WO2022071451A1 - α－アミラーゼ変異体 - Google Patents

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amylase
mutant
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貴大 日置
真緒 釋
彰人 川原
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花王株式会社
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    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a variant of ⁇ -amylase.
  • ⁇ -Amylase is used in a wide range of industrial fields such as starch industry, brewing industry, textile industry, pharmaceutical industry and food industry, and is known to be suitable for use in detergents as a component for removing starchy stains. It is used in dishwashing agents for automatic dishwashers and detergents for clothing.
  • ⁇ -amylase useful for detergents are ⁇ -amylase AP1378 (Patent Document 1) derived from Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) strain and ⁇ -amylase derived from Bacillus likeniformis.
  • ⁇ -amylase AA560 Patent Document 2 derived from Bacillus sp. DSM12649 strain, ⁇ -amylase SP722 derived from Bacillus sp. 722 strain (Patent Document 3).
  • ⁇ -amylase CspAmy2 derived from the genus Cytopherga
  • Patent Document 5 these ⁇ -amylases have been modified so as to improve their functions for specific uses, and for example, mutants having improved stability in detergents have been reported.
  • Patent Document 1 International Publication No. 94/26881
  • Patent Document 2 International Publication No. 00/60060
  • Patent Document 3 International Publication No. 06/002643
  • Patent Document 4 International Publication No. 2014/1647777
  • Patent Document 3 Reference 5] International Publication No. 98/044126
  • the present invention relates to the following. 1) G5, S38, T49, Q96, N126, T129, G140, F153, Q167, G179, W186, E187, N192, M199, Y200, L203, Y205, D206, R211 and K215 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a variant of the parent ⁇ -amylase comprising modification of one or more amino acid residues at positions corresponding to each position of G477, wherein the parent ⁇ -amylase or ⁇ -amylase variant is in SEQ ID NO: 4.
  • An ⁇ -amylase variant having at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown. 2) A polynucleotide encoding a variant of 1). 3) A vector or DNA fragment containing the polynucleotide of 2). 4) Transformed cells containing the vector or DNA fragment of 3). 5) A detergent composition containing the variant of 1).
  • the present invention relates to providing ⁇ -amylase capable of functioning at low temperatures and at the same time maintaining or improving stability and / or cleaning performance.
  • the present inventors have succeeded in obtaining an ⁇ -amylase variant having improved cleaning performance and / or stability as compared with the parent ⁇ -amylase, using ⁇ -amylase that functions at low temperature as a parent.
  • an ⁇ -amylase variant having improved cleaning performance and / or stability as compared with the parent ⁇ -amylase.
  • an ⁇ -amylase mutant By using such an ⁇ -amylase mutant, it is possible to perform cleaning that exhibits an excellent starch stain removing effect even at low temperatures.
  • amylase (EC 3.2.1.1; ⁇ -D- (1 ⁇ 4) -glucan glucanohydrolase) refers to starch and other linear or branched 1,4-glycoside oligosaccharides. Alternatively, it means a group of enzymes that catalyze the hydrolysis of polysaccharides.
  • the ⁇ -amylase activity can be determined by measuring the amount of reduced ends produced by enzymatic degradation of starch. Further, the determination is not limited to this, and it can also be determined by measuring the release of the dye due to the enzymatic decomposition of the dye-crosslinked starch such as Phadebas (Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromagenic ⁇ -amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine.” Scandinavian journal of clinical and laboratory investment 30.3 (1972): 291-297.
  • the identity of an amino acid sequence or nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, the genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis with Unit size to homology (ktup) as 2 using 12 homology analysis (Search homology) programs.
  • amino acid residue refers to 20 kinds of amino acid residues constituting a protein, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or). D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamine (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L).
  • amino acid position and the variant is described as follows using the one-letter amino acid abbreviation of IUPAC, which is officially recognized.
  • Amino acids at predetermined positions are represented by [amino acids, positions].
  • threonine at position 226 is designated as "T226”.
  • substitution of an amino acid is expressed as [original amino acid, position, substituted amino acid].
  • substitution of threonine at position 226 with alanine is indicated as "T226A”.
  • Amino acid "deletion” is represented by [original amino acid, position, ⁇ ].
  • deletion of serin at position 181 is indicated as "S181 ⁇ ".
  • the "insertion" of an amino acid is expressed as [original amino acid, position, original amino acid, inserted amino acid].
  • the insertion of lysine after glycine at position 195 is indicated as "G195GK”.
  • Insertion of a plurality of amino acids is represented by [original amino acid, position, original amino acid, inserted amino acid No. 1, inserted amino acid No. 2; etc.].
  • the insertion of lysine and alanine after glycine at position 195 is designated as "G195GKA”.
  • Variants containing multiple modifications are represented by an addition symbol (“+”).
  • R170Y + G195E represents the substitution of arginine at position 170 with tyrosine and the substitution of glycine at position 195 with glutamic acid, respectively.
  • the different modifications are separated by a slash (“/”), for example “R170Y / E” represents the substitution of arginine at position 170 with tyrosine or glutamic acid.
  • a control region such as a promoter and a "operable linkage" of a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene mean upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • gene located downstream of the promoter means that the gene is present on the 3'side of the promoter in the DNA sense strand, and upstream of the gene means 5'of the gene in the DNA sense strand. Means the area on the side.
  • the term "original” used for a cell function, property, or trait is used to indicate that the function, property, or trait originally exists in the cell.
  • the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not originally present in the cell but is introduced from the outside.
  • a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide introduced externally into a cell.
  • the foreign gene or polynucleotide may be of the same species as the cell into which it was introduced or of a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • the variants of the present invention are G5, S38, T49, Q96, N126, T129, G140, F153, Q167, G179, W186, E187, N192, M199, Y200, L203, Y205, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a variant of the parent ⁇ -amylase comprising modification of one or more amino acid residues at positions corresponding to the positions W439, N471, G476 and G477. That is, the “variant” means a polypeptide having ⁇ -amylase activity in which amino acid residues at one or a plurality of predetermined positions are modified in the amino acids constituting the parent ⁇ -amylase. Modification of the amino acid residue at such a predetermined position is a modification for enhancing cleaning performance and / or stability in a detergent, and therefore, the variant has improved cleaning performance as compared with the parent ⁇ -amylase. And / or have stability.
  • the modification site (mutation position) of the amino acid residue is G5, S38, T49, Q96, N126, T129, G140, F153, Q167, G179, W186 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence constituting ⁇ -amylase YR288, and the mutation position in the variant of the present invention is numbered based on the amino acid number of the amino acid sequence.
  • YR288 is a protein registered as WP_100346362.1 in the NCBI protein sequence database, and is a protein specified by the present applicant as an ⁇ -amylase having high starch degrading activity and washing performance at low temperature (Japanese Patent Application No. 2020-121626).
  • the "corresponding position" on the amino acid sequence is determined by aligning the target sequence and the reference sequence (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the present invention) so as to give the maximum homology. be able to.
  • Amino acid sequence alignment can be performed using known algorithms and the procedure is known to those of skill in the art. For example, alignment can be performed by using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which is a revised version of Clustal W, can also be used.
  • Crystal W, Crystal W2 and Crystal omega are, for example, European Bioinformatics Institute (European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and Japanese DNA data operated by the National Institute of Genetics. It can be used on the website of the bank (DDBJ [www.dbbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • the position of the target sequence aligned to any position in the reference sequence by the above alignment is considered to be the "corresponding position" to that arbitrary position.
  • the similarity of amino acid sequences means the ratio (%) of the number of positions where the same or similar amino acid residues are present in both sequences when the two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues. ..
  • the similar amino acid residue means an amino acid residue that has properties similar to each other in terms of polarity and charge among the 20 kinds of amino acids constituting the protein and causes so-called conservative substitution.
  • Groups of such similar amino acid residues are well known to those of skill in the art, for example: arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and aspartin or arginine; leucine. And isoleucine, etc., respectively, but are not limited to these.
  • the "parent ⁇ -amylase” means a reference ⁇ -amylase that is modified to bring about a variant of the present invention.
