JP2020510712A - アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、α−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物と、そのような組成物を含む水性液を用いて、特に低温で、織物などの表面を処理する方法と、に関する。

Description

（配列リストの参照）
本明細書は、コンピュータ可読形態での配列表を含む。このコンピュータ可読形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、親アミラーゼと比較して、冷水表面処理プロセスにおいて改善された洗浄性能を有するα−アミラーゼの変異体を含有する洗浄組成物に関する。
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン並びに他の線状及び分岐状１，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。
最初に使用された細菌α−アミラーゼのうちの１つは、広く特徴付けられているＴｅｒｍａｍｙｌとしても既知のバチルス・リケニフォルミス由来のα−アミラーゼであり、この酵素についての結晶構造が決定されている。ＡＡ５６０などのアルカリ性アミラーゼは、洗剤中での使用が見出されているα−アミラーゼの特定の群を形成する。これらの既知の細菌アミラーゼのうちの多くは、特定の用途におけるそれらの機能性を改善するように修飾されている。Ｔｅｒｍａｍｙｌ、ＡＡ５６０（国際公開第２０００／０６００６０号）及びＳＰ７０７（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：２５−３１により記載）などのバチルスアミラーゼは、洗剤中での使用が見出されている特定の群のα−アミラーゼを形成する。これらのアミラーゼは、洗剤中の安定性を改善するように修飾されている。国際公開第９６／２３８７３号は、例えば、このアミラーゼの安定性を改善するために、ＳＰ７０７（国際公開第９６／２３８７３号の配列番号７）のアミノ酸１８１＋１８２又はアミノ酸１８３＋１８４を欠失させることを開示している。国際公開第９６／２３８７３号は、Ｍ２０２を例えばロイシンに置換することによってＳＰ７０７アミラーゼを修飾して、分子を酸化に対して安定化させることを更に開示している。このように、ある特定の特性を改善するためにアミラーゼを修飾することが知られている。
環境上の理由から、洗浄、食器洗浄、及び／又は洗浄プロセスにおいて温度を下げることがますます重要になっている。しかしながら、アミラーゼを含むほとんどの酵素は、低温洗浄で通常使用される温度よりも高い最適温度を有する。α−アミラーゼは、洗剤組成物における使用に重要な酵素であり、その使用は、洗濯洗浄又は食器洗浄中にデンプン質の染みを除去するためにますます重要となっている。したがって、温度を下げた場合でも、その洗浄性能、染み除去効果、及び／又は活性を保持するα−アミラーゼ変異体を見出すことが重要である。しかしながら、現在の洗剤酵素組成物の効率にもかかわらず、完全に除去するのが困難な多くの染みが存在する。これらの問題は、低い（例えば、冷水）洗浄温度及びより短い洗浄サイクルの使用が増えることによって悪化する。したがって、低温下で機能することができ、同時に、より短い洗浄サイクルで良好な洗浄を可能にするための特定の活性（デンプン分解活性）、安定性、及び／又は洗浄性能などの他の望ましい特性を保持又は増加させることが望ましい。
国際公開第２０００／０６００６０号 国際公開第９６／２３８７３号
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：２５−３１
したがって、本発明の目的は、低温での洗浄、食器洗浄、及び／又は洗浄プロセスに使用することができるα−アミラーゼ変異体を含有する洗浄組成物を提供することである。本発明の更なる目的は、親α−アミラーゼと比較して、又は配列番号１、２、３、４、５、６、７、若しくは８のいずれかのα−アミラーゼを含有する洗浄組成物と比較して、低温で改善された洗浄性能を有するα−アミラーゼ変異体を含有する洗浄組成物を提供することである。
本発明は、洗浄組成物であって、
（ａ）親α−アミラーゼの変異体であって、変異体が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３及び３９１からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置における修飾、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６からなる群から選択される位置に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、
（ｉｉ）変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）変異体が、α−アミラーゼ活性を有する、親α−アミラーゼの変異体と、
ｂ）洗浄補助剤、好ましくは０．０１〜９９．９重量％の量の洗浄補助剤と、
を含む洗剤組成物を提供する。
本発明は、表面、好ましくは織物を処理する方法であって、
（ｉ）水と、上記のような洗浄組成物とを含む水性洗浄液を形成することと、
（ｉｉ）表面を、水性洗浄液を用いて、好ましくは５若しくは１０〜４０℃、又は好ましくは３５℃以下の温度で、より好ましくは３０℃以下の温度で、又は２０℃以下の温度で処理することと、
（ｉｉｉ）表面をすすぐことと、を含む方法も提供する。
本発明は、洗浄組成物であって、
（ａ）親α−アミラーゼの変異体であって、変異体が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３及び３９１に対応する１つ以上の位置における修飾、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、
（ｉｉ）変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）変異体が、α−アミラーゼ活性を有する、親α−アミラーゼの変異体と、
ｂ）洗浄補助剤、好ましくは０．０１〜９９．９重量％の量の洗浄補助剤と、
を含む、洗浄組成物を提供する。
定義
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体」とは、同じ染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のうちのいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、個体群内の多形性をもたらし得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コード化されたポリペプチドが変化しない）であり得、改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されたポリペプチドである。
α−アミラーゼ：用語「α−アミラーゼ」（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン並びに他の線状及び分岐状１，４−グルコシドオリゴ糖及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。本発明の目的では、α−アミラーゼ活性は、実施例セクションに記載されている手順に従って決定される。一態様では、本発明の変異体は、配列番号１に示される成熟ポリペプチドのα−アミラーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％を有する。
アミノ酸：本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」は、標準的な２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸、及び「ｄ」形態の（天然の「ｌ」形態と比較した場合）それらの対応する立体異性体、オメガアミノ酸、他の天然に生じるアミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、及び化学的に誘導体化されたアミノ酸を含む。１つ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能性側基との反応によって獲得され得る。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成する分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル、又は他の種類のエステル及びヒドラジドを形成するために誘導体化されてもよい。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するために誘導体化されてもよい。また、化学誘導体としては、２０個の標準アミノ酸の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンの代わりに使用されてもよく、５−ヒドロキシリジンが、リジンの代わりに使用されてもよく、３−メチルヒスチジンが、ヒスチジンの代わりに使用されてもよく、ホモセリンが、セリンの代わりに使用されてもよく、オルニチンが、リジンの代わりに使用されてもよい。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加又は欠失を含有するペプチドも含む。他の含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア又はメチルアミンによる）などの末端修飾である。
「アラニン」又は「Ａｌａ」又は「Ａ」などのようにアミノ酸が具体的に列挙されている場合、他のものが明示されていない限り、その用語は、ｌ−アラニン及びｄ−アラニンの両方を指す。他の非従来型アミノ酸はまた、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、本発明のポリペプチドに好適な構成成分であってもよい。示されるペプチドについて、各コードされたアミノ酸残基は、適切な場合、従来のアミノ酸の慣用名に対応する単一の文字表記によって表される。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ｌ−アミノ酸を含むか、又はそれからなる。
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」は、真核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写によって調製できるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠く。初期の一次ＲＮＡ転写物は、スプライシングされた成熟ｍＲＮＡとして現れる前に、スプライシングを含む一連の工程を通して加工されるｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：用語「コード配列」は、ポリヌクレオチドであって、その変異体のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームで決定され、通常、ＡＴＧ、ＧＴＧ、及びＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成、又は組み換えポリヌクレオチドであり得る。
制御配列：用語「制御配列」は、本発明の変異体をコードしているポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドに対してネイティブ（すなわち、同じ遺伝子に由来する）であっても外来（すなわち、異なる遺伝子に由来する）であってもよく、又は互いに対してネイティブであっても外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダ、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。制御配列は、最低限、プロモータと、転写及び翻訳停止シグナルとを含む。制御配列は、制御配列と変異体をコードしているポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特異的制限酵素部位を導入する目的のためのリンカーを備えていてもよい。
デルタ強度：本明細書では、用語「デルタ強度」又は「デルタ強度値」は、試験材料、例えば、見本ＣＳ−２８（Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）又は硬質表面の強度測定の結果として定義される。見本は、見本の一部で測定し、バックグラウンドと同一条件下で洗浄する。デルタ強度は、アミラーゼなしで洗浄された試験材料の強度値を減算した、アミラーゼで洗浄された試験材料の強度値である。
酵素洗剤効果：本明細書で使用される用語「酵素洗剤効果」は、酵素を含まない同じ洗剤と比較して、酵素が洗剤に追加し得る有利な効果を指す。酵素によって提供され得る重要な洗剤効果は、洗濯及び／又は洗浄後に可視的な汚れを全く又はほとんど伴わない染み除去、洗濯プロセス中に放出される汚れの再付着の予防又は低減（再付着防止とも呼ばれる効果）、元々白色であったが、繰り返し使用及び洗浄した結果、灰色又は黄味がかった外観を得た織物の白色度を完全に又は部分的に回復させること（ホワイトニングとも呼ばれる効果）である。汚れの再付着の触媒的染み除去又は防止に直接関係しない織物ケア効果も、酵素洗剤効果にとって重要であり得る。このような織物ケア効果の例としては、１つの布地から別の布地への、又は同じ布地の別の部分への移染の防止又は低減（移染防止又は裏汚れ防止とも呼ばれる効果）、ピリング傾向を減少させるか、又は既に存在する毛玉若しくは毛羽立ちを除去するための布地表面からの突出繊維又は破断繊維の除去（抗ピリングとも呼ばれる効果）、布地の柔軟性の改善、布地の色の澄明化、及び布地又は衣類の繊維に捕捉された粒子状汚れの除去、が挙げられる。酵素漂白は、更なる酵素洗剤効果であり、この触媒活性は、過酸化水素又は他の過酸化物などの漂白成分の形成を触媒するために一般的に使用される。
発現：用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌が挙げられるがこれらに限定されない、変異体の産生に含まれる任意の工程を含む。
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む線状又は環状のＤＮＡ分子を意味し、それを発現させる追加のヌクレオチドに操作可能に連結している。
フラグメント：用語「フラグメント」は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端から１つ以上の（例えば、数個の）アミノ酸が欠失したポリペプチドを意味し、ここで、フラグメントは、α−アミラーゼ活性を有する。一態様では、フラグメントは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８の少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８の少なくとも３００個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも３５０個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも４００個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも４５０個の連続するアミノ酸残基を含有する。
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターを用いて、形質転換、トランスフェクション、形質導入などをしやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に生じた突然変異に起因する、親細胞とは同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。
強度値：本明細書で使用するとき、用語「強度値」は、洗浄性能の測定値を指す。それは、白色光で照射される場合に、試料から反射される光の強度として表される輝度として測定される。試料が染色されると、反射光の強度は、きれいな試料の反射光の強度よりも低い。したがって、反射光の強度を使用して洗浄性能を測定することができ、より高い強度値は、より高い洗浄性能と相関する。洗浄した織物の画像を捕捉するために使用する、専門のフラットベッドスキャナー（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ）を用いて色測定を行う。スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの２４ビットピクセル値を、レッド、グリーン、及びブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。ＲＧＢ値を１次元配列として合計し、その後、結果として生じる１次元配列の長さを算出して、強度値（Ｉｎｔ）を計算する：
Figure 2020510712
改善された特性：用語「改善された特性」は、親と比較して改善された変異体に関連する特性を意味する。そのような改善された特性としては、洗浄性能、熱活性、熱安定性、保存条件下での安定性、及び化学的安定性が挙げられるが、これらに限定されない。
改善された洗浄性能：用語「改善された洗浄性能」又は「洗浄性能の向上」は、染み除去の増大による、親アミラーゼのものと比較して改善された、又は配列番号２若しくは１に示されるアミノ酸配列を有するα−アミラーゼの活性に対して改善された、洗濯又は食器洗浄などの洗浄プロセスにおいて洗浄効果（例えば、染み除去）を提供する変異体酵素の能力を意味する。洗浄性能は、自動機械的応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を使用するなど、当該技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。改善された洗浄性能は、例えば、２０℃以上（例えば、４０℃）の洗浄温度で、いくつかの又はおそらく全ての洗浄条件下で獲得され得ることが当業者には理解されるであろう。改善された洗浄性能は、実施例１に列挙される条件の１つ以上において、例えば、α−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである２０℃でのモデル洗剤Ａにおいて、又はα−アミラーゼ変異体濃度が０．０５ｍｇ／Ｌである４０℃でのモデル洗剤Ａにおいて、又はα−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである２０℃でのモデル洗剤Ｊにおいて、又はα−アミラーゼ変異体濃度が０．０５ｍｇ／Ｌである３０℃でのモデル洗剤Ｊにおいて、又はα−アミラーゼ変異体濃度が０．２ｍｇ／Ｌである２０℃でのモデル洗剤Ｋにおいて、１．０超、好ましくは、例えば、１．０５超の改善係数（ＩＦ）によって示されてもよい。洗浄条件は、実施例セクションに記載される。
単離された：用語「単離された」は、自然に発生しない形態又は環境中の物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）天然に発生しない任意の物質、（２）天然に関連付けられる自然発生の構成成分の１つ以上若しくは全てから少なくとも部分的に除去された、任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、若しくは補因子を含むが、これらに限定されない任意の物質、（３）天然に見出される物質に対して、人為的に修飾された任意の物質、又は（４）天然に関連付けられる他の成分に対して、物質の量を増加させることによって（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードしている遺伝子に天然に関連付けられるプロモータよりも強力なプロモータの使用）修飾された任意の物質、を含む。単離された物質は、発酵ブロス試料中に存在してもよい。一態様では、本発明は、単離されたα−アミラーゼ変異体に関する。
単離ポリヌクレオチド：用語「単離ポリヌクレオチド」は、人為的に修飾されたポリヌクレオチドを意味する。一態様では、単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動によって決定したとき、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、少なくとも９０％純粋、及び少なくとも９５％純粋である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組合せであってもよい。
単離変異体：用語「単離変異体」は、人為的に修飾された変異体を意味する。一態様では、変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定したとき、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％純粋、少なくとも８０％純粋、及び少なくとも９０％純粋である。
低温：「低温」は、５〜４０℃、好ましくは５〜３５℃、好ましくは５〜３０℃、より好ましくは５〜２５℃、より好ましくは５〜２０℃、最も好ましくは５〜１５℃、特に５〜１０℃の温度である。好ましい一実施形態では、「低温」は、１０〜３５℃、好ましくは１０〜３０℃、又は１０〜２５℃、又は１０〜２０℃、又は１０〜１５℃の温度である。
成熟ポリペプチド：用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳後、及び任意の翻訳後修飾後、例えば、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化後の最終形態のポリペプチドを意味する。当該技術分野において、宿主細胞は、同じポリヌクレオチドによって発現される２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を伴う）の混合物を生成し得ることが、当該技術分野において既知である。
成熟ポリペプチドコード配列：用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、αーアミラーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを意味する。
突然変異体：用語「突然変異体」は、変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する。
核酸コンストラクト：用語「核酸コンストラクト」は、天然に存在する遺伝子から単離されたか若しくは修飾しなければ自然界には存在しない様式で核酸のセグメントを含有するように修飾された、又は合成である、１つ以上の制御配列を含有する、一本鎖又は二本鎖のいずれかである核酸分子を意味する。核酸コンストラクトという用語は、核酸コンストラクトが本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、用語「表現カセット」と同義である。
操作可能に連結される：用語「操作可能に連結される」は、制御配列がコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置される構成を意味する。
親又は親α−アミラーゼ：用語「親」又は「親α−アミラーゼ」は、本発明の酵素変異体を産生するために改変がなされるα−アミラーゼを意味する。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。例えば、親は、配列番号１のα−アミラーゼ（ＳＰ７２２として知られる）であってもよい。あるいは、配列番号２のα−アミラーゼ、又は本明細書に配列番号３、４、５、６、７、及び８として列挙されるものなどの任意の好適なα−アミラーゼを意味し得る。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって表される。
本発明の目的では、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスであり得る。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
デンプン除去プロセス：「デンプン除去プロセス」という表現は、デンプンが織物から除去される洗浄プロセス、例えば、洗濯のような織物洗浄などにおいて、デンプンが除去される（又は変換される）任意の種類のプロセスに関する。デンプン除去プロセスはまた、食器洗浄などの硬質表面洗浄であってもよく、又は工業的若しくは業務的洗浄などの一般的な洗浄プロセスであってもよい。この表現はまた、一般的に、他のデンプン除去プロセス又はデンプン変換、エタノール生産、デンプン液化、織物湯通し、紙及びパルプ生産、ビール製造、並びに洗剤も含む。
サブシークエンス：用語「サブシークエンス」は、成熟ポリペプチドコード配列の５’−及び／又は３’−末端から欠失した１つ以上の（例えば、数個の）ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し、ここで、サブシークエンスは、α−アミラーゼ活性を有するフラグメントをコードする。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来性又は不必要なヌクレオチドを含まず、かつ遺伝子組み換えされたポリペプチド生産システム内での使用に好適な形態にあるポリヌクレオチド製剤を意味する。用語「実質的に純粋な変異体」は、１０重量％以下、８重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、及び０．５重量％以下のネイティブに又は組み換えで結合している他のポリヌクレオチド材料を含有する。しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモータ及びターミネータのような天然に存在する５’−及び３’−非翻訳領域を含んでいてもよい。いくつかの態様では、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量によって決定したとき、少なくとも９０％純粋、例えば、少なくとも９２％純粋、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋、及び少なくとも９９．５％純粋であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な形態である。
実質的に純粋な変異体：用語「実質的に純粋な変異体」は、１０重量％以下、８重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、及び０．５重量％以下のネイティブに又は組み換えで結合している他のポリペプチド材料を含有する調製品を意味する。好ましくは、変異体は、調製品中に存在する全ポリペプチド材料の重量により、少なくとも９２％純粋、例えば、少なくとも９４％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９６％純粋、少なくとも９７％純粋、少なくとも９８％純粋、少なくとも９９％純粋、少なくとも９９．５％純粋、及び少なくとも１００％純粋である。本発明の変異体は、好ましくは実質的に純粋な形態である。これは、例えば、変異体を周知の組み換え方法によって又は古典的な精製法によって調製することにより達成することができる。
