,001,203 discloses variants of lipases from Proteus bacteria (hereinafter PvLip) that have improved cleaning performance when compared to one or more reference lipolytic enzymes.
- Patent Document 3 discloses that metagenome-derived lipase Lipr138 has superior cleaning performance compared to TLL.
- Lipr139, PvLip, and Lipr138 are lipases belonging to the same clade (Proteus/Yersinia clade) that includes lipases derived from Proteus and Yersinia bacteria.
- Non-Patent Document 1 Many of the lipases derived from Gram-negative bacteria require a lipase-specific chaperone for folding into an active form (Non-Patent Document 1), and there is a problem in inexpensive production by heterologous expression. It has been reported that co-expression of specific chaperones improves heterologous expression (Non-Patent Document 2), but the productivity is low and there are still major problems in inexpensive production by heterologous expression.
- bacterial lipases of the Proteus/Yersinia clade do not require specific chaperones and have an advantage in inexpensive production through heterologous expression (Non-Patent Documents 3, 4). As described above, bacterial lipases of the Proteus/Yersinia clade have excellent potential as cleaning enzymes in terms of both their suitability for cleaning and their low cost production.
- Patent Document 1 Japanese Translation of PCT Publication No. 2015-523078 (Patent Document 2) International Publication No. 2020/046613 (Patent Document 3) Japanese Patent Publication No. 2015-525248 (Non-Patent Document 1) Hobson, Audrey H., et al . Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
- Non-patent Document 2 Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
- Non-patent Document 3 Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
- Non-patent Document 4 Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
- the present invention relates to the following 1) to 6).
- Any of the following lipases A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 79% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence having at least 76% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence having at least 81% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence having at least 96% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence having at least 90%
- Lipase activity of each lipase in surfactant solution Lipase activity in model washing solution containing surfactant for each lipase. Detergent power of each lipase in a model cleaning solution containing a surfactant. Phylogenetic analysis results of each lipase.
- lipase refers to triacylglycerol lipase (EC3.1.1.3), and refers to a group of enzymes that have the activity of hydrolyzing triglycerides to produce fatty acids. Lipase activity can be determined by measuring the rate of increase in absorbance associated with the release of 4-nitrophenol by hydrolysis of 4-nitrophenyl octoate. Specific procedures for measuring lipase activity are detailed in the Examples below.
- lipase estimated to have been possessed by an ancestral organism refers to the lipase derived from the amino acid sequence of lipase of each organism derived from a common ancestor, based on a rooted phylogenetic tree representing protein evolution. It refers to a lipase (also simply referred to as ancestral lipase) consisting of an amino acid sequence that is presumed to have been possessed by a common ancestor.
- Ancestral lipases are obtained by obtaining lipase homolog sequences from public databases, etc., performing multiple alignment using the obtained homolog sequences, then creating a rooted phylogenetic tree, and running the Ancestral Sequence Reconstruction (ASR) program. It can be designed by deducing the amino acid sequence of the common ancestor lipase using this method.
- ASR Ancestral Sequence Reconstruction
- the created multiple alignment is appropriately trimmed by a program such as GBLOCKS (Castresana, 2000) or trimAl (Capella-Gutierrez et al., 2009), and then used for estimating a phylogenetic tree.
- GBLOCKS Basesana, 2000
- trimAl Capella-Gutierrez et al., 2009
- the most parsimonious method, the Bayesian method, and the maximum likelihood method can be used to estimate the phylogenetic tree, such as MrBayes (Ronquist et al., 2012), BEAST (Bouckaert et al., 2019), FastTree (Price et al.
- Programs such as PhyML (Guindon et al., 2010), RAxML (Stamatakis et al., 2014), and IQ-TREE (Nguyen et al., 2015) can be used.
- Appropriate evolutionary models for use in phylogenetic tree estimation can be selected using programs such as modeltest-ng (Darriba, D. et al., 2020) and ModelFinder (Kalyaanamoorthy et al., 2017).
- Dedicated programs can be used for ancestral array design, and it can be used for FASTML (PUPKO ET Al., 2000), PROTASR2 (ARENAS M And Bastolla, 2020), GRASP (GABRIEL ET AL. 2019).
- FASTML PUPKO ET Al., 2000
- PROTASR2 ARENAS M And Bastolla, 2020
- GRASP GABRIEL ET AL. 2019
- phylogenetic tree estimation programs include ancestral sequence design as part of their functions, and programs such as PAML (Yang, 1997), RAxML, and IQ-TREE can also be used.
- MEGA Trimura et al., 2021
- the "Proteus/Yersinia clade” refers to a clade containing lipases (e.g., SEQ ID NOs: 4 and 12) derived from bacteria of the genus Proteus and Yersinia on a rooted phylogenetic tree; , 6, 8, 10, 12 and 46 are all extant lipase sequences belonging to the Proteus/Yersinia clade.
- lipases e.g., SEQ ID NOs: 4 and 12
- the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis using a search homology program of 12 with Unit size to compare (ktup) set to 2.
- operable linkage between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
- upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream of the gene in the direction of transcription.
- a gene located downstream of a promoter means that the gene is located on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
- upstream of the gene means that the gene is located on the 5' side of the promoter in the DNA sense strand. means the area on the side.
- lipase It is known that the activity of lipase is inhibited by surfactants contained in cleaning compositions. As far as the present inventors actually verified, among the known lipases whose suitability for washing has been disclosed, all of TLL, Lipr139 and PvLip were significantly inhibited in activity by the coexistence of a surfactant. Inhibition of activity by surfactants is a major problem common to cleaning lipases. Furthermore, lipases are often used together with surfactants not only in cleaning applications but also in industrial applications such as pulp processing, and inhibition of activity by surfactants is a problem for all industrial lipases. Therefore, there is a need for a lipase that is less inhibited by surfactants and exhibits a high cleaning effect.
- the lipase of the present invention has significantly high resistance to activity inhibition by surfactants, and exhibits excellent cleaning effects even in the presence of surfactants.
- the lipase of the present invention is any of the following lipases: A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 79% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence having at least 76% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence having at least 81% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence having at least 96% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 or an amino acid sequence
- the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 and 44 belong to the Proteus/Yersinia clade.
- This is a novel lipase sequence that is presumed to have been possessed by the ancestor of the bacteria from which the existing lipases belong to.
- ancestral enzymes are known to exhibit properties such as high heat resistance and a high optimum temperature, but until now, their properties related to activity inhibition by surfactants and properties related to cleaning effects have not been known at all. It was completely unexpected that the lipase of the present invention has significantly high resistance to inhibition of lipase activity by surfactants and exhibits significantly high detergency even in the presence of surfactants.
- Amino acid sequences having at least 79% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Examples include lipases consisting of an amino acid sequence having the following.
- Amino acid sequences having at least 81% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Examples include lipases consisting of an amino acid sequence having the following.
- Amino acid sequences having at least 83% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 96% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, specifically, at least 96% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22,
- Examples include lipases having amino acid sequences having an identity of preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
- Amino acid sequences having at least 96% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Examples include lipases consisting of an amino acid sequence having the following.
- Amino acid sequences having at least 83% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Amino acid sequences having at least 90% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 82% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, a lipase having at least 83% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, specifically, 82% or more, Preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more.
- lipases consisting of an amino acid sequence having the following.
- Amino acid sequences having at least 82% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Amino acid sequences having at least 73% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
- Amino acid sequences having at least 73% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
- Amino acid sequences having at least 79% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Amino acid sequences having at least 85% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
- Amino acid sequences having at least 73% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
- Amino acid sequences having at least 71% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
- Amino acid sequences having at least 72% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- Amino acid sequences having at least 70% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
- amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted, or added refers to 1 to 30, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, and even more preferably 5 or less. Examples include amino acid sequences in which amino acids are deleted, inserted, substituted, or added.
- amino acid sequence having at least 79% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and at least an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18.
- amino acid sequence with 81% identity an amino acid sequence with at least 83% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 an amino acid sequence with at least 96% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22
- amino acid sequence having at least 83% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 and at least an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28.
- amino acid sequence with 82% identity an amino acid sequence with at least 73% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, an amino acid sequence with at least 73% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32, An amino acid sequence having at least 79% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34, an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, and at least an amino acid sequence having at least 85% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
- An amino acid sequence with 73% identity, an amino acid sequence with at least 71% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40, an amino acid sequence with at least 72% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 42, or Lipases consisting of an amino acid sequence having at least 70% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44 include, for example, SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, Artificially produced mutants of lipase consisting of the amino acid sequence shown by 36, 38, 40, 42, or 44 can be mentioned.
- the mutant is, for example, a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 or 44.
- Mutations are introduced into the cells using known mutagenesis methods such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis, and the gene with the mutation is expressed to produce a protein with the desired lipase activity. It can be manufactured by selecting. Procedures for creating such variants are well known to those skilled in the art.
- the lipase of the present invention has an amino acid sequence different from conventionally isolated or purified lipases and proteins predicted as triacylglycerol lipase in the NCBI protein sequence database.
- Conventionally isolated or purified lipases include, for example, lipase TLL derived from Thermomyces lanuginosus (SEQ ID NO: 48), Cedecea sp.
- Lipase Lipr139 (SEQ ID NO: 2) derived from -16640 strain, lipase derived from a Proteus bacterium (hereinafter referred to as PvLip, SEQ ID NO: 4) disclosed as a parent enzyme of a group of lipase mutants suitable for washing in Patent Document 2.
- metagenome-derived lipase Lipr138 (SEQ ID NO: 46), which is disclosed as a lipase suitable for washing in Patent Document 3, and the like.
- proteins estimated as triacylglycerol lipase in the NCBI protein sequence database include the protein with accession number WP_123598507.1 (hereinafter referred to as PfLip, SEQ ID NO: 6) and the protein with accession number WP_115457195.1 (hereinafter referred to as PfLip).
- Proteins with accession number WP_135495634.1 (hereinafter referred to as EspLip, SEQ ID NO: 10), protein with accession number WP_005161363.1 (hereinafter referred to as YeLip, SEQ ID NO: 12), etc. Can be mentioned. The enzymatic properties of these proteins registered in this database have not been reported so far.
- AncLip1 is derived from Pseudomonas sp., which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_131062716.1. shows 78% amino acid sequence identity with the derived lipase.
- AncLip2 shows 75% amino acid sequence identity with the lipase from Proteus terrae registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_109394219.1.
- AncLip3 shows 80% amino acid sequence identity with lipase from Enterobacillus tribolii, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_115457195.1.
- AncLip4 exhibits 82% amino acid sequence identity with lipase from Serratia, registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_025122441.1.
- AncLip5 shows 95% amino acid sequence identity with the lipase from Yersinia aleksiciae, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_050126899.1.
- AncLip6 shows 82% amino acid sequence identity with lipase from Enterobacteriaceae, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_045783583.1.
- AncLip7 exhibits 89% amino acid sequence identity with lipase from Chania multitudinisentens, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_037407093.1.
- AncLip8 shows 81% amino acid sequence identity with the lipase from Serratia marcescens registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_033635162.1.
- AncLip9 shows 72% amino acid sequence identity with the lipase from Snodgrassella alvi, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_100141403.1.
- AncLip10 exhibits 72% amino acid sequence identity with the lipase from Yersinia nurmii registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_049600386.1.
- AncLip11 shows 78% amino acid sequence identity with the lipase from Yersinia urmii registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_049600386.1.
- AncLip12 exhibits 84% amino acid sequence identity with lipase from Yersinia enterocolitica, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_057631122.1.
- AncLip13 shows 72% amino acid sequence identity with lipase from Snodgrassella, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_025329791.1.