  • the parent can be a natural (wild-type) polypeptide or variant thereof.
  • the parent ⁇ -amylase or ⁇ -amylase variant is at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 96%, more preferably at least 96%, more preferably at least 96%, more preferably at least 96%, more preferably at least 96%, more preferably at least 96% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the amino acid sequence. It has at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99% identity.
  • YR288 the amino acid residues corresponding to R178 and T180 were deleted in the ⁇ -amylase (YR288) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (the amino acid residues corresponding to R178 and T180 were deleted).
  • R178 ⁇ + T180 ⁇ ) ⁇ -amylase variant As shown in Examples described later, YR288 is a parent ⁇ -amylase containing deletions of amino acid residues at two positions corresponding to the positions R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The mutant is dramatically improved in stability in detergents as compared with YR288.
  • the ⁇ -amylase mutation lacking two or more amino acid residues at the positions corresponding to the R178, G179, T180 and G181 positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the body can be the parent ⁇ -amylase of any of the variants of the invention, including the ⁇ -amylase consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • R178 ⁇ + T180 ⁇ , G179 ⁇ + T180 ⁇ , R178 ⁇ + G179 ⁇ , R178 ⁇ + G181 ⁇ , G179 ⁇ + G181 ⁇ and the like are preferable, and R178 ⁇ + T180 ⁇ is more preferable.
  • ⁇ -amylases having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 include DE0178, which is an ⁇ -amylase derived from Bacillus flexus, and Bacillus sp. Examples thereof include RU2C, which is an ⁇ -amylase derived from Bacillus sp. (Japanese Patent Application No. 2020-121626).
  • Modifications of amino acid residues performed at one or more of the above-mentioned predetermined positions include substitution, insertion and / or deletion of amino acid residues.
  • substitution means replacing an amino acid at a position with a different amino acid
  • deletion means removing an amino acid at a position
  • insertion means adjoining an amino acid at a position. It means that amino acids are added so as to be directly continuous.
  • the number of mutation sites may be one or more, but it is preferably two or more, more preferably 2 to 15, more preferably 3 to 15, and even more preferably 5 to 10.
  • the mutant is preferably ⁇ -amylase having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 from the viewpoint of improving cleaning performance or stability.
  • the mutant may contain any number of conservative amino acid substitutions as long as it retains the above-mentioned mutant properties.
  • G5 is preferably substituted with E, D, P, R or K (G5E / D / P / R / K); Substitution with N (S38N) is preferable for S38; Substitution with Q (T49Q) is preferable for T49;
  • N126 is preferably substituted with Y (N126Y); T129 is preferably substituted with I (T129I); G140 is preferably substituted with Y, F or W (G140Y / F / W); F153 is preferably substituted with W (F153W);
  • substitution with E (Q167E) is preferable; G179 is preferably substituted with D or H (G179D / H); W186 is preferably substituted with L (W186L); E187 is preferably substituted with P (E187P); N192 is preferably substituted with F (N192F); M199 is preferably substituted with L, T, A, N, Q, S,
  • a mutant having at least the combination mutation is a mutant that particularly contributes to the improvement of cleaning performance.
  • a mutant having at least the combination mutation is a mutant that particularly contributes to the improvement of stability.
  • a mutation combining the combination mutations in Tables 1-1 to 1-4 and the combination mutations in Tables 2-1 to 2-4 is also preferable from the viewpoint of improving cleaning performance and stability.
  • a mutant having at least the combination mutation is a mutant that particularly contributes to the improvement of cleaning performance and stability.
  • the mutant of the present invention can be produced using various mutagenesis techniques known in the art.
  • the polynucleotide encoding the amino acid residue to be modified in the parent ⁇ -amylase gene (reference ⁇ -amylase gene) encoding the reference amino acid sequence is mutated to the polynucleotide encoding the modified amino acid residue. Further, it can be produced by expressing a mutant from the mutant gene.
  • the polynucleotide encoding the variant of the invention can be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or can be cDNA, or chemically synthesized DNA that does not contain introns.
  • various mutagenesis techniques known in the art can be used as means for mutating the amino acid residue of the parent ⁇ -amylase.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated is mutated to the nucleotide sequence encoding the amino acid residue after the mutation.
  • the introduction of the desired mutation into the parent gene can basically be carried out by using various site-specific mutation introduction methods well known to those skilled in the art.
  • the site-specific mutagenesis method can be performed by any method such as an inverse PCR method or an annealing method.
  • a commercially available site-directed mutagentage kit (for example, a QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, a QuickChange Multi Site-Directed Mutagesis Kit, etc.) can also be used.
  • the site-specific mutagenesis into the parent gene can most generally be carried out using a mutagenizing primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer anneals to the region containing the nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and replaces the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated with the post-mutation amino acid. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a residue. Nucleotide sequences (codons) encoding amino acid residues before and after mutation can be appropriately recognized and selected by those skilled in the art based on ordinary textbooks and the like.
  • SOE splicing by overflow extension
  • SOE is a DNA fragment obtained by amplifying the upstream side and the downstream side of the mutation site separately using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • -A method of linking to one by PCR (Gene, 1989, 77 (1): p61-68) can also be used.
  • the template DNA containing the parent gene can be prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned microorganism producing ⁇ -amylase by a conventional method, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription.
  • the corresponding nucleotide sequence may be chemically synthesized and used as a template DNA based on the amino acid sequence of the parent ⁇ -amylase.
  • the DNA sequence containing the base sequence encoding the ⁇ -amylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is assigned to SEQ ID NO: 3
  • the base sequence encoding the ⁇ -amylase (YR288) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is assigned to SEQ ID NO: 3.
  • the DNA sequence contained is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the primer for mutation can be prepared by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4search, 1989, 17: 7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.).
  • a primer set containing the mutation primer and introducing a site-specific mutation as described above using the parent gene as a template DNA a polynucleotide encoding the mutant of the present invention having the desired mutation can be obtained. Can be done.
  • the polynucleotide encoding the variant of the invention may include single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA or other artificial nucleic acids.
  • the DNA, cDNA and RNA may be chemically synthesized.
  • the polynucleotide may also contain a nucleotide sequence of an untranslated region (UTR) in addition to the open reading frame (ORF).
  • UTR untranslated region
  • ORF open reading frame
  • the polynucleotide may be codon-optimized according to the species of the transformant for producing the mutant polypeptide of the present invention. Information on codons used by various organisms can be obtained from Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the obtained polynucleotide encoding the variant of the present invention can be incorporated into a vector.
  • the type of the vector containing the polynucleotide is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, a phage, a phagemid, a cosmid, a virus, a YAC vector, and a shuttle vector.
  • the vector is not limited, but is preferably a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a Bacillus bacterium (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a introduced gene in a Bacillus bacterium. It is an expression vector capable of inducing the expression of.
  • the shuttle vector which is a vector that can be replicated by any of Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the mutant of the present invention.
  • preferred vectors are, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 34929935), pHY300PLK (an expression vector capable of transforming both E. coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: 235-243), shuttle vectors such as pAC3 (E.
  • Examples include plasmid vectors that can be used for transformation of Bacillus spp.
  • plasmid vectors derived from Escherichia coli for example, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc. can also be used.
  • the vector may include a DNA replication initiation region or a DNA region containing an origin of replication.
  • the promoter region, terminator region, or expressed protein for initiating transcription of the gene is extracellularly above the polynucleotide encoding the mutant of the present invention (that is, the mutant gene).
  • Control sequences such as secretory signaling regions for secretion into may be operably linked.
  • "operably linked" to the gene and the control sequence means that the gene and the control region are arranged so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • control sequence such as the promoter region, terminator, and secretory signal region is not particularly limited, and a normally used promoter or secretory signal sequence can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
  • a preferred example of a control sequence that can be incorporated into a vector is Baclls sp. Examples include the promoter of the cellulase gene of the KSM-S237 strain, the secretory signal sequence, and the like.