織物ケア効果：本明細書で使用するとき、用語「織物ケア効果」は、触媒的染み除去又は汚れの再付着の防止に直接関係しないものとして定義され、酵素洗剤効果にとっても重要である。このようなケア効果の例としては、１つの織物から別の織物への、又は同じ織物の別の部分への移染の防止又は低減（移染防止又は裏汚れ防止とも呼ばれる効果）、ピリング傾向を減少させるか、又は既に存在する毛玉若しくは毛羽立ちを除去するための織物表面からの突出繊維又は破断繊維の除去（抗ピリングとも呼ばれる効果）、織物の柔軟性の改善、織物の色の澄明化、及び織物の繊維に捕捉された粒子状汚れの除去、が挙げられる。酵素漂白は、更なる酵素洗剤効果であり、この触媒活性は、過酸化水素又は他の過酸化物又は他の漂白物質などの漂白成分の形成を触媒するために一般的に使用される。
変異体：用語「変異体」は、親α−アミラーゼに対する１つ以上の（例えば、いくつかの）位置において改変／変異、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含む、α−アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占有するアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、欠失は、ある位置を占有するアミノ酸の除去を意味し、挿入は、ある位置を占有するアミノ酸に隣接させ、その直後に、１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。
洗浄性能：本文脈では、用語「洗浄性能」は、例えば、洗濯又は食器洗浄などの硬質表面の洗浄中に洗浄される、対象物上に存在するデンプン又はデンプン含有の汚れを除去する酵素の能力として使用される。洗浄性能は、ＡＭＳＡの説明において又は以下の方法セクションにおけるビーカー洗浄性能試験において定義されるいわゆる強度値（Ｉｎｔ）を計算することによって、定量化され得る。
野生型酵素：「野生型」α−アミラーゼという用語は、自然界に見られる細菌、酵母菌又は糸状菌などの自然発生微生物によって発現されるα−アミラーゼを意味する。
用語「洗浄性能」は、一般的に、例えば、食器洗浄時の硬質表面洗浄の洗浄を含むが、洗濯などの織物上での洗浄性能、並びに工業的及び業務的洗浄も含む。改善された洗浄性能は、本明細書の定義に記載のデルタ強度を比較することによって測定することができる。
用語「洗浄性能」は、一般的に、例えば、食器洗浄時の硬質表面洗浄の洗浄を含むが、洗濯などの織物上での洗浄性能、並びに工業的及び業務的洗浄も含む。
変異体指定の取り決め
α−アミラーゼ活性を有する本発明のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に示されるように、バチルス由来のα−アミラーゼの変異体に対応する。
配列番号１
ＨＨＮＧＴＮＧＴＭＭＱＹＦＥＷＨＬＰＮＤＧＮＨＷＮＲＬＲＤＤＡＳＮＬＲＮＲＧＩＴＡＩＷＩＰＰＡＷＫＧＴＳＱＮＤＶＧＹＧＡＹＤＬＹＤＬＧＥＦＮＱＫＧＴＶＲＴＫＹＧＴＲＳＱＬＥＳＡＩＨＡＬＫＮＮＧＶＱＶＹＧＤＶＶＭＮＨＫＧＧＡＤＡＴＥＮＶＬＡＶＥＶＮＰＮＮＲＮＱＥＩＳＧＤＹＴＩＥＡＷＴＫＦＤＦＰＧＲＧＮＴＹＳＤＦＫＷＲＷＹＨＦＤＧＶＤＷＤＱＳＲＱＦＱＮＲＩＹＫＦＲＧＤＧＫＡＷＤＷＥＶＤＳＥＮＧＮＹＤＹＬＭＹＡＤＶＤＭＤＨＰＥＶＶＮＥＬＲＲＷＧＥＷＹＴＮＴＬＮＬＤＧＦＲＩＤＡＶＫＨＩＫＹＳＦＴＲＤＷＬＴＨＶＲＮＡＴＧＫＥＭＦＡＶＡＥＦＷＫＮＤＬＧＡＬＥＮＹＬＮＫＴＮＷＮＨＳＶＦＤＶＰＬＨＹＮＬＹＮＡＳＮＳＧＧＮＹＤＭＡＫＬＬＮＧＴＶＶＱＫＨＰＭＨＡＶＴＦＶＤＮＨＤＳＱＰＧＥＳＬＥＳＦＶＱＥＷＦＫＰＬＡＹＡＬＩＬＴＲＥＱＧＹＰＳＶＦＹＧＤＹＹＧＩＰＴＨＳＶＰＡＭＫＡＫＩＤＰＩＬＥＡＲＱＮＦＡＹＧＴＱＨＤＹＦＤＨＨＮＩＩＧＷＴＲＥＧＮＴＴＨＰＮＳＧＬＡＴＩＭＳＤＧＰＧＧＥＫＷＭＹＶＧＱＮＫＡＧＱＶＷＨＤＩＴＧＮＫＰＧＴＶＴＩＮＡＤＧＷＡＮＦＳＶＮＧＧＳＶＳＩＷＶＫＲ
本発明の目的では、配列番号１に開示される成熟ポリペプチドは、別のα−アミラーゼ中の対応するアミノ酸残基を決定するのに使用される。しかしながら、当業者であれば、配列番号２の配列を使用して、別のα−アミラーゼポリペプチドにおける対応するアミノ酸残基を決定してもよいことを認識するであろう。別のα−アミラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に開示されている成熟ポリペプチドとアラインメントし、そのアラインメントに基づいて、配列番号１に開示されている成熟ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）の好ましくはバージョン５．０．０以上のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を使用して決定する。用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
別のα−アミラーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、限定するものではないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｌｏｇ予測による多重配列比較；バージョン３．５以上；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以上；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：１８９９−１９００）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３以上Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）を使用するＥＭＢＯＳＳ ＥＭＭＡ、を含むいくつかのコンピュータプログラムを使用して、それぞれのデフォルトパラメータを使用して、複数のポリペプチド配列をアライメントすることにより、決定することができる。
他のα−アミラーゼが配列番号１の成熟ポリペプチドから分岐しており、その結果、従来の配列に基づく比較がこれらの関係を検出できないとき（Ｌｉｎｄａｈｌ ａｎｄ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを使用してもよい。データベースを検索するためにポリペプチドファミリーの確率的表現（プロファイル）を利用するサーチプログラムを使用して、配列に基づく検索においてより大きな感度を得ることができる。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベース検索プロセスを通してプロファイルを作成し、遠縁ホモログを検出することができる（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが、タンパク質構造データベースにおいて１つ以上の表現を有する場合、更に大きな感度を得ることができる。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：８７４−８８１）などのプログラムは、クエリー配列の構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへのインプットとして、様々な情報源（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造的アラインメントプロファイル、及び溶媒和物電位）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９の方法を使用して、未知の構造の配列を、ＳＣＯＰデータベース中に存在するスーパーファミリーのモデルとアラインメントすることができる。次に、これらアラインメントを、ポリペプチドのホモロジーモデルを作成するために使用することができ、その目的のために開発された様々なツールを使用して、このようなモデルを精度について評価することができる。
既知の構造のタンパク質については、構造的アラインメントを検索し、作成するために、いくつかのツール及び情報源を利用可能である。例えば、タンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーは、構造的にアラインメントされており、これらアラインメントは、アクセス可能であり、ダウンロード可能である。ディスタンスアラインメントマトリクス（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ３３：８８−９６）又はコンビナトリアルエクステンション（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ ａｎｄ Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：７３９−７４７）などの様々なアルゴリズムを使用して２つ以上のタンパク質構造体をアラインメントすることができ、これらアルゴリズムの実行は、更に、可能性のある構造的ホモログを見つけるために、対象構造について構造データベースにクエリーを行うために利用することができる（例えば、Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：５６６−５６７）。
本発明のα−アミラーゼ変異体を説明する際、参照を簡略化するために、以下に記載の命名法を適応する。一般に認められているＩＵＰＡＣの１文字又は３文字アミノ酸略記を用いる。
置換。アミノ酸置換に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、置換アミノ酸、が使用される。したがって、位置２２６における例えばスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と表される。複数の突然変異は、マーク（「＋」）を付加することによって区切られ、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」若しくは「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５及び４１１において、それぞれ、グリシン（Ｇ）をアルギン（Ｒ）で、及びセリン（Ｓ）をフェニルアラニン（Ｆ）で置換することを表す。
欠失。アミノ酸欠失に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、アルタリスク（＊）が使用される。したがって、位置１８１におけるグリシンの欠失は、「Ｓｅｒ１８１＊」又は「Ｓ１８１＊」と表される。複数の欠失は、付加マーク（「＋」）によって区切られ、例えば、「Ｓｅｒ１８１＊＋Ｔｈｒ１８２」又は「Ｓ１８１＊＋Ｔ１８２＊」と表される。
挿入。アミノ酸挿入に関しては、次の命名法、すなわち、元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸、が使用される。したがって、位置１９５における例えばグリシンの後のリジンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」又は「Ｇ１９５ＧＫ」と表される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と表される。例えば、位置１９５におけるグリシンの後のリジン及びアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」又は「Ｇ１９５ＧＫＡ」と表される。
このような場合、挿入されるアミノ酸残基（複数可）は、挿入されるアミノ酸残基（複数可）に先行するアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって付番される。上記の例では、配列は、以下のようになり得る：
Figure 2020510712
複数の修飾。複数の修飾を含む変異体は、更なる記号（「＋」）を付加することにより区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」又は「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０及び１９５におけるアルギニン及びグリシンのチロシン及びグルタミン酸での置換を表す。
異なる修飾。異なる複数の改変がある位置で導入され得る場合、異なる複数の改変は、コンマにより区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、位置１７０におけるアルギニンのチロシン又はグルタミン酸での置換を表す。したがって、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は、以下の変異体：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、及び「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、を表す。
親α−アミラーゼ
親α−アミラーゼは、配列番号１に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号１に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号１のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号２に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号２に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号２のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号３に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号３に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号３のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号４に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号４に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号４のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号４のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号５に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号５に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号５のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号５のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号６に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号６に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号６のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号６のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号７に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号７に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号７のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号７のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
親α−アミラーゼはまた、配列番号８に記載のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
一態様では、親α−アミラーゼは、α−アミラーゼ活性を有する、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列番号８に示されるポリペプチドと配列同一性を有する。一態様では、親α−アミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号８のポリペプチドとは、１０個以下のアミノ酸、例えば、５つのアミノ酸、４つのアミノ酸、３つのアミノ酸、２つのアミノ酸、及び１つのアミノ酸だけ異なる。
好ましくは、親α−アミラーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、親α−アミラーゼは、配列番号８のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
当該技術分野において周知の方法に従って、異なる属又は種の株に由来する親をコードするＤＮＡを同定及びクローニングするために、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号８のアミノ酸配列、又はそのフラグメントを、核酸プローブの設計に使用することが可能である。特に、かかるプローブは、所望の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡをハイブリダイズするために使用可能であり、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、続いて通常のサザンブロッティング手順が行なわれる。かかるプローブは全配列より大幅に短くてよいが、少なくとも１４、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さでなければならない。好ましくは、核酸プローブは、長さが少なくとも１００ヌクレオチド、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、又は少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡとＲＮＡとの両方を使用することができる。プローブは、対応する遺伝子（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンを有する）を検出するために、通常標識化される。かかるプローブは本発明に包含される。
かかる他の生物から調製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブでハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。かかる他の生物からのゲノム又はその他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミド電気泳動、又はその他の分離技術によって分離され得る。ライブラリからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡは、サザンブロットに使用されるニトロセルロース又は他の好適な担体物質上に移動及び固定化されてもよい。
本発明の目的では、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８をコードするポリヌクレオチド、又はそのサブシーケンスに対応する、標識化されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズすることを表す。プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルム又は当該技術分野において既知であるその他の検出手段を用いて検出され得る。
一態様では、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、又はそれらのフラグメントである。
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブでは、ストリンジェンシーが非常に低い条件から非常に高い条件は、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片化変性サケ精子ＤＮＡ、及びストリンジェンシーが非常に低い場合及び低い場合には２５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが中程度である場合及び中の上である場合には３５％のホルムアミド、ストリンジェンシーが高い場合及び非常に高い場合には５０％のホルムアミドのいずれか中、４２℃でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った後に、標準的なサザンブロッティング手順を１２〜２４時間、最適に行うものとして定義する。最後に、２ＸＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、５０℃（低いストリンジェンシー）、５５℃（中程度のストリンジェンシー）、６０℃（中の上のストリンジェンシー）、６５℃（高いストリンジェンシー）、又は７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、担体物質を、１５分間それぞれ３回洗浄する。
約１５個のヌクレオチド〜約７０個のヌクレオチドの長さである短いプローブについて、ストリンジェンシー条件は、最適には１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング手順の後、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１Ｘデンハルト溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ、及び１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中、Ｂｏｌｔｏｎ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出されるＴｍよりも低い約５℃〜約１０℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。最後に、担体物質を６ＸＳＣＣ及び０．１％のＳＤＳ中で１５分間一度洗い、計算されたＴｍよりも低い約５℃〜約１０℃の温度で６Ｘ ＳＳＣを用いてそれぞれ１５分間、２回洗う。
親は、あらゆる属の微生物から得ることができる。本発明の目的では、「から得られる」という用語は、所与の源に関連して本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドによってコードされる親が、源によって、又は源からのポリヌクレオチドが挿入された細胞によって産生されることを意味するものとする。一態様において、親は細胞外に分泌される。
親は、細菌α−アミラーゼであってもよい。例えば、親は、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えば、バチルス、クロストリジウム、エンテロコッカス、ゲオバチルス（Geobacillus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、オセカンバチルス（Oceanobacillus）、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、又はストレプトマイセスα−アミラーゼであるか、又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えば、カンピロバクター（Campylobacter）、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、フソバクテリウム（Fusobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、イリオバクター（Ilyobacter）、ネセシリア（Neissera）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、又はウリプラマ・α−アミラーゼであり得る。
一態様では、親は、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチリス、及びバチルス・チューリンゲンシスのα−アミラーゼである。
別の態様では、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、又はストレプトコッカス・イクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）のα−アミラーゼである。
別の態様では、親は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）のα−アミラーゼである。
別の態様では、親は、バチルス種α−アミラーゼ、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８のα−アミラーゼである。
前述の種については、本発明は、それらについて知られている種名にかかわらず、完全及び不完全な状態、並びに他の分類学上の等価物、例えばアナモルフ、を包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な等価物の同一性を容易に認識するであろう。
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの多数の培養コレクションにおいて、公衆に容易に利用可能とされている。
親は、天然物（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離された微生物、又は前述のプローブを使用して天然物質（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られたＤＮＡ試料を含む他の供給源から同定及び取得され得る。天然生息物から直接微生物及びＤＮＡを単離するための技術は、当該技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、別の微生物のゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリ、又は混合ＤＮＡ試料を同様にスクリーニングすることによって、得ることができる。親をコードするポリヌクレオチドがプローブ（複数可）で検出されると、ポリヌクレオチドは、当業者に既知の技術を利用することによって単離されるか、又はクローニングされ得る（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
親は、１つのポリペプチドの一部が別のポリペプチドの一部のＮ末端又はＣ末端で融合されるハイブリッドポリペプチドであってもよい。
親はまた、１つのポリペプチドが別のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合される融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合させることによって産生される。融合ポリペプチドを産生するための技術は、当該技術分野において既知であり、それらがフレーム内にあるようにポリペプチドをコードするコード配列をライゲーションすることを含み、融合されたポリペプチドの発現は、同じプロモータ（複数可）及びターミネータの制御下にある。融合タンパク質はまた、翻訳後に融合が生成されるインテイン技術を使用して構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９）。