- AncLip14 shows 70% amino acid sequence identity with the lipase from Serratia marcescens registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_033635162.1.
- AncLip15 shows 71% amino acid sequence identity with lipase from Snodgrassella, which is registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_025329791.1.
- AncLip16 shows 69% amino acid sequence identity with the lipase from Pseudomonas lundensis registered in the NCBI protein sequence database as accession number WP_097192271.1.
- the lipase of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 or 44. More preferably, it is a lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 or 42.
- the lipase of the present invention can be produced, for example, by expressing the polynucleotide encoding the lipase of the present invention.
- the lipase of the present invention can be produced from a transformant into which a polynucleotide encoding the lipase of the present invention has been introduced.
- a polynucleotide encoding the lipase of the present invention or a vector containing the same is introduced into a host to obtain a transformant, and the transformant is cultured in an appropriate medium, the polynucleotide can be introduced into the transformant.
- the lipase of the present invention is produced from the polynucleotide encoding the lipase of the present invention.
- the lipase of the present invention can be obtained by isolating or purifying the produced lipase from the culture.
- the polynucleotide encoding the lipase of the present invention includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 79% identity thereto, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence having at least 76% identity therein.
- polynucleotide encoding the lipase of the present invention may be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or may be cDNA or chemically synthesized DNA without introns.
- a polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be synthesized chemically or genetically based on the amino acid sequence of the lipase.
- the polynucleotide can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the lipase of the present invention described above.
- a nucleic acid synthesis contract service eg, provided by Medical and Biological Research Institute, Genscript, etc.
- the synthesized polynucleotide can also be amplified by PCR, cloning, etc.
- the polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be mutated by a known mutagenesis method such as the ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis described above on the polynucleotide synthesized by the above procedure. It can be produced by introducing.
- a polynucleotide encoding a lipase of the present invention may be a polynucleotide of SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 or 43. It can be obtained by introducing a mutation using a known method, expressing the resulting polynucleotide, examining lipase activity, and selecting a polynucleotide encoding a protein having the desired lipase activity.
- Site-specific mutations can be introduced into polynucleotides using any method such as the inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "New Genetic Engineering Handbook, Revised 4th Edition,” Yodosha, p. 82-88). This can be done by If necessary, use Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit or QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Various commercially available site-directed mutagenesis kits such as Kit can also be used.
- any method such as the inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "New Genetic Engineering Handbook, Revised 4th Edition," Yodosha, p. 82-88). This can be done by If necessary, use Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit or QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Various commercially available site-directed mutagenesis kits such as Kit can also be used.
- a polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be incorporated into a vector.
- the type of vector containing the polynucleotide is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector.
- the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a bacterium of the genus Bacillus (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a vector capable of amplifying the introduced gene in a bacterium of the genus Bacillus.
- shuttle vectors which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the lipase of the present invention.
- preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No.
- pHY300PLK expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: Shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); pUB110 (J Bacteriol, 1978, 134:318-329), pTA10607 (Plasmid, 1987, 18:8-1) 5) etc.
- Examples include plasmid vectors that can be used to transform bacteria belonging to the genus Bacillus.
- plasmid vectors derived from E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
- E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, p
- the above-mentioned vector may include a DNA region containing a DNA replication initiation region or an origin of replication.
- a promoter region, a terminator region, or an expressed protein for initiating transcription of the gene is placed upstream of the polynucleotide encoding the lipase of the present invention (i.e., the lipase gene of the present invention).
- a control sequence such as a secretory signal region for secretion to the outside may be operably linked.
- the term "operably linked" between a gene and a control sequence means that the gene and the control region are arranged such that the gene can be expressed under the control of the control region. means.
- control sequences such as the promoter region, terminator region, secretion signal region, etc. are not particularly limited, and commonly used promoters and secretion signal sequences can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
- suitable examples of control sequences that can be incorporated into vectors include Bacillus sp.
- Examples include the cellulase gene promoter and secretion signal sequence of the KSM-S237 strain.
- the vector of the present invention may further incorporate a marker gene (for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.) for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced. You can leave it there.
- a marker gene for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.
- a gene encoding a required nutrient synthesizing enzyme may be incorporated into the vector as a marker gene.
- a gene related to the metabolism may be incorporated into the vector as a marker gene.
- An example of such a metabolism-related gene is an acetamidase gene for utilizing acetamide as a nitrogen source.
- the above polynucleotide encoding the lipase of the present invention and the control sequence and marker gene can be linked by a method known in the art such as SOE (splicing by overlap extension)-PCR method (Gene, 1989, 77:61-68). This can be done by any method. Procedures for introducing ligated fragments into vectors are well known in the art.
- the transformed cells of the present invention can be transformed by introducing into a host a vector containing a polynucleotide encoding the lipase of the present invention, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the lipase of the present invention into the genome of the host. Obtainable.
- Examples of host cells include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
- bacteria include Escherichia coli, bacteria belonging to the genus Staphylococcus, genus Enterococcus, genus Listeria, and genus Bacillus.
- Bacillus bacteria for example, Bacillus subtilis Marburg No. 168 or mutant strains thereof) are preferred.
- Bacillus subtilis mutants include J. subtilis mutants. Biosci. Bioeng. , 2007, 104(2): 135-143, and the protease 9-deficient strain KA8AX, as well as Biotechnol. Lett.
- the D8PA strain is a protease octad-deficient strain with improved protein folding efficiency.
- filamentous fungi include Trichoderma, Aspergillus, Rhizopus, and the like.
- a method for introducing the vector into the host methods commonly used in the field, such as protoplast method and electroporation method, can be used. By selecting a strain into which the introduction has been properly carried out using marker gene expression, auxotrophy, etc. as indicators, it is possible to obtain the desired transformant into which the vector has been introduced.
- a fragment in which a polynucleotide encoding the lipase of the present invention, a control sequence, and a marker gene are linked can be directly introduced into the host genome.
- a DNA fragment is constructed by adding sequences complementary to the host's genome to both ends of the above-mentioned ligated fragment by SOE-PCR method, etc., and this is introduced into the host to create a gap between the host genome and the DNA fragment.
- a polynucleotide encoding the lipase of the present invention is introduced into the genome of the host.
- the thus obtained transformant into which the polynucleotide encoding the lipase of the present invention or the vector containing the same has been introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector will be expressed.
- a lipase of the invention is produced.
- the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of microorganism of the transformant.
- the lipase of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the lipase of the present invention or a transcription product thereof using a cell-free translation system.
- a "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
- the lipase of the present invention produced in the above-mentioned culture or cell-free translation system can be produced by conventional methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Isolation or purification can be achieved by using either alone or in appropriate combination. Proteins recovered from the culture may be further purified by known means.
- the thus obtained lipase of the present invention has significantly higher resistance to inhibition of lipase activity by surfactants than known proteins, and has significantly higher detergency even in the presence of surfactants. Show power.
- “high resistance” refers to a known protein, specifically a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12, or a lipase estimated to be a lipase in the NCBI protein sequence database. It means high resistance compared to proteins. Resistance to inhibition of lipase activity by detergents can be assessed using methods well known in the art.
- a lipase solution and a surfactant solution are mixed, a 4-nitrophenyl octoate solution, which is a substrate for lipase, is added to the mixture, and the absorbance change at 405 nm (OD/min) due to the release of 4-nitrophenol is measured. is measured, and the difference ⁇ OD/min from the blank is determined as the lipase activity value (lipase activity value in the surfactant solution).
- calculate the lipase activity value when a buffer is used instead of the surfactant solution (lipase activity value in the buffer) divide the lipase activity value in the surfactant solution by the lipase activity value in the buffer, and calculate 100.
- the multiplied value is calculated as relative activity (%). It can be determined that the higher the relative activity (%), the higher the resistance to inhibition of lipase activity by surfactants.
- the lipase of the present invention has a relative lipase activity (%) in a Triton X-100 solution (0.1% (w/v)) of preferably 20% or more, more preferably is 30% or more, more preferably 50% or more of lipase.
- “high detergency” refers to a known protein, specifically a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12, or a lipase estimated to be a lipase in the NCBI protein sequence database.
- Detergency refers to the ability to provide high detergency, eg, soil removal, in a laundering or washing process compared to proteins.
- Detergency can be assessed using methods well known in the art. For example, a cleaning solution containing lipase is added to a model stain containing a predetermined indicator substance (for example, a dye with high fat solubility such as Sudan III), and the stain is washed under predetermined conditions. A portion of the cleaning liquid is taken out, and the concentration of the indicator substance in the model soil solubilized in the cleaning liquid through the cleaning process is measured, for example, by absorbance measurement, and the difference from the blank can be determined as the cleaning power.
- a predetermined indicator substance for example, a dye with high fat solubility such as Sudan III
- the lipase of the present invention is useful as an enzyme for blending in various cleaning compositions, and is particularly useful as an enzyme for blending in cleaning compositions suitable for low-temperature cleaning.
- “low temperature” includes 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, and 25°C or lower, and also includes 5°C or higher, 10°C or higher, and 15°C or higher. Further examples include 5 to 40°C, 10 to 35°C, 15 to 30°C, and 15 to 25°C.
- the amount of the lipase of the present invention incorporated into the cleaning composition is not particularly limited as long as the lipase exhibits activity, but for example, preferably 0.1 mg or more, more preferably 1 mg per 1 kg of the cleaning composition. Above, it is more preferably 5 mg or more, and preferably 5000 mg or less, more preferably 1000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, it is preferably 0.1 to 5000 mg, more preferably 1 to 1000 mg, and even more preferably 5 to 500 mg.
- the cleaning composition preferably contains a sulfosuccinate or a salt thereof in addition to the lipase of the present invention.
- Sulfosuccinic acid esters or salts thereof are known as components to be included in cleaning compositions (for example, Japanese Patent Application Publication No. 2019-182911).
- the sulfosuccinic acid ester or its salt is preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or its salt having a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, and a sulfosuccinic acid branched alkyl ester having a branched chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms or Salts thereof are more preferred, and sulfosuccinic acid branched alkyl esters having a branched alkyl group having 10 carbon atoms or salts thereof are even more preferred.
- the sulfosuccinic acid ester or its salt is a sulfosuccinic acid di-branched alkyl ester or its salt
- the two branched-chain alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 9 or more and 12 or less carbon atoms.
- Esters or salts thereof are preferred, and sulfosuccinic acid di-branched alkyl esters or salts thereof, in which the two branched alkyl groups each have 9 or 10 carbon atoms, are more preferred, and the two branched alkyl groups each have 10 carbon atoms.
- sulfosuccinic acid di-branched alkyl esters or salts thereof which are branched chain alkyl groups
- bis-(2-propylheptyl)sulfosuccinic acid or salts thereof are particularly preferred.
- the salt examples include alkali metal salts and alkanolamine salts, preferably alkali metal salts or alkanolamine salts, and salts selected from sodium salts, potassium salts, triethanolamine salts, diethanolamine salts, and monoethanolamine salts. is more preferred, and sodium salt is even more preferred.
- Examples of the sulfosuccinic acid ester or its salt include a compound represented by the following formula 1.
- R 1 and R 2 are each a branched alkyl group having 9 or more and 12 or less carbon atoms, and A 1 O and A 2 O are each an alkyleneoxy group having 2 or more and 4 or less carbon atoms.
- x1 and x2 are average numbers of added moles, each of which is a number from 0 to 10, and M is a cation.
- R 1 and R 2 are each preferably a branched alkyl group selected from a branched nonyl group, a branched decyl group, and a branched dodecyl group, and more preferably a branched decyl group.