  • the vector of the present invention further incorporates a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced (for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol). May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a gene encoding a synthase of the required nutrient may be incorporated into the
  • the linkage between the polynucleotide encoding the mutant of the present invention and the control sequence and the marker gene is known in the art such as SOE (splicing by overflow extension) -PCR method (Gene, 1989, 77: 61-68). It can be done by the method of. Procedures for introducing the ligated fragments into the vector are well known in the art.
  • Transformation of the invention by introducing into the host a vector containing a polynucleotide encoding a variant of the invention, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding a variant of the invention into the genome of the host. You can get cells.
  • Examples of host cells include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
  • bacteria include Escherichia coli, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, and the like.
  • Bacteria of the genus Bacillus for example, Bacillus subtilis Marbulg No. 168 (Bacillus 168 strain) or a mutant strain thereof) are preferable.
  • Bacillus subtilis mutants include J. Biosci. Bioeng. , 2007, 104 (2): Protease 9-fold deficient strain KA8AX according to 135-143, and Biotechnol. Let.
  • filamentous fungi include the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Rizhopus, and the like.
  • a method for introducing the vector into the host a method usually used in the art such as a protoplast method and an electroporation method can be used.
  • a strain that has been appropriately introduced using the expression of the marker gene, auxotrophy, and the like as indicators By selecting a strain that has been appropriately introduced using the expression of the marker gene, auxotrophy, and the like as indicators, the target transformant into which the vector has been introduced can be obtained.
  • a fragment in which a polynucleotide encoding a mutant of the present invention, a control sequence and a marker gene are ligated can be directly introduced into the genome of the host.
  • a DNA fragment in which a sequence complementary to the host genome is added to both ends of the linking fragment is constructed, and this is introduced into the host to be introduced between the host genome and the DNA fragment.
  • the polynucleotide encoding the mutant of the present invention is introduced into the genome of the host.
  • the transformant thus obtained into which the polynucleotide encoding the mutant of the present invention or the vector containing the same is introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector is expressed.
  • the mutant of the present invention is produced.
  • the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of microorganism of the transformant.
  • the mutant of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the mutant of the present invention or a transcript thereof using a cell-free translation system.
  • the "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which a reagent such as an amino acid necessary for protein translation is added to a suspension obtained by mechanically destroying a host cell. It is composed of.
  • Variants of the invention produced in the culture or cell-free translation system can be used in common methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography. Etc. can be isolated or purified by using them alone or in combination as appropriate.
  • the gene encoding the ⁇ -amylase variant of the present invention and the secretory signal sequence are operably linked on the vector in the transformant, the produced protein is secreted extracellularly, and thus more. It can be easily recovered from the culture.
  • the protein recovered from the culture may be further purified by known means.
  • the mutant of the present invention thus obtained has improved cleaning performance and / or stability as compared with the parent ⁇ -amylase.
  • the "improved cleaning performance” means an improved cleaning effect as compared with the parent ⁇ -amylase, for example, the ability to bring about stain removal in a washing or washing step.
  • Cleaning performance can be evaluated using methods well known in the art. For example, a contaminated cloth cut to a predetermined size is inserted into a well of a 96-well assay plate, and a detergent solution and an enzyme solution are added for cleaning under predetermined conditions. The absorbance at 488 nm is measured for the cleaning liquid after the cleaning is completed, and the difference ⁇ A488 from the blank is determined as the cleaning power. The relative detergency can be determined by dividing the mutant ⁇ A488 by the parent ⁇ -amylase ⁇ A488.
  • improved stability means the ability to maintain ⁇ -amylase activity in the presence of a cleaning agent, which is improved as compared with the parent ⁇ -amylase. Stability can be assessed using methods well known in the art. For example, an enzyme solution is added to a detergent, and after a predetermined time treatment, the ⁇ -amylase activity is measured, the inactivation rate per unit time (h) by the treatment is calculated, and the half-life (h) is calculated. Relative stability can be determined by dividing the half-life (h) of the mutant by the half-life (h) of the parent ⁇ -amylase.
  • the variant of the present invention is useful as an enzyme for blending various detergent compositions, and is particularly useful as an enzyme for blending detergent compositions suitable for low-temperature cleaning.
  • the "low temperature” include 40 ° C. or lower, 35 ° C. or lower, 30 ° C. or lower, 25 ° C. or lower, and 5 ° C. or higher, 10 ° C. or higher, and 15 ° C. or higher. Further, 5 to 40 ° C., 10 to 35 ° C., 15 to 30 ° C., and 15 to 25 ° C. may be mentioned.
  • the amount of the mutant of the present invention blended into the detergent composition is not particularly limited as long as the protein exhibits activity, but for example, it is preferably 1 mg or more, more preferably 10 mg or more per 1 kg of the detergent composition. , More preferably 50 mg or more, and preferably 5000 mg or less, more preferably 1000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, it is preferably 1 to 5000 mg, more preferably 10 to 1000 mg, and even more preferably 50 to 500 mg.
  • various enzymes can be used in combination in the detergent composition.
  • hydrolases oxidoreductases, reductases, transferases, lyases, isomerases, ligases, synthetases and the like.
  • amylase protease, cellulase, keratinase, esterase, cutinase, lipase, pullulanase, pectinase, mannanase, glucosidase, glucanase, cholesterol oxidase, peroxidase, lacquerase and the like, which are different from the proteins of the present invention, are preferable, and protease, cellulase and amylase are particularly preferable.
  • Lipase is preferred.
  • proteases examples include commercially available Alcalase, Esperase, Everlase, Savinase, Kannase, Progress Uno (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ, EXCELLENZ (registered trademark; DuPont), and Loverge (registered trademark; Dupont). Kao), etc.
  • cellulase examples include Cellulase, Carezyme (registered trademark; Novozymes), KAC, an alkaline cellulase produced by Bacillus sp. KSM-S237 strain described in JP-A No. 10-313859, and a variant described in JP-A-2003-313592.
  • Alkaline cellulase (above, Kao) and the like can be mentioned.
  • amylase include Termamyl, Duramyl, Steinzyme, Steinzyme Plus, Amylase Prime (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ (registered trademark; DuPont), and KAM (Kao).
  • lipase examples include Lipase and Lipex (registered trademark; Novozymes).
  • a known cleaning agent component can be blended in the cleaning agent composition, and examples of the known cleaning agent component include the following.
  • the surfactant is blended in an amount of 0.5 to 60% by mass in the detergent composition, particularly 10 to 45% by mass for the powder detergent composition and 20 to 90% for the liquid detergent composition. It is preferable to add by mass%.
  • the surfactant is generally 1 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • surfactant used in the cleaning agent composition examples include one or a combination of anionic surfactant, nonionic surfactant, amphoteric surfactant, and cationic surfactant. Preferred are anionic surfactants and nonionic surfactants.
  • anionic surfactant examples include sulfate ester salts of alcohols having 10 to 18 carbon atoms, sulfate ester salts of alkoxylated alcoholic acids having 8 to 20 carbon atoms, alkylbenzene sulfonates, paraffin sulfonates, and ⁇ -olefin sulfonates. Preference is given to acid salts, internal olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid alkyl ester salts or fatty acid salts.
  • a linear alkylbenzene sulfonate having 10 to 14 carbon atoms in an alkyl chain, more preferably 12 to 14 carbon atoms, and an internal olefin having 12 to 20 carbon atoms in an alkylene chain, more preferably 16 to 18 carbon atoms.
  • One or more anionic surfactants selected from sulfones are preferable, and as counterions, alkali metal salts and amines are preferable, and sodium and / or potassium, monoethanolamine and diethanolamine are particularly preferable.
  • WO2017 / 098637 can be referred to.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) phenyl ether, and polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (8 to 20 carbon atoms). 22) Esters, polyoxyalkylene glycol fatty acid (8 to 22 carbon atoms) esters, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymers are preferable.
  • 4 to 20 mol of an alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide is added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms
  • HLB value calculated by the Griffin method
  • polyoxyalkylene alkyl ethers are preferred.