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位を更に含むことができる。融合タンパク質の分泌の際、部位は切断され、２つのポリペプチドを放出する。切断部位の例としては、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：４９８−５０３及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：２４０−２４８及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ４：３５−４８において開示されている部位が挙げられるが、これらに限定されない。
変異体の調製
α−アミラーゼ活性を有する本発明に必須の変異体を得るための好適な方法は、（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置において、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置において、修飾を導入することであって、ここで、各修飾は、独立して置換又は欠失であり、変異体は、α−アミラーゼ活性を有する、修飾を導入することと、（ｂ）この変異体を回収することと、を含む。
一態様では、α−アミラーゼ活性を有する変異体を得るための方法は、（ａ）親α−アミラーゼに、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置において、並びに場合により、配列番号２、３、４、５、６、７、８に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置において、修飾を導入することであって、ここで、各修飾は、独立して置換又は欠失であり、変異体は、α−アミラーゼ活性を有する、修飾を導入することと、（ｂ）この変異体を回収することと、を含む。
一実施形態では、修飾は置換である。一実施形態では、修飾は欠失である。
別の実施形態では、α−アミラーゼ活性を有する変異体を得る方法は、（ａ）親α−アミラーゼに１つ以上の位置において置換を導入することであって、ここで、置換は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のポリペプチドのＨ１Ａ、Ｇ７Ａ、Ｇ１０９Ａ、Ｎ２８０Ｓ、Ｗ２８４Ｈ、Ｋ３２０Ａ、Ｍ３２３Ｎ、及びＥ３９１Ａから選択され、番号付けは配列番号１に従うものである、置換を導入することと、（ｂ）この変異体を回収することと、を含む。
本方法は、親α−アミラーゼに１つ以上の位置において欠失を導入することであって、ここで、欠失は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のポリペプチドのＨ１＊、Ｒ１８１＊、Ｇ１８２＊、Ｄ１８３＊、及びＧ１８４＊から選択され、番号付けは配列番号１に従うものである、欠失を導入することと、この変異体を回収することと、を更に含む。
本方法は、親α−アミラーゼに１つ以上の位置において置換を導入することであって、ここで、置換は、配列番号１、３、４、５、６、７、又は８のポリペプチドのＷ１４０Ｙ、Ｎ１９５Ｆ、Ｖ２０６Ｙ、Ｙ２４３Ｆ、Ｅ２６０Ｇ、Ｇ３０４Ｒ、及びＧ４７６Ｋから選択される、置換を導入することと、この変異体を回収することと、を更に含み得る。
変異体は、部位特異的な突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム変異導入法、シャッフルなどなどの、当該技術分野において既知である任意の突然変異誘発手段を用いて調製することができる。
部位特異的突然変異誘発は、親をコードしているポリヌクレオチドにおける１つ以上の規定の部位に１つ以上（数個）の突然変異を作成する技術である。
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによって、インビトロで行うことができる。また、部位特異的突然変異誘発は、親をコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド中のある部位を制限酵素によって切断し、続いて、ポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドをライゲーションすることを含むカセット式突然変異誘発によって、インビトロで行うこともできる。通常、このプラスミド及びオリゴヌクレオチドで消化する制限酵素は同じであり、プラスミドの付着末端及び互いをライゲートするためのインサートを可能にする。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：４９４９−４９５５及びＢａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照されたい。
また、部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野において既知の方法によってインビボで行うこともできる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号、Ｓｔｏｒｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０及びＣａｌｉｓｓａｎｏ ａｎｄ Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照されたい。
本発明では、任意の部位特異的な突然変異誘発手段を用いることができる。変異体を調製するために使用することができる多くの市販のキットが入手可能である。
合成遺伝子の構築は、対象ポリペプチドをコードするように設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、オリゴヌクレオチドを合成し、フォトプログラム可能なマイクロ流体チップ上でアセンブルする、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１０５０−１０５４）によって記載されているマルチプレックスマイクロチップベースの技術及び類似の技術などの多くの技術を利用して実施することができる。
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、既知の突然変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフリングの方法、続いて、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号、又は国際公開第９５／２２６２５号によって開示されているものなどの関連するスクリーニング手順を用いて実施及び試験され得る。使用することができる他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号、国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域指向突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）が挙げられる。
突然変異誘発／シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されるクローニングされた突然変異ポリペプチドの活性を検出するためにハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせてもよい（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードしている突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当該技術分野において標準的な方法を用いて迅速にシーケンスすることができる。これら方法は、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができる。
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、並びに／又は部位特異的な突然変異誘発、及び／若しくはランダムな突然変異誘発、並びに／又はシャッフリングの側面を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチドのフラグメントを利用するプロセスによって典型的に象徴される。このように、遺伝子の規定の領域をデノボ合成することができるが、他の領域は、部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて増幅してもよく、また、更に他の領域は、エラープローンＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅に供してもよい。次いで、ポリヌクレオチドのサブシークエンスをシャッフリングしてもよい。
変異体
本発明に必須の親α−アミラーゼの変異体は、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置における修飾、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含んでもよく、
（ｉｉ）変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）変異体は、α−アミラーゼ活性を有する。これにより、親α−アミラーゼと比較して、又は配列番号１、２、３、４、５、６、７若しくは８のα−アミラーゼと比較して、低温で改善された洗浄性能を有する変異体が提供される。
好適な変異体は、親α−アミラーゼのアミノ酸に対して、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有し得る。
本明細書において好適な親α−アミラーゼの単離された変異体は、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置における修飾、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含んでもよく、
（ｉｉ）この変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）この変異体は、α−アミラーゼ活性を有する。
好適な変異体は、配列番号１に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有し得る。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号２に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号３に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号４に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号５に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号６に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号７に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
別の実施形態では、好適な変異体は、配列番号８に示される成熟ポリペプチドと少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％であるが、１００％未満である配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明で使用するのに好適な変異体における修飾の数は、１〜２０、例えば、１〜１０及び１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾である。
一実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する２つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する３つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する４つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する５つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する６つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する７つ以上の位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する８つの位置での置換などの修飾、並びに場合により、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
一実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する２つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する３つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する４つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する５つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する６つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する７つ以上の位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
別の実施形態では、好適な変異体は、位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する８つの位置での置換などの修飾、並びに、位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０３、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、ここで番号付けは配列番号１に従う。
好ましい一実施形態では、変異体は、１、７、１０９、２８０、及び３９１からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの位置における修飾を含む。一実施形態では、変異体は、１、７、１０９、２８０、及び３９１からなる群から選択される２つ、３つ、４つ、又は５つの位置における少なくとも１つの欠失及び少なくとも１つの修飾を含む。
一実施形態では、好適な変異体は、７、１０９、２８０、及び３９１から選択される１つ、２つ、３つ、又は４つの位置での置換を含む。
一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１＋Ｘ７；Ｘ１＋Ｘ１０９；Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１０９；Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３９１；Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８４＋Ｘ３９１；Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３２０＋Ｘ３９１及びＸ３２３＋Ｘ３９１からなる位置の群から選択される位置において修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３及びＸ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３からなる位置の群から選択される位置において修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ７＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８０＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３９１＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３及びＸ２８０＋Ｘ２８４＋Ｘ３２０＋Ｘ３２３からなる位置の群から選択される位置において修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ７Ｋ、Ｘ７Ｅ、Ｘ７Ｎ、Ｘ７Ｑ、Ｘ７Ｌ、Ｘ７Ｄ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１４０Ｙ、Ｘ１８１＊、Ｘ１８２＊、Ｘ１８３＊、Ｘ１８４＊、Ｘ１９５Ｆ、Ｘ２０６Ｙ、Ｘ２４３Ｆ、Ｘ２６０Ｇ、Ｘ２８０Ｓ、Ｘ２８４Ｈ、Ｘ２８４Ｒ、Ｘ２８４Ｆ、Ｘ３０４Ｒ、Ｘ３２０Ａ、Ｘ３２０Ｍ、Ｘ３２０Ｔ、Ｘ３２０Ｖ、Ｘ３２０Ｓ、Ｘ３２３Ｎ、Ｘ３２３Ｒ、Ｘ３２３Ｓ、Ｘ３２３Ｋ、Ｘ３９１Ａ、Ｘ３９１Ｖ、及びＸ４７６Ｋからなる群から選択される１つ以上の修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
特定の一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１＊＋Ｘ１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ及びＸ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
一実施形態では、好適な変異体は、Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１＊＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１＊＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ７Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ７Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ１０９Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ及びＸ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従う。
好ましい変異体は、以下：
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３ＳＸ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される位置に対応する位置における修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミラーゼのいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号１に記載のアミラーゼと少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号２に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号２に記載のアミラーゼと少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好ましい変異体は、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｅ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｎ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｑ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｌ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ｄ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｍ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｔ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｖ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ｖ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｋ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ｓ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｇ７Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
Ｋ３２０Ａ；
Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ及び
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号２に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得る。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号３に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号３に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号４に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号４に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号５に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号５に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号６に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号６に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号７に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号７に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｋ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｅ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｎ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｑ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｌ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ｄ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｍ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｔ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｖ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ｖ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｋ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ｓ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ；
Ｘ３２０Ａ；
Ｘ７Ａ＋Ｘ３２０Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｆ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｓ＋Ｘ３９１Ａ；
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｒ＋Ｘ３９１Ａ及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号８に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置において修飾を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、また、変異体は、配列番号８に記載のアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
変異体は、Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ２８０Ｓ、及びＸ３９１Ａの群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの位置において修飾を含むことが好ましい。より好ましい一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの位置における修飾は、Ｘ１＊、Ｘ７Ａ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ２８０Ｓ、及びＸ３９１Ａから選択される。
一態様では、好適な変異体は、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３９１Ａ、
Ｘ１＊＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３２０Ａ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａ、
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ３９１Ａ、及び
Ｘ１＊＋Ｘ７Ａ＋Ｘ１０９Ａ＋Ｘ２８０Ｓ＋Ｘ２８４Ｈ＋Ｘ３２３Ｎ＋Ｘ３９１Ａに対応する位置において修飾を含んでもよく、
ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する位置における修飾を含む、配列番号１の変異体を含んでもよく、
ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
好適な変異体は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号２の変異体を含んでもよく、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及び Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号３の変異体に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号４の変異体に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号５の変異体に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号６の変異体に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号７の変異体に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、変異体は、Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ及びＨ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａに対応する修飾を含む、配列番号８の変異体を含み得、ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