- the branched decyl group is preferably a 2-propylheptyl group.
- a 1 O and A 2 O are each an alkyleneoxy group having 2 or more and 4 or less carbon atoms, preferably 2 or 3 carbon atoms from the viewpoint of lubricity against water.
- x1 and x2 represent the average number of added moles of A 1 O and A 2 O, and each is 0 or more and 10 or less, preferably 6 or less from the viewpoint of water lubricity, more preferably 4 or less, and Preferably the number is 2 or less, and 0 is more preferable.
- M is a cation.
- M is preferably a cation other than a hydrogen ion.
- M include alkali metal ions such as lithium ions, sodium ions, and potassium ions, alkaline earth metal ions such as calcium ions and barium ions, triethanolammonium ions, diethanolammonium ions, monoethanolammonium ions, and trimethylammonium ions. , organic ammonium ions such as monomethylammonium ion, and the like.
- M is preferably an alkali metal ion or an alkanol ammonium ion, more preferably a sodium ion, a potassium ion, a triethanol ammonium ion, a diethanol ammonium ion, or a monoethanol ammonium ion, and even more preferably a sodium ion.
- the sulfosuccinic acid ester or its salt is preferably a compound represented by the following formula 1-1.
- the compound of formula 1-1 is a compound in which x1 and x2 in formula 1 are each 0.
- R 1 and R 2 are each a branched alkyl group having 9 or more and 12 or less carbon atoms, and M is a cation.
- Specific examples and preferred examples of R 1 , R 2 , and M in Formula 1-1 are the same as in Formula 1.
- the sulfosuccinate or salt thereof is bis-(2-propylheptyl)sulfosuccinic acid or a salt thereof.
- the amount of the sulfosuccinate or its salt added to the cleaning composition is preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, and preferably 2.0% by mass or less, more preferably It is 1.0% by mass or less. Further, it is preferably 0.01 to 2.0% by mass, and more preferably 0.1 to 1.0% by mass.
- the cleaning composition can also contain various enzymes in addition to the lipase of the present invention.
- enzymes include hydrolase, oxidase, reductase, transferase, lyase, isomerase, ligase, synthetase, and the like.
- lipases, amylases, proteases, cellulases, keratinases, esterases, cutinases, pullulanase, pectinases, mannanases, glucosidases, glucanases, cholesterol oxidases, peroxidases, laccases, etc. which are different from the lipase of the present invention, are preferable, and particularly proteases, cellulases, and amylases. , lipase is preferred.
- Proteases include commercially available Alcalase, Esperase, Everlase, Savinase, Kannase, Progress Uno (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ, EXCELLENZ (registered trademark; DuPont), Lav ergy (registered trademark; BASF), and KAP ( Kao), etc.
- cellulases include Celluclean, Carezyme (registered trademark; Novozymes), KAC, alkaline cellulase produced by Bacillus sp. Examples include alkaline cellulase (Kao).
- amylase examples include Termamyl, Duramyl, Stainzyme, Stainzyme Plus, Amplify Prime (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ (registered trademark; DuPont), and KAM (Kao).
- lipases examples include Lipolase and Lipex (registered trademark; Novozymes).
- Known detergent components can be blended into the detergent composition, and examples of the known detergent components include the following.
- the surfactant is blended in the cleaning composition in an amount of 0.5 to 60% by mass, particularly 10 to 45% by mass for powdered cleaning compositions, and 20 to 90% for liquid cleaning compositions. It is preferable to mix % by mass. Furthermore, when the detergent composition of the present invention is a laundry detergent or a detergent for automatic dishwashers, the surfactant is generally blended in an amount of 1 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
- the surfactants used in the cleaning composition include anionic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, and cationic surfactants other than the above-mentioned sulfosuccinates or their salts.
- anionic surfactants and nonionic surfactants are preferred.
- anionic surfactants include sulfate ester salts of alcohols having 10 to 18 carbon atoms, sulfate ester salts of alkoxylated alcohols having 8 to 20 carbon atoms, alkylbenzene sulfonates, paraffin sulfonates, and ⁇ -olefin sulfones.
- Preferred are acid salts, internal olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid alkyl ester salts, or fatty acid salts.
- a linear alkylbenzene sulfonate having an alkyl chain of 10 to 14 carbon atoms, more preferably 12 to 14 carbon atoms, and an internal olefin having an alkylene chain of 12 to 20 carbon atoms, more preferably 16 to 18 carbon atoms
- One or more anionic surfactants selected from sulfones are preferred, and as counterions, alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
- alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
- Nonionic surfactants include polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) phenyl ether, polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (8 to 20 carbon atoms) 22) Ester, polyoxyalkylene glycol fatty acid (carbon number 8 to 22) ester, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymer are preferred.
- 4 to 20 moles of alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide are added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms [HLB value (calculated by Griffin method) of 10.5 to 15. 0, preferably 11.0 to 14.5] are preferred.
- the divalent metal ion scavenger is blended in an amount of 0.01 to 50% by mass, preferably 5 to 40% by mass.
- the divalent metal ion scavenger used in the cleaning composition of the present invention includes condensed phosphates such as tripolyphosphate, pyrophosphate, and orthophosphate, aluminosilicates such as zeolite, and synthetic layered crystalline silicates. , nitrilotriacetate, ethylenediaminetetraacetate, citrate, isocitrate, polyacetal carboxylate, and the like.
- crystalline aluminosilicate is particularly preferred, and among A-type, X-type, and P-type zeolites, A-type is particularly preferred.
- the synthetic zeolite preferably has an average primary particle size of 0.1 to 10 ⁇ m, particularly 0.1 to 5 ⁇ m.
- Alkaline agent is blended in an amount of 0.01 to 80% by weight, preferably 1 to 40% by weight.
- examples include alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash, and amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
- alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash
- amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
- These inorganic alkaline agents are effective in forming particle skeletons during detergent drying, and can yield detergents that are relatively hard and have excellent fluidity.
- alkalis other than these include sodium sesquicarbonate and sodium hydrogen carbonate, and phosphates such as tripolyphosphate also act as alkaline agents.
- sodium hydroxide and mono-, di-, or triethanolamine can be used as alkaline agents used in liquid detergents, and can also be
- Anti-restaining agent is blended in an amount of 0.001 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
- anti-recontamination agents used in the cleaning composition of the present invention include polyethylene glycol, carboxylic acid polymers, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone.
- carboxylic acid polymers have the ability to prevent recontamination, as well as the ability to capture metal ions and disperse solid particle stains from clothing into the washing bath.
- the carboxylic acid polymer is a homopolymer or copolymer of acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, etc.
- the preferred copolymer is a copolymer of the above monomers and maleic acid, and those with a molecular weight of several thousand to 100,000 are suitable. preferable.
- polymers such as polyglycidylate, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, and aminocarboxylic acid-based polymers such as polyaspartic acid also have metal ion scavenging agents, dispersing agents, and re-fouling prevention abilities. Therefore, it is preferable.
- Bleaching agent Bleaching agents such as hydrogen peroxide and percarbonate are preferably blended in an amount of 1 to 10% by mass.
- a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or the one described in JP-A-6-316700 can be added.
- Fluorescent agent examples include biphenyl type fluorescent agents (eg, Tinopal CBS-X, etc.) and stilbene type fluorescent agents (eg, DM type fluorescent dye, etc.).
- the fluorescent agent is preferably blended in an amount of 0.001 to 2% by mass.
- the detergent composition includes builders, softeners, reducing agents (such as sulfites), foam suppressants (such as silicones), fragrances, and antibacterial and antifungal agents known in the field of laundry detergents. (Proxel [trade name], benzoic acid, etc.) and other additives can be included.
- a cleaning composition can be produced in accordance with a conventional method by combining the lipase of the present invention obtained by the above method and the above-mentioned known cleaning components.
- the form of the detergent can be selected depending on the application, and can be, for example, liquid, powder, granule, paste, solid, etc.
- the cleaning composition thus obtained can be used as a laundry detergent, a dishwashing agent, a bleaching agent, a hard surface cleaning agent, a drain cleaning agent, a denture cleaning agent, a disinfectant cleaning agent for medical instruments, etc.
- laundry detergents and dishwashing agents preferred are laundry detergents and dishwashing agents, and more preferred are laundry detergents (laundry laundry detergents), hand-washing dishwashing agents, and automatic dishwashing detergents.
- the cleaning composition is suitable for use at temperatures of 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and 5°C or higher, 10°C or higher, or 15°C or higher.
- Preferred usage modes include use in low-temperature (15-30°C) washing in laundry facilities and low-temperature (15-30°C) washing in automatic dishwashers.
- the cleaning composition of the present invention By using the cleaning composition of the present invention, objects to be cleaned that require stain removal (e.g., clothes, tableware, hard surfaces, drain pipes, dentures, medical instruments, etc.) can be cleaned, that is, stains can be removed. can do.
- a cleaning method includes bringing the cleaning composition of the present invention into contact with an object to be cleaned that requires stain removal.
- the stain is a sebum stain or a stain containing food-derived oils and fats.
- the object to be cleaned in order to bring the object to be cleaned and the cleaning agent composition into contact, the object to be cleaned may be soaked in water in which the cleaning agent composition is dissolved; The material may be applied directly to the object to be cleaned.
- the object to be cleaned after soaking or applying the detergent composition may be further washed by hand or in a washing machine, but this is not always necessary.
- the present invention further discloses the following aspects.
- Any of the following lipases A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 79% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence having at least 76% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence having at least 81% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence having at least 96% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or an amino acid sequence having at least 83% identity thereto; A lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 or
- ⁇ 2> Consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 or 44, according to ⁇ 1> Lipase.
- ⁇ 3> A polynucleotide encoding the lipase according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
- ⁇ 4> A vector or DNA fragment comprising the polynucleotide according to ⁇ 3>.
- ⁇ 5> A transformed cell containing the vector or DNA fragment according to ⁇ 4>.
- ⁇ 6> The transformed cell according to ⁇ 5>, which is a microorganism.
- ⁇ 7> The transformed cell according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, which is Escherichia coli or a bacterium belonging to the genus Bacillus.
- Sulfosuccinic acid ester or salt thereof preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or salt thereof having a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, more preferably a sulfosuccinate having a branched chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms.
- the cleaning composition according to ⁇ 8> further comprising an acid branched alkyl ester or a salt thereof, more preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or a salt thereof having a branched alkyl group having 10 carbon atoms.
- a sulfosuccinic acid diester or a salt thereof preferably a sulfosuccinic acid di-branched alkyl ester or a salt thereof, wherein each of the two branched chain alkyl groups is a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, more preferably two branched chains.
- a di-branched sulfosuccinic acid alkyl ester or salt thereof in which the alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms, more preferably a di-branched sulfosuccinic acid, in which the two branched-chain alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 10 carbon atoms.
- ⁇ 11> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10>, which is a clothes cleaning agent or a dishwashing agent.
- ⁇ 12> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 11>, which is a powder or liquid.
- ⁇ 13> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 12>, which is used at low temperatures.
- ⁇ 14> Used at temperatures below 40°C, below 35°C, below 30°C, below 25°C, and above 5°C, above 10°C, above 15°C, or from 5 to 40°C, 10 to 35°C, 15°C
- the cleaning composition according to ⁇ 13> which is used at ⁇ 30°C and 15-25°C.
- ⁇ 15> A method for cleaning dirt using the cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 14>.
- ⁇ 16> The method according to ⁇ 15>, which comprises contacting the object to be cleaned with the cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 14>.
- ⁇ 17> The method according to ⁇ 15> or ⁇ 16>, wherein the stain is a sebum stain or a stain containing food-derived oils and fats.