  • the divalent metal ion scavenger is blended in an amount of 0.01 to 50% by mass, preferably 5 to 40% by mass.
  • the divalent metal ion trapping agent used in the cleaning agent composition of the present invention includes condensed phosphates such as tripolyphosphate, pyrophosphate and orthophosphate, aluminosilicates such as zeolite, and synthetic layered crystalline silicates. , Nitrilo triacetate, ethylenediamine tetraacetate, citrate, isocitrate, polyacetal carboxylate and the like.
  • crystalline aluminosilicate is particularly preferable, and among A-type, X-type, and P-type zeolites, A-type is particularly preferable.
  • synthetic zeolite one having an average primary particle size of 0.1 to 10 ⁇ m, particularly 0.1 to 5 ⁇ m, is preferably used.
  • Alkaline agent is blended in an amount of 0.01 to 80% by mass, preferably 1 to 40% by mass.
  • alkali metal carbonates such as sodium carbonate collectively referred to as dense ash and light ash, and amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, No. 3 and the like can be mentioned.
  • These inorganic alkaline agents are effective in forming the skeleton of particles when the detergent is dried, and a detergent that is relatively hard and has excellent fluidity can be obtained.
  • alkalis other than these include sodium sesquicarbonate, sodium hydrogencarbonate and the like, and phosphates such as tripolyphosphate also have an action as an alkaline agent.
  • sodium hydroxide and mono, di or triethanolamine can be used in addition to the above alkaline agent, and can also be used as a counter ion of the activator.
  • the anti-recontamination agent is blended in an amount of 0.001 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • the anti-recontamination agent used in the cleaning agent composition of the present invention include polyethylene glycol, carboxylic acid-based polymers, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • the carboxylic acid polymer has the ability to prevent recontamination, the function of capturing metal ions, and the function of dispersing solid particle stains from clothing into the washing bath.
  • the carboxylic acid polymer is a homopolymer or copolymer such as acrylic acid, methacrylic acid, and itaconic acid, and the copolymer is preferably a copolymer of the above-mentioned monomer and maleic acid, and has a molecular weight of several thousand to 100,000. preferable.
  • polymers such as polyglycidylate, cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose, and aminocarboxylic acid-based polymers such as polyaspartic acid also have metal ion trapping agents, dispersants, and anti-recontamination ability. Therefore, it is preferable.
  • Bleaching agent For example, it is preferable to add 1 to 10% by mass of a bleaching agent such as hydrogen peroxide and percarbonate.
  • a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or JP-A-6-316700 can be blended in an amount of 0.01 to 10% by mass.
  • Fluorescent agent examples include a biphenyl type fluorescent agent (for example, Tinopearl CBS-X) and a stilbene type fluorescent agent (for example, DM type fluorescent dye).
  • the fluorescent agent is preferably blended in an amount of 0.001 to 2% by mass.
  • Cleaning agent compositions include builders known in the field of laundry detergents, softeners, reducing agents (sulfites, etc.), defoaming agents (silicone, etc.), fragrances, antibacterial and antifungal agents. (Proxel [trade name], benzoic acid, etc.) and other additives can be contained.
  • the detergent composition can be produced according to a conventional method by combining the protein of the present invention obtained by the above method and the above known cleaning components.
  • the form of the detergent can be selected according to the application, and can be, for example, liquid, powder, granule, paste, solid or the like.
  • the detergent composition thus obtained shall be used as a laundry detergent, a dishwashing agent, a bleaching agent, a hard surface cleaning detergent, a drainage pipe cleaning agent, a artificial tooth cleaning agent, a sterilizing cleaning agent for medical instruments, and the like.
  • a laundry detergent and a dishwashing agent are preferable, and a laundry detergent (washing detergent for laundry), a dishwashing detergent by hand washing, and a cleaning agent for an automatic dishwashing machine are more preferable.
  • the detergent composition is suitable for use at 40 ° C. or lower, 35 ° C. or lower, 30 ° C. or lower, 25 ° C. or lower, and 5 ° C. or higher, 10 ° C. or higher, 15 ° C. or higher. Further, it is suitable for use at 5 to 40 ° C, 10 to 35 ° C, 15 to 30 ° C, and 15 to 25 ° C.
  • a variant of the parent ⁇ -amylase comprising modification of one or more amino acid residues at positions corresponding to the respective positions of G476 and G477, wherein the parent ⁇ -amylase or ⁇ -amylase variant is SEQ ID NO: 4.
  • ⁇ 3> A variant of ⁇ 1> or ⁇ 2> in which the modification of the amino acid residue is a modification of two or more places.
  • ⁇ 4> The variant of ⁇ 1>, wherein the modification of the amino acid residue is a modification of the amino acid residue at a position corresponding to each position of N126, E187, N192, F205, R211, H240, S241 and Y242.
  • Modifications of amino acid residues at positions corresponding to the N126, E187, N192, F205, R211, H240, S241 and Y242 positions are N126Y, E187P, N192F, F205Y, R211I, H240F, S241Q and Y242F, respectively.
  • ⁇ 6> A variant of ⁇ 4> or ⁇ 5> in which the modification of the amino acid residue is a modification of two or more places.
  • ⁇ 7> Modifications in at least one amino acid residue selected from amino acid residues corresponding to each position of E187, F205 and H240, and amino acid residue corresponding to each position of N126, N192, R211, S241 and Y242.
  • ⁇ 8> Modifications at least one amino acid residue selected from amino acid residues corresponding to each position of E187 and H240, and amino acid residue corresponding to each position of N126, N192, F205, R211, S241 and Y242. Variants of ⁇ 1> or ⁇ 2>, including modifications at at least one amino acid residue selected from the group.
  • ⁇ 9> Modifications in at least one amino acid residue selected from amino acid residues corresponding to each position of F205 and H240, and amino acid residue corresponding to each position of N126, E187, N192, R211, S241 and Y242.
  • Variants of ⁇ 1> or ⁇ 2> including modifications at at least one amino acid residue selected from the group.
  • ⁇ 10> Modification at the amino acid residue corresponding to the position of F205 and at least one amino acid residue selected from the amino acid residues corresponding to each position of N126, E187, N192, R211, H240, S241 and Y242. Variants of ⁇ 1> or ⁇ 2>, including modifications in.
  • ⁇ 11> Modification at the amino acid residue corresponding to the position of H240 and at least one amino acid residue selected from the amino acid residues corresponding to each position of N126, E187, N192, F205, R211, S241 and Y242.
  • Variants of ⁇ 1> or ⁇ 2> including modifications in.
  • ⁇ 12> Modification at the amino acid residue corresponding to the position of R211 and at least one amino acid residue selected from the amino acid residues corresponding to each position of N126, E187, N192, F205, H240, S241 and Y242.
  • Variants of ⁇ 1> or ⁇ 2> including modifications in.
  • ⁇ 13> A variant of ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the parent ⁇ -amylase is an ⁇ -amylase variant in which the amino acid residue in R178 and G179 is deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ 14> The mutant of ⁇ 1>, ⁇ 2> or ⁇ 13>, wherein the mutant contains at least a mutation selected from the combinations of mutations shown in Tables 1-1 to 1-4.
  • ⁇ 15> The mutant of ⁇ 1>, ⁇ 2> or ⁇ 13>, wherein the mutant contains at least a mutation selected from the combinations of mutations shown in Tables 2-1 to 2-4.
  • the mutant includes a mutation selected from the combination of mutations shown in Tables 1-1 to 1-4 and a mutation selected from a combination of mutations shown in Tables 2-1 to 2-4. , ⁇ 1>, ⁇ 2> or ⁇ 13>.
  • ⁇ 17> A variant of ⁇ 1>, ⁇ 2> or ⁇ 13>, wherein the variant comprises at least a mutation selected from the combinations of mutations shown in Table 3 above.
  • ⁇ 18> A polynucleotide encoding the variant according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 19> A vector or DNA fragment containing the polynucleotide of ⁇ 18>.
  • ⁇ 20> Transformed cells containing the vector or DNA fragment of ⁇ 19>.
  • ⁇ 21> Transformed cells of ⁇ 20>, which are microorganisms.