一実施形態では、本発明の変異体は、１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６．の群から選択される１つ以上の位置における修飾を更に含む。特定の一実施形態では、本発明の変異体は、Ｗ１４０Ｙ／Ｆ、Ｒ１８１＊、Ｇ１８２＊、Ｄ１８３＊、Ｇ１８４＊、Ｎ１９５Ｆ／Ｙ、Ｉ２０６Ｙ／Ｆ、Ｙ２４３Ｆ、Ｅ２６０Ａ／Ｄ／Ｃ／Ｑ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｔ／Ｙ、Ｇ３０４Ｒ／Ｋ／Ｅ／Ｑ、及びＧ４７６Ｅ／Ｑ／Ｒ／Ｋの群から選択される１つ以上の更なる修飾を含む。本発明の変異体は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０ＹＦ、Ｅ２６０ＧＨＩＫＮＰＲＴＹ、及びＧ４７６ＥＱＲＫからなる群から選択される、２つ、３つ、又は４つの位置での置換を更に含んでもよい。より好ましい一実施形態では、２つ、３つ、又は４つの位置における置換は、Ｇ３０４Ｒ、Ｗ１４０Ｙ、Ｅ２６０Ｇ、及びＧ４７６Ｋから選択される。
本発明の変異体は、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋ、及び
Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ１４０Ｙ＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ＋Ｅ２６０Ｇ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｇ３０４Ｒ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ＋Ｇ４７６Ｋに対応する修飾を含んでもよく、
ここで、番号付けは配列番号１に従い、変異体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の変異体である。
親中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）などの当該技術分野において既知の手順によって同定され得る。後者の技術では、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入し、得られた突然変異型分子をα−アミラーゼ活性について試験して、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照されたい。また、α−アミラーゼ又は他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、又は光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することができる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。親に関連するポリペプチドとの同一性の分析から、必須アミノ酸の同一性を推論することもまた可能である。
核酸コンストラクト
核酸コンストラクトは、制御配列に適合する条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する１つ以上（数個）の制御配列に操作可能に連結された、本発明に必須の変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、変異体の発現を提供するために様々な方法で操作され得る。ベクターに挿入する前にポリヌクレオチドを操作することが、発現ベクターによっては望ましい又は必要な場合がある。組み換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを改変するための技術は、当該技術分野において周知である。
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるプロモータ配列であってもよい。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、突然変異型、切断型、及びハイブリッド型のプロモータを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に相同又は非相同な細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードしている遺伝子から得ることができる。
細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するのに好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）マルトース産生アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、大腸菌（E. coli）ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、及び原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモータ、並びにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）である。更なるプロモータは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４−９４における「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」及び上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。
糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するのに好適なプロモータの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ベネナタムＤａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号）、フサリウム・ベネナタムＱｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイβ−キシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモータ、並びにＮＡ２ ｔｐｉプロモータ（未翻訳リーダが、アスペリギリ属のトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子に由来する未翻訳リーダによって置換されているアスペリギリ属中性α−アミラーゼを含む、修飾プロモータであり、非限定的な例としては、未翻訳リーダが、アスペルギルス・ニデュランス又はアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子に由来する未翻訳リーダによって置換されているアスペルギルス・ニガーのα−アミラーゼをコードする遺伝子を含む、修飾プロモータが挙げられる）、並びにその突然変異体、切断型、及びハイブリッド型プロモータが挙げられる。
酵母宿主では、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエメタロチオネイン（ＣＵＰ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエ３ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８によって記載されている。
また、制御配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される好適な転写ターミネータ配列であってもよい。ターミネータ配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドの３’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のターミネータを使用してよい。
糸状菌宿主細胞に好ましいターミネータは、アスペルギルス（Aspergillus）・ニドゥランスアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーα−グルコシダーゼ、アスペルギルス・ニガーα−グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロマイセス・セレビシエグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、上記のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２によって記載されている。
また、制御配列は、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である、好適なリーダ配列であってもよい。リーダ配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドの５’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のリーダ配列を使用してよい。
糸状菌宿主細胞に好ましいリーダは、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランストリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞に好適なリーダは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセス・セレビシエ３ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエアルファ−因子、及びサッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
また、制御配列は、変異体コード配列の３’末端に操作可能に連結しており、転写されるとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列を使用してよい。
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニドゥランスアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーアルファ−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０によって記載されている。
また、制御配列は、変異体のＮ末端に連結されたシグナルペプチドをコードしており、変異体を細胞の分泌経路に誘導する、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、変異体をコードしているコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレームで天然に連結されているシグナルペプチドコード領域を固有に含んでいてよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有していてもよい。外来シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を天然には含有していない場合、必要になることがある。あるいは、変異体の分泌を強化するために、天然シグナルペプチドコード領域を単に外来シグナルペプチドコード領域に置き換えてもよい。しかし、発現された変異体を宿主細胞の分泌経路に誘導する任意のシグナルペプチドコード領域を使用してもよい。
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属ＮＣＩＢ １１８３７マルトース産生アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスサブチリシン、バチルス・リケニフォルミスベータ−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスアルファ−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリスｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。更なるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７よって記載されている。
糸状菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ、フミコーラ・インソレンスエンドグルカナーゼＶ、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ、及びリゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエアルファ因子及びサッカロマイセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記によって記載されている。
また、制御配列は、変異体のＮ末端に位置するプロペプチドをコードしているプロペプチドコード領域であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によっては酵素原）として知られている。ポリペプチドは、一般的には不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的開裂によって活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフィソーラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号）、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロマイセス・セレビシエアルファ因子の遺伝子から得ることができる。
シグナルペプチド領域及びプロペプチド領域の両方が変異体のＮ末端に存在する場合、プロペプチド領域は変異体のＮ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のＮ末端に隣接して位置する。
また、宿主細胞の増殖に対して変異体の発現を調節することを可能にする調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。原核細胞系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムを使用してもよい。糸状菌では、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、及びアスペルギルス・オリザエグルコアミラーゼプロモータを使用してもよい。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核細胞系では、これら調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及び重金属で増幅するメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、変異体をコードしているポリヌクレオチドは、調節配列と操作可能に連結される。
発現ベクター
組み換え発現ベクターは、本発明に必須であるポリヌクレオチド、プロモータ、並びに転写及び翻訳終止シグナルを含み得る。様々なヌクレオチド及び制御配列は、１つ以上（数個）の便利な制限酵素部位において変異体をコードしているポリヌクレオチドを挿入又は置換するのを可能にするために、このような部位を含み得る組み換え発現ベクターを生成するために互いに接合させてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを、発現に適したベクターに挿入することによって発現させることもできる。発現ベクターの作成において、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列と操作可能に連結されるように、ベクター内に位置する。
組み換え発現ベクターは、簡便に組み換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリヌクレオチドを発現させることができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドであってよい。
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは無関係な染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含んでいてよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡ又はトランスポゾンを一緒に含有する、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドを使用してもよい。
ベクターは、好ましくは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などに供された細胞を容易に選択することを可能にする１つ以上（数個）の選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを備える遺伝子である。
細菌の選択可能マーカーの例は、バチルス・リケニフォルミス若しくはバチルス・サブチリスのｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムにベクターを組み込むか、又はゲノムに依存せずに細胞内でベクターが自律複製することを可能にするエレメントを含む。
宿主細胞のゲノムへの組み込みについては、ベクターは、変異体をコードしているポリヌクレオチドの配列、又は相同若しくは非相同組み換えによってゲノムに組み込むためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。あるいは、ベクターは、染色体（複数可）中の正確な位置（複数可）における宿主細胞のゲノムへの相同組み換えによる組み込みを誘導するための追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、組み込みエレメントは、相同組み換えの可能性を高めるために対応する標的配列に対して高い同一度を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しなければならない。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であってもよい。更に、組み込みエレメントは、非コード又はコードヌクレオチド配列であってもよい。他方、ベクターは、非相同的組み換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
自律複製については、ベクターは、ベクターを対象宿主細胞中で自律的に複製することができる複製起点を更に含み得る。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。用語「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」は、プラスミド又はベクターをインビボで複製させることができるヌクレオチド配列を意味する。
本発明のポリヌクレオチドの１つ超のコピーを宿主細胞に挿入して、変異体の産生を増加させることもできる。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加コピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって、又は選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピー、したがってポリヌクレオチドの追加のコピーを含む細胞が、適切な選択可能な薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択され得る、ポリヌクレオチドと共に増幅可能かつ選択可能なマーカー遺伝子を含めることによって、得ることができる。
実質的に純粋な変異体を得るための本発明の組み換え発現ベクターを構築するために上記エレメントをライゲーションするために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、上記を参照）。
宿主細胞
組み換え宿主細胞は、本発明の変異体の産生を誘導する１つ以上（数個）の制御配列に操作可能に連結された本発明に必須のポリヌクレオチドを含んでもよい。ポリヌクレオチドを含むコンストラクト又はベクターは、当該コンストラクト又はベクターが上記のように染色体組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、複製中に生じた突然変異に起因する、親細胞と同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードしている遺伝子及びその起源に大きく依存する。
宿主細胞は、変異体の組み換え産生において有用な任意の細胞、例えば原核生物又は真核生物であってもよい。
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌としては、バチルス属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、ゲオバチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オセアノバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、及びストレプトマイセス属が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属、大腸菌（E.coli）、フラボバクテリウム属、フソバクテリウム属、ヘリコバクター属、イリオバクター属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ属、及びウレアプラズマ属が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシイ、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチリス、及びバチルス・チューリンゲンシスの細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のバチルス属の細胞であってもよい。
また、細菌宿主細胞は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ウベリス（Streptococcus uberis）、及びストレプトコッカス・イクイ（Streptococcus equi）亜種ズーエピデミカス（Zooepidemicus）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のストレプトコッカス属の細胞であってもよい。
また、細菌宿主細胞は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意のストレプトマイセス属の細胞であってもよい。
バチルス属の細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照されたい）によって、コンピテントセルを使用することによって（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、若しくはＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照されたい）によって、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１を参照されたい）によって、又はコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照されたい）によって行うことができる。大腸菌細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照）又はエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照）によって行うことができる。ストレプトマイセス属の細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換及びエレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照）によって、コンジュゲーション（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５）によって、又は形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９−６２９４を参照）によって行うことができる。シュードモナス属の細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１−３９７を参照）によって、又はコンジュゲーション（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照）によって行うことができる。ストレプトコッカス属の細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、天然コンピテント（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照）によって、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９−２０７０を参照 によって、エレクトロポーテ−ション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照）によって、又はコンジュゲーション（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照）によって行うことができる。しかし、宿主細胞にＤＮＡを導入するための当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができる。
また、宿主細胞は、哺乳類、昆虫、植物、又は真菌の細胞などの真核細胞であってもよい。
真菌細胞は、それ自体既知の方法において、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換され得る。アスペルギルス及びトリコデルマ宿主細胞の形質転換のための好適な手順は、欧州特許第２３８０２３号及びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム種を形質転換するのに好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７−１５６及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０によって記載されている手順を使用して形質転換され得る。