- the lipase is a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 or 44, ⁇ 18>.
- the cleaning composition is a laundry detergent or a dishwasher.
- the cleaning composition is a powder or liquid.
- the cleaning composition is used at low temperatures.
- the cleaning composition is used at a temperature of 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher, or 5 to 40°C, 10°C or lower.
- the lipase is a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 or 44, ⁇ 24>.
- Washing is at 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and at 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher, or 5-40°C, 10-35°C
- lipase expression plasmid was constructed using the plasmid for expression of VHH of SEQ ID NO: 26 containing the Bacillus subtilis spoVG gene-derived promoter described in WO2021/153129 as a template. It was constructed by replacing each lipase gene with the full length ORF containing the VHH gene of the above plasmid by In-Fusion reaction.
- Lipr139 PvLip, PfLip, EtLip, EspLip, YeLip, AncLip1, AncLip2, AncLip3, AncLip4, AncLip5, AncLip6, AncLip7, AncLip8, AncLip9, An cLip10, AncLip11, AncLip12, AncLip13, AncLip14, AncLip15, AncLip16, Lipr138 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 and 45 polynucleotides of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, respectively.
- pHY-AncLip4 pHY-AncLip5, pHY-AncLip6, pHY-AncLip7, pHY-AncLip8, pHY-AncLip9, pHY-AncLip10, pHY-AncLip11, pHY-AncLip12, pHY-AncLip13, pHY-AncLip14, pHY-AncLip15, pHY-AncLip16 , pHY-Lipr138 was constructed.
- amino acid sequences shown by any of SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 and 44 belong to the Proteus/Yersinia clade. This is a novel lipase sequence that is presumed to have been possessed by the ancestor of the bacteria from which the existing lipases belong.
- a lipase TLL gene (sequence) in which a signal sequence derived from Bacillus subtilis amyE (polynucleotide of SEQ ID NO: 49, encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50) was linked to the full-length ORF containing the Lipr139 gene of plasmid pHY-Lipr139 on the N-terminal side.
- pHY-amyEsig-TLL was constructed by replacing the artificially synthesized gene of polynucleotide number 47 (encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48) by In-Fusion reaction.
- a lipase expression plasmid was introduced into a Bacillus subtilis strain by the protoplast method, and a 2 ⁇ L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm sulfuric acid After culturing at 30°C for 2 days in manganese pentahydrate, 0.04% calcium chloride dihydrate, 15 ppm tetracycline (% is (w/v)%), the culture supernatant containing lipase was collected by centrifugation. Recovered. The culture supernatant was buffer exchanged into 10 mM Tris-HCl + 0.01% Triton-X100 (pH 7.0) by dialysis, and the lipase concentration was determined from the band intensity of SDS-PAGE.
- TLL, Lipr139, PvLip and Lipr138 whose suitability for washing has been disclosed in Patent Documents 1, 2 and 3, and the naturally occurring lipase sequences PfLip, EtLip, EspLip and YeLip, were prepared using SDS and Triton X-100.
- TLL, Lipr139, PvLip and Lipr138 whose suitability for washing has been disclosed in Patent Documents 1, 2 and 3, and the naturally occurring lipase sequences PfLip, EtLip, EspLip and YeLip, are significantly active in the model washing solution. inhibited.
- novel ancestral lipases AncLip1, AncLip3, AncLip4, AncLip6, AncLip7, AncLip8, AncLip9, AncLip10, AncLip11, AncLip12, AncLip13, AncLip14, AncLip15 and AncLip16 is highly resistant to activity inhibition in model wash solution showed resistance.
- Lipr139 whose suitability for cleaning is disclosed in Patent Document 1, showed high cleaning power in a model cleaning solution compared to TLL, Lipr138, PvLip, PfLip, EtLip, EspLip, and YeLip.
- novel ancestral lipases AncLip1, AncLip3, AncLip4, AncLip5, AncLip6, AncLip7, AncLip8, AncLip9, AncLip10, AncLip11, AncLip12, AncLip13, AncLip14 and AncL ip15 has significantly higher cleaning power than Lipr139 in the model cleaning solution. Indicated.
- Lipr139 PvLip, PfLip, EtLip, EspLip, YeLip, AncLip1, AncLip2, AncLip3, AncLip4, AncLip5, AncLip6, AncLip7, AncLip8, AncLip9 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, respectively) , 10, 12, 14, 16, 18 , 20, 22, 24, 26, 28, and 30) were used to create a phylogenetic tree. Multiple alignment was performed using clustalW using Genetyx, and a phylogenetic tree was created using the Neighbor-Joining method (NJ method) (FIG. 4).
- NJ method Neighbor-Joining method
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
界面活性剤による活性阻害が緩和され、高い洗浄効果を示すリパーゼの提供。配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列又はこれらのいずれかと少なくとも相当程度の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
Description
本発明は、新規リパーゼに関する。
リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼはトリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
現行の洗浄組成物や洗浄環境は、リパーゼの活性や洗浄効果を阻害する様々な成分を含んでおり、そのような条件下で機能するリパーゼが求められている。洗浄に有用なリパーゼとして、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼ(以下TLL)がLIPOLASE(登録商標)の商品名で販売されている。特許文献1にはCedecea sp-16640株由来のリパーゼLipr139がTLLと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献2には、1つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するProteus属細菌由来リパーゼ(以下PvLip)の変異体が開示されている。特許文献3にはメタゲノム由来のリパーゼLipr138がTLLと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。Lipr139、PvLip及びLipr138はProteus属細菌やYersinia属細菌に由来するリパーゼを含む同一のクレード(Proteus/Yersiniaクレード)に属するリパーゼである。
グラム陰性菌由来のリパーゼの多くは、活性型への折りたたみにリパーゼ特異的シャペロンを必要とし(非特許文献1)、異種発現による安価製造に課題を有する。特異的シャペロンの共発現によって異種発現が改善することが報告されている(非特許文献2)が、その生産性は低く、異種発現による安価製造には依然として大きな課題がある。一方、Proteus/Yersiniaクレードのバクテリアリパーゼは特異的シャペロンを必要とせず、異種発現による安価製造において優位性を持つ(非特許文献3、4)。
以上のように、Proteus/Yersiniaクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
以上のように、Proteus/Yersiniaクレードのバクテリアリパーゼは洗浄への適性と安価製造可能性の両者において、洗浄用酵素として優れたポテンシャルを有する。
(特許文献1)特表2015-523078号公報
(特許文献2)国際公開第2020/046613号
(特許文献3)特表2015-525248号公報
(非特許文献1)Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
(非特許文献2)Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
(非特許文献3)Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
(非特許文献4)Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
(特許文献2)国際公開第2020/046613号
(特許文献3)特表2015-525248号公報
(非特許文献1)Hobson, Audrey H., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 90.12 (1993): 5682-5686.
(非特許文献2)Quyen, ThiDinh, ChiHai Vu, and GiangThi Thu Le. Microbial cell factories 11.1 (2012): 1-12.
(非特許文献3)Lee, Hong-Weon, et al. Biotechnology letters 22.19 (2000): 1543-1547.
(非特許文献4)Glogauer, Arnaldo, et al. Microbial cell factories 10.1 (2011): 1-15.
本発明は、下記1)~6)に係るものである。
1)下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
2)1)に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
3)2)のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
4)3)のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
5)1)に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
6)5)に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
1)下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
2)1)に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
3)2)のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
4)3)のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
5)1)に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
6)5)に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ(EC3.1.1.3)を指し、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、オクタン酸4-ニトロフェニルの加水分解による4-ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
本明細書において、「祖先生物が有していたと推定されるリパーゼ」とは、タンパク質の進化を表す有根系統樹に基づいて、共通祖先に由来する各生物のリパーゼのアミノ酸配列から導き出される該共通祖先が有していたと推定されるアミノ酸配列からなるリパーゼ(単に祖先型リパーゼとも称する)を意味する。祖先型リパーゼは、リパーゼのホモログ配列を公共データベースなどから取得し、得られたホモログ配列を用いてマルチプルアラインメント、次いで有根系統樹を作成し、祖先配列設計法(Ancestral sequence reconstruction:ASR)プログラムを用いて共通祖先のリパーゼのアミノ酸配列を推定することで設計することができる。
祖先型リパーゼの設計には、一般的な手法を用いることができ、例えばMerkl R,Sterner R.,Biol Chem.2016;397(1):1-21やScossa F,Fernie AR.,Comput Struct Biotechnol J.2021;19:1579-1594などに記載されている手法を用いることができる。また、JSBi Bioinformatics Review,2(1),30-57(2021)に記載されている系統解析の一般的な手法も用いることができる。リパーゼホモログ配列のデータセットは、例えばNCBI、UniProtKBといった公共のデータベースからBLAST(Altschul et al.,1990)によって取得することができる。または、InterProやPfamといったドメインデータベースからファミリーとして一括で取得することもできる。マルチプルアライメントの作成には例えば、Clustal X and Clustal W(Larkin et al.,2007)、MUSCLE(Edgar,2004)、MAFFT(Katoh and Standley,2013)、MAFFT-DASH(Rozewicki et al.,2019)、PRANK(Loytynoja,2014)、T-COFFEE(Notredame et al.,2000)などのプログラムを用いることができる。作成されたマルチプルアライメントは、GBLOCKS(Castresana,2000)やtrimAl(Capella-Gutierrez et al.,2009)などのプログラムによって適切にトリミングされたあと、系統樹の推定に用いられる。系統樹の推定には最節約法やベイズ法、最尤法の手法を用いることができ、例えばMrBayes(Ronquist et al.,2012)、BEAST(Bouckaert etal.,2019)、FastTree(Price et al.,2010)、PhyML(Guindon et al.,2010),RAxML(Stamatakis et al.,2014)、IQ-TREE(Nguyen et al.,2015)などのプログラムを用いることができる。系統樹推定に用いる適切な進化モデルは、modeltest-ng(Darriba,D. et al.,2020)やModelFinder(Kalyaanamoorthy et al.,2017)などのプログラムを使用して選択することができる。祖先配列設計には専用のプログラムを用いることができ、FastML(Pupko et al.,2000)、ProtASR2(Arenas M and Bastolla,2020)、GRASP(Gabriel et al.,2019)などのプログラムを用いることができる。また、系統樹推定プログラムの一部の機能として祖先配列設計が含まれているものもあり、PAML(Yang,1997)、RAxML、IQ-TREEなどのプログラムを用いることもできる。これらの系統解析から祖先配列設計を一括で行う統合環境としてMEGA(Tamura et al.,2021)を用いることもできる。
本明細書において、「Proteus/Yersiniaクレード」とは、有根系統樹上でProteus属細菌及びYersinia属細菌に由来するリパーゼ(例えば配列番号4及び12)を含むクレードを指し、配列番号2、4、6、8、10、12及び46で示されるアミノ酸配列はいずれも、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼ配列である。
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX Ver.12のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、DNAセンス鎖においてプロモーターの3’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、DNAセンス鎖における該遺伝子の5’側の領域を意味する。
リパーゼは洗浄組成物中に含まれる界面活性剤によってその活性が阻害されることが知られている。実際に本発明者らが検証した限り、洗浄への適性が開示されている公知のリパーゼは、TLL、Lipr139及びPvLipのいずれもが界面活性剤の共存によって大きな活性阻害を受けた。界面活性剤による活性阻害は洗浄用リパーゼ共通の大きな課題である。また、リパーゼは洗浄用途に限らずパルプ処理などの産業用途においても界面活性剤と共に使用されることが多く、界面活性剤による活性阻害は産業用リパーゼ全体の課題でもある。よって、界面活性剤による活性阻害が緩和され、高い洗浄効果を示すリパーゼが求められている。
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼの由来菌の祖先生物が有していたと推定される新規リパーゼ配列群が、驚くべきことに、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を示し、顕著な洗浄性能を有することを見出した。
一般に祖先型の酵素は、高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や低温における洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、上記結果は予想外のものであった。
一般に祖先型の酵素は、高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や低温における洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、上記結果は予想外のものであった。
本発明のリパーゼは、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄効果を示す。
<1.リパーゼ>
本発明のリパーゼは、下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ、
である。
ここで、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及び44のいずれかで示されるアミノ酸配列は、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼの由来菌の祖先生物が有していたと推定される新規リパーゼ配列である。一般に祖先型の酵素は高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、本発明のリパーゼが界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示すことは全く予想外であった。
本発明のリパーゼは、下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ、
である。
ここで、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及び44のいずれかで示されるアミノ酸配列は、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼの由来菌の祖先生物が有していたと推定される新規リパーゼ配列である。一般に祖先型の酵素は高い耐熱性や高い至適温度を有するといった特性を示すことが知られているが、界面活性剤による活性阻害に関する特性や洗浄作用に関する特性はこれまで全く知られておらず、本発明のリパーゼが界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示すことは全く予想外であった。