  • ⁇ 22> A detergent composition containing the variants of ⁇ 1> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 23> The detergent composition of ⁇ 22>, which is a laundry detergent or a dishwashing agent.
  • the detergent composition of ⁇ 23> which is a powder or liquid.
  • ⁇ 25> The detergent composition according to any one of ⁇ 22> to ⁇ 24>, which is used at a low temperature.
  • Detergent composition of ⁇ 25> used at a temperature of 5-40 ° C.
  • YR288 mutant expression plasmid The method for constructing the YR288 mutant described in the following Examples is described. A forward primer containing a mutant sequence having 15 bases complementary to the reverse primer at the 5'end and a reverse primer having the base immediately preceding the mutant sequence at the 5'end were used as a primer pair for mutagenesis. PCR was performed using the YR288 expression plasmid pHY-YR288 described in the examples of Japanese Patent Application No. 2020-121626 or the YR288 variant expression plasmid prepared in this example as a template and a primer pair for mutation introduction.
  • an In-Fusion reaction was performed using each PCR product according to the In-Fusion and HD Cloning kit (Clontech) protocols.
  • the PCR product or In-Fusion reaction solution was transformed into Bacillus subtilis by the protoplast method to obtain a transformant carrying the desired YR288 mutant expression plasmid.
  • Japanese product, 15 ppm tetracycline;% is (w / v)%) Inoculated into a 96-well deep well plate dispensed with 100 ⁇ L, cultured at 30 ° C. and 210 rpm for 2 days, and then containing the enzyme produced from the cells. The culture supernatant was collected by centrifugation and used as an enzyme solution.
  • Etilidene-paranitrophenyl- ⁇ -D-maltoheptaoside (Et-G7-pNP) with a protected non-reducing end was used as a substrate.
  • ⁇ -Glucosidase is allowed to act on maltooligosaccharide-pNP produced by the action of ⁇ -amylase on Et-G7-pNP to release pNP, and the rate of increase in absorbance accompanying pNP production is measured to determine ⁇ -amylase activity. be able to.
  • a 2 1 mixture of RI solution and RII solution of AMY-EL (Serotech), which is an ⁇ -amylase activity measuring reagent containing Et-G7-pNP and ⁇ -glucosidase, was used as a substrate solution. 100 ⁇ L of the substrate solution and 10 ⁇ L of the appropriately diluted enzyme sample were mixed in each well of the 96-well assay plate, and the absorbance change (OD / min) at 405 nm was measured at 30 ° C. The difference ⁇ OD / min from the blank (sample without enzyme addition) was used as the activity value.
  • the mutant shown in FIG. 1 was constructed using YR288 (SEQ ID NO: 2) as the parent polypeptide by the method described in Example (1).
  • the enzyme solution was added to a commercially available liquid laundry detergent (Kao Corporation, Attack 3X) diluted to 10% (v / v) with ion-exchanged water, and the activity was measured after incubating at 50 ° C. for 15 minutes.
  • the residual activity (%) was calculated by dividing the activity value of the sample after the treatment at 50 ° C. by the activity value of the sample before the treatment at 50 ° C. and multiplying by 100. Deletion of any two residues of R178, G179, T180, and G181 greatly improved stability (FIG. 1).
  • a blank was prepared by adding tap water instead of the enzyme solution, and the difference ⁇ A488 from the blank was determined as the detergency. Relative detergency was determined by dividing ⁇ A488 of each variant by ⁇ A488 of the parent polypeptide.
  • Example (1) contains two or more mutations obtained in Example (8) using YR288 R178 ⁇ + T180 ⁇ (SEQ ID NO: 4) as the parent polypeptide. Various variants were constructed. The detergency of the mutant was evaluated by the method described in Example (6). The results are shown below.
  • Example 10 Evaluation of Stability of Multiple Mutants
  • two or more mutations obtained in Example (8) with YR288 R178 ⁇ + T180 ⁇ (SEQ ID NO: 4) as the parent polypeptide are included.
  • Various variants were constructed.
  • the stability of the mutant was evaluated by the method described in Example (7). The results are shown below.
  • Example (9) Evaluation of detergency and stability of multiple mutants
  • various variants including the multiple mutations obtained in Example (10) were constructed.
  • the performance of the mutant was evaluated by the method described in Examples (6) and (7). The results are shown below.

Abstract

低温下で機能することが可能であり、同時に安定性及び／又は洗浄性能が維持又は向上したα－アミラーゼを提供する。　配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。

Description

α－アミラーゼ変異体
　本発明は、α－アミラーゼの変異体に関する。
　α－アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。
　洗浄剤用として有用なα－アミラーゼとしては、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８（特許文献１）、バチルス リケニフォルミス由来のα－アミラーゼであるターマミルやデュラミル（登録商標）の他、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０（特許文献２）、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２（特許文献３の配列番号４）、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２（特許文献４）等が知られている。また、これらのα－アミラーゼについては、特定の用途に向けて機能が改善するように改変され、例えば洗剤中における安定性が向上した変異体等が報告されている（特許文献５）。
　近年では、環境保護や洗浄コスト軽減の観点から、食器洗浄や洗濯洗浄、特にランドリーでの洗濯洗浄の際の温度を下げることが重要とされ、また洗浄時間の短縮化も望まれている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常設定される温度よりも高く、このため、多くのデンプン質の汚れは完全に除去することが困難となっている。
　したがって、低温においても、洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα－アミラーゼを見出すことが重要である。
　　〔特許文献１〕国際公開第９４／２６８８１号
　　〔特許文献２〕国際公開第００／６００６０号
　　〔特許文献３〕国際公開第０６／００２６４３号
　　〔特許文献４〕国際公開第２０１４／１６４７７７号
　　〔特許文献５〕国際公開第９８／０４４１２６号
　本発明は、以下に係るものである。
　１）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。
　２）１）の変異体をコードするポリヌクレオチド。
　３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　５）１）の変異体を含む洗浄剤組成物。
２アミノ酸欠失変異体の安定性評価。
発明の詳細な説明
　本発明は、低温下で機能することが可能であり、同時に安定性及び／又は洗浄性能が維持又は向上したα－アミラーゼを提供することに関する。
　本発明者らは、低温下で機能するα－アミラーゼを親として、当該親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有するα－アミラーゼ変異体を得ることに成功した。
　本発明によれば、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有するα－アミラーゼ変異体を提供することができる。斯かるα－アミラーゼ変異体を用いることにより、低温でも優れたデンプン汚れ除去効果を発揮する洗浄が可能となる。
　本明細書において、「アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルカノヒドロラーゼ）とは、デンプンならびに他の直鎖又は分岐１，４－グリコシドオリゴ糖若しくは多糖類の加水分解を触媒する酵素群を意味する。α－アミラーゼ活性は、デンプンの酵素的分解による還元末端の生成量を測定することによって決定することができる。また、これに限定されず、例えばＰｈａｄｅｂａｓのような色素架橋デンプンの酵素的分解による色素の遊離を測定することによっても決定することができる（Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic α-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine." Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.）。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
　所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンは、「Ｔ２２６」と示される。
　アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔ２２６Ａ」と示される。
　アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置１８１でのセリンの欠失は「Ｓ１８１Δ」と示される。
　アミノ酸の「挿入」に関しては、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸]で表記される。例えば位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］で表記される。例えば、位置１９５のグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
　複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。例えば、「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０のアルギニンのチロシンへの置換と位置１９５のグリシンのグルタミン酸への置換を表す。
　１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｒ１７０Ｙ／Ｅ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸への置換を表す。