産生方法
変異体を産成する方法は、（ａ）本発明の宿主細胞を、変異体の発現に好適な条件下で培養することと、（ｂ）変異体を回収することと、を含み得る。したがって、本発明は、変異体を産生する方法であって、（ａ）変異体の発現に好適な条件下で、発現ベクター、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置において、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置において修飾を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、（ｂ）この変異体を回収することと、を含む方法に関する。
宿主細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して変異体の産生に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、実験室又は産業用発酵槽において、好適な培地中、ポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で実施される、振盪フラスコ培養又は小規模若しくは大規模発酵（連続、バッチ、流加、又は固形発酵を含む）によって培養され得る。培養は、当該技術分野において既知の手順を使用して、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、商業供給者から入手可能であるか、又は（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに）公開されている組成に従って調製され得る。変異体が栄養培地に分泌された場合、変異体を培地から直接回収することができる。変異体が分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。
変異体は、変異体に特異的な当該技術分野において既知の方法を用いて検出され得る。これら検出方法としては、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消失を挙げることができる。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を決定することができる。
変異体は、当該技術分野において既知の方法により回収することができる。例えば、変異体は、回収、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿が挙げられるがこれらに限定されない、従来の手順によって栄養培地から回収することができる。
変異体は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、溶解度差（例えば、硫安塩析）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出が挙げられるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の様々な手順によって精製して（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）、実質的に純粋な変異体を得ることができる。
別の態様では、変異体を回収せずに、変異体を発現する本発明の宿主細胞を変異体源として使用する。
組成物は、当該技術分野において既知の方法に従って調製することが可能であり、液体又は乾燥組成物の形状であってもよい。例えば、組成物は粒子又は微粒子の形状であり得る。変異体は、当該技術分野において既知の方法に従って安定化することができる。
洗浄組成物
本発明は、好ましくは、消費者用又は業務用のエアケア、カーケア、食器洗浄、布地柔軟剤（軟化剤を含む）、洗濯洗浄力、洗濯及びリンス剤及び／又はケア、塗装面洗浄及び／又はトリートメント、並びに他の洗浄のための特許請求される組成物に関する方法及び／又はその使用のための製品に関する。本発明による、上述のα−アミラーゼ変異体は、典型的には、固形、液体、ゲル、及び／又は単位分量洗剤組成物などの洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物又は食器洗浄洗剤組成物などの洗浄組成物中の構成要素であり得る。液体洗濯洗剤組成物が特に好ましい。
かかる洗浄組成物は、洗浄／洗剤補助剤、好ましくは成分の混合物を含む。典型的には、洗浄補助剤は、０．００１〜９９．９重量％、より典型的には、０．０１〜８０重量％の洗浄補助剤の量で組成物中に存在する。好適な洗浄補助剤は、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白触媒、着色剤、漂白ブースタ、キレート剤、染料移行剤、沈着補助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素源、蛍光増白剤、光活性剤、蛍光剤、布地色相剤、布地柔軟剤、予備形成過酸、ポリマー分散剤、粘土質土壌除去／再付着防止剤、充填塩、ハイドロトロープ、光沢剤、石鹸泡抑制剤、構造伸縮剤、布地軟化剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、殺菌剤、防カビ剤、変色防止剤、防食剤、アルカリ度源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、染料、香料並びにｐＨ調整剤、カプセル化剤、ポリマーを含む。例えば、これらは、イミン漂白促進剤などの漂白成分、過酸化水素源、例えば、過炭酸塩及び／又は過ホウ酸塩、特に、炭酸塩及び／又は硫酸塩、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、及びこれらの任意の混合物などの材料でコーティングされた過炭酸塩、カプセル化形態の予め形成された過酸を含む、予め形成された過酸、遷移金属触媒、抑泡剤又は抑泡剤系、例えば、シリコーン系抑泡剤及び／又は脂肪酸系抑泡剤、粘土、シリコーン、及び／又は四級アンモニウム化合物などの布地柔軟剤、ポリエチレンオキシドなどの凝集剤、ポリビニルピロリドン、ポリ４−ビニルピリジンＮ−オキシド、及び／又はビニルピロリドンとビニルイミダゾールとのコポリマーなどの移染阻害剤、イミダゾールとエピクロロヒドリンとの縮合によって産生されるオリゴマーなどの布地一体性成分、アルコキシル化ポリアミン及びエトキシル化エチレンイミンポリマーなどの汚れ分散剤及び汚れ再付着防止助剤、ポリエステルなどの再付着防止成分、カルボキシレートポリマー、例えば、マレイン酸ポリマー、又はマレイン酸とアクリル酸とのコポリマー、香料、例えば、香料マイクロカプセル、デンプン封入アコード、香料噴霧剤、石鹸リング、審美的粒子、染料、硫酸ナトリウムなどのフィラー（ただし、組成物はフィラーを実質的に含まないことが好ましい）、１．６Ｒ及び２．０Ｒケイ酸ナトリウムを含むケイ酸ナトリウム、又はメタケイ酸ナトリウムなどのケイ酸塩、ジカルボン酸とジオールとのコポリエステル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエトキシセルロース、又は他のアルキル若しくはアルキルアルコキシセルロースなどのセルロース性ポリマー、１，２プロパンジオール、モノエタノールアミンなどの溶媒、ジエチレングリコール、エタノール、及びこれらの任意の混合物、ヒドロトロープ、例えば、クメンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、及び任意の混合物、クエン酸などの有機酸、並びにこれらの任意の組み合わせを含み得る。組成物は、洗浄補助剤が、（ｉ）香料マイクロカプセル、（ｉｉ）布地色相剤、（ｉｉｉ）プロテアーゼ、（ｉｖ）両親媒性の洗浄用ポリマー、（ｖ）リパーゼ、又は（ｖｉ）これらの混合物、からなる群から選択される１つ以上を含むようなものであり得る。
別の好ましい態様では組成物は、非イオン性を含む半極性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は両性イオン性及び／又は両性及び／又は半極性非イオン性及び／又はこれらの混合物であり得る１つ以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、０．１重量％〜６０重量％又は０．５〜５０重量％又は１〜４０重量％の組成物のレベルで存在する。
それに含まれるとき、洗浄組成物は、通常、線状アルキルベンゼンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート、アルキルサルフェート（高級アルコール硫酸エステル塩）、アルコールエトキシサルフェート、二級アルカンスルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸などの約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤を含有する。
それに含まれるとき、洗浄剤は、通常、アルコールエトキシレート、ノニル−フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミン−オキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミン、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）などの約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤を含有する。
洗浄組成物は、１つ以上の他の酵素を含んでもよい。したがって、好ましい組成物は、（ａ）親α−アミラーゼの変異体であって、ここで、変異体が、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３及び３９１に対応する１つ以上の位置における修飾、並びに場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、
（ｉｉ）この変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
（ｉｉｉ）この変異体が、α−アミラーゼ活性を有する、親α−アミラーゼの変異体と、（ｂ）好ましくはアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ぺクチン分解酵素、ペプチドグルタミアーゼ、ペロオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼからなる群から選択される１つ以上の更なる酵素と、を含む。更なる酵素（複数可）は、例えば、アスペルギルス属、例えば、アスペルギルス・アクレタス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス−フミガーツフ、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、若しくはアスペルギルス・オリザエ；フザリウム（Fusarium）、例えば、フザリウム・バクトリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クロクウェレンス、フザリウム・クルモラム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・グラミナム、フザリウム・ヘテロスポラム、フザリウム・ネグンジ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レチクラタム、フザリウム・ロセウム、フザリウム・サムブシナム、フザリウム・サルコクロウム、フザリウム・サルフレウム、フザリウム・トルロサム、フザリウム・トリコセシオイデス、若しくはフザリウム・ベンニタム；フミコーラ（Humicola）、例えば、フミコーラ・インソレンス、若しくはフミコーラ・ラヌギノサ；又はトリコデルマ（Trichoderma）、例えば、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・レーシ、若しくはトリコデルマ・ビリデ、に属する微生物によって産生されてもよい。
好ましくは、組成物は、プロテアーゼ若しくは２種以上のプロテアーゼの混合物、リパーゼ若しくは２種以上のリパーゼの混合物、ペルオキシダーゼ若しくは２種以上のペルオキシダーゼの混合物、１つ以上の追加のデンプン分解酵素、例えば、追加のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、好ましくは追加のα−アミラーゼ、１種のＣＧＴａｓｅ若しくは２種以上のＣＧＴａｓｅの混合物、及び／又はセルラーゼ若しくは２種以上のセルラーゼの混合物、マンナナーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，ＤｅｎｍａｒｋのＭＡＮＮＡＷＡＹ（商標））若しくは２種以上のマンナナーゼの混合物、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、及び／又はラッカーゼ、あるいはこれらの１つ以上のうちの２種以上の混合物、を含む。
概して、選択された酵素の性質（複数可）は、選択された洗剤と適合すべきであり（すなわち、ｐＨ最適条件、他の酵素及び非酵素成分との適合性など）、酵素（複数可）は、有効量で存在すべきである。好ましくは、本発明の製品は、組成物１グラム当たり、少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは約０．０５〜約１０、より好ましくは約０．１〜約６、とりわけ約０．２〜約５ｍｇの更なる活性酵素を含む。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）などの中性又はアルカリ性の微生物セリンプロテアーゼを含むメタロプロテアーゼ及び／又はセリンプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。一態様では、このような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものであってもよい。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの化学的又は遺伝的に改変された突然変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどのセリンプロテアーゼであってよい。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下が挙げられる。
（ａ）米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、同第７，２６２，０４２号及び国際公開第０９／０２１８６７号に記載のバチルス・レンタス、Ｂ．アルカロフィルス（B.alkalophilus）、枯草菌、Ｂ．アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス及びバチルス・ギブソニィなどのバチルスから誘導されたものなどを含むサブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）。
（ｂ）国際公開第８９／０６２７０号に記載されているフサリウムプロテアーゼ、並びに同第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記載されているセルロモナスに由来するキモトリプシンプロテアーゼを含む、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源）などのトリプシン型又はキモトリプシン型のプロテアーゼ。
（ｃ）国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記載されているバチルス・アミロリケファシエンスに由来するものを含むメタロプロテアーゼ。
好ましいプロテアーゼとしては、バチルス・ギブソニィ又はバチルス・レンタスに由来するものが挙げられる。
好適な市販のプロテアーゼ酵素としては、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）より、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｓｏｌｖａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓより、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）の商品名で販売されているもの、Ｈｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａより入手可能なもの、すなわちＢＬＡＰ（以下の突然変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する、米国特許第５，３５２，６０４号の図２９で示される配列、以下ＢＬＡＰという）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）（全てＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａより入手可能）、並びに花王のＫＡＰ（突然変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバチルス・アルカロフィルス由来のサブチリシン）が挙げられる。更なる適切なプロテアーゼが、国際公開第２０１１／０３６２３号、同第２０１１／１４０３１６号、同第２０１１／１４０３６４号及び同第２０１２／０５７７８号に記載される。
リパーゼ：適切なリパーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のものが挙げられる。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば、Ｈ．ラヌギノサ（H.lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノサス（T.lanuginosus））又はＨ．インソレンス（H.insolens）などのフミコーラ属（別名サーモマイセス属（Thermomyces））由来のリパーゼ；例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P.pseudoalcaligenes）、Ｐ．セパシア（P.epacia）、Ｐ．スタットゼリ（P.stutzeri）、Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）、シュードモナスＳＤ７０５株、Ｐ．ウィスコシネンシス（P.wisconsinensis）などのシュードモナス属のリパーゼ；例えば、Ｂ．サブチリス（Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１，２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス、又はＢ．プミルスなどのバチルス属のリパーゼが挙げられる。
リパーゼは、米国特許第６，９３９，７０２（Ｂ１）号、及び米国特許出願第２００９／０２１７４６４号に記載されているような「第１サイクルのリパーゼ」であってもよい。一態様では、リパーゼは、第１の洗浄用リパーゼであり、好ましくは、Ｔ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒ変異を含む、サーモマイセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）由来の野生型リパーゼの変異体である。野生型配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのアクセッション番号Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｏ５９９５２（サーモマイセス・ラヌギノサス（フミコーラ・ラヌギノサ）由来の２６９個のアミノ酸（アミノ酸２３〜２９１）である。好ましいリパーゼは、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（登録商標）、及びＬｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）の商品名で販売されているリパーゼを含み得る。
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フミコーラ（Humicola）属、フサリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えば、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、及びフサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から産生される、真菌セルラーゼが挙げられる。
一態様では、好ましい酵素としては、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を呈する微生物由来のエンドグルカナーゼが挙げられ、好ましくは、以下を含む群から選択される：
（ａ）米国特許第７，１４１，４０３（Ｂ２）号におけるアミノ酸配列の配列番号２に対して少なくとも９０％、９４％、９７％、更には９９％同一な配列を有するバシルス属のメンバーに対して内因性である細菌性ポリペプチド；
（ｂ）キシログルカンと非晶質セルロース基質の両方に対して酵素活性を有するグリコシル加水分解酵素であって、ＧＨファミリー５、１２、４４又は７４の中から選択される、グリコシル加水分解酵素；
（ｃ）国際公開第０９／１４８９８３号の配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９４％、９７％、及び更には９９％同一な配列を有するグリコシル加水分解酵素；
（ｄ）及びこれらの混合物。
好適なエンドグルカナーゼは、商品名Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）及びＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）として販売されている。
他の市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸ ＨＡ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
他のアミラーゼ：好ましくは、組成物は更なるアミラーゼを含む。好適な更なるアミラーゼは、細菌又は真菌由来のものを含む、α−アミラーゼを含む。化学的又は遺伝的に改変された突然変異体（変異体）が含まれる。好ましいアルカリ性α−アミラーゼは、バチルスの菌種に由来するもの、例えば、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、又は他のバチルス属（Bacillus sp）、例えばバチルス属（Bacillus sp）のＮＣＢＩ １２２８９、ＮＣＢＩ １２５１２、ＮＣＢＩ １２５１３、ＤＳＭ ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）ＤＳＭ １２３６８、ＤＳＭＺ１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ Ｋ３６、又はＫＳＭ Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）である。好ましい更なるアミラーゼは、以下から選択され得る：（ａ）国際公開第９４／０２５９７号、同第９４／１８３１４号、同第９６／２３８７４号及び同第９７／４３４２４号に記載されている変異体、特に国際公開第９６／２３８７４号に配列番号２として列挙されている酵素に対して、以下の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８及び４４４のうちの１つ以上が置換されている変異体；（ｂ）国際公開第９６／２３８７３号、国際公開第００／６００６０号、国際公開第０６／００２６４３号、及び国際公開第２０１７／１９２６５７号に記載の変異体、特に、国際公開第０６／００２６４３号において配列番号１２として記載のＡＡ５６０酵素に対して、以下の位置：２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０３、２１４、２３１、２４６、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４において１つ以上の置換を有する変異体、好ましくは、Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊の欠損を含有する変異体；（ｃ）国際公開第０６／００２６４３号における配列番号４、バチルス属ＳＰ７２２由来の野生型酵素と少なくとも９０％の同一性を示す変異体、特に１８３及び１８４位に欠失を有する変異体、並びに参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第００／６００６０号に記載されている変異体；（ｄ）バチルス属７０７の野生型酵素（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）と少なくとも９５％の同一性を示す変異体、特に、以下の突然変異Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２、及び／又はＭ２６１のうちの１つ以上を含むもの。好ましくは、当該アミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑのうちの１つ以上を含む。特に好ましいのは、Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔ変異を含むものである；（ｅ）国際公開第０９／１４９１３０号に記載されている変異体、好ましくは国際公開第０９／１４９１３０号において配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を示すもの、ゲオバチルス・ステアロフェルモフィルス（Geobacillus Stearophermophiluss）に由来する野生型酵素又はその切断バージョン；（ｆ）国際公開第２０１６０９１６８８号の配列番号１と少なくとも８９％の同一性を示す変異体、特にＨ１８３＋Ｇ１８４位での欠失及び４０５、４２１、４２２、及び／又は４２８位に１つ以上の変異を含む変異体；（ｇ）パエニバチルス・カードラノリティカス（Paenibacillus curdlanolyticus）ＹＫ９由来の「ＰｃｕＡｍｙｌ α−アミラーゼ」（国際公開第２０１４０９９５２３号の配列番号３）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体；（ｈ）サイトファーガ属由来の「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」（国際公開第２０１４１６４７７７号の配列番号１）と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を示す変異体；（ｉ）枯草菌（国際公開第２００９１４９２７１号の配列番号１）と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を示す変異体；（ｊ）受託番号ＡＢ０５１１０２によるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｋ３８由来の野生型アミラーゼと少なくとも９０％の同一性を示す変異体；（ｋ）バチルス属（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号７）からのＡＡＩ１０の成熟アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示す変異体；（ｌ）アリシクロバチルス属アミラーゼ（国際公開第２０１６１８０７４８号の配列番号８）の成熟アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を示す変異体；又はこれらの混合物。存在する場合、本発明の組成物は、好ましくは、組成物１グラム当たり、少なくとも０．０１ｍｇ、好ましくは約０．０５〜約１０、より好ましくは約０．１〜約６、とりわけ約０．２〜約５ｍｇの更なる活性アミラーゼを含む。