配列番号14で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号14で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性、具体的には、79%以上、好ましくは82%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号16で示されるアミノ酸配列と少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号16で示されるアミノ酸配列と少なくとも76%の同一性、具体的には、76%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号18で示されるアミノ酸配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号18で示されるアミノ酸配列と少なくとも81%の同一性、具体的には、81%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号20で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号20で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性、具体的には、83%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性、具体的には、96%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号24で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号24で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性、具体的には、83%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号26で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号26で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性、具体的には、90%以上、好ましくは93%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号28で示されるアミノ酸配列と少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号28で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性、具体的には、82%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号30で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号30で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性、具体的には、73%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号32で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号32で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性、具体的には、73%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号34で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号34で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性、具体的には、79%以上、好ましくは82%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号36で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号36で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性、具体的には、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号38で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号38で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性、具体的には、73%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号40で示されるアミノ酸配列と少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号40で示されるアミノ酸配列と少なくとも71%の同一性、具体的には、71%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号42で示されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号42で示されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同一性、具体的には、72%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
配列番号44で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号44で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、具体的には、70%以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列には、1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。
「1又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、1個以上30個以下、好ましくは20個以下、より好ましくは10個以下、さらに好ましくは5個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
配列番号14で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号16で示されるアミノ酸配列と少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号18で示されるアミノ酸配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号20で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号22で示されるアミノ酸配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号24で示されるアミノ酸配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号26で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号28で示されるアミノ酸配列と少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号30で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号32で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号34で示されるアミノ酸配列と少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号36で示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号38で示されるアミノ酸配列と少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号40で示されるアミノ酸配列と少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号42で示されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号44で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼは、例えば、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼの人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入(Site-Directed Mutagenesis)のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
本発明のリパーゼは、従来単離又は精製されているリパーゼ及びNCBIタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する。従来単離又は精製されているリパーゼとしては、例えば、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼTLL(配列番号48)、前記特許文献1において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているCedecea sp.-16640株由来のリパーゼLipr139(配列番号2)、前記特許文献2において洗浄に好適なリパーゼ変異体群の親酵素として開示されているProteus属細菌由来リパーゼ(以下、PvLipと称する、配列番号4)、前記特許文献3において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているメタゲノム由来のリパーゼLipr138(配列番号46)などが挙げられる。また、NCBIタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質としては、アクセッション番号WP_123598507.1のタンパク質(以下、PfLipと称する、配列番号6)、アクセッション番号WP_115457195.1のタンパク質(以下、EtLipと称する、配列番号8)、アクセッション番号WP_135495634.1のタンパク質(以下、EspLipと称する、配列番号10)、アクセッション番号WP_005161363.1のタンパク質(以下、YeLipと称する、配列番号12)などが挙げられる。当該データベースに登録されているこれらのタンパク質について、その酵素学的性質はこれまでに報告されていない。
配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列がコードするリパーゼをそれぞれAncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15、AncLip16と称する。
AncLip1はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_131062716.1として登録されているPseudomonas sp.由来のリパーゼと78%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip2はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_109394219.1として登録されているProteus terrae由来のリパーゼと75%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip3はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_115457195.1として登録されているEnterobacillus tribolii由来のリパーゼと80%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip4はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025122441.1として登録されているSerratia由来のリパーゼと82%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip5はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_050126899.1として登録されているYersinia aleksiciae由来のリパーゼと95%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip6はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_045783583.1として登録されているEnterobacteriaceae由来のリパーゼと82%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip7はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_037407093.1として登録されているChania multitudinisentens由来のリパーゼと89%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip8はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_033635162.1として登録されているSerratia marcescens由来のリパーゼと81%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip9はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_100141403.1として登録されているSnodgrassella alvi由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip10はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_049600386.1として登録されているYersinia nurmii由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip11はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_049600386.1として登録されているYersinia nurmii由来のリパーゼと78%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip12はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_057631122.1として登録されているYersinia enterocolitica由来のリパーゼと84%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip13はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025329791.1として登録されているSnodgrassella由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip14はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_033635162.1として登録されているSerratia marcescens由来のリパーゼと70%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip15はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025329791.1として登録されているSnodgrassella由来のリパーゼと71%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip16はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_097192271.1として登録されているPseudomonas lundensis由来のリパーゼと69%のアミノ酸配列同一性を示す。
AncLip1はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_131062716.1として登録されているPseudomonas sp.由来のリパーゼと78%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip2はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_109394219.1として登録されているProteus terrae由来のリパーゼと75%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip3はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_115457195.1として登録されているEnterobacillus tribolii由来のリパーゼと80%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip4はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025122441.1として登録されているSerratia由来のリパーゼと82%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip5はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_050126899.1として登録されているYersinia aleksiciae由来のリパーゼと95%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip6はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_045783583.1として登録されているEnterobacteriaceae由来のリパーゼと82%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip7はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_037407093.1として登録されているChania multitudinisentens由来のリパーゼと89%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip8はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_033635162.1として登録されているSerratia marcescens由来のリパーゼと81%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip9はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_100141403.1として登録されているSnodgrassella alvi由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip10はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_049600386.1として登録されているYersinia nurmii由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip11はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_049600386.1として登録されているYersinia nurmii由来のリパーゼと78%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip12はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_057631122.1として登録されているYersinia enterocolitica由来のリパーゼと84%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip13はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025329791.1として登録されているSnodgrassella由来のリパーゼと72%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip14はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_033635162.1として登録されているSerratia marcescens由来のリパーゼと70%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip15はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_025329791.1として登録されているSnodgrassella由来のリパーゼと71%のアミノ酸配列同一性を示す。AncLip16はNCBIタンパク質配列データベースにアクセッション番号WP_097192271.1として登録されているPseudomonas lundensis由来のリパーゼと69%のアミノ酸配列同一性を示す。
好ましい一実施形態において、本発明のリパーゼは、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼであり、より好ましくは配列番号14、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40又は42で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである。
<2.リパーゼの生産方法>
本発明のリパーゼは、例えば、上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のリパーゼは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のリパーゼが生産される。生産されたリパーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のリパーゼを取得することができる。
本発明のリパーゼは、例えば、上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のリパーゼは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のリパーゼが生産される。生産されたリパーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のリパーゼを取得することができる。
本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号14で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号16で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号18で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号20で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号22で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号24で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号26で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号28で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号30で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号32で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号34で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号36で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号38で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号40で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号42で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列又は配列番号44で示されるアミノ酸配列もしくはこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドであり得る。また本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖DNA、RNA、又は人工核酸の形態であり得、あるいはcDNA、又はイントロンを含まない化学合成DNAであり得る。