　本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
　本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
＜変異体＞
　本発明の変異体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体である。
　すなわち、「変異体」は、親α－アミラーゼを構成するアミノ酸において、１又は複数箇所の所定位置のアミノ酸残基が改変されたα－アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。斯かる所定位置のアミノ酸残基が改変は、洗浄性能及び／又は洗剤中での安定性を高めるための改変であり、したがって、当該変異体は、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有する。
　本発明の変異体において、アミノ酸残基の改変部位（変異位置）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置である。
　ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、α－アミラーゼＹＲ２８８を構成するアミノ酸配列であり、本発明の変異体における変異位置は、当該アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
　ＹＲ２８８は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいて、ＷＰ＿１００３４６３６２．１として登録されているタンパク質であり、本出願人によって、低温でのデンプン分解活性及び洗浄性能が高いα－アミラーゼとして特定されたタンパク質である（特願２０２０－１２１６２６）。
　アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（本発明においては配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、「親α－アミラーゼ」とは、本発明の変異体をもたらすために改変が行われる基準α－アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
　本発明において、親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は、アミノ酸配列において、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
　ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼ（ＹＲ２８８）において、Ｒ１７８及びＴ１８０に対応するアミノ酸残基が欠失した（Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ）α－アミラーゼ変異体である。後述する実施例に示すとおり、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置に相当する位置の２箇所におけるアミノ酸残基の欠失を含む、ＹＲ２８８を親α－アミラーゼとする変異体は、洗剤中での安定性がＹＲ２８８よりも飛躍的に向上される。したがって、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置に相当する位置の２箇所以上のアミノ酸残基を欠失させたα－アミラーゼ変異体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼを含め、いずれも本発明の変異体の親α－アミラーゼとなり得る。
　ここで、２箇所以上のアミノ酸残基を欠失としては、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｇ１８１Δ等が挙げられ、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δがより好ましい。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるα－アミラーゼとしては、この他に、バチルス　フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｌｅｘｕｓ）由来のα－アミラーゼであるＤＥ０１７８や、バチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）由来のα－アミラーゼであるＲＵ２Ｃなどが挙げられる（特願２０２０－１２１６２６）。
　上記所定位置の１又は複数箇所で行われるアミノ酸残基の改変は、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。ここで、「置換」はある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、「欠失」はある位置にあるアミノ酸の除去を意味し、「挿入」はある位置にあるアミノ酸に隣接して、直接連続するようアミノ酸を付加することを意味する。
　本発明において、変異箇所は１又は複数箇所であり得るが、２個所以上であるのが好ましくは、より好ましくは２～１５箇所、より好ましくは３～１５箇所、より好ましくは５～１０箇所が挙げられる。
　なお、当該変異体は、洗浄性能又は安定性向上の点から、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するα－アミラーゼであるのが好ましい。また、変異体は、上記変異体としての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置で示される変異箇所のうち、安定性向上の点から、好ましくは、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、の各位置に相当する位置が挙げられる。
　このうち、好適な２箇所以上の改変としては、例えば、以下のａ）～ｆ）の改変の組み合わせが挙げられる。
　ａ）Ｅ１８７、Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　ｂ）Ｅ１８７及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　ｃ）Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　ｄ）Ｆ２０５の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　ｅ）Ｈ２４０の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　ｆ）Ｒ２１１の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
　Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変の好適な態様を以下に示す。
　すなわち、Ｇ５は、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｒ又はＫへの置換（Ｇ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ）が好ましく；
　Ｓ３８は、Ｎへの置換（Ｓ３８Ｎ）が好ましく；
　Ｔ４９は、Ｑへの置換（Ｔ４９Ｑ）が好ましく；
　Ｑ９６は、Ｒ又はＫへの置換（Ｑ９６Ｒ／Ｋ）が好ましく；
　Ｎ１２６は、Ｙへの置換（Ｎ１２６Ｙ）が好ましく；
　Ｔ１２９は、Ｉへの置換（Ｔ１２９Ｉ）が好ましく；
　Ｇ１４０は、Ｙ、Ｆ又はＷへの置換（Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ）が好ましく；
　Ｆ１５３は、Ｗへの置換（Ｆ１５３Ｗ）が好ましく；
　Ｑ１６７は、Ｅへの置換（Ｑ１６７Ｅ）が好ましく；
　Ｇ１７９は、Ｄ又はＨへの置換（Ｇ１７９Ｄ／Ｈ）が好ましく；
　Ｗ１８６は、Ｌへの置換（Ｗ１８６Ｌ）が好ましく；
　Ｅ１８７は、Ｐへの置換（Ｅ１８７Ｐ）が好ましく；
　Ｎ１９２は、Ｆへの置換（Ｎ１９２Ｆ）が好ましく；
　Ｍ１９９は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｖ又はＩへの置換（Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
　Ｙ２００は、Ｇへの置換（Ｙ２００Ｇ）が好ましく；
　Ｌ２０３は、Ｙ、Ｍ又はＦへの置換（Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ）が好ましく；
　Ｙ２０５は、Ｆへの置換（Ｙ２０５Ｆ）が好ましく；
　Ｄ２０６は、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｔ又はＧへの置換（Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ）が好ましく；
　Ｒ２１１は、Ｌ、Ｖ又はＩへの置換（Ｒ２１１Ｌ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
　Ｋ２１５は、Ｆへの置換（Ｋ２１５Ｆ）が好ましく；
　Ｈ２４０は、Ｆへの置換（Ｈ２４０Ｆ）が好ましく；
　Ｓ２４１は、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｙ、Ｐ、Ｈへの置換（Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ）が好ましく；
　Ｙ２４２は、Ｆへの置換（Ｙ２４２Ｆ）が好ましく；
　Ｇ２４４は、Ｋ、Ｗ、Ｌ又はＲへの置換（Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ）が好ましく；
　Ｅ２５７は、Ｔへの置換（Ｅ２５７Ｔ）が好ましく；
　Ｆ２５９は、Ｗへの置換（Ｆ２５９Ｗ）が好ましく；
　Ｋ２７８は、Ｌ、Ｄ、Ｗ、Ｉ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｙ又はＦへの置換（Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ）が好ましく；
　Ｈ２８３は、Ｑへの置換（Ｈ２８３Ｑ）が好ましく；
　Ｓ２８４は、Ｗへの置換（Ｓ２８４Ｗ）が好ましく；
　Ａ２８８は、Ｆへの置換（Ａ２８８Ｆ）が好ましく；
　Ｈ２９５は、Ｙへの置換（Ｈ２９５Ｙ）が好ましく；
　Ｙ２９６は、Ａへの置換（Ｙ２９６Ａ）が好ましく；
　Ｎ３０３は、Ｒ、Ｅ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｄ、Ｔ又はＡへの置換（Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ）が好ましく；
　Ｔ３２０は、Ｄ又はＥへの置換（Ｔ３２０Ｄ／Ｅ）が好ましく；
　Ｓ３３１は、Ｔへの置換（Ｓ３３１Ｔ）が好ましく；
　Ｌ３４８は、Ｉへの置換（Ｌ３４８Ｉ）が好ましく；
　Ｙ３６０は、Ｃ、Ｍ、Ｌ又はＶへの置換（Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ）が好ましく；
　Ｗ４０８位はＰへの置換（Ｗ４０８Ｐ）が好ましく；
　Ｌ４２９は、Ｖへの置換（Ｌ４２９Ｖ）が好ましく；
　Ｖ４３０は、Ｍへの置換（Ｖ４３０Ｍ）が好ましく；
　Ｇ４３３は、Ｇの後へＳの挿入（Ｇ４３３ＧＳ）が好ましく；
　Ａ４３４は、Ｖへの置換（Ａ４３４Ｖ）が好ましく；
　Ｗ４３９は、Ｒへの置換（Ｗ４３９Ｒ）が好ましく；
　Ｎ４７１は、Ｔへの置換（Ｎ４７１Ｔ）が好ましく；
　Ｇ４７６は、Ａ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｆ、Ｒ又はＫへの置換（Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）が好ましく；
　Ｇ４７７は、Ｅへの置換（Ｇ４７７Ｅ）が好ましい。
　次に、洗浄性能の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表１－１～１－４に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、洗浄性能の向上に特に寄与する変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　次に、安定性の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表２－１～２－４に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、安定性の向上に特に寄与する変異体である。また、表１－１～１－４の組み合わせ変異と、表２－１～２－４の組み合わせ変異を組み合わせた変異も、洗浄性能及び安定性の向上を図る点から好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　次に、洗浄性能及び安定性の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表３に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、洗浄性能及び安定性の向上に特に寄与する変異体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
＜本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド＞
　本発明の変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親α－アミラーゼ遺伝子（基準α－アミラーゼ遺伝子）内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。
　本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
　本発明において、親α－アミラーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親α－アミラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したα－アミラーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親α－アミラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号３に、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼ（ＹＲ２８８）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に示した。
　変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　当該本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
　得られた本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。なお、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
　上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。
　あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
　上記本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
＜形質転換細胞＞
　本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
　宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
　宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
　あるいは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