好適な市販のα−アミラーゼとしては、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ ９０００（Ｂｉｏｚｙｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ ＧｍｂＨＷｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ ２７ｂ Ａ−１２００ Ｗｉｅｎ Ａｕｓｔｒｉａ）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ ＨＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ１０００（登録商標）及びＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ２０００（登録商標）を含むＰＲＥＦＥＲＥＮＺ Ｓ（登録商標）シリーズ、並びにＰＵＲＡＳＴＡＲ ＯＸＡＭ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、及びＫＡＭ（登録商標）（Ｋａｏ，１４−１０ Ｎｉｈｏｎｂａｓｈｉ Ｋａｙａｂａｃｈｏ，１−ｃｈｏｍｅ，Ｃｈｕｏ−ｋｕ Ｔｏｋｙｏ １０３−８２１０，Ｊａｐａｎ）、が挙げられる。一態様では、適切なアミラーゼとしては、ＡＴＬＡＮＴＩＣ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＩＮＴＥＮＳＡ（登録商標）、及びＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、並びにこれらの混合物が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学的に修飾された又はタンパク質操作された突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Coprinus）属のペルオキシダーゼ、例えば、国際公開第９３／２４６１８号、同第９５／１０６０２号、及び同第９８／１５２５７号に記載のようなＣ．サイネレウス（cinereus）及びその変異型のペルオキシダーゼが挙げられる。
市販のペルオキシダーゼとしては、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
他の酵素；他の好ましい酵素には、商標名、Ｐｅｃｔａｗａｓｈ（登録商標）、Ｐｅｃｔａｗａｙ（登録商標）で販売されているペクチン酸リアーゼ、及び商標名、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）（以上全てＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、及びＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で販売されているマンナナーゼが含まれる。
洗剤酵素（複数可）は、１つ以上の酵素を含有する別個の添加物を添加することによって、又はこれらの酵素の全てを含む混合添加物を添加することによって、洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加物、すなわち、別個の添加物又は混合添加物は、例えば、粒状、液体、スラリーなどに製剤化することができる。好ましい洗剤添加物製剤は、粒状、特に非ダスティング粒状、液体、特に安定化された液体、又はスラリーである。
非ダスティング粒状物が産生されてもよく、所望により当該技術分野において既知の方法でコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材料の例は、平均モル重量が１０００〜２００００であるポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、かつ１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。フィルム形成コーティング材料は、例えば、流動床技術に適用されてもよい。液体酵素調製品は、例えば、確立されている方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することによって安定化させてもよい。
組成物は、布地色相剤（色合い剤、青味剤、又は白化剤と称される場合もある）を含み得る。典型的には、色相剤は、布地に青又は紫の色合いをもたらす。色相剤は、単独又は組み合わせのいずれかで使用して、特定の色相の色合いを作り出し、かつ／又は異なる種類の布地に色合いを付けることができる。これは、例えば赤と緑−青の染料とを混合して青又は紫の色合いを生じさせることにより提供され得る。色相剤は、任意の既知の化学的部類の染料から選択されてもよく、これには、アクリジン、アントラキノン（多環式キノンを含む）、アジン、予め金属化されたアゾを含むアゾ（例えば、モノアゾ、ジスアゾ、トリスアゾ、テトラキスアゾ、ポリアゾ）、ベンゾジフラン及びベンゾジフラノン、カロテノイド、クマリン、シアニン、ジアザヘミシアニン、ジフェニルメタン、ホルマザン、ヘミシアニン、インジゴイド、メタン、ナフタルイミド、ナフトキノン、ニトロ及びニトロソ、オキサジン、フタロシアニン、ピラゾール、スチルベン、スチリル、トリアリールメタン、トリフェニルメタン、キサンテン、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
好適な布地色相剤は、染料、染料−粘土結合体、並びに有機及び無機顔料を含む。好適な染料としては、低分子染料及びポリマー染料が挙げられる。好適な小分子染料は、例えば、ブルー、バイオレット、レッド、グリーン、又はブラックに分類され、単独で又は組み合わせのいずれかで所望の色合いをもたらす、直接染料、塩基性染料、反応染料若しくは加水分解した反応性染料、溶媒染料、又は分散染料の色指数（Ｃ．Ｉ．）分類に分類される染料からなる群から選択される小分子染料を含む。別の態様では、適切な小分子染料としては、色指数（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＵＫ））番号９、３５、４８、５１、６６、及び９９などのダイレクトバイオレット染料、１、７１、８０及び２７９などのダイレクトブルー染料、１７、７３、５２、８８及び１５０などのアシッドレッド染料、１５、１７、２４、４３、４９及び５０などのアシッドバイオレット染料、１５、１７、２５、２９、４０、４５、７５、８０、８３、９０及び１１３などのアシッドブルー染料、１などのアシッドブラック染料、１、３、４、１０及び３５などのベーシックバイオレット染料、３、１６、２２、４７、６６、７５及び１５９などのベーシックブルー染料、欧州特許第ＥＰ１７９４２７５号若しくは欧州特許第ＥＰ１７９４２７６号に記載されるものなどの分散又は溶媒染料、又は米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に開示される染料、並びにこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、色指数番号が、アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。
好適なポリマー染料としては、共有結合している（結合していると称されることもある）色原体（色素−ポリマー結合体）を含有するポリマー、例えば、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。ポリマー染料としては、国際公開第２０１１／９８３５５号、同第２０１１／４７９８７号、米国特許出願公開第２０１２／０９０１０２号、国際公開第２０１０／１４５８８７号、同第２００６／０５５７８７号、及び同第２０１０／１４２５０３号に記載されているものが挙げられる。
別の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）の名称で販売されている布地直接着色剤、少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、一級アミン部分、二級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーと、から形成される染料−ポリマー共役体からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。更に別の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）バイオレットＣＴ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）から商品名ＡＺＯ−ＣＭ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ、商品コードＳ−ＡＣＭＣで販売されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９と共役されているＣＭＣなどのリアクティブブルー、リアクティブバイオレット又はリアクティブレッドの染料に共有結合しているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アルコキシル化トリフェニル−メタンポリマー着色料、アルコキシル化チオフェンポリマー着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
好ましい色相染料としては、米国特許出願公開第２００８／０１７７０９０号に見出されるアルコキシル化チオフェンアゾ増白剤が挙げられ、場合により、国際公開第２０１１／０１１７９９号の表５中の実施例１〜４２から選択されるものなどのように、アニオン性であり得る。他の好ましい染料は、米国特許第８，１３８，２２２号に開示されている。
好適な染料−粘土結合体としては、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料及びスメクタイト粘土、並びにこれらの混合物を含む群から選択される染料−粘土結合体が挙げられる。別の態様では、好適な染料−粘土結合体としては、Ｃ．Ｉ．ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料と、モンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土及びこれらの混合物からなる群から選択される粘土とからなる群から選択される、染料−粘土結合体が挙げられる。更に別の態様では、好適な染料粘土複合体としては、モンモリロナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５複合体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５複合体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５複合体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０複合体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０複合体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２複合体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５複合体、ヘクトライトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５複合体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５複合体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０複合体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０複合体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２複合体、サポナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５複合体、サポナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５複合体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５複合体、サポナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０複合体、サポナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０複合体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２複合体、及びこれらの混合物からなる群から選択される染料粘土複合体が挙げられる。
好適な顔料としては、フラバントロン、インダントロン、１〜４個の塩素原子を含有する塩素化インダントロン、ピラントロン、ジクロロピラントロン、モノブロモジクロロピラントロン、ジブロモジクロロピラントロン、テトラブロモピラントロン、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基は、非置換であってもよく、又はＣ１〜Ｃ３−アルキル若しくはフェニル若しくは複素環式ラジカルによって置換されていてもよく、当該フェニル及び複素環式ラジカルは、水溶性を付与しない置換基を更に有してもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン、イソビオラントロン、ジオキサジン顔料、１分子あたり最高２個の塩素原子を含有し得る銅フタロシアニン、１分子あたり最高１４個の臭素原子を含有するポリクロロ−銅フタロシアニン又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン、並びにこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。
別の態様では、適切な顔料としては、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．顔料ブルー２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．顔料バイオレット１５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。ビルダー−洗浄組成物は、ゼオライトＡ、ゼオライトＭＡＰ（最大アルミニウムＰ型）などのゼオライトであってもよい、炭酸塩、重炭酸塩、又はケイ酸塩に基づくビルダーなどのビルダーを更に含有してもよい。洗濯に使用可能なゼオライトは、好ましくは、式Ｎａ１２（ＡｌＯ２）１２（ＳｉＯ２）１２・２７Ｈ２Ｏを有し、粒径は、通常、ゼオライトＡにおいて１〜１０μｍ、及びゼオライトＭＡＰにおいて０．７〜２ｕｍである。他のビルダーは、強アルカリ性のメタケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３・ｎＨ２Ｏ又はＮａ２Ｓｉ２Ｏ５・ｎ Ｈ２Ｏ）であり、好ましくは食器洗浄に使用される。好ましい実施形態では、洗剤ビルダーの量は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、又は５０％超であってもよく、また８０％未満、６５％未満であってもよい。食器洗浄洗剤において、ビルダーの濃度は、典型的には、４０〜６５％、特に５０〜６５％、又は更には７５〜９０％である。
カプセル化剤：組成物はカプセル化剤を含み得る。一態様では、カプセル化剤は、コアと、内面及び外面を有するシェルと、を含み、当該シェルは、当該コアをカプセル化する。
カプセル剤の一態様では、コアは、以下からなる群から選択される材料を含み得る：香料、増白剤；染料、防虫剤；シリコーン；ワックス；着香剤；ビタミン；布地柔軟化剤；スキンケア剤、一態様では、パラフィン；酵素；抗菌剤；漂白剤；感覚剤；及びこれらの混合物からなる群から選択される材料を含んでもよく、当該シェルは、ポリエチレン；ポリアミド、ポリスチレン；ポリイソプレン；ポリカーボネート；ポリエステル；ポリアクリレート；アミノプラスト（一態様では、当該アミノプラストは、ポリ尿素、ポリウレタン、及び／又はポリ尿素ウレタンを含んでもよく、一態様では、当該ポリ尿素は、ポリオキシメチレン尿素及び／又はメラミンホルムアルデヒドを含んでもよい）；ポリオレフィン；多糖類、（一態様では、当該多糖類は、アルギン酸塩及び／又はキトサンを含んでもよい）；ゼラチン；セラック；エポキシ樹脂；ビニルポリマー；非水溶性無機材料；シリコーン；並びにこれらの混合物。
このカプセル化剤の一態様では、このコアは香料を含んでもよい。このようなカプセル化剤は、香料マイクロカプセルである。
このカプセル化剤の一態様では、このシェルはメラミンホルムアルデヒド、及び／又は架橋したメラミンホルムアルデヒドを含んでもよい。
一態様では、コア材料及びシェルを含むことができ、このシェルがこのコア材料を少なくとも部分的に取り囲む、好適なカプセルが開示される。このカプセル化剤の少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％が、約０．２ＭＰａ〜約１０ＭＰａ、約０．４ＭＰａ〜約５ＭＰａ、約０．６ＭＰａ〜約３．５ＭＰａ、又は更には約０．７ＭＰａ〜約３ＭＰａの破壊強度、並びに０％〜約３０％、０％〜約２０％、又は更には０％〜約５％の有益剤漏出率を有してもよい。
一態様では、このカプセル化剤の少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％が、約１マイクロメートル〜約８０マイクロメートル、約５マイクロメートル〜６０マイクロメートル、約１０マイクロメートル〜約５０マイクロメートル、又は更には約１５マイクロメートル〜約４０マイクロメートルの粒径を有してもよい。
一態様では、このカプセル化剤の少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％が、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ、又は更には約１００ｎｍ〜約１６０ｎｍの粒子壁厚を有し得る。
一態様では、カプセル化剤のコア材料は、香料原材料からなる群から選択される材料、及び／又は場合により、以下からなる群から選択される材料を含み得る：ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、菜種油、大豆油、トウモロコシ油、ヤシ油、亜麻仁油、ベニバナ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム核油、ヒマシ油、レモン油及びこれらの混合物を含むストレート及び／又はブレンド植物油を含む植物油；植物油のエステル（エステルは、アジピン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、アジピン酸ブチルベンジル、アジピン酸ベンジルオクチル、リン酸トリクレジル、リン酸トリオクチル、及びこれらの混合物を含む）；約８０℃を超える沸点を有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を含む、直鎖又は分岐鎖炭化水素；部分的に水素化したテルフェニル、フタル酸ジアルキル、モノイソプロピルビフェニルを含むアルキルジフェニル、ジプロピルナフタレンを含むアルキル化ナフタレン、灯油、鉱油、及びこれらの混合物を含むペトロリウムスピリット；ベンゼン、トルエン、及びこれらの混合物を含む芳香族溶剤；シリコーンオイル；並びにこれらの混合物。
一態様では、このカプセル化剤の壁材料は、アルデヒドとアミンの反応生成物などの適切な樹脂を含んでもよく、適切なアルデヒドとしてはホルムアルデヒドが挙げられる。好適なアミンとしては、メラミン、尿素、ベンゾグアナミン、グリコールウリル、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なメラミンとしては、メチロールメラミン、メチル化メチロールメラミン、イミノメラミン、及びこれらの混合物が挙げられる。好適な尿素としては、ジメチロール尿素、メチル化ジメチロール尿素、尿素−レゾルシノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
一態様では、好適なホルムアルデヒドスカベンジャは、カプセル化剤と共に、例えばカプセルスラリー中で用いても、かつ／又は、カプセル化剤を消費者製品に加える前に、加えるときに、加えた後に、このような消費者製品に加えられてもよい。
好適なカプセルは、Ａｐｐｌｅｔｏｎ Ｐａｐｅｒｓ Ｉｎｃ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＵＳＡ）から購入することができる。
加えて、前述のカプセル化剤を製造するための材料が、以下の供給元から入手可能である：Ｓｏｌｕｔｉａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｕ．Ｓ．Ａ）、Ｃｙｔｅｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｕ．Ｓ．Ａ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＣＰ Ｋｅｌｃｏ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）；ＢＡＳＦ ＡＧ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｒｈｏｄｉａ Ｃｏｒｐ．（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）、Ａｇｒｉｕｍ（Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）、ＩＳＰ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｕ．Ｓ．Ａ）、Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）；Ｓｔｒｏｅｖｅｒ Ｓｈｅｌｌａｃ Ｂｒｅｍｅｎ（Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）；Ｂａｙｅｒ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）。
一態様では、組成物は、以下からなる群から選択される酵素安定化剤を含んでもよい：（ａ）カルシウム塩、マグネシウム塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される無機塩；（ｂ）オリゴ糖、多糖類、及びこれらの混合物からなる群から選択される炭水化物；（ｃ）フェニルボロン酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される質量有効可逆性プロテアーゼ阻害剤；並びに（ｄ）これらの混合物。
別の実施形態では、組成物は、（１）ホウ素含有化合物などの可逆的プロテアーゼ阻害剤、（２）１−２プロパンジオール、（３）ギ酸カルシウム及び／又はギ酸ナトリウム、（４）それらの任意の組み合わせを含む。
一態様では、組成物は、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロースベースの材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、並びにこれらの混合物からなる群から選択される構造剤を含み得る。
ポリマー
ポリマー：消費者製品は、１つ以上のポリマーを含み得る。実施例には、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリル酸塩などのポリカルボン酸塩、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸コポリマー、並びに両親媒性のポリマーがある。
両親媒性の洗浄用ポリマー
好ましくは、両親媒性洗浄ポリマーは、次の一般構造式：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（式中、ｎ＝２０〜３０であり、ｘは、３〜８である）を有する化合物であるか、又はその硫酸化若しくはスルホン化変形体である。
本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、布地及び表面からグリース粒子を除去するように、親水性と疎水性との特性が釣り合っている任意のアルコキシル化ポリマーを示す。本発明の両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの具体的な実施形態は、コア構造及びそのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基を含む。これらは、好ましくは内側ポリエチレンオキシドブロック及び外側ポリプロピレンオキシドブロックを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンを含んでいてもよい。
コア構造は、縮合形態で式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（ＩＶ）の繰り返し単位を含むポリアルキレンイミン構造を含んでもよい。
Figure 2020510712
 （式中、＃は、各場合において、窒素原子と、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の２つの隣接する繰り返し単位の基Ａ１の遊離結合部位との間の結合の半分を示し、＊は、各場合において、アルコキシレート基の１つとの結合の半分を示し；Ａ１は独立して直鎖又は分岐鎖Ｃ２〜Ｃ６−アルキレンから選択され；ポリアルキレンイミン構造は、式（Ｉ）の１の繰り返し単位、式（ＩＩ）のｘの繰り返し単位、式（ＩＩＩ）のｙの繰り返し単位及び式（ＩＶ）のｙ＋１の繰り返し単位からなり、ｘ及びｙは、各場合において、０〜約１５０の範囲の値を有し、ポリアルキレンイミンコア構造の平均重量平均分子量Ｍｗは、約６０〜約１０，０００ｇ／モルの範囲の値である）。
代替的に、コア構造は、式（Ｉ．ａ）及び／又は（Ｉ．ｂ）のＮ−（ヒドロキシアルキル）アミンから選択される少なくとも１つの化合物の縮合生成物のポリアルカノールアミン構造
Figure 2020510712
 を含む（式中Ａは、Ｃ１〜Ｃ６−アルキレンから独立して選択され、Ｒ１、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４、Ｒ４＊、Ｒ５及びＲ５＊は、水素、アルキル、シクロアルキル、又はアリールから独立して選択され、上記ラジカルのアルキル、シクロアルキル、又はアリールは、任意に置換されてもよく、Ｒ６は、水素、アルキル、シクロアルキル、又はアリールから選択され、上記ラジカルのアルキル、シクロアルキル、又はアリールは、任意に置換されてもよい）。