本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、該リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述した本発明のリパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス(例えば、株式会社医学生物学研究所、Genscript社などより提供されている)を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをPCR、クローニングなどにより増幅することもできる。
またあるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記の手順で合成されたポリヌクレオチドに対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41又は43のポリヌクレオチドに公知の方法で突然変異導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させてリパーゼ活性を調べ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することによって、得ることができる。
ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、例えば、インバースPCR法やアニーリング法など(村松ら編、「改訂第4版 新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、p.82-88)の任意の手法により行うことができる。必要に応じてStratagene社のQuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kitや、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kitなどの各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、YACベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌(例えば枯草菌又はその変異株)内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のリパーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、pHA3040SP64、pHSP64R又はpASP64(特許第3492935号)、pHY300PLK(大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター;Jpn J Genet,1985,60:235-243)、pAC3(Nucleic Acids Res,1988,16:8732)などのシャトルベクター;pUB110(J Bacteriol,1978,134:318-329)、pTA10607(Plasmid,1987,18:8-15)などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescriptなど)を用いることもできる。
上記ベクターは、DNAの複製開始領域又は複製起点を含むDNA領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド(すなわち本発明のリパーゼ遺伝子)の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Bacllus sp.KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子)がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、SOE(splicing by overlap extension)-PCR法(Gene,1989,77:61-68)などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むDNA断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌(Escherichia coli)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、リステリア属(Listeria)、バチルス属(Bacillus)に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌(例えば、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168(枯草菌168株)又はその変異株)が好ましい。枯草菌変異株の例としては、J.Biosci.Bioeng.,2007,104(2):135-143に記載のプロテアーゼ9重欠損株KA8AX、ならびにBiotechnol.Lett.,2011,33(9):1847-1852に記載の、プロテアーゼ8重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたD8PA株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属(Trichoderma)、アスペルギルス属(Aspergillus)、リゾプス属(Rhizopus)などが挙げられる。
宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
あるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、SOE-PCR法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したDNA断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該DNA断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
斯くして得られた、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のリパーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
あるいは、本発明のリパーゼは、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、in vitro転写翻訳系又はin vitro翻訳系を構成したものである。
上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のリパーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
<3.洗浄剤組成物>
斯くして得られる本発明のリパーゼは、公知のタンパク質に比して、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。
ここで、「高い耐性」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号2、4、6、8、10もしくは12で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はNCBIタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い耐性を意味する。界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、リパーゼ溶液と界面活性剤溶液を混合し、該混合液にリパーゼの基質となるオクタン酸4-ニトロフェニル溶液を添加し、4-ニトロフェノールの遊離に伴う405nmの吸光度変化(OD/min)を測定し、ブランクとの差分ΔOD/minをリパーゼ活性値(界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値)として求める。さらに、界面活性剤溶液にかえてバッファーを用いた際のリパーゼ活性値(バッファー中のリパーゼ活性値)を求め、界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値をバッファー中のリパーゼ活性値で割って100を掛けた値を相対活性(%)として求める。相対活性(%)が高い程、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性が高いと判断できる。
本発明のリパーゼは、後記実施例の(3)の条件下、Triton X-100溶液(0.1%(w/v))中のリパーゼ相対活性(%)が好ましくは20%以上、より好ましくは30%以上、さらに好ましくは50%以上のリパーゼである。
また、「高い洗浄力」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号2、4、6、8、10若しくは12で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はNCBIタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い洗浄力、例えば、汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。洗浄力は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の指標物質(例えば、スダンIIIなどの脂肪に対する溶解性の高い染色剤)を含むモデル汚れにリパーゼを含む洗浄液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄液の一部を分取し、洗浄処理により洗浄液に可溶化したモデル汚れ中の指標物質の濃度を、例えば吸光度測定により測定し、ブランクとの差分を洗浄力として求めることができる。
斯くして得られる本発明のリパーゼは、公知のタンパク質に比して、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。
ここで、「高い耐性」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号2、4、6、8、10もしくは12で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はNCBIタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い耐性を意味する。界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、リパーゼ溶液と界面活性剤溶液を混合し、該混合液にリパーゼの基質となるオクタン酸4-ニトロフェニル溶液を添加し、4-ニトロフェノールの遊離に伴う405nmの吸光度変化(OD/min)を測定し、ブランクとの差分ΔOD/minをリパーゼ活性値(界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値)として求める。さらに、界面活性剤溶液にかえてバッファーを用いた際のリパーゼ活性値(バッファー中のリパーゼ活性値)を求め、界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値をバッファー中のリパーゼ活性値で割って100を掛けた値を相対活性(%)として求める。相対活性(%)が高い程、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性が高いと判断できる。
本発明のリパーゼは、後記実施例の(3)の条件下、Triton X-100溶液(0.1%(w/v))中のリパーゼ相対活性(%)が好ましくは20%以上、より好ましくは30%以上、さらに好ましくは50%以上のリパーゼである。
また、「高い洗浄力」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号2、4、6、8、10若しくは12で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はNCBIタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い洗浄力、例えば、汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。洗浄力は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の指標物質(例えば、スダンIIIなどの脂肪に対する溶解性の高い染色剤)を含むモデル汚れにリパーゼを含む洗浄液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄液の一部を分取し、洗浄処理により洗浄液に可溶化したモデル汚れ中の指標物質の濃度を、例えば吸光度測定により測定し、ブランクとの差分を洗浄力として求めることができる。
本発明のリパーゼは、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
ここで、「低温」としては、40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下が挙げられ、また5℃以上、10℃以上、15℃以上が挙げられる。また、5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃が挙げられる。
ここで、「低温」としては、40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下が挙げられ、また5℃以上、10℃以上、15℃以上が挙げられる。また、5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃が挙げられる。
洗浄剤組成物中への本発明のリパーゼの配合量は、当該リパーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物1kg当たり好ましくは0.1mg以上、より好ましくは1mg以上、より好ましくは5mg以上であり、且つ好ましくは5000mg以下、より好ましくは1000mg以下、より好ましくは500mg以下である。また0.1~5000mgであるのが好ましく、1~1000mgであるのがより好ましく、5~500mgであるのがより好ましい。
洗浄剤組成物は、好ましくは、本発明のリパーゼに加えて、スルホコハク酸エステル又はその塩を含む。スルホコハク酸エステル又はその塩は、洗浄剤組成物に配合される成分として知られている(例えば、特開2019-182911号公報)。スルホコハク酸エステル又はその塩は、炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、炭素数10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましい。また、スルホコハク酸エステル又はその塩は、スルホコハク酸ジ分岐鎖アルキルエステル又はその塩であって、2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましく、ビス-(2-プロピルヘプチル)スルホコハク酸又はその塩がさらに好ましい。
塩としては、例えばアルカリ金属塩、アルカノールアミン塩などが挙げられ、アルカリ金属塩又はアルカノールアミン塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、及びモノエタノールアミン塩から選ばれる塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。
スルホコハク酸エステル又はその塩としては、下記式1で表される化合物が挙げられる。
〔式1中、R1、R2は、それぞれ、炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基であり、A1O、A2Oは、それぞれ、炭素数2以上4以下のアルキレンオキシ基であり、x1、x2は、平均付加モル数であり、それぞれ、0以上10以下の数であり、Mは陽イオンである。〕
式1中、R1、R2は、それぞれ、分岐鎖ノニル基、分岐鎖デシル基及び分岐鎖ドデシル基から選ばれる分岐鎖アルキル基が好ましく、分岐鎖デシル基がより好ましい。分岐鎖デシル基は、2-プロピルヘプチル基が好ましい。
式1中、A1O、A2Oは、それぞれ、炭素数2以上4以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは炭素数2又は3のアルキレンオキシ基である。式1中、x1、x2は、A1O、A2Oの平均付加モル数を表し、それぞれ、0以上10以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは6以下、より好ましくは4以下、さらに好ましくは2以下の数であり、0がさらに好ましい。
式1中、Mは陽イオンである。Mは水素イオン以外の陽イオンが好ましい。Mとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオン、トリメチルアンモニウムイオン、モノメチルアンモニウムイオンなどの有機アンモニウムイオンなどが挙げられる。
Mは、水への分散性の観点から、アルカリ金属イオン、アルカノールアンモニウムイオンが好ましく、ナトリウムイオン、カリウムイオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがさらに好ましい。
Mは、水への分散性の観点から、アルカリ金属イオン、アルカノールアンモニウムイオンが好ましく、ナトリウムイオン、カリウムイオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがさらに好ましい。
スルホコハク酸エステル又はその塩は、下記式1-1で表される化合物が好ましい。式1-1の化合物は、式1中のx1、x2がそれぞれ0の化合物である。
〔式1-1中、R1、R2は、それぞれ、炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基であり、Mは陽イオンである。〕
式1-1中のR1、R2、Mの具体例や好ましい例は式1と同じである。
好ましい一実施形態において、スルホコハク酸エステル又はその塩は、ビス-(2-プロピルヘプチル)スルホコハク酸又はその塩である。
式1-1中のR1、R2、Mの具体例や好ましい例は式1と同じである。
好ましい一実施形態において、スルホコハク酸エステル又はその塩は、ビス-(2-プロピルヘプチル)スルホコハク酸又はその塩である。
洗浄剤組成物中へのスルホコハク酸エステル又はその塩の配合量は、好ましくは0.01質量%以上、より好ましくは0.1質量%以上、且つ好ましくは2.0質量%以下、より好ましくは1.0質量%以下である。また0.01~2.0質量%であるのが好ましく、0.1~1.0質量%であるのがさらに好ましい。
洗浄剤組成物は、本発明のリパーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼなどである。このうち、本発明のリパーゼとは異なるリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどが好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
プロテアーゼとしては市販のAlcalase、Esperase、Everlase、Savinase、Kannase、Progress Uno(登録商標;ノボザイムズ社)、PREFERENZ、EFFECTENZ、EXCELLENZ(登録商標;デュポン社)、Lavergy(登録商標;BASF社)、またKAP(花王)、などが挙げられる。
セルラーゼとしてはCelluclean、Carezyme(登録商標;ノボザイムズ社)、またKAC、特開平10-313859号公報記載のバチルス・エスピーKSM-S237株が生産するアルカリセルラーゼ、特開2003-313592の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ(以上、花王)などが挙げられる。
アミラーゼとしてはTermamyl、Duramyl、Stainzyme、Stainzyme Plus、Amplify Prime(登録商標;ノボザイムズ社)、PREFERENZ、EFFECTENZ(登録商標;デュポン社)、またKAM(花王)、などが挙げられる。
リパーゼとしてはLipolase、Lipex(登録商標;ノボザイムズ社)などが挙げられる。
プロテアーゼとしては市販のAlcalase、Esperase、Everlase、Savinase、Kannase、Progress Uno(登録商標;ノボザイムズ社)、PREFERENZ、EFFECTENZ、EXCELLENZ(登録商標;デュポン社)、Lavergy(登録商標;BASF社)、またKAP(花王)、などが挙げられる。
セルラーゼとしてはCelluclean、Carezyme(登録商標;ノボザイムズ社)、またKAC、特開平10-313859号公報記載のバチルス・エスピーKSM-S237株が生産するアルカリセルラーゼ、特開2003-313592の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ(以上、花王)などが挙げられる。
アミラーゼとしてはTermamyl、Duramyl、Stainzyme、Stainzyme Plus、Amplify Prime(登録商標;ノボザイムズ社)、PREFERENZ、EFFECTENZ(登録商標;デュポン社)、またKAM(花王)、などが挙げられる。
リパーゼとしてはLipolase、Lipex(登録商標;ノボザイムズ社)などが挙げられる。
洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
(1)界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中0.5~60質量%配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については10~45質量%、液体洗浄剤組成物については20~90質量%配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に1~10質量%、好ましくは1~5質量%配合される。
界面活性剤は洗浄剤組成物中0.5~60質量%配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については10~45質量%、液体洗浄剤組成物については20~90質量%配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に1~10質量%、好ましくは1~5質量%配合される。
洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、上記のスルホコハク酸エステル又はその塩以外の、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の1種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数10~18のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数8~20のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α-オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α-スルホ脂肪酸塩、α-スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が10~14の、より好ましくは12~14の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が12~20の、より好ましくは16~18の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び/又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばWO2017/098637を参照することができる。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル(炭素数8~20)エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル(炭素数8~20)フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸(炭素数8~22)エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸(炭素数8~22)エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数10~18のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシドなどのアルキレンオキシドを4~20モル付加した〔HLB値(グリフィン法で算出)が10.5~15.0、好ましくは11.0~14.5であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