　斯くして得られた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明の変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
　あるいは、本発明の変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のα－アミラーゼ変異体をコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
　斯くして得られる本発明の変異体は、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有する。
　ここで、「向上した洗浄性能」とは、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄効果、例えば汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。
　洗浄性能は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の大きさに裁断した汚染布を９６穴アッセイプレートのウェルに挿入し、洗剤溶液及び酵素溶液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄終了後の洗浄液について４８８ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄力として求める。変異体のΔＡ４８８を親α－アミラーゼのΔＡ４８８で割ることで相対洗浄力を求めることができる。
　また、「向上した安定性」とは、親α－アミラーゼと比して向上した、洗浄剤存在下におけるα－アミラーゼ活性の維持能力を意味する。
　安定性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、洗剤に酵素溶液を添加して、所定時間処理した後にα－アミラーゼ活性を測定し、当該処理による単位時間（ｈ）当たりの失活速度を算出して半減期（ｈ）を計算する。変異体の半減期（ｈ）を親α－アミラーゼの半減期（ｈ）で割ることで相対安定性を求めることができる。
　本発明の変異体は、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
　ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。
　洗浄剤組成物中への本発明の変異体の配合量は、当該タンパク質が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１０～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５０～５００ｍｇであるのがより好ましい。
　洗浄剤組成物は、本発明の変異体以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明のタンパク質とは異なるアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
　プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。
　セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。
　アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ　Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ　Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。
　リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。
　洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
　界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
　洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
　陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
（２）二価金属イオン捕捉剤
　二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
（３）アルカリ剤
　アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
（４）再汚染防止剤
　再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
（５）漂白剤
　例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
（６）蛍光剤
　洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
（７）その他の成分
　洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
　洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のタンパク質及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
　斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
　また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
　＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α―アミラーゼ変異体。
　＜２＞前記Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＧ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ／Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ／Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ、Ｒ２１１Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ、Ｔ３２０Ｄ／Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ及びＧ４７７Ｅである、＜１＞の変異体。
　＜３＞アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜４＞前記アミノ酸残基の改変がＮ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変である、＜１＞の変異体。
　＜５＞前記Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＮ１２６Ｙ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｆ２０５Ｙ、Ｒ２１１Ｉ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ｑ及びＹ２４２Ｆである、＜４＞の変異体。
　＜６＞アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、＜４＞又は＜５＞の変異体。
　＜７＞Ｅ１８７、Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜８＞Ｅ１８７及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜９＞Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜１０＞Ｆ２０５の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜１１＞Ｈ２４０の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜１２＞Ｒ２１１の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜１３＞親α－アミラーゼが、配列番号２で示されるアミノ酸配列においてＲ１７８及びＧ１７９におけるアミノ酸残基が欠失したα－アミラーゼ変異体である、＜１＞又は＜２＞の変異体。
　＜１４＞変異体が、前記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、＜１＞、＜２＞又は＜１３＞の変異体。
　＜１５＞変異体が、前記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、＜１＞、＜２＞又は＜１３＞の変異体。
　＜１６＞変異体が、前記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異と、前記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異とを含む、＜１＞、＜２＞又は＜１３＞の変異体。
　＜１７＞変異体が、前記表３で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、＜１＞、＜２＞又は＜１３＞の変異体。
　＜１８＞＜１＞～＜１７＞のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
　＜１９＞＜１８＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　＜２０＞＜１９＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　＜２１＞微生物である、＜２０＞の形質転換細胞。
　＜２２＞＜１＞～＜１７＞の変異体を含む洗浄剤組成物。
　＜２３＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜２２＞の洗浄剤組成物。
　＜２４＞粉末又は液体である、＜２３＞の洗浄剤組成物。
　＜２５＞低温で使用される、＜２２＞～＜２４＞のいずれかの洗浄剤組成物。
　＜２６＞５～４０℃の温度で使用される、＜２５＞の洗浄剤組成物。
（１）ＹＲ２８８変異体発現プラスミドの構築
　下記の実施例に記載のＹＲ２８８変異体の構築方法を記す。５'末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５'末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。特願２０２０－１２１６２６の実施例に記載のＹＲ２８８発現プラスミドｐＨＹ－ＹＲ２８８又は本実施例にて作成したＹＲ２８８変異体発現プラスミドを鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してＰＣＲを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのＰＣＲ産物を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。ＰＣＲ産物又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のＹＲ２８８変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
（２）酵素生産培養
　１５ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに（１）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養液６μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）１００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収し酵素溶液とした。
（３）培養上清のタンパク質濃度測定
　培養上清のタンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット　ワコーII（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。アミラーゼ発現カセットを持たないｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで培養上清中のアミラーゼの濃度を算出した。
（４）活性測定
　非還元末端を保護したエチリデン－パラニトロフェニル－α－Ｄ－マルトヘプタオシド（Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰ）を基質として用いた。Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰに対するα－アミラーゼの作用により生成するマルトオリゴ糖－ｐＮＰにα－グルコシダーゼを作用させてｐＮＰを遊離させ、ｐＮＰ生成に伴う吸光度の増加速度を測定することでα－アミラーゼ活性を求めることができる。Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰとα－グルコシダーゼを含むα－アミラーゼ活性測定試薬であるＡＭＹ－ＥＬ（セロテック）のＲＩ液とＲＩＩ液を２：１で混合したものを基質溶液として用いた。基質溶液１００μＬと適宣希釈した酵素サンプル１０μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とした。
（５）１７８－１８１位における２アミノ酸欠失変異体の安定性評価
　実施例（１）に記載の方法によりＹＲ２８８（配列番号２）を親ポリペプチドとして図１に記載の変異体を構築した。イオン交換水で１０％（ｖ／ｖ）に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタック３Ｘ）に酵素溶液を添加し、５０℃で１５分間インキュベートした後に活性測定を行った。５０℃処理後のサンプルの活性値を５０℃処理前のサンプルの活性値で割り１００をかけることで残存活性（％）を算出した。Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１のうち任意の２残基を欠失させることで安定性が大きく向上した（図１）。
（６）洗浄力評価
　直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布をＣＦＴ社から入手して使用した。９６穴アッセイプレートの各ウェルにＣＳ－２６円形汚染布を２枚ずつ挿入し、水道水で３０００倍に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタックゼロ）を２００μＬずつ加えた。水道水で３ｐｐｍに希釈した酵素溶液を１０μＬずつ添加し、シールをして２０℃でキュートミキサーを用いて１２００ｒｐｍ、１５分間振盪した。洗浄終了後、１００μＬの洗浄液を新たな９６穴アッセイプレートに移し、４８８ｎｍの吸光度を測定した。酵素溶液のかわりに水道水を加えたものをブランクとし、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄力として求めた。各変異体のΔＡ４８８を親ポリペプチドのΔＡ４８８で割ることで相対洗浄力を求めた。
（７）安定性評価
　イオン交換水で１０％（ｖ／ｖ）に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタック３Ｘ又は花王株式会社、アタックゼロ）に酵素溶液を添加し、５０℃で３０分間～１８時間インキュベートした後に活性測定を行った。５０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、５０℃処理による単位時間（ｈ）当たりの失活速度を算出し、そこから半減期（ｈ）を計算した。各変異体の半減期（ｈ）を親ポリペプチドの半減期（ｈ）で割ることで相対安定性を求めた。
（８）変異スクリーニング