コア構造に結合した複数のアルキレンオキシ基は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位
Figure 2020510712
 から独立して選択される（式中＊は、各場合において、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＶ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合の半分を示し、Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから独立して選択され、Ａ３は、１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４−アルキルから独立して選択され、ｍは、０〜約２の範囲の平均値を有し、ｎは、約２０〜約５０の範囲の平均値を有し、ｐは、約１０〜約５０の範囲の平均値を有する）。
両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーの特定の実施形態は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンから選択されてもよく、エトキシル化度及びプロポキシル化度は特定の制限値を上回りも下回りもしない。本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの特定の実施形態は、ポリエチレンブロックの、ポリプロピレンブロックに対する比率（ｎ／ｐ）の最小値が約０．６であり、最大値が約１．５（ｘ＋２ｙ＋１）１／２である。約０．８〜約１．２（ｘ＋２ｙ＋１）１／２のｎ／ｐ比率を有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンは、特に有益な特性を有することが判明している。
本発明によるアルコキシル化ポリアルキレンイミンは第一級、第二級、及び第三級アミン窒素原子からなる主鎖を有し、これらの窒素原子は、アルキレンラジカルＡにより互いに結合し、ランダムに配列される。ポリアルキレンイミン主鎖の主鎖及び側鎖を開始又は終端し、その残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される、第一級アミノ部分は、それぞれ式（Ｉ）又は（ＩＶ）の繰り返し単位と称される。残りの水素原子が引き続いてアルキレンオキシ単位により置換される第二級アミノ部分は、式（ＩＩ）の繰り返し単位と称される。主鎖及び側鎖に分岐する第三級アミノ部分は、式（ＩＩＩ）の繰り返し単位と称される。
環化はポリアルキレンイミン主鎖の形成時に生じる可能性があるので、環状アミノ部分が主鎖内に小量で存在する場合もある。環状アミノ部分を含有するこのようなポリアルキレンイミンは、無論、非環状第一級及び第二級アミノ部分からなるものと同様にアルコキシル化される。
窒素原子及びＡ１基からなるポリアルキレンイミン主鎖は、約６０〜約１０，０００ｇ／ｍｏｌｅ、好ましくは、約１００〜約８，０００ｇ／ｍｏｌｅ、より好ましくは、約５００〜約６，０００ｇ／ｍｏｌｅの平均分子量Ｍｗを有する。
和（ｘ＋２ｙ＋１）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアルキレンイミン単位の総数に相当し、それゆえにポリアルキレンイミン主鎖の分子量に直接関わる。しかしながら、本明細書で与えられた値は、混合物中に存在する全てのポリアルキレンイミンの数平均に関わる。和（ｘ＋２ｙ＋２）は、１つの個々のポリアルキレンイミン主鎖内に存在するアミノ基の総数に相当する。
アミノ窒素原子に接続するラジカルＡ１は、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン、１，２−イソブチレン、１，２−ペンタンジイル、１，２−ヘキサンジイル又はヘキサメチレンなどの、同一又は異なる、直鎖又は分岐鎖Ｃ２〜Ｃ６−アルキレンラジカルであってもよい。好ましい分岐状アルキレンは、１，２−プロピレンである。好ましい直鎖アルキレンは、エチレン及びヘキサメチレンである。より好ましいアルキレンは、１，２−エチレンである。
ポリアルキレンイミン主鎖の第一級及び第二級アミノ基の水素原子は、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位により置換される。
Figure 2020510712
この式では、可変因子は、好ましくは、以下に与えられる意味のうちの１つを有する。
Ａ２は、各場合において、１，２−プロピレン、１，２−ブチレン及び１，２−イソブチレンから選択され、好ましくは、Ａ２は、１，２−プロピレンであり、Ａ３は、１，２−プロピレンであり、Ｒは、各場合において、水素及びＣ１〜Ｃ４アルキル（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルなど）から選択され、好ましくは、Ｒは、水素である。添え字ｍは、各場合において、０〜約２の値を有し、好ましくは、ｍは、０又はおよそ１であり、より好ましくは、ｍは、０である。添え字ｎは、約２０〜約５０の範囲、好ましくは、約２２〜約４０の範囲、より好ましくは、約２４〜約３０の範囲の平均値を有する。添え字ｐは、約１０〜約５０の範囲、好ましくは、約１１〜約４０の範囲、より好ましくは、約１２〜約３０の範囲の平均値を有する。
好ましくは、式（Ｖ）のアルキレンオキシ単位は、アルコキシレートブロックの非ランダム配列である。非ランダム配列により、［−Ａ２−Ｏ−］ｍが１番目に付加され（すなわち、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の繰り返し単位の窒素原子に対する結合に最も近接している）、［−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−］ｎが２番目に付加され、［−Ａ３−Ｏ−］ｐが３番目に付加されることが意味される。この配向は、内側ポリエチレンオキシドブロックと外側ポリプロピレンオキシドブロックとを有するアルコキシル化ポリアルキレンイミンを提供する。
式（Ｖ）のこれらのアルキレンオキシ単位のかなりの部分は、エチレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）］ｎ−及びプロピレンオキシ単位−［ＣＨ２−ＣＨ２（ＣＨ３）−Ｏ］ｐ−により形成される。アルキレンオキシ単位はまた追加的に、小さな比率のプロピレンオキシ又はブチレンオキシ単位−［Ａ２−Ｏ］ｍ−を有してもよく、すなわち、水素原子で飽和したポリアルキレンイミン主鎖は、存在するＮＨ−部分１モル当たりで最大約２モル、特に約０．５〜約１．５モル、特に約０．８〜約１．２モルの、少量のプロピレンオキシド又はブチレンオキシドと最初に反応させてもよい、すなわち、初期にアルコキシル化させてもよい。
ポリアルキレンイミン主鎖のこの最初の修飾により、必要である場合には、アルコキシル化における反応混合物の粘性を低下させることができる。しかしながら、修飾は一般にアルコキシル化ポリアルキレンイミンの性能特性に影響せず、したがって、好ましい尺度を構成しない。
両親媒性のアルコキシル化グリース洗浄用ポリマーは、限定するものではないが、洗剤が挙げられる本発明の布地ケア製品及びホームケア製品中に、布地ケア製品及びホームケア製品の約０．０５重量％〜１０重量％の範囲の濃度で存在する。布地ケア製品及びホームケア製品の実施形態は、約０．１％〜約５重量％を含んでもよい。より具体的には、本実施形態は、約０．２５〜約２．５％のグリース洗浄ポリマーを含んでもよい。
カルボン酸塩ポリマー−本発明の消費者製品はまた、マレエート／アクリレートランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマーなどのカルボン酸塩ポリマーを１つ以上含んでもよい。一態様では、カルボキシレートポリマーは、４，０００Ｄａ〜９，０００Ｄａ又は６，０００Ｄａ〜９，０００Ｄａの分子量を有するポリアクリレートホモポリマーである。
防汚ポリマー−本発明の消費者製品はまた、以下の構造（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の１つにより定義される構造を有する防汚ポリマーを１つ以上含んでもよい：
（Ｉ）−［（ＯＣＨＲ１−ＣＨＲ２）ａ−Ｏ−ＯＣ−Ａｒ−ＣＯ−］ｄ
（ＩＩ）−［（ＯＣＨＲ３−ＣＨＲ４）ｂ−Ｏ−ＯＣ−ｓＡｒ−ＣＯ−］ｅ
（ＩＩＩ）−［（ＯＣＨＲ５−ＣＨＲ６）ｃ−ＯＲ７］ｆ
（式中、
ａ、ｂ及びｃは、１〜２００であり、
ｄ、ｅ及びｆは、１〜５０であり、
Ａｒは、１，４−置換フェニレンであり、
ｓＡｒは、５位がＳＯ３Ｍｅで置換されている１，３−置換フェニレンであり、
Ｍｅは、Ｌｉ、Ｋ、Ｍｇ／２、Ｃａ／２、Ａｌ／３、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−若しくはテトラ−アルキルアンモニウム（アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル又はＣ２〜Ｃ１０ヒドロキシアルキルである）、又はこれらの混合物であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して、Ｈ又はＣ１〜Ｃ１８ ｎ−若しくはイソ−アルキルから選択され、
Ｒ７は、直鎖状若しくは分岐鎖状Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、又は直鎖状若しくは分岐鎖状Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、又は５個〜９個の炭素原子を有するシクロアルキル基、又はＣ８〜Ｃ３０アリール基、又はＣ６〜Ｃ３０アリールアルキル基である）。
好適な汚れ放出ポリマーは、Ｒｈｏｄｉａによって供給されているＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６を含むＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘポリマーなどのポリエステル汚れ放出ポリマーである。他の好適な汚れ放出ポリマーとしては、Ｃｌａｒｉａｎｔによって供給されているＴｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５を含むＴｅｘｃａｒｅポリマーが挙げられる。他の好適な汚れ放出ポリマーは、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔポリマー（例えば、Ｓａｓｏｌにより供給されているＭａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬなど）である。
セルロースポリマー−本発明の消費者製品はまた、アルキルセルロース、アルキルアルコキシルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースから選択されるものを含む、１種以上のセルロースポリマーを含んでもよい。一態様では、セルロース系ポリマーは、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物を含む群から選択される。一態様では、カルボキシメチルセルロースは、０．５〜０．９のカルボキシメチル置換度及び１００，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａの分子量を有する。
洗剤は、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートなどの過酸形成漂白活性化剤と合わせることができる過ホウ酸塩又は過炭酸塩などのＨ２Ｏ２源を含む場合がある漂白系を含有してもよい。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含んでもよい。一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、標記洗浄組成物の約０．１重量％〜約５０重量％、又は更に約０．１重量％〜約２５重量％の漂白剤を含んでもよい。
キレート剤−本明細書の消費者製品は、キレート剤を含有してもよい。好適なキレート剤としては、銅、鉄、及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。キレート剤を使用する場合、本消費者製品は、本消費者製品の約０．００５重量％〜約１５重量％、又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含んでもよい。適切なキレート剤としては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
本発明の酵素変異体は、従来の安定化剤、並びに／又はプロテアーゼ阻害剤、例えば、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール、糖類若しくは糖アルコール、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩、乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又は４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体、又はジ−、トリ−、若しくはテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒド類似体などのペプチドアルデヒドを用いて安定化され得、これらのいずれかはＢ１−Ｂ０−Ｒを形成し、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２、若しくはＣＨ２Ｘであり（Ｘ＝ハロゲン）、Ｂ０は、単一アミノ酸残基であり（好ましくは、任意で置換された脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を有する）、かつＢ１は、任意でＮ末端保護基を含むか、あるいは国際公開第０９１１８３７５号、同第９８／１３４５９号）に記載の１つ以上のアミノ酸残基（好ましくは１つ、２つ又は３つ）、あるいはＲＡＳＩ、ＢＡＳＩ、ＷＡＳＩ（稲、大麦及び小麦の二官能性α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）、又はＣＩ２若しくはＳＳＩなどのタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤からなる。いくつかの実施形態では、本明細書において採用される酵素は、以下のようなイオンを酵素に提供する最終組成物中で、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））の存在によって安定化される。
組成物は、例えば、布地調整剤を含む粘度、起泡力増進剤、石鹸泡抑制剤、防食剤、土壌沈殿防止剤、土壌再堆積防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り防止剤、エタノールなどの有機溶媒、又は香料などの他の従来の洗剤成分も含有し得る。更に、洗剤は、全般的な洗浄レベルを増加させるために洗濯物に付加される事前染み抜き又は増進剤を含有し得、これらの添加物のうちのいずれかは、洗浄工程前に織物に適用される前処理剤としても使用され得る。
洗剤組成物中の任意の酵素、具体的には、本発明に必須の酵素は、洗浄液１リットル当たり０．００１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液１リットル当たり０．００５〜５ｍｇの酵素タンパク質、より好ましくは洗浄液１リットル当たり０．０１〜１ｍｇの酵素タンパク質、及び具体的には、洗浄液１リットル当たり０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質に相当する量で添加され得ることが、現在企図されている。しかしながら、本発明の組成物は、少なくとも０．０００１〜約０．１重量％、例えば、約０．０００１重量％〜約０．０１重量％、約０．００１重量％〜約０．０１重量％、又は約０．００１重量％〜約０．０１重量％の純酵素タンパク質を含む。しかしながら、製剤化された酵素を用いるとき、洗剤組成物は、約０．０２％〜約２０重量％、又は例えば、約０．０５重量％〜約１５重量％、又は約０．０５重量％〜約２０重量％、又は約０．０５重量％〜約５重量％、又は約０．０５重量％〜約３重量％を含む。
本発明において有用なα−アミラーゼ変異体は、国際公開第９７／０７２０２号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示の洗剤製剤に追加で組み込まれ得る。
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、タブレット、粉末、顆粒、ペースト、ゲル、又は液体であり得る。組成物は、粉末形態の汎用「強力」洗浄剤、ペースト形態の汎用及び強力な液体タイプ、上質布地用液体タイプ、手洗い用食器洗浄剤、軽質の食器洗浄剤、泡立ち良好タイプ、食器洗い機用洗浄剤、種々のタブレットタイプ、食器洗浄顆粒タイプ、食器洗浄溶液タイプ、すすぎ補助剤タイプであり得る。組成物は、当該技術分野において既知のもの、並びに水溶性、不水溶性、及び／又は透水性のものを含む単位分量包装であり得る。液体洗剤は、典型的には、最大７０％の水及び０〜３０％の有機溶媒を含有する水性の液体洗剤であるか、非水性であるか、あるいは０．５ｇ／Ｌを超える洗剤組成物を含有する溶液であり得る。
本発明の組成物は、例えば、染みのついた布地の前処理に好適な洗濯添加組成物及びすすぎ添加布地柔軟剤組成物を含む手洗い用又は機械用洗濯洗剤組成物として製剤化され得るか、全般的な家庭の硬表面洗浄作業で用いる洗剤組成物として製剤化され得るか、あるいは手洗い用又は機械用食器洗浄作業のために製剤化され得る。洗剤は、粉末若しくは粒状形態であり得るか、液体、ゲル、若しくはペーストの形態、又はタブレット若しくは多区画ポーチを含むポーチなどの単位分量製品の形態であり得るか、あるいは洗剤は、シート形態であり得る。
α−アミラーゼ活性の判定のためのｐＮＰ−Ｇ７アッセイ
α−アミラーゼ活性を、Ｇ７−ｐＮＰ基質を採用する方法によって決定することができる。Ｇ７−ｐＮＰは、４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ１）−α、Ｄ−マルトヘプタオシドの省略形であり、α−アミラーゼなどのエンドアミラーゼで切断することができるブロックオリゴ糖である。切断後、キット中に含まれるα−グルコシダーゼは、加水分解基質を更に消化して、黄色を有する遊離ＰＮＰ分子を自由にし、ひいては、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）で、可視分光測光で測定することができる。Ｇ７−ｐＮＰ基質及びα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３）によって製造される。
試薬：
このキットのＧ７−ｐＮＰ基質は、２２ｍＭの４，６−エチリデン−Ｇ７−ｐＮＰ及び５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ｐＨ７．０）を含有する。
α−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８７ｍＭのＮａＣｌ、１２．６ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０７５ｍＭのＣａＣｌ２、４ｋＵ／Ｌ以上のα−グルコシダーゼ）を含有する。
１ｍＬのα−グルコシダーゼ試薬を０．２ｍＬのＧ７−ｐＮＰ基質と混合して、基質作用液を作製する。この基質作用液を、使用直前に作製する。
希釈緩衝液：５０ｍＭのＭＯＰ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９−１０）））、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０。
手順：
希釈した試料中のｐＨが７であることを確実にするために、分析されるアミラーゼ試料を希釈緩衝液で希釈した。２０μＬの希釈酵素試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μｌの基質作用溶液を添加することによって、アッセイを実施した。溶液を混合し、室温で１分間事前インキュベートし、吸収を２０秒毎に５分間、ＯＤ４０５ｎｍで測定する。
時間依存吸収曲線の勾配（１分間当たりの吸収度）は、所与の一連の条件下での問題のα−アミラーゼの比活性（１ｍｇ酵素当たりの活性）に直接比例する。アミラーゼ試料を、勾配が１分間当たり０．４吸収度単位未満のレベルに希釈すべきである。
洗濯用自動機械的応力アッセイ（ＡＭＳＡ）
洗濯における洗浄性能を評価するために、自動機械的応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を使用して、洗浄実験を実施する。ＡＭＳＡを用いて、大量の少量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することが可能である。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多くのスロットと、洗浄される織物である洗濯試料をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドと、を有する。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照されたい。
一般的な洗浄性能の記述：
水（１０°ｄＨ）、洗剤、例えば、以下に記載の５．１ｇ／Ｌの欧州液体洗剤、並びに例えば、１リットル当たり０、０．８及び／若しくは１．２ｍｇの酵素タンパク質濃度の本発明の酵素を含む試験溶液を調製する。デンプン（例えば、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＣＳ−２８）で染みを付けた布地を添加し、２０℃で２０分間洗浄する。水道水を流して完全にすすぎ、暗所で乾燥させた後、続いて、染色した布地の光強度又は反射率の値を、洗浄性能の尺度として測定する。デルタレミッション値を得るために、０ｍｇの酵素タンパク質／Ｌを有する試験物を、ブランクとして使用する。好ましくは、機械的な動きを、例えば、布地を有する洗浄液の振盪、回転又は撹拌の形態で、洗浄工程中に適用する。
ＡＭＳＡ洗浄性能実験を、以下に指定される実験条件下で実行した。
Figure 2020510712
アミラーゼ希釈緩衝液：低濃度のカルシウム（０．１ｍＭ）を伴う超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）中でアミラーゼを希釈し、貯蔵中のアミラーゼを安定化させ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で、酵素タンパク質の容器及びピペットへの吸着の危険性を低減した。
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ −＝３：１：４．５）を試験系に添加することにより、水硬度を１０°ｄＨに調整した。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、乾燥させた。
洗浄性能は、洗浄された織物の色の輝度として測定される。白色光で照射するとき、輝度を、試料から反射される光の強度として表すこともできる。試料が染色されると、反射光の強度は、きれいな試料の反射光の強度よりも低い。したがって、反射光の強度を、洗浄性能を測定するために使用することができる。
洗浄した織物の画像を捕捉するために使用する、専門のフラットベッドスキャナー（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ，Ｍｉｄｔａｇｅｒ ２９，ＤＫ−２６０５ Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて色測定を行うことができる。
スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの２４ビットピクセル値を、レッド、グリーン及びブルー（ＲＧＢ）の値に変換する。ＲＧＢ値を１次元配列として合計し、その後、結果として生じる１次元配列の長さを算出して、強度値（Ｉｎｔ）を計算する：
Figure 2020510712
異なる変異体のＡＭＳＡ洗濯試験の結果を表１及び２に示す。結果中、添え字は１００である。親α−アミラーゼの性能結果は、１００の値を割り当てられ、変異体の結果はこの値と比較される。
ＴＯＭ洗浄性能
水硬度は、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＮＡＨＣＯ３を添加することによって以下に記載される強度に調整した。洗浄溶液は、以下に記載されるように、所望の量の洗剤、温度及び水硬度を用いてバケツ中で調製した。１０分間、磁石撹拌しながら、洗剤を溶解した（調製後３０〜６０分以内に洗浄溶液を使用した）。
Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏＭｅｔｅｒ中の水浴中の温度及び回転（ｒｐｍ）を、以下の表２の設定に従って設定した。設定（許容量は、＋／−０．５℃である）に従って温度を調整したら、以下に記載の量に従って、ＴＯＭビーカーに洗浄液を添加した。
ビーカー内での撹拌は、２００ｒｐｍであった。２つの手製米デンプン見本（ＨＭ ＣＳ−２８）、２つの手製タピオカデンプン見本（ＨＭ ＣＳ−２９）、及びバラストを、ビーカーのそれぞれに添加し、以下に記載の時間に従って洗浄を行った。見本を冷たい水道水で５分間すすぎ、洗浄用袋に入れ、「ＳＴＩＶＮ」プログラムを用いて洗濯機（ＡＥＧ ＯＫＯ ＬＡＶＡＭＡＴ ８６８２０）ですすぎ洗いした。見本を選別し、一晩加熱することなく乾燥カップボード内の濾紙の間で乾燥させた。
織物試料ＨＭ ＣＳ−２８（綿上の米デンプン、５×５ｃｍ、直径２．５ｃｍの円にデンプンを塗布）、及びＨＭ ＣＳ−２９（綿上のタピオカデンプン、５×５ｃｍ、直径２．５ｃｍの円にデンプンを塗布）、及びＨＭ ＣＳ−２６（綿上のトウモロコシデンプン、５×５ｃｍ、直径２．５ｃｍの円にデンプンを塗布）を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得た。
白色のニット綿をバラストとして使用し、これは、Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ Ｌｔｄ，Ｕｎｉｔ ５５，Ｃｏｎｓｅｔｔ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ Ｄｕｒｈａｍ，ＤＨ８ ６ＢＮ ＵＫから入手した。
Figure 2020510712
洗剤及び試験材料は以下のとおりであった。
Figure 2020510712
洗浄性能は、レミッション値（ＲＥＭ）で表される、洗浄された織物の色の輝度として測定した。レミッション測定は、Ｍａｃｂｅｔｈ ７０００ Ｃｏｌｏｒ Ｅｙｅ分光光度計を使用して行った。乾燥した見本のそれぞれを測定した。バックグラウンドからの干渉の危険性があるため、レミッション測定中、見本を２層の布地の上に配置した。レミッションを４６０ｎｍで測定した。ＵＶフィルタは含まれなかった。見本のレミッションの平均結果を計算した。
異なる変異体の洗浄性能を、改善係数（ＩＦ）として表５に示し、以下に示すように計算する：
Figure 2020510712
実施例１
自動機械的応力アッセイを使用したα−アミラーゼの洗浄性能