(2)二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は0.01~50質量%、好ましくは5~40質量%配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩(合成ゼオライト)が特に好ましく、A型、X型、P型ゼオライトのうち、A型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径0.1~10μm、特に0.1~5μmのものが好適に使用される。
二価金属イオン捕捉剤は0.01~50質量%、好ましくは5~40質量%配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩(合成ゼオライト)が特に好ましく、A型、X型、P型ゼオライトのうち、A型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径0.1~10μm、特に0.1~5μmのものが好適に使用される。
(3)アルカリ剤
アルカリ剤は0.01~80質量%、好ましくは1~40質量%配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにJIS1号、2号、3号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
アルカリ剤は0.01~80質量%、好ましくは1~40質量%配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにJIS1号、2号、3号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
(4)再汚染防止剤
再汚染防止剤は0.001~10質量%、好ましくは1~5質量%配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千~10万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
再汚染防止剤は0.001~10質量%、好ましくは1~5質量%配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千~10万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
(5)漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は1~10質量%配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)や特開平6-316700号公報記載などの漂白活性化剤(アクチベーター)を0.01~10質量%配合することができる。
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は1~10質量%配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン(TAED)や特開平6-316700号公報記載などの漂白活性化剤(アクチベーター)を0.01~10質量%配合することができる。
(6)蛍光剤
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤(例えばチノパールCBS-Xなど)やスチルベン型蛍光剤(例えばDM型蛍光染料など)が挙げられる。蛍光剤は0.001~2質量%配合するのが好ましい。
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤(例えばチノパールCBS-Xなど)やスチルベン型蛍光剤(例えばDM型蛍光染料など)が挙げられる。蛍光剤は0.001~2質量%配合するのが好ましい。
(7)その他の成分
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤(亜硫酸塩など)、抑泡剤(シリコーンなど)、香料、防菌防カビ剤(プロキセル[商品名]、安息香酸など)、その他の添加剤を含有させることができる。
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤(亜硫酸塩など)、抑泡剤(シリコーンなど)、香料、防菌防カビ剤(プロキセル[商品名]、安息香酸など)、その他の添加剤を含有させることができる。
洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のリパーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤(ランドリー用洗濯洗剤)、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上での使用に適する。また、5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温(15~30℃)洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温(15~30℃)洗浄における使用が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上での使用に適する。また、5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温(15~30℃)洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温(15~30℃)洗浄における使用が挙げられる。
本発明の洗浄剤組成物を用いることで、汚れの除去を必要とする被洗浄物(例えば、衣類、食器、硬質表面、排水管、義歯、医療器具など)を洗浄すること、すなわち汚れを除去することができる。斯かる洗浄方法は、汚れの除去を必要とする被洗浄物と本発明の洗浄剤組成物とを接触させることを含む。好ましくは、汚れとは、皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである。
本発明の洗浄方法において、被洗浄物と洗浄剤組成物とを接触させるには、該洗浄剤組成物を溶かした水に、該被洗浄物を漬け置きしてもよく、また該洗浄剤組成物を、該被洗浄物に直接塗布してもよい。本発明の方法においては、該漬け置き又は洗剤組成物の塗布後の被洗浄物をさらに手洗い、洗濯機などで洗ってもよいが、必ずしもその必要はない。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
<1>下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<2>配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなる、<1>に記載のリパーゼ。
<3><1>又は<2>に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
<4><3>に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
<5><4>に記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
<6>微生物である、<5>に記載の形質転換細胞。
<7>大腸菌又はバチルス属細菌である、<5>又は<6>に記載の形質転換細胞。
<1>下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<2>配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなる、<1>に記載のリパーゼ。
<3><1>又は<2>に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
<4><3>に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
<5><4>に記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
<6>微生物である、<5>に記載の形質転換細胞。
<7>大腸菌又はバチルス属細菌である、<5>又は<6>に記載の形質転換細胞。
<8><1>又は<2>に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
<9>スルホコハク酸エステル又はその塩、好ましくは炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは炭素数10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩をさらに含有する、<8>に記載の洗浄剤組成物。
<10>スルホコハク酸ジエステル又はその塩、好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくはビス-(2-プロピルヘプチル)スルホコハク酸又はその塩をさらに含有する、<8>に記載の洗浄剤組成物。
<11>衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、<8>~<10>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<12>粉末又は液体である、<8>~<11>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<13>低温で使用される、<8>~<12>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<14>40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上で使用されるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃で使用される、<13>に記載の洗浄剤組成物。
<9>スルホコハク酸エステル又はその塩、好ましくは炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは炭素数10の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩をさらに含有する、<8>に記載の洗浄剤組成物。
<10>スルホコハク酸ジエステル又はその塩、好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9以上12以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数9又は10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは2つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素10の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくはビス-(2-プロピルヘプチル)スルホコハク酸又はその塩をさらに含有する、<8>に記載の洗浄剤組成物。
<11>衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、<8>~<10>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<12>粉末又は液体である、<8>~<11>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<13>低温で使用される、<8>~<12>のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
<14>40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上で使用されるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃で使用される、<13>に記載の洗浄剤組成物。
<15><8>~<14>のいずれかに記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
<16>被洗浄物と<8>~<14>のいずれかに記載の洗浄剤組成物とを接触させることを含む、<15>に記載の方法。
<17>汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、<15>又は<16>に記載の方法。
<16>被洗浄物と<8>~<14>のいずれかに記載の洗浄剤組成物とを接触させることを含む、<15>に記載の方法。
<17>汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、<15>又は<16>に記載の方法。
<18>洗浄剤組成物の製造のための下記のいずれかのリパーゼの使用:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<19>リパーゼが配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、<18>に記載の使用。
<20>洗浄剤組成物が衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、<18>又は<19>に記載の使用。
<21>洗浄剤組成物が粉末又は液体である、<18>~<20>のいずれかに記載の使用。
<22>洗浄剤組成物が低温で使用されるものである、<18>~<21>のいずれかに記載の使用。
<23>洗浄剤組成物が40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上で使用されるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃で使用されるものである、<22>に記載の使用。
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<19>リパーゼが配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、<18>に記載の使用。
<20>洗浄剤組成物が衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、<18>又は<19>に記載の使用。
<21>洗浄剤組成物が粉末又は液体である、<18>~<20>のいずれかに記載の使用。
<22>洗浄剤組成物が低温で使用されるものである、<18>~<21>のいずれかに記載の使用。
<23>洗浄剤組成物が40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上で使用されるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃で使用されるものである、<22>に記載の使用。
<24>汚れの洗浄のための下記のいずれかのリパーゼの使用:
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<25>リパーゼが配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、<24>に記載の使用。
<26>汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、<24>又は<25>に記載の使用。
<27>洗浄が低温での洗浄である、<24>~<26>のいずれかに記載の使用。
<28>洗浄が40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上での洗浄であるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃での洗浄である、<27>に記載の使用。
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
<25>リパーゼが配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42又は44で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、<24>に記載の使用。
<26>汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、<24>又は<25>に記載の使用。
<27>洗浄が低温での洗浄である、<24>~<26>のいずれかに記載の使用。
<28>洗浄が40℃以下、35℃以下、30℃以下、25℃以下で、且つ5℃以上、10℃以上、15℃以上での洗浄であるか、又は5~40℃、10~35℃、15~30℃、15~25℃での洗浄である、<27>に記載の使用。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
(1)リパーゼ発現プラスミドの構築
リパーゼ発現プラスミドは、WO2021/153129に記載の枯草菌spoVG遺伝子由来プロモーターを含む配列番号26のVHHの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのVHH遺伝子を含むORF全長に、In-Fusion反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Lipr139、PvLip、PfLip、EtLip、EspLip、YeLip、AncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15、AncLip16、Lipr138(それぞれ配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及び45のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及び46のアミノ酸配列をコードする)から、それぞれプラスミドpHY-Lipr139、pHY-PvLip、pHY-PfLip、pHY-EtLip、pHY-EspLip、pHY-YeLip、pHY-AncLip1、pHY-AncLip2、pHY-AncLip3、pHY-AncLip4、pHY-AncLip5、pHY-AncLip6、pHY-AncLip7、pHY-AncLip8、pHY-AncLip9、pHY-AncLip10、pHY-AncLip11、pHY-AncLip12、pHY-AncLip13、pHY-AncLip14、pHY-AncLip15、pHY-AncLip16、pHY-Lipr138を構築した。尚、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及び44のいずれかで示されるアミノ酸配列は、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼの由来菌の祖先生物が有していたと推定される新規リパーゼ配列である。プラスミドpHY-Lipr139のLipr139遺伝子を含むORF全長に、N末端側に枯草菌amyE由来シグナル配列(配列番号49のポリヌクレオチド、配列番号50のアミノ酸配列をコードする)が連結されたリパーゼTLL遺伝子(配列番号47のポリヌクレオチド、配列番号48のアミノ酸配列をコードする)の人工合成遺伝子をIn-Fusion反応によって載せ替えることでpHY-amyEsig-TLLを構築した。
リパーゼ発現プラスミドは、WO2021/153129に記載の枯草菌spoVG遺伝子由来プロモーターを含む配列番号26のVHHの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのVHH遺伝子を含むORF全長に、In-Fusion反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Lipr139、PvLip、PfLip、EtLip、EspLip、YeLip、AncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15、AncLip16、Lipr138(それぞれ配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及び45のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及び46のアミノ酸配列をコードする)から、それぞれプラスミドpHY-Lipr139、pHY-PvLip、pHY-PfLip、pHY-EtLip、pHY-EspLip、pHY-YeLip、pHY-AncLip1、pHY-AncLip2、pHY-AncLip3、pHY-AncLip4、pHY-AncLip5、pHY-AncLip6、pHY-AncLip7、pHY-AncLip8、pHY-AncLip9、pHY-AncLip10、pHY-AncLip11、pHY-AncLip12、pHY-AncLip13、pHY-AncLip14、pHY-AncLip15、pHY-AncLip16、pHY-Lipr138を構築した。尚、配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及び44のいずれかで示されるアミノ酸配列は、Proteus/Yersiniaクレードに属する現存リパーゼの由来菌の祖先生物が有していたと推定される新規リパーゼ配列である。プラスミドpHY-Lipr139のLipr139遺伝子を含むORF全長に、N末端側に枯草菌amyE由来シグナル配列(配列番号49のポリヌクレオチド、配列番号50のアミノ酸配列をコードする)が連結されたリパーゼTLL遺伝子(配列番号47のポリヌクレオチド、配列番号48のアミノ酸配列をコードする)の人工合成遺伝子をIn-Fusion反応によって載せ替えることでpHY-amyEsig-TLLを構築した。
(2)リパーゼ溶液の調整
リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、0.04%塩化カルシウム二水和物、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)で、30℃、2日間培養した後、リパーゼを含む培養上清を遠心分離により回収した。透析によって培養上清を10mM Tris-HCl+0.01% Triton-X100(pH7.0)にバッファー交換し、SDS-PAGEのバンド強度からリパーゼ濃度を定量した。
リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、0.04%塩化カルシウム二水和物、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)で、30℃、2日間培養した後、リパーゼを含む培養上清を遠心分離により回収した。透析によって培養上清を10mM Tris-HCl+0.01% Triton-X100(pH7.0)にバッファー交換し、SDS-PAGEのバンド強度からリパーゼ濃度を定量した。
(3)界面活性剤溶液中での活性測定
オクタン酸4-ニトロフェニル(SIGMA)を基質として用いた。リパーゼの作用による4-ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。20mM Tris-HCl(pH7.0)中の20mM オクタン酸4-ニトロフェニルを基質溶液として用いた。20mM Tris-HCl(pH7.0)にSDS又はTriton X-100を0.1%(w/v)添加したものを界面活性剤溶液として用いた。2ppmに調整したリパーゼ溶液5μLと界面活性剤溶液100μLを96穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液10μLを添加して、30℃で405nmの吸光度変化(OD/min)を測定した。ブランク(酵素添加無しサンプル)との差分ΔOD/minを活性値とした。各リパーゼについて、界面活性剤溶液の代わりに20mM Tris-HCl(pH7.0)を用いた際の活性値(バッファー中での活性)で界面活性剤溶液中での活性値を割って100をかけた値を、相対活性(%)として求めた(図1)。
TLL、特許文献1、2及び3において洗浄への適性が開示されているLipr139、PvLip及びLipr138、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるPfLip、EtLip、EspLip及びYeLipは、SDS及びTriton X-100の存在下で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15及びAncLip16はTriton X-100による活性阻害に対して高い耐性を示した。さらにAncLip3、AncLip4、AncLip6、AncLip8、AncLip9、AncLip12及びAncLip13はSDSによる活性阻害に対して高い耐性を示した。