　実施例（１）に記載の方法によりＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして様々な変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。相対洗浄力及び／又は相対安定性が１．１以上である場合に性能が向上したとみなした。以下の変異体では性能が向上した。
　Ｇ５Ｅ、Ｇ５Ｄ、Ｇ５Ｐ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ、Ｑ９６Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ、Ｇ１４０Ｆ、Ｇ１４０Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ、Ｇ１７９Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ、Ｍ１９９Ｔ、Ｍ１９９Ａ、Ｍ１９９Ｎ、Ｍ１９９Ｑ、Ｍ１９９Ｓ、Ｍ１９９Ｖ、Ｍ１９９Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ、Ｌ２０３Ｍ、Ｌ２０３Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ、Ｄ２０６Ｅ、Ｄ２０６Ｎ、Ｄ２０６Ｔ、Ｄ２０６Ｇ、Ｒ２１１Ｖ、Ｒ２１１Ｌ、Ｒ２１１Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ、Ｓ２４１Ｑ、Ｓ２４１Ｄ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ、Ｇ２４４Ｗ、Ｇ２４４Ｌ、Ｇ２４４Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ、Ｎ３０３Ｅ、Ｎ３０３Ｓ、Ｎ３０３Ｇ、Ｎ３０３Ｖ、Ｎ３０３Ｄ、Ｎ３０３Ｔ、Ｎ３０３Ａ、Ｔ３２０Ｄ、Ｔ３２０Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ、Ｙ３６０Ｍ、Ｙ３６０Ｌ、Ｙ３６０Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ、Ｇ４７６Ｐ、Ｇ４７６Ｅ、Ｇ４７６Ｓ、Ｇ４７６Ｆ、Ｇ４７６Ｒ、Ｇ４７６Ｋ、Ｇ４７７Ｅ
（９）多重変異体の洗浄力評価
　実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（８）で得られた変異を２つ以上含む様々な変異体を構築した。実施例（６）に記載の方法によって変異体の洗浄力を評価した。以下にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（１０）多重変異体の安定性評価
　実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（８）で得られた変異を２つ以上含む様々な変異体を構築した。実施例（７）に記載の方法によって変異体の安定性を評価した。以下にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして様々な変異体を構築した。実施例（７）に記載の方法によって変異体の安定性を評価した。以下にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（１１）多重変異体の洗浄力及び安定性の評価
　実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（９）で得られた多重変異及び実施例（１０）で得られた多重変異を含む様々な変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。以下にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（１２）多重変異体の洗浄力及び安定性の評価
　実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ+Ｇ１７９Δを親ポリペプチドとして下記の変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。以下にその結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025

Claims (15)

  1. 　配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。
  2. 　前記Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＧ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ／Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ／Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ、Ｒ２１１Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ、Ｔ３２０Ｄ／Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ及びＧ４７７Ｅである、請求項１に記載の変異体。
  3. 　アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、請求項１又は２に記載の変異体。
  4. 　変異体が、下記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
  5. 　変異体が、下記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
  6. 　変異体が、下記表３で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
  8. 　請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  9. 　請求項８に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
  10. 　微生物である、請求項９に記載の形質転換細胞。
  11. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
  12. 　衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項１１に記載の洗浄剤組成物。
  13. 　粉末又は液体である、請求項１２に記載の洗浄剤組成物。
  14. 　低温で使用される、請求項１２又は１３に記載の洗浄剤組成物。
  15. 　５～４０℃の温度で使用される、請求項１４に記載の洗浄剤組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023120594A1 (ja) * 2021-12-24 2023-06-29 花王株式会社 アミラーゼ配合洗浄剤組成物
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS492935B1 (ja) 1968-10-07 1974-01-23
JPH06316700A (ja) 1993-03-11 1994-11-15 Kao Corp 漂白剤組成物及び漂白洗浄剤組成物
WO1994026881A1 (en) 1993-05-19 1994-11-24 Kao Corporation LIQUEFYING ALKALINE α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME
WO1998044126A1 (en) 1997-03-31 1998-10-08 Kao Corporation MUTATED α-AMYLASES
JPH10313859A (ja) 1997-05-19 1998-12-02 Kao Corp 耐熱性アルカリセルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造方法
WO2000060060A2 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
JP2003313592A (ja) 2002-04-18 2003-11-06 Kao Corp 粉末洗浄剤組成物
WO2006002643A2 (en) 2004-07-05 2006-01-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
JP2014520517A (ja) * 2011-06-30 2014-08-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼのスクリーニング方法
WO2014164777A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
WO2017098637A1 (ja) 2015-12-10 2017-06-15 花王株式会社 界面活性剤組成物
JP2020506698A (ja) * 2017-02-01 2020-03-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異体
JP2020510712A (ja) * 2017-02-01 2020-04-09 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物
JP2020121626A (ja) 2019-01-30 2020-08-13 マツダ株式会社 車両システム

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS492935B1 (ja) 1968-10-07 1974-01-23
JPH06316700A (ja) 1993-03-11 1994-11-15 Kao Corp 漂白剤組成物及び漂白洗浄剤組成物
WO1994026881A1 (en) 1993-05-19 1994-11-24 Kao Corporation LIQUEFYING ALKALINE α-AMYLASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME, AND DETERGENT COMPOSITION CONTAINING THE SAME
WO1998044126A1 (en) 1997-03-31 1998-10-08 Kao Corporation MUTATED α-AMYLASES
JPH10313859A (ja) 1997-05-19 1998-12-02 Kao Corp 耐熱性アルカリセルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造方法
WO2000060060A2 (en) 1999-03-31 2000-10-12 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
JP2003313592A (ja) 2002-04-18 2003-11-06 Kao Corp 粉末洗浄剤組成物
WO2006002643A2 (en) 2004-07-05 2006-01-12 Novozymes A/S Alpha-amylase variants with altered properties
JP2014520517A (ja) * 2011-06-30 2014-08-25 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼのスクリーニング方法
WO2014164777A1 (en) 2013-03-11 2014-10-09 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
WO2017098637A1 (ja) 2015-12-10 2017-06-15 花王株式会社 界面活性剤組成物
JP2020506698A (ja) * 2017-02-01 2020-03-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ α−アミラーゼ変異体
JP2020510712A (ja) * 2017-02-01 2020-04-09 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニーＴｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙ アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物
JP2020121626A (ja) 2019-01-30 2020-08-13 マツダ株式会社 車両システム

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL. LETT., vol. 33, no. 9, 2011, pages 1847 - 1852
DATABASE PROTEIN 13 March 2019 (2019-03-13), ANONYMOUS : "alpha-amylase [Bacillus sp. CBEL-1] ", XP055918164, retrieved from NCBI Database accession no. TDB53832 *
DATABASE PROTEIN 28 November 2017 (2017-11-28), ANONYMOUS : "alpha-amylase [Bacillus sp. YR288]", XP055918167, retrieved from NCBI Database accession no. PJJ22460 *
DATABASE PROTEIN 4 December 2015 (2015-12-04), ANONYMOUS : "alpha-amylase [Priestia veravalensis]", XP055918162, retrieved from NCBI Database accession no. KSU86317 *
GENE, vol. 77, 1989, pages 61 - 68
J BACTERIOL, vol. 134, 1978, pages 318 - 329
J. BIOSCI. BIOENG., vol. 104, no. 2, 2007, pages 135 - 143
JPN J GENET, vol. 60, 1985, pages 235 - 243
NUCLEIC ACIDS R4ESEARCH, vol. 17, 1989, pages 7059 - 7071
NUCLEIC ACIDS RES, vol. 16, 1988, pages 8732
PLASMID, vol. 18, 1987, pages 8 - 15
SCIENCE, vol. 227, 1985, pages 1435 - 1441
SOININEN, K.M. CESKAH. ADLERCREUTZ: "Comparison between a new chromogenic a-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine.", SCANDINAVIAN JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY INVESTIGATION, vol. 30, no. 3, 1972, pages 291 - 297
THOMPSON, J.D. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 22, 1994, pages 4673 - 4680

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023120594A1 (ja) * 2021-12-24 2023-06-29 花王株式会社 アミラーゼ配合洗浄剤組成物
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

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