洗剤ベース組成物中のα−アミラーゼの洗浄性能を評価するために、自動機械的応力アッセイ（ＡＭＳＡ）を使用して洗浄実験を実施することができる。ＡＭＳＡ試験で、大量の少量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することが可能である。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多くのスロット及び洗浄される織物の見本をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドを有している。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際公開第０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照されたい。
一般的な洗浄性能の記述：
水（６°ｄＨ若しくは１５°ｄＨ）、０．７９ｇ／Ｌの洗剤、例えば、以下に記載のモデル洗剤Ｊ、及び１リットル当たり０若しくは０．２ｍｇの酵素タンパク質濃度の本発明の酵素を含む試験溶液を調製する。デンプン（Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓからのＣＳ−２８）で染みを付けた布地を加え、実施例において特定されるように、２０℃及び４０℃で１０分間、あるいは２０℃及び３０℃で１０分間、洗浄する。水道水を流して完全にすすぎ、暗所で乾燥させた後、続いて、染色した布地の光強度の値を、洗浄性能の尺度として測定する。１Ｌあたり０ｍｇの酵素タンパク質を伴う試験物をブランクとして使用し、洗剤からの貢献度に相関させる。好ましくは、機械的な動きを、例えば、布地を有する洗浄液の振盪、回転又は撹拌の形態で、洗浄工程中に適用する。ＡＭＳＡ洗浄性能実験を、以下に指定される実験条件下で実行することができる。
Figure 2020510712
Figure 2020510712
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝２：１：４．５）を試験系に添加することにより、水硬度を６°ｄＨに調整した。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、乾燥させた。
Figure 2020510712
Figure 2020510712
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＮＡＨＣＯ３
（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）を試験系に加えることにより、水硬度を１５°ｄＨに調整した。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、
乾燥させた。
Figure 2020510712
Figure 2020510712
ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮＡＨＣＯ３
（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）を試験系に加えることにより、水硬度を１５°ｄＨに調整した。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、
乾燥させた。
洗浄性能は、白色光で照射される場合に、試料から反射される光の強度として表される輝度として測定される。試料が染色されると、反射光の強度は、きれいな試料の反射光の強度よりも低い。したがって、反射光の強度を、洗浄性能を測定するために使用することができる。
洗浄した織物の画像を捕捉するために使用する、専門のフラットベッドスキャナー（ＥＰＳＯＮ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １００００ＸＬ，ＥＰＳＯＮ）を用いて色測定を行う。
スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの４８→２４ビットカラーピクセル値を、ＲＧＢ値としても既知である、レッド、グリーン及びブルーの値に変換する。ＲＧＢ値を１次元配列として合計し、その後、結果として生じる１次元配列の長さを算出して、強度値（Ｉｎｔ）を計算する：
Figure 2020510712
本発明による変異体の洗浄性能を以下の表に示す。表３は、異なる濃度（洗剤１Ｌあたり０．０５ｍｇ酵素及び洗剤１Ｌあたり０．２ｍｇの酵素）、及び異なる温度（２０℃及び４０℃）での、モデル洗剤Ａ（表Ｄ）及びＪ（表Ｂ）における洗浄性能にアクセスする実験から得られた結果を示す。表４は、異なる濃度（洗剤１Ｌあたり０．０５ｍｇ酵素及び洗剤１Ｌあたり０．２ｍｇの酵素）、及び異なる温度（２０℃及び４０℃）での、モデル洗剤Ｋ（表Ｆ）における洗浄性能にアクセスする実験から得られた結果を示す。
Figure 2020510712
Figure 2020510712
表１及び表２から分かるように、全ての試験した変異体は、試験条件のうちの少なくとも１つにおいて、参照（配列番号２）と比較して改善された洗浄性能を有する。
実施例２−液体洗剤Ｋ中のα−アミラーゼの洗浄性能
試験した変異体及び対応する親α−アミラーゼ（配列番号２）の洗浄性能を、上記のように試験した。結果は、（親の性能−ブランクの性能）で除算した（変異体の性能−ブランクの性能）として、表す。
Figure 2020510712
Figure 2020510712
Figure 2020510712
本明細書に記載され、特許請求される本発明は、本明細書に開示される特定の態様が本発明のいくつかの態様の説明として意図されるため、これらの態様によって範囲を限定するものではない。任意の同等の態様は、本発明の範囲内であるよう意図されている。実際、本明細書に示され、記載される修正に加えて、本発明の種々の修正は、前述の記述から当業者には明らかとなる。そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まるよう意図されている。不一致が生じた場合、定義を含む本開示が支配する。
使用方法
本発明は、ある場所、とりわけ表面又は布地を洗浄及び／又は処理する方法を含む。一態様では、かかる方法は、任意選択的に表面又は布地を洗浄及び／又はすすぐ工程と、かかる表面又は布地と本明細書に開示される任意の消費者製品とを接触させる工程と、その後に、任意選択的にかかる表面又は布地を洗浄及び／又はすすぐ工程と、を含む。
本明細書で使用するとき、洗浄することは、擦ること、及び機械的撹拌を含むが、これらに限定されない。このような表面又は布地の乾燥工程は、家庭環境又は工業環境のいずれかで使用される、一般的な手段のうちの任意の１つにより実行することができる。このような手段としては、太陽光、赤外線、紫外線、及びマイクロ波照射を含む電磁放射線の存在下又は非存在下、５〜０．０１気圧の圧力で、周囲温度又は高温で、強制空気又は静止空気乾燥させることが挙げられるが、これらに限定されない。一態様では、このような乾燥は、鉄を使用することによって周囲を超える温度で達成されてもよく、例えば、このような布地は、比較的短い又は更には長時間にわたって鉄と直接接触してもよく、重力によって通常存在する圧力を超えて圧力が加えられてもよい。別の態様では、このような乾燥は、乾燥機を用いることによって、周囲温度を上回る温度で達成され得る。布地を乾燥させる装置は周知であり、衣類用乾燥機と呼ばれることが多い。衣類に加えて、このような装置は、タオル、シーツ、枕カバー、おむつなどを含む多くの他の品目を乾燥させるために使用され、そのような装置は、布地を乾燥させるための物干し用ロープの使用に実質的に置き換わるものとして、世界の多くの国々で標準的な利器として受け入れられている。今日使用されているほとんどの乾燥機は、乾燥機内で混転される際に、布地上又は布地中を通過する加熱空気を使用している。空気は、例えば、電気的に、ガス炎を介して、又は更にはマイクロ波放射を用いて、加熱されてもよい。このような空気は、約１５℃〜約４００℃、約２５℃〜約２００℃、約３５℃〜約１００℃、又は更には約４０℃〜約８５℃に加熱されて、乾燥機中で使用され、表面及び／又は布地を乾燥させることができる。当業者に理解されるように、本発明の洗浄組成物は理想的には洗濯用途に用いるのに適している。それゆえに、本発明は布地を洗濯する方法を含む。この方法は、洗濯されるべき布帛を本出願の洗浄組成物の少なくとも１つの実施形態、洗浄添加剤又はこれらの混合物を含む洗浄洗濯溶液と接触させる工程を含む。布地は、標準的な消費者若しくは施設の使用条件で洗濯され得る大抵の任意の布地を含んでもよい。溶液のｐＨは、約８〜約１０．５であるのが好ましい。本発明の組成物は、溶液中約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用され得る。水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。水の布地に対する比は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
洗剤例
実施例１〜６
手洗い用又はトップローディング式洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物
Figure 2020510712
 ＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
実施例７〜１２
フロントローディング式自動洗濯機用に設計されている顆粒状洗濯洗剤組成物
Figure 2020510712
 ＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
実施例１３〜１８：強力液体洗濯洗剤組成物
Figure 2020510712
 １ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリ酢酸ビニル側鎖とを有する、ポリ酢酸ビニルグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド骨格鎖の分子量は、約６０００であり、ポリエチレンオキシドのポリ酢酸ビニルに対する重量比は、約４０〜６０であり、５０のエチレンオキシド単位当たり１個以下のグラフト点である。
２−ＮＨ１個当たり２０個のエトキシレート基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、１つの−ＮＨにつき２４個のエトキシレート基と、１つの−ＮＨにつき１６個のプロポキシレート基とを有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
実施例１９〜２１：強力液体洗濯洗剤組成物
Figure 2020510712
 ＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
＊＊総洗浄及び／又は処理組成物重量に基づいて、水は合計７％以下である。
実施例１〜２１の組成物の原材料及び注記
Ｃ１１〜Ｃ１８の平均脂肪族炭素鎖長を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、
Ｃ１２〜１８ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド
ＡＥ３Ｓは、Ｃ１２〜１５アルキルエトキシ（３）サルフェートである
ＡＥ７は、平均エトキシル化度が７のＣ１２〜１５アルコールエトキシレートである。
ＡＥ９は、平均エトキシル化度が９のＣ１２〜１６アルコールエトキシレートである。
ＨＳＡＳは、米国特許第６，０２０，３０３号及び同第６，０６０，４４３号に開示されているとおり、約１６〜１７の炭素鎖長を有する中鎖分岐状一級アルキルサルフェートである。
ポリアクリレートＭＷ４５００は、ＢＡＳＦによって供給されている。
カルボキシメチルセルロースは、ＣＰ Ｋｅｌｃｏ（Ａｒｎｈｅｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給されているＦｉｎｎｆｉｘ（登録商標）Ｖである。
ＣＨＥＣは、カチオン変性ヒドロキシエチルセルロースポリマーである。
ホスホネートキレート剤は、例えば、ジエチレンテトラアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ヒドロキシエタンジホスホネート（ＨＥＤＰ）である。
Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（登録商標）、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（商標）、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）、及びＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）はいずれも、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の製品である。
Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）は、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の製品である。
蛍光増白剤１は、Ｔｉｎｏｐａｌ（登録商標）ＡＭＳであり、蛍光増白剤２は、Ｔｉｎｏｐａｌ（登録商標）ＣＢＳ−Ｘであり、ダイレクトバイオレット９は、Ｐｅｒｇａｓｏｌ（登録商標）Ｖｉｏｌｅｔ ＢＮ−Ｚであり、ＮＯＢＳは、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
ＴＡＥＤはテトラアセチルエチレンジアミンである。
Ｓ−ＡＣＭＣは、Ｃ．Ｉ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｂｌｕｅ １９と共役しているカルボキシメチルセルロース、商品名ＡＺＯ−ＣＭ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥである。
汚れ放出剤は、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ（登録商標）ＰＦである。
アクリル酸／マレイン酸コポリマーは、分子量７０，０００であり、アクリレート：マレエート比は、７０：３０であり、
ＥＤＤＳは、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二コハク酸、（Ｓ，Ｓ）異性体のナトリウム塩であり、泡抑制剤凝集体は、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）によって供給されている。
ＨＳＡＳは、中鎖分岐状アルキルサルフェートである。
リキティント（Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ）（登録商標）バイオレットＣＴは、Ｍｉｌｌｉｋｅｎ（Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）から供給される。
１ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリ酢酸ビニル側鎖とを有する、ポリ酢酸ビニルグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド骨格鎖の分子量は、約６０００であり、ポリエチレンオキシドのポリ酢酸ビニルに対する重量比は、約４０〜６０であり、５０のエチレンオキシド単位当たり１個以下のグラフト点である。
２−ＮＨ１個あたり２０個のエトキシレート基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３両親媒性アルコキシル化ポリマーは、−ＮＨ１個あたり２４個のエトキシレート基及び−ＮＨ１個あたり１６個のプロポキシレート基を含有するように誘導体化されたポリマーから調製されるポリエチレンイミン（ＭＷ６００）である。
アミラーゼ４は、本明細書のａ）〜ｋ）のいずれか（ｍｇ活性タンパク質）である。
実施例２２〜２６単位分量洗濯洗剤組成物。このような単位分量の配合物は、１つ又は複数の区画を含んでもよい。
Figure 2020510712
 ＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
１−ＮＨ １個当たり２０個のエトキシレート基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
実施例２７多区画型単位分量組成物
本発明の多区画単位分量洗濯洗剤製剤を以下に提供する。これらの実施例では、単位分量は３つの区画を有するが、同様の組成物を２、４、又は５つの区画で作製することもできる。区画を封入するために使用されるフィルムは、ポリビニルアルコールである。
Figure 2020510712
 ＊本発明のアミラーゼは、洗剤１００ｇあたりの活性酵素のｍｇとして示される。
本明細書で開示する寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳密に限られるとして理解されるべきではない。その代わりに、特に指示がない限り、このような寸法はそれぞれ、列挙された値とその値を囲む機能的に同等な範囲との両方を意味することが意図されている。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味するものとする。

Claims (18)

  1. 洗浄組成物であって、
    ａ）親α−アミラーゼの変異体であって、前記変異体が、
    （ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する１つ以上の位置における修飾、及び場合により、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４、及び４７６に対応する１つ以上の位置における修飾を含み、
    （ｉｉ）前記変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも８０、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９７％であるが、１００％未満の配列同一性を有し、
    （ｉｉｉ）前記変異体が、α−アミラーゼ活性を有する、親α−アミラーゼの変異体と、
    ｂ）洗浄補助剤、好ましくは０．０１〜９９．９重量％の量の洗浄補助剤と、
    を含む、洗浄組成物。
  2. 前記修飾が、欠失又は置換である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記変異体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、２８０、２８４、３２０、３２３、及び３９１に対応する少なくとも１つの位置における修飾を含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
  4. 前記変異体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置１０９、１、７、１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、２８０、２８４、３０４、３２０、３２３、３９１、及び４７６に対応する少なくとも１つ又は２つの位置における修飾を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  5. 前記１つ以上の修飾が置換である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  6. 前記１つ以上の修飾のうちの少なくとも１つが欠失である、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記変異体が、１、１０９、及び３９１からなる群から選択される少なくとも２つの位置における修飾を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
  8. 前記変異体において、前記修飾（複数可）が、Ｘ１＊、Ｘ１Ａ、Ｘ７Ａ、Ｘ７Ｋ、Ｘ７Ｅ、Ｘ７Ｎ、Ｘ７Ｑ、Ｘ７Ｌ、Ｘ７Ｄ、Ｘ１０９Ａ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１４０Ｙ、Ｘ１８１＊、Ｘ１８２＊、Ｘ１８３＊、Ｘ１８４＊、Ｘ１９５Ｆ、Ｘ２０６Ｙ、Ｘ２４３Ｆ、Ｘ２６０Ｇ、Ｘ２８０Ｓ、Ｘ２８４Ｈ、Ｘ２８４Ｒ、Ｘ２８４Ｆ、Ｘ３０４Ｒ、Ｘ３２０Ａ、Ｘ３２０Ｍ、Ｘ３２０Ｔ、Ｘ３２０Ｖ、Ｘ３２０Ｓ、Ｘ３２３Ｎ、Ｘ３２３Ｒ、Ｘ３２３Ｓ、Ｘ３２３Ｋ、Ｘ３９１Ａ、Ｘ３９１Ｖ、及びＸ４７６Ｋからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
  9. 前記変異体が、改善された洗浄性能などの改善された性能を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
  10. 前記変異体が、前記親α−アミラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
  11. 前記変異体において、修飾の数が、１〜３０、又は１〜２０、又は１〜１０、又は１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の修飾である、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
  12. 前記変異体が、Ｘ１＋Ｘ７；Ｘ１＋Ｘ１０９；Ｘ１＋Ｘ２８０；Ｘ１＋Ｘ２８４；Ｘ１＋Ｘ３２０；Ｘ１＋Ｘ３２３；Ｘ１＋Ｘ３９１；Ｘ１０９＋Ｘ２８０；Ｘ１０９＋Ｘ２８４；Ｘ１０９＋Ｘ３２０；Ｘ１０９＋Ｘ３２３；Ｘ１０９＋Ｘ３９１；Ｘ７＋Ｘ１０９；Ｘ７＋Ｘ２８０；Ｘ７＋Ｘ２８４；Ｘ７＋Ｘ３２０；Ｘ７＋Ｘ３２３；Ｘ７＋Ｘ３９１；Ｘ２８０＋Ｘ２８４；Ｘ２８０＋Ｘ３２０；Ｘ２８０＋Ｘ３２３；Ｘ２８０＋Ｘ３９１；Ｘ２８４＋Ｘ３２０；Ｘ２８４＋Ｘ３２３；Ｘ２８４＋Ｘ３９１；Ｘ３２０＋Ｘ３２３；Ｘ３２０＋Ｘ３９１；及びＸ３２３＋Ｘ３９１からなる位置の群から選択される位置における修飾を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従うものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
  13. 前記変異体が、
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｋ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｅ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｎ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｑ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｌ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ｄ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｍ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｔ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｖ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ｖ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｋ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ｓ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｇ７Ａ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
    Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ；
    Ｋ３２０Ａ；
    Ｇ７Ａ＋Ｋ３２０Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｈ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｆ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｓ＋Ｅ３９１Ａ；
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｗ２８４Ｒ＋Ｅ３９１Ａ；及び
    Ｈ１＊＋Ｇ７Ａ＋Ｇ１０９Ａ＋Ｎ２８０Ｓ＋Ｋ３２０Ａ＋Ｍ３２３Ｎ＋Ｅ３９１Ａからなる群から選択される、配列番号２に記載のアミノ酸配列の位置に対応する位置における修飾を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
  14. 前記変異体の前記親α−アミラーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、及び８に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるか、又は配列番号１、２、３、４、５、６、７、及び８に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する任意のα−アミラーゼである、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
  15. 前記変異体の前記親α−アミラーゼが、配列番号１若しくは２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるか、又は配列番号１若しくは２に記載のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する任意のα−アミラーゼである、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 前記変異体が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、若しくは８のいずれかの成熟ポリペプチドと、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するか、又は前記親α−アミラーゼの前記変異体が、（ｉ）配列番号１；（ｉｉ）配列番号２；（ｉｉｉ）配列番号３；（ｉｖ）配列番号４；（ｖ）配列番号５；（ｖｉ）配列番号６；（ｖｉｉ）配列番号７；（ｖｉｉｉ）配列番号８から選択される成熟ポリペプチドのアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなる、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
  17. 前記組成物が、液体洗濯洗剤組成物又は単位分量洗剤組成物である、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
  18. 表面、好ましくは織物を処理する方法であって、
    （ｉ）水と請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物とを含む水性洗浄液を形成することと、
    （ｉｉ）前記表面を、前記水性洗浄液を用いて、好ましくは４０℃以下の温度で、又はより好ましくは３５℃以下の温度で、最も好ましくは３０℃以下の温度で処理することと、（ｉｉｉ）前記表面をすすぐことと、を含む、方法。
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