オクタン酸4-ニトロフェニル(SIGMA)を基質として用いた。リパーゼの作用による4-ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。20mM Tris-HCl(pH7.0)中の20mM オクタン酸4-ニトロフェニルを基質溶液として用いた。20mM Tris-HCl(pH7.0)にSDS又はTriton X-100を0.1%(w/v)添加したものを界面活性剤溶液として用いた。2ppmに調整したリパーゼ溶液5μLと界面活性剤溶液100μLを96穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液10μLを添加して、30℃で405nmの吸光度変化(OD/min)を測定した。ブランク(酵素添加無しサンプル)との差分ΔOD/minを活性値とした。各リパーゼについて、界面活性剤溶液の代わりに20mM Tris-HCl(pH7.0)を用いた際の活性値(バッファー中での活性)で界面活性剤溶液中での活性値を割って100をかけた値を、相対活性(%)として求めた(図1)。
TLL、特許文献1、2及び3において洗浄への適性が開示されているLipr139、PvLip及びLipr138、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるPfLip、EtLip、EspLip及びYeLipは、SDS及びTriton X-100の存在下で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15及びAncLip16はTriton X-100による活性阻害に対して高い耐性を示した。さらにAncLip3、AncLip4、AncLip6、AncLip8、AncLip9、AncLip12及びAncLip13はSDSによる活性阻害に対して高い耐性を示した。
(4)モデル洗浄液中での活性測定
20 mM Tris-HCl(pH7.0)中の20mM オクタン酸4-ニトロフェニルを基質溶液として用いた。モデル洗浄液として、表1の水性媒体を用いた。4ppmに調整したリパーゼ溶液2μLと試験液(モデル洗浄液又は20mM Tris-HCl(pH7.0))100μLを96穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液10μLを添加して、30℃で405nmの吸光度変化(OD/min)を測定した。ブランク(酵素添加無しサンプル)との差分ΔOD/minを求めた。31~500μMの4-ニトロフェノールを含む20mM Tris-HCl(pH7.0)10μLを各試験液100μLと混合し、405nmの吸光度を測定し検量線を作成した。各試験液の検量線とΔOD/minの値から、一分間あたりの4-ニトロフェノールの遊離速度(μM/min)を活性値として算出した。
各リパーゼについて、20mM Tris-HCl(pH7.0)を試験液とした際の活性値(バッファー中での活性)で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って100をかけた値を、相対活性(%)として求めた(図2)。
TLL、特許文献1、2及び3において洗浄への適性が開示されているLipr139、PvLip及びLipr138、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるPfLip、EtLip、EspLip及びYeLipは、モデル洗浄液中で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip3、AncLip4、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15及びAncLip16はモデル洗浄液中での活性阻害に対して高い耐性を示した。
20 mM Tris-HCl(pH7.0)中の20mM オクタン酸4-ニトロフェニルを基質溶液として用いた。モデル洗浄液として、表1の水性媒体を用いた。4ppmに調整したリパーゼ溶液2μLと試験液(モデル洗浄液又は20mM Tris-HCl(pH7.0))100μLを96穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液10μLを添加して、30℃で405nmの吸光度変化(OD/min)を測定した。ブランク(酵素添加無しサンプル)との差分ΔOD/minを求めた。31~500μMの4-ニトロフェノールを含む20mM Tris-HCl(pH7.0)10μLを各試験液100μLと混合し、405nmの吸光度を測定し検量線を作成した。各試験液の検量線とΔOD/minの値から、一分間あたりの4-ニトロフェノールの遊離速度(μM/min)を活性値として算出した。
各リパーゼについて、20mM Tris-HCl(pH7.0)を試験液とした際の活性値(バッファー中での活性)で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って100をかけた値を、相対活性(%)として求めた(図2)。
TLL、特許文献1、2及び3において洗浄への適性が開示されているLipr139、PvLip及びLipr138、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるPfLip、EtLip、EspLip及びYeLipは、モデル洗浄液中で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip3、AncLip4、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14、AncLip15及びAncLip16はモデル洗浄液中での活性阻害に対して高い耐性を示した。
(5)モデル洗浄液中での洗浄評価
牛脂(SIGMA,03-0660)とナタネ油(SIGMA,23-0450)を重量比9:1で混合し、3倍量のクロロホルムに溶解した後に0.2wt%のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとした。ポリプロピレン製の96穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを10μLずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとした。
表1記載のモデル洗浄液に、1/100容量の240ppmのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とした。汚れプレートに洗浄液を300μLずつ緩やかに添加し、室温(約22℃)で15分間静置して浸漬洗浄を行った。底部の汚れに触れないように洗浄液を100μLずつ分取し、新しい96穴プレートに移した。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、500nmの吸光度(A500)を測定した。洗浄後のA500から洗浄前のA500を差し引いた値ΔA500は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。各リパーゼの洗浄力ΔA500を図3に示した。
特許文献1において洗浄への適性が開示されているLipr139は、TLL、Lipr138、PvLip、PfLip、EtLip、EspLip及びYeLipと比較して、モデル洗浄液中で高い洗浄力を示した。一方、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14及びAncLip15はモデル洗浄液中でLipr139と比較して顕著に高い洗浄力を示した。
牛脂(SIGMA,03-0660)とナタネ油(SIGMA,23-0450)を重量比9:1で混合し、3倍量のクロロホルムに溶解した後に0.2wt%のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとした。ポリプロピレン製の96穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを10μLずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとした。
表1記載のモデル洗浄液に、1/100容量の240ppmのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とした。汚れプレートに洗浄液を300μLずつ緩やかに添加し、室温(約22℃)で15分間静置して浸漬洗浄を行った。底部の汚れに触れないように洗浄液を100μLずつ分取し、新しい96穴プレートに移した。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、500nmの吸光度(A500)を測定した。洗浄後のA500から洗浄前のA500を差し引いた値ΔA500は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。各リパーゼの洗浄力ΔA500を図3に示した。
特許文献1において洗浄への適性が開示されているLipr139は、TLL、Lipr138、PvLip、PfLip、EtLip、EspLip及びYeLipと比較して、モデル洗浄液中で高い洗浄力を示した。一方、新規の祖先型リパーゼAncLip1、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9、AncLip10、AncLip11、AncLip12、AncLip13、AncLip14及びAncLip15はモデル洗浄液中でLipr139と比較して顕著に高い洗浄力を示した。
Lipr139、PvLip、PfLip、EtLip、EspLip、YeLip、AncLip1、AncLip2、AncLip3、AncLip4、AncLip5、AncLip6、AncLip7、AncLip8、AncLip9(それぞれ配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28及び30)のアミノ酸配列を用いて系統樹を作成した。Genetyxを用いてclustalWによりマルチプルアライメントを行い、近隣結合法(Neighbor-Joining method:NJ法)により系統樹を作成した(図4)。
Claims (11)
- 下記のいずれかのリパーゼ:
配列番号32で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号14で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号16で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも76%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号18で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号20で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号22で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号24で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号26で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号28で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも82%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号30で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号34で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも79%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号36で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号38で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも73%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号40で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも71%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;
配列番号42で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも72%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ;及び
配列番号44で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。 - 請求項1に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はDNA断片。
- 請求項3に記載のベクター又はDNA断片を含有する形質転換細胞。
- 微生物である、請求項4に記載の形質転換細胞。
- 請求項1に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
- 衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項6に記載の洗浄剤組成物。
- 粉末又は液体である、請求項7に記載の洗浄剤組成物。
- 低温で使用される、請求項7又は8に記載の洗浄剤組成物。
- 5~40℃の温度で使用される、請求項9に記載の洗浄剤組成物。
- 請求項6~10のいずれか1項に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022-066571 | 2022-04-13 | ||
JP2022066571A JP2023156913A (ja) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 新規リパーゼ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2023199945A1 true WO2023199945A1 (ja) | 2023-10-19 |
Family
ID=88329892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2023/014862 WO2023199945A1 (ja) | 2022-04-13 | 2023-04-12 | 新規リパーゼ |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2023156913A (ja) |
WO (1) | WO2023199945A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2024034839A (ja) * | 2022-09-01 | 2024-03-13 | 花王株式会社 | リパーゼの探索方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013073760A1 (ko) * | 2011-11-18 | 2013-05-23 | 한국생명공학연구원 | 갯벌 메타게놈 유래 신규 유전자 및 이로부터 얻어지는 포스포리파제 및 리파제 동시 활성을 보이는 신규 단백질 |
JP2015523078A (ja) * | 2012-07-12 | 2015-08-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド |
JP2015525248A (ja) * | 2012-05-16 | 2015-09-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼを含む組成物およびその使用方法 |
WO2020046613A1 (en) * | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Danisco Us Inc | Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof |
-
2022
- 2022-04-13 JP JP2022066571A patent/JP2023156913A/ja active Pending
-
2023
- 2023-04-12 WO PCT/JP2023/014862 patent/WO2023199945A1/ja unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013073760A1 (ko) * | 2011-11-18 | 2013-05-23 | 한국생명공학연구원 | 갯벌 메타게놈 유래 신규 유전자 및 이로부터 얻어지는 포스포리파제 및 리파제 동시 활성을 보이는 신규 단백질 |
JP2015525248A (ja) * | 2012-05-16 | 2015-09-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼを含む組成物およびその使用方法 |
JP2015523078A (ja) * | 2012-07-12 | 2015-08-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | リパーゼ活性を有するポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド |
WO2020046613A1 (en) * | 2018-08-30 | 2020-03-05 | Danisco Us Inc | Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
DATABASE Prootein 13 June 2015 (2015-06-13), ANONYMOUS: "lipase [Yersinia nurmii]", XP093099069, retrieved from NCBI Database accession no. CNE94863.1 * |
DATABASE Protein 12 April 2020 (2020-04-12), ANONYMOUS: "triacylglycerol lipase [Cedecea sp. FDAARGOS_727]", XP093099079, retrieved from NCBI Database accession no. QIX96665.1 * |
DATABASE Protein 14 June 2015 (2015-06-14), ANONYMOUS: "lipase [Yersinia massiliensis]", XP093099075, retrieved from NCBI Database accession no. CNH57461.1 * |
DATABASE Protein 16 December 2019 (2019-12-16), ANONYMOUS : "Triacylglycerol lipase [Enterobacterales bacterium 8AC]", XP093099083, retrieved from NCBI Database accession no. VXD06940.1 * |
DATABASE Protein 2 August 2018 (2018-08-02), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Enterobacillus tribolii]", XP093099080, retrieved from NCBI Database accession no. RDK97484.1 * |
DATABASE Protein 24 April 2018 (2018-04-24), ANONYMOUS : "triacylglycerol lipase [Yersinia enterocolitica]", XP093098787, retrieved from NCBI Database accession no. WP_049600386.1 * |
JAN ANNE-HéLèNE; DUBREUCQ ERIC; DRONE JULLIEN; SUBILEAU MAEVA: "A glimpse into the specialization history of the lipases/acyltransferases family of CpLIP2", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - PROTEINS & PROTEOMICS, ELSEVIER, NETHERLANDS, vol. 1865, no. 9, 13 June 2017 (2017-06-13), Netherlands , pages 1105 - 1113, XP085143900, ISSN: 1570-9639, DOI: 10.1016/j.bbapap.2017.06.004 * |
ROZI MOHAMAD FARIHAN AFNAN MOHD; RAHMAN RAJA NOOR ZALIHA RAJA ABD.; LEOW ADAM THEAN CHOR; ALI MOHD SHUKURI MOHAMAD: "Ancestral sequence reconstruction of ancient lipase from family I.3 bacterial lipolytic enzymes", MOLECULAR PHYLOGENETICS AND EVOLUTION, ORLANDO, FL, US, vol. 168, 27 December 2021 (2021-12-27), US , XP086947902, ISSN: 1055-7903, DOI: 10.1016/j.ympev.2021.107381 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2023156913A (ja) | 2023-10-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4897186B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
US7429642B2 (en) | Alkaline protease | |
WO2022014428A1 (ja) | アミラーゼ配合洗浄剤組成物 | |
WO2022071451A1 (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
US7405271B2 (en) | Alkaline protease | |
JP2004000122A (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
WO2023199945A1 (ja) | 新規リパーゼ | |
JP7057140B2 (ja) | 角質汚れ洗浄剤 | |
US20240034961A1 (en) | Enzymes and enzyme compositions for cleaning | |
WO2023199946A1 (ja) | 新規リパーゼ | |
WO2022044629A1 (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
WO2023278297A1 (en) | Variant lipases and uses thereof | |
WO2023190938A1 (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
WO2024177043A1 (ja) | リパーゼ変異体 | |
WO2024177042A1 (ja) | リパーゼ変異体 | |
JP4836701B2 (ja) | アルカリキシラナーゼ | |
WO2023120594A1 (ja) | アミラーゼ配合洗浄剤組成物 | |
WO2024024527A1 (ja) | 変異プロテアーゼ | |
WO2023176970A1 (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
JP5666816B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
WO2023168234A1 (en) | Enzymes and enzyme compositions for cleaning | |
JP2023138320A (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
JP5202716B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ | |
JP2022060158A (ja) | α-アミラーゼ変異体 | |
JP5698460B2 (ja) | 変異アルカリセルラーゼ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 23788363 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |