JP2013519757A - キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 - Google Patents

キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、親酵素と比較して、キレート剤への改善された安定性を有するアルファ−アミラーゼの変異体含む洗浄組成物、及びそのような組成物を含む洗浄プロセスに関する。

Description

配列リストの参照
本明細書は、コンピュータ可読形態での配列リストを含む。本コンピュータ可読形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、親酵素と比較して、キレート剤への改善された安定性を有するアルファ−アミラーゼ変異体を含む洗浄組成物に関する。
アルファ−アミラーゼ（アルファ−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン並びに他の線状及び分枝上１，４−グルコシドオリゴ及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。
最初に使用された細菌アルファ−アミラーゼのうちの１つは、広く特徴付けられたターマミルとしても既知のバチルス・リケニフォルミス由来のアルファ−アミラーゼであり、この酵素のための結晶構造が判定されていた。国際特許第９５／２６３９７号に開示のバチルス種に由来するアルファ−アミラーゼ等のアルカリ性アミラーゼは、洗剤における用途が見出されたアルファ−アミラーゼの特定の一群を形成する。これらの既知の細菌アミラーゼのうちの多くは、特定の用途におけるそれらの機能性を改善するように修飾されている。
ターマミル及び多くの高度に有効なアルファ−アミラーゼは、活性のためにカルシウムを必要とした。ターマミルの結晶構造は、４個のカルシウム原子が陰性荷電アミノ酸残基によって配位されるアルファ−アミラーゼ構造で結合されたことが見出された。他のアルファ−アミラーゼでは、この構造で結合されるカルシウムイオンの量は異なり得る。このカルシウム要件は、洗剤及び洗浄組成物中等で強力なキレート化合物が存在する用途において不利である。
上述のように、いくつかの酵素が、活性及び安定性の両方において、カルシウム又はマグネシウム又は亜鉛等の他の金属イオンに依存していることは周知であり、したがって、キレート剤を含有する洗剤及び洗浄組成物中で安定しており、良好な性能を示す酵素を開発することが課題である。キレート剤は、洗浄中に水の硬度を低減させ、また存在し得る漂白剤を保護するために組み込まれ、キレート剤は、ある染みの除去に直接的な影響を与える。洗剤中のカルシウム依存性酵素の安定度は、場合によっては、洗剤にカルシウムを添加することによって改善され得るが、これは、多くの場合、染み抜き効果を破壊する。更に、液体洗剤へのカルシウムの添加は、製剤に関連する問題、すなわち、洗剤の物理的安定性の問題を提示し得る。
したがって、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤に対して安定しており、好ましくは洗浄性能を保持したか、あるいは増加させたアルファ−アミラーゼの組成物及び変異体を提供することが有益であろう。
したがって、第１の態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、洗浄補助剤及び任意で少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
更なる態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、任意で、少なくとも１つの洗浄補助剤を更に含み、キレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
別の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、洗浄補助剤と、任意で、少なくとも１つのキレート剤であって、前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
好ましい態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を更に含み、
（ａ）（１つ又は複数の）変更は独立して、
（ｉ）その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び／又は
（ｉｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
（ｂ）変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
別の態様において、本発明は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含み、
（ａ）（１つ又は複数の）変更は独立して、
（ｉ）その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び／又は
（ｉｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
（ｂ）変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
定義
アルファ−アミラーゼ（アルファ−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプン並びに他の線状及び分枝状１，４−グルコシドオリゴ及び多糖類の加水分解を触媒する酵素の一群を構成する。バチルス属種、例えば、バチルス・リケニフォルミス等由来、アスペルギルス・オリザエ（ＴＡＫＡ−アミラーゼ）又は黒色アスペルギルス等の菌類の種由来、大麦等の植物由来、及び哺乳動物由来等の細菌を含む広範囲の選択の生物に由来するアルファ−アミラーゼが既知である。
野生型酵素：「野生型」アルファ−アミラーゼという用語は、自然界に見られる細菌、酵母菌又は糸状菌等の自然発生微生物によって発現されるアルファ−アミラーゼを意味する。「野生型酵素」及び「親酵素」という用語は、親酵素が変異酵素ではない場合、同義に使用され得る。
変異酵素：「変異体」という用語は、本明細書において、親又は野生型アルファ−アミラーゼの１つ以上（又は１つ若しくはいくつか）の特定位置で、１つ以上（又は１つ若しくはいくつか）のアミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失等の変更を含むアルファ−アミラーゼ活性を有するポリペプチドと定義される。好ましくは、５０未満の修飾であり、３０未満の修飾がより好ましい。変更したアルファ−アミラーゼは、人間の介入を経て親アルファ−アミラーゼの修飾によって得られる。
親酵素：本明細書で使用される「親」アルファ−アミラーゼという用語は、本発明の変異体アルファ−アミラーゼを産生するために修飾が行なわれるアルファ−アミラーゼを意味する。この用語は、本発明の変異体が比較されるポリペプチドも指す。親は、自然発生（野生型）ポリペプチドであり得るか、又は更には任意の好適な手段によって調製されるその変異体であり得る。例えば、親タンパク質は、アミノ酸配列において修飾又は変更された自然発生ポリペプチドの変異体であり得る。したがって、親アルファ−アミラーゼは、１つ以上（又は１つ若しくはいくつか）のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有してもよい。したがって、親アルファ−アミラーゼは、親アルファ−アミラーゼの変異体であり得る。親は、同一の染色体座を占有する遺伝子の２つ以上の代替形態のうちのいずれかによってコードされるポリペプチドである対立遺伝子変異体でもあり得る。
改善された性質：「改善された性質」という用語は、本明細書において、親アルファ−アミラーゼと比較して改善された変異体と関連した特性と定義される。そのような改善された性質には、例えば、ＥｎｚＣｈｅｋアッセイ又は本明細書の実施例の項に記載のＰＮＰ−Ｇ７アッセイにおいて測定される際の増加したデンプン分解活性、土壌性能等の増加した洗浄性能、例えば、土壌を含有するデンプンに対する性能、染み除去、抗灰色化、安定性、例えば、耐熱性、ｐＨ安定性、あるいはキレート化物を含むビルダーの存在下における安定性、粉末、液体若しくはゲル洗剤製剤又は食器洗浄組成物における安定性、変化した温度依存性性能及び活性プロファイル、ｐＨ活性、基質特異性、生成物特異性、並びに化学安定性が含まれるが、これらに限定されない。洗浄性能及び／又は食器洗浄性能は、本明細書の以下の「材料及び方法」に記載されるように測定され得る。好ましくは、本発明の変異体は、洗剤における改善された安定性、改善された洗浄性能、改善された食器洗浄性能及び／又は改善された活性等の改善された性質の組み合わせを含む。改善された安定性には、濃縮洗剤製品の保管中の安定性及び希釈洗剤の洗浄中の安定性の両方が含まれる。改善された性質には、低温度で、改善された洗浄又は食器洗浄性能が含まれる。
活性：本文脈において、「活性」という用語は、例えば、特定の条件でのデンプン中の単位時間当たり及び単位当たりの酵素タンパク質として、３つ以上の１，４−アルファ結合したＤ−グルコース単位を含有する多糖類に加水分解される１，４−アルファ−Ｄ−グリコシド結合の数によって測定されるデンプン分解活性、例えば、１ｇの酵素タンパク質の１ｍＬの酵素試料当たりの特定の条件で得られる活性である。活性は、例えば、ＥｎｚＣｈｅｋアッセイ又は以下の「材料及び方法」に記載のＰＮＰ−Ｇ７アッセイにおいて測定され得る。本明細書において、「活性」という用語は、「デンプン分解活性」と同義に使用される。「比活性」という用語は、多くの場合、１ｍＬ（又は１ｇ）の酵素タンパク質当たり得られる最大活性を説明するために使用される。
改善された化学安定性：「改善された化学安定性」という用語は、本明細書において、親酵素の酵素活性を低減させる自然発生又は合成のいずれかの１つ又は複数の化学物質の存在下におけるある期間のインキュベーション後に、酵素活性の保持を示す変異酵素と定義される。改善された化学安定性はまた、かかる化学物質の存在下における反応をより良好に触媒することが可能な変異体をもたらすことができる。本発明の特定の態様において、改善された化学安定性は、洗剤、特に液体洗剤中での改善された安定性である。改善された洗剤安定性は、具体的には、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体がキレート剤を含む液体洗剤製剤に混合されるときの、アルファ−アミラーゼ活性の改善された安定性であり、この液体には、ゲル又はペーストも含まれる。液体洗剤製剤は、洗濯若しくは自動食器洗浄プロセス中に添加される濃縮洗剤、又は洗浄液、すなわち、濃縮洗剤が添加される水溶液等の希釈洗剤を指し得る。
本発明において、液体洗剤は液体洗濯洗剤として特に有用である。
安定性：「安定性」という用語は、保管安定性及び使用中、例えば、洗浄プロセス中の安定性を含み、時間の関数としてのアミラーゼの安定性、例えば、アミラーゼが溶液、具体的には、洗剤溶液中に維持されるとき、どれくらいの活性が保持されるか、を示す。例えば、アルファ−アミラーゼ変異体は、３１℃で１８時間後に７０％を超える残存活性、すなわち、活性が保持される量を有し得る。安定性は、多くの要因、例えば、ｐＨ、温度、洗剤組成物、例えば、ビルダー、界面活性剤等の量及び種類に影響される。アミラーゼの安定性は、ＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイ又は「材料及び方法」に記載のＰＮＰ−Ｇ７アッセイのいずれかを用いて測定される。
改善された安定性：「改善された安定性」という用語は、本明細書において、例えば、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイにおいて測定されるとき、（１．５ｗ／ｖ）ＤＴＰＡの存在下、３１℃、ｐＨ ８で１８時間後、親と比較して、７０％を超える残存活性を有するか、あるいは残存活性において少なくとも１０ｐｐの改善を有することによって、親アルファ−アミラーゼの安定性よりも高い増加した安定性を示す変異酵素と定義される。親と比較した変異体の残存活性における百分率点（ｐｐ）改善は、「材料及び方法」に記載の変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。
ビルダー：ビルダーは、溶液中で水の硬度をｐＨ ８で２．０ｍＭ（ＣａＣＯ３として）から０．１０ｍＭに低下させるのに必要とされる最低ビルダーレベルを決定するように、Ｍ．Ｋ．Ｎａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．６１，ｎｏ．９（１９８４年９月），ｐｐ．１４７５〜１４７８によって説明される試験によって分類され得る。ビルダーは、特に、例えば、カルシウム及びマグネシウムイオンで水溶性錯体を形成するキレート剤であり得る。
キレート剤又はキレート化剤は、他の素子と反応できないようにイオンを不活性化するある特定の金属イオンで分子を形成する化学物質、したがって、キレートを形成することによって化学活性を抑制する結合剤である。キレート化は、配位子と単一中心原子との間の２つ以上の別個の結合の形成又は存在である。配位子は、任意の有機化合物、ケイ酸塩又はリン酸塩であり得る。本文脈において、「キレート剤」という用語には、キレート化物、キレート剤、キレート剤、錯化剤、又はカルシウム及びマグネシウム等の金属イオンで水溶性錯体を形成する金属イオン封鎖剤が含まれる。キレート効果は、同一の金属への類似した非キレート配位子の収集物の親和性と比較して、金属イオンへの強化されたキレート配位子の親和性を説明する。金属イオン、具体的には、カルシウム（Ｃａ２＋）イオンを伴う結合能力を有するキレート剤は、一般に洗濯又は食器洗浄等の洗浄のための洗剤及び組成物において広く使用されている。しかしながら、キレート剤は、それ自身が酵素活性を阻害することを示している。キレート剤という用語は、本明細書において、「錯化剤」又は「キレート剤」又は「キレート化物」と同義に使用される。
ほとんどのアルファ−アミラーゼがカルシウムに感受性であるため、キレート剤の存在は、酵素活性を低下させ得る。アルファ−アミラーゼのカルシウム感受性は、強力なキレート剤の存在下で所与のアルファ−アミラーゼをインキュベートし、問題のアルファ−アミラーゼの活性へのこのインキュベーションの影響を分析することによって決定され得る。カルシウム感受性のアルファ−アミラーゼは、インキュベーション中にその活性のうちの大部分又はすべてを失う。
キレート剤の特徴付け：上述のように、キレート効果又はキレート化効果は、同一の金属への類似した非キレート配位子の収集物の親和性と比較して、金属イオンへの強化されたキレート配位子の親和性を説明する。しかしながら、このキレート効果の強度は、種々の種類のアッセイ又は測定方法によって決定され得、それによって、それらのキレート化効果（若しくは強度）に従ってキレート剤を区別又はランク付けする。
好ましいアッセイにおいて、キレート剤は、例えば、Ｍ．Ｋ．Ｎａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．６１，ｎｏ．９（１９８４年９月），ｐｐ．１４７５〜１４７８によって説明される方法に基づいた試験を用いることによって、ｐＨ ８．０で遊離カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭ以下に減少させるそれらの能力を特徴とし得る。Ｎａｇａｒａｊａｎらに基づく方法を用いたキレート剤の特徴付けの例は、実施例２ａに記載されている。好ましくは、本発明によるキレート剤は、ｐＨ ８．０及び２１℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭ以下に減少させることができる、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度のキレート剤を包含する。
好ましくは、本発明によるキレート剤は、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ（（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸））中で、ｐＨ ８及び２１℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭに減少させることができる、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度のキレート剤を包含する。特定の好ましい実施形態では、キレート剤は、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、ｐＨ ８及び２１℃で測定されるとき、並びに「材料及び方法」に記載されるように、遊離カルシウム濃度の決定のためにカルシウムイオン選択性電極を用いて、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１ｍＭに減少させることができる。したがって、好ましくは、キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるようにｐＨ ８．０及び２１℃で試験されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９．０ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８．０ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７．０ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６．０ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５．０ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４．０ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３．０ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２．０ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１．０ｍＭ未満の濃度のキレート剤を包含する。
特に好ましい実施形態では、キレート剤は、９ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは９ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは８ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは７ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは６ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは４ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは３ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは９．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは８．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは７．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは６．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは５．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは４．０ｍＭ〜１．５ｍＭ、好ましくは３．０〜１．５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭ〜１．０ｍＭ、好ましくは２．０ｍＭ〜１．１ｍＭ、好ましくは１．８５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度で、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、ｐＨ ８及び２１℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
２．０ｍＭＣａ２＋から０．１０ｍＭへの遊離カルシウムイオン濃度の減少は、２００ｐｐｍ（酸性ＣＯ２の存在下で、Ｃａ（ＨＣＯ３）２の形態のＣａＣＯ３として）から１０ｐｐｍに水の硬度を減少させることに相当する。最低ビルダーレベルは、キレート化物のナトリウム塩から、及び１００％乾燥したキレート化物基礎原料上で計算される。
キレート剤のキレート化効果を、クエン酸塩と比較して測定することもできる。遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度は、値１と指定され、キレート剤の結果は、この値と比較される。本発明による好ましいキレート剤は、ｐＨ ８．０及び２１℃で測定されるとき、クエン酸塩の濃度よりも０．９倍未満、例えば０．８倍未満、例えば０．７倍未満、例えば０．６倍未満、例えば０．５倍未満、例えば０．４倍未満、例えば０．３倍未満、例えば０．２倍未満、例えば０．１倍未満の低い濃度で、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。本発明による好ましいキレート剤は、ｐＨ ８．０及び２１℃で測定されるとき、遊離カルシウム濃度の決定のために、カルシウムイオン選択性電極を用いて、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、クエン酸塩の濃度よりも０．９倍未満、例えば０．８倍未満、例えば０．７倍未満、例えば０．６倍未満、例えば０．５倍未満、例えば０．４倍未満、例えば０．３倍未満、例えば０．２倍未満、例えば０．１倍未満の低い濃度で、遊離カルシウム濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
特に好ましい実施形態では、キレート剤は、ｐＨ ８．０及び２１℃で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度よりも１．０〜０．１倍未満、例えば０．９〜０．１倍未満、例えば０．８〜０．１倍未満、例えば０．７〜０．１倍未満、例えば０．６〜０．１倍未満、例えば０．５〜０．１倍未満、例えば０．４〜０．１倍未満、例えば０．３５〜０．１倍未満、例えば０．３〜０．１倍未満の低いキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明の更なる実施形態は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
本発明の好ましい実施形態において、洗浄組成物は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３〜２１３の範囲の１つ以上の位置での置換を含み、少なくとも１つのキレート剤であって、前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
本発明の更なる実施形態は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号６に少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤を更に含む。
したがって、本発明によるキレート剤は、同一の条件で遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるのに必要なクエン酸塩の濃度よりも低い濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
あるいは、キレート剤とカルシウム及び／又はマグネシウム等の金属イオンとの間に形成される錯体の強度は、ｌｏｇ Ｋ値（平衡又は結合又は解離又は安定度定数）で表される。この定数を、所与のｐＨ、所与の温度及び所与のイオン強度で測定することができる。
上述のように、キレート剤と金属イオン、例えば、カルシウム及び／又はマグネシウムとの間に形成される錯体の強度を、ｌｏｇ Ｋ値（平衡又は結合又は解離又は安定度定数）で表すことができ、定数を、Ａ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．３１４，（２００３），ｐｐ ２２７〜２３４に記載の等温滴定熱量計（ＩＴＣ）によって、Ｋ値から測定することができ、ｌｏｇ Ｋを、Ｋ値の対数（１０を底とする）として計算することができる。この方法で測定されるｌｏｇ Ｋ値は、温度、ｐＨ、イオン強度に依存するため、ｌｏｇ Ｋ値と比較するとき、それらが同様、好ましくは同一の条件で決定されることが重要である。更に、クエン酸塩等の参照として標準物質を導入することによって、実験における変化からの影響は減少し得る。好ましくは、ｌｏｇ Ｋは、本明細書の「材料及び方法」に記載されるように決定され、したがって、本発明の一実施形態において、本発明による組成物中のキレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、ｌｏｇ ＫがｐＨ １０及び１９℃で測定されるとき、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１のｌｏｇ Ｋを有する。本発明による組成物中のキレート剤のｌｏｇ Ｋ値は、３〜１１、例えば３〜１０、例えば３〜９、例えば３〜８、例えば４〜１１、例えば５〜１１、例えば６〜１１、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば４〜９、例えば５〜９、例えば４〜８、特に５〜８の範囲でもあり得る。好ましくは、本発明による組成物中のキレート剤のｌｏｇ Ｋは、実施例２ｂに記載されるように決定されるクエン酸塩のｌｏｇ Ｋの少なくとも１倍、例えば少なくとも１．３３倍、例えば少なくとも１．６７倍、例えば少なくとも２倍、例えば少なくとも２．３３倍、例えば少なくとも２．６７倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも３．３３倍、例えば少なくとも３．６７倍の因数である。本発明による組成物中のキレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように決定されるクエン酸塩のｌｏｇ Ｋの１〜３．６７倍、例えば１〜３．３３倍、例えば１〜３．００倍、例えば１〜２．６７倍、例えば１．３３〜３．６７倍、例えば１．３３〜３．３３倍、例えば１．３３〜３．００倍、例えば１．３３〜２．６７倍、例えば１．６７〜３．６７倍、例えば１．６７〜３．３３倍、例えば１．６７〜３倍、具体的には、１．６７〜２．６７倍の因数の範囲であり得る。
有用なキレート剤は、以下：Ｎ−（１，２−ジカルボキシ−エチル）−Ｄ，Ｌ−アスパラギン酸（ＩＤＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ、Ｎ−アセト酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ、Ｎ−アセト酢酸（ＴＵＤＡ）、スルホメチル−Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（ヒドロキシエチル）−エチレンジアミントリアセテート（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）であり得るが、これらに限定されない。
好ましいキレート剤は、アミノ基を含有し得、例えば、アミノポリカルボン酸塩又はホスホン酸塩であり得る。これは、１つ、２つ又は３つのアミノ基（典型的には、二級又は三級アミノ基）を含む単量体分子であり得、これは、２つ、３つ、４つ若しくは５つのカルボキシル基又は更にはそれ以上のカルボキシル基を含有し得る。キレート剤は、リンを含有する場合もあり、リンを含有しない場合もある。キレート剤を分類する方法が多く存在し、１つの方法は、以下の通りである：
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＮＴＡ（２，２’，２”−ニトリロトリアセテート）、クエン酸塩、２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボキシレート、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＭＧＤＡ（メチルグリシンアセト酢酸又はＮ，Ｎ’−ビス（カルボキシメチル）アラニン）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＥＤＤＳ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸）、ＧＬＤＡ（Ｌ−グルタミン酸、Ｎ，Ｎ−アセト酢酸）、ＰＡＡ［ポリ（アクリル酸）］等のポリカルボン酸塩、ＰＡＡ／ＰＭＡ［コポリ（アクリル酸／マレイン酸）］、又はこれらの混合物様のカルボキシレート基であるキレート剤であるか、あるいはそれに基づくキレート剤であり得る。
リンを含有するキレート剤は、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰ）、ＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸）、ＥＤＴＭＰ［エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸］、ＥＤＴＭＰＡ（エチレンジアミンテトラメチレンテトラホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、ＤＴＭＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））等のポリリン酸塩又はホスホン酸塩であり得る。ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＰＤＴＡ、ＧＬＤＡ、ＭＧＤＡ、ＥＤＤＳ、ＥＤＴＭＰ、ＥＤＴＭＰＡ、及びＤＴＰＭＰ又はＡＳＭＡ、ＡＳＤＡ、ＡＳＭＰ、ＩＤＡ、ＳＭＡＳ、ＳＥＡＳ、ＳＭＧＬ、ＳＥＧＬ、ＭＩＤＡ、α−ＡＬＤＡ、ＳＥＤＡ、ＩＳＤＡ、ＰＨＤＡ、ＡＮＤＡ、ＳＬＤＡ、ＴＵＤＡ、ＳＭＤＡ、ＨＥＤＴＡ、ＤＥＧ、ＡＴＭＰ、又はこれらの混合物等のキレート剤は、窒素を含有し得る。
したがって、好ましいキレート剤は、以下：エチレン−ジアミン−テトラ−酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＭＰＡ、ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、メチルグリシンアセト酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−アセト酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、及びニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、又はこれらの混合物であり得るが、これらに限定されない。キレート剤は、それらの酸形態又は塩中に存在し得、好ましくは、キレート剤は、ナトリウム、アンモニウム又はカリウム塩として存在し得る。
キレート剤は、０．０００１重量％〜２０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％の量の組成物中に存在し得る。
親アルファ−アミラーゼ：親アルファ−アミラーゼは、原則として、保管中若しくは使用中、例えば、洗浄中又はデンプン加水分解プロセスにおいて、改善された安定性を有する変異体を調製するのに所望される、任意のアルファ−アミラーゼであり得る。したがって、改善された安定性は、保管中のデンプン分解活性の減少した損失として、又は使用中の増加した活性及び性能として観察され得る。既知のアルファ−アミラーゼは、バチルス属種、例えば、バチルス・リケニフォルミス由来、アスペルギルス・オリザエ（ＴＡＫＡ−アミラーゼ）又は黒色アスペルギルス等の菌類の種由来、大麦等の植物由来、及び哺乳動物由来等の細菌を含む広範囲の選択の生物に由来する。親アルファ−アミラーゼは、原則として、起源に関係しない任意のそのようなアルファ−アミラーゼであり得る。
バチルス種によって産生されるいくつかのアルファ−アミラーゼが、アミノ酸レベルにおいて高度に同一であることが周知である。相当の同一性がこれらのアルファ−アミラーゼ間で見出されるため、それらは、アルファ−アミラーゼの同一のクラス、すなわち、「ターマミル様アルファ−アミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。
したがって、本文脈において、「ターマミル様の」アルファ−アミラーゼという用語は、アルファ−アミラーゼ、具体的には、アミノ酸レベルで、本明細書において配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ（ターマミル（商標））に対して相当の、すなわち、少なくとも６０％の同一性を呈するバチルスアルファ−アミラーゼを示すよう意図される。
ターマミル様アルファ−アミラーゼ
いくつかの既知のバチルスアルファ−アミラーゼの同一性を、以下の表１で求めることができる。
Figure 2013519757
例えば、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ（ターマミル（商標）として市販されている）は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼ（ＢＡＮ）と約８１％の相同性であり、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むバチルス・ステアロサーモフィルスアルファ−アミラーゼ（ＢＳＧ）と約６５％の相同性であると見出された。更なる相同のアルファ−アミラーゼは、それぞれ、国際特許第９５／２６３９７号に開示され、本明細書において配列番号６及び配列番号１２に更に示される、ＳＰ７２２＋ＳＰ６９０を含む。他のアミラーゼは、バチルス種に由来し、配列番号１０に示されるＡＡ５６０アルファ−アミラーゼ、及びバチルス種に由来し、配列番号８に示され、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１５１（１９８８），ｐｐ．２５〜３１によって説明されるＳＰ７０７又は＃７０７アルファ−アミラーゼである。更なる相同体は、配列番号１８を有する国際特許第９７／００３２４号（ＫＡＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示のＫＳＭ ＡＰ１３７８アルファ−アミラーゼである。更に別の相同体は、配列番号２２を有するＳＰ．７〜７である。別の好適な親アミラーゼは、配列番号２を有するＫ３８、又は国際特許第２００５／００１０６４号に記載の配列番号４及び配列番号２４を有するバチルス・サーキュランスアミラーゼである。
更に更なる興味深いアルファ−アミラーゼは、欧州特許第０２５２６６６号（ＡＴＣＣ２７８１１）に記載のバチルス・リケニフォルミス株によって産生されるアルファ−アミラーゼ、並びに国際特許第９１／００３５３号及び国際特許第９４／１８３１４号において特定されるアルファ−アミラーゼを含む。他の市販のターマミル様アルファ−アミラーゼは、以下の商標名下で販売されている製品中に含まれている：Ｏｐｔｉｔｈｅｒｍ（商標）及びＴａｋａｔｈｅｒｍ（商標）（Ｓｏｌｖａｙ）、Ｍａｘａｍｙｌ（商標）（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能）、Ｓｐｅｚｙｍ ＡＡ（商標）、及びＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能）、並びにＫｅｉｓｔａｓｅ（商標）（Ｄａｉｗａから入手可能）、Ｄｅｘ ｌｏ、ＧＣ５２１（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能）、並びにＵｌｔｒａｐｈｌｏｗ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）、Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）ＳＴ５０００Ｅ、ＰＵＲＡＳＴＲＡ（商標）ＨＰＡＭ Ｌ、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、Ｓｐｅｚｙｍｅ ＦＲＥＤ、ＧＣ３５８、ＣｌｅａｒＦｌｏｗ ＡＡ（Ｄａｎｉｓｃｏから入手可能）、又はアルファ−アミラーゼＴＳ−２３（配列番号２６（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７，８２，３２５〜３３４）。
非ターマミル様アルファ−アミラーゼは、例えば、真菌アルファ−アミラーゼ、哺乳類若しくは植物アルファ−アミラーゼ、又は細菌アルファ−アミラーゼであり得る（ターマミル様アルファ−アミラーゼとは異なる）。そのようなアルファ−アミラーゼの具体例には、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸アルファ−アミラーゼ、バチルス・ズブチルスアルファ−アミラーゼ、ブタ膵臓アルファ−アミラーゼ、及び大麦アルファ−アミラーゼが挙げられる。これらのアルファ−アミラーゼのすべては、本明細書に参照されるような典型的なターマミル様アルファ−アミラーゼの構造とは著しく異なる構造を解明した。
上述の、すなわち、黒色アスペルギルス及びアスペルギルスオリーゼに由来する真菌アルファ−アミラーゼは、アミノ酸レベルにおいて高度に同一であり、概して、同一のアルファ−アミラーゼのファミリーに属すると考えられる。アスペルギルス・オリザエに由来する真菌アルファ−アミラーゼは、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）の商標名下で市販されている。
親ハイブリッドアルファ−アミラーゼ
親アルファ−アミラーゼは、ハイブリッドアルファ−アミラーゼ、すなわち、少なくとも２つのアルファ−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組み合わせを含むアルファ−アミラーゼであり得る。
親ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、アミノ酸相同性及び／又は免疫学的交差反応性及び／又はＤＮＡハイブリダイゼーション（上で定義される）に基づいて、ターマミル様アルファ−アミラーゼファミリーに属すると決定することができる親ハイブリッドアルファ−アミラーゼであり得る。この場合、ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、典型的には、ターマミル様アルファ−アミラーゼの少なくとも一部分、及び微生物（細菌若しくは真菌）及び／又は哺乳類由来のターマミル様アルファ−アミラーゼ又は非ターマミル様アルファ−アミラーゼから選択される１つ以上の他のアルファ−アミラーゼの（１つ又は複数の）部分からなる。
したがって、親ハイブリッドアルファ−アミラーゼは、少なくとも２つのターマミル様アルファ−アミラーゼ由来、又は少なくとも１つのターマミル様及び少なくとも１つの非ターマミル様の細菌アルファ−アミラーゼ由来、又は少なくとも１つのターマミル様及び少なくとも１つの真菌アルファ−アミラーゼ由来の部分アミノ酸配列の組み合わせを含み得る。部分アミノ酸配列が由来するターマミル様アルファ−アミラーゼは、本明細書に参照されるターマミル様アルファ−アミラーゼのうちのいずれかであり得る。
一実施形態では、親ターマミル様アルファ−アミラーゼは、（成熟タンパク質の）３５個のＮ末端アミノ酸残基が、配列番号１４に示されるバチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼの成熟タンパク質の３３個のＮ末端アミノ酸残基に置換されることを除いて、配列番号２０に示されるバチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼと同一のハイブリッドターマミル様アルファ−アミラーゼであり、前記ハイブリッドは、（配列番号６の番号付けを用いて）以下の変異：ＬＥ１７４と称されるＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを更に有し得る。別の実施形態において、ＬＥ１７４は、ＬＥ３９９と称される変異Ｇ４８Ａ、Ｔ４９Ｉ、Ｇ１０７Ａ、Ｉ２０１Ｆを更に含む。一実施形態では、親は、変異Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９５Ｆを伴う配列番号１６である。
本発明の好ましい態様において、親アルファ−アミラーゼは、本明細書において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列を有するアルファ−アミラーゼである。別の好ましい態様では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチドの６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、更に特により好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の相同性を示すアルファ−アミラーゼである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチド由来の１つ又はいくつかのアミノ酸、好ましくは１０個のアミノ酸、より好ましくは９個、８個、７個、６個、好ましくは５個のアミノ酸、より好ましくは４個のアミノ酸、更により好ましくは３個のアミノ酸、最も好ましくは２個のアミノ酸、及び更に最も好ましくは１個のアミノ酸による、例えば、欠失、挿入又は置換によって異なるアミノ酸配列を有する。
親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの１つを有するアルファ−アミラーゼに対して産生される抗体との免疫学的交差反応性を示すアルファ−アミラーゼであり得る。好ましい実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、親アルファ−アミラーゼに対して産生される抗体が例えば、それぞれ、ＥＬＩＳＡ又はＢｉａＣｏｒｅ等の競合アッセイ技法において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するアルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力を示すか、あるいは親アルファ−アミラーゼの親和性又は結合力に匹敵する親和性又は結合力を示し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有する、アルファ−アミラーゼに対して産生される抗体が、前記競合アッセイ技法において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するアルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力に匹敵する親アルファ−アミラーゼへの親和性又は結合力を示すものである。更なる実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４又は２６に示されるアミノ酸配列のうちの１つを有するアルファ−アミラーゼの親和性又は結合力の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１００％、好ましくは少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも１２０％、特に好ましくは少なくとも１２５％である親和性又は結合力を有するものである。
親アルファ−アミラーゼは、本明細書の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５から明らかな上述の特定のアルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるアルファ−アミラーゼでもあり得る。したがって、一実施形態は、親アルファ−アミラーゼが以下の場合、親アルファ−アミラーゼの変異体アルファ−アミラーゼに関する：
（Ａ）バチルス・リケニフォルミス、バチルス種、又はＫＳＭ ＡＰ１３７８の株に由来するか、
（Ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２に示されるアミノ酸配列を有する群から選択されるか、
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６のうちの１つに対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９７％、及び更により好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、
（Ｄ）低い、好ましくは中程度、好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５のうちの１つの核酸配列とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
一態様では、デンプン分解増強活性を有する親ポリペプチドは、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３若しくは２５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３若しくは２５の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
特定の親アルファ−アミラーゼの変異体が、従来の様式で、特定のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾（例えば、欠失又は置換）への参照によって参照されるとき、（それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような）（１つ又は複数の）同等の位置で修飾される別のアルファ−アミラーゼの変異体が、それによって包含されることを理解されたい。
本発明の特定の態様において、親アルファ−アミラーゼは、任意の好適な手段によって調製される自然発生（野生型）の変異体である。例えば、親アルファ−アミラーゼは、アミノ酸配列において修飾又は変更された自然発生アルファ−アミラーゼの変異体であり得る。
親アルファ−アミラーゼは、１つ以上の（いくつかの）アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有し得る実質的に相同性の親アルファ−アミラーゼであり得る。これらの変化は、軽度のもの、すなわち、以下で示されるような保守的なアミノ酸置換、及びタンパク質又はポリペプチドの三次元折り畳み又は活性に著しく影響を及ぼさない他の置換；小さい欠失、典型的には、１〜約３０個のアミノ酸の欠失；並びに小さいアミノ若しくはカルボキシ末端伸長等のアミノ末端メチオニン残基、最大約２０〜２５個の残基の小さいリンカーペプチド、又はポリヒスチジン路若しくはタンパク質Ａ等の精製を促進する小さい伸長（親和性タグ）（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．４：１０７５、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３）が好ましい。概して、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５〜１０７も参照されたい。
上記の変更は軽度のものであるのが好ましいが、かかる変更は、アミノ末端又はカルボキシル末端の伸長として最大３００個以上のアミノ酸の大きなポリペプチドの融合などの実質的な性質のものであってもよい。
特定の親アルファ−アミラーゼの変異体（本発明の変異体）が、従来の様式で、特定の親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の修飾（例えば、欠失又は置換）への参照によって参照されるとき、（それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような）（１つ又は複数の）同等の位置で修飾される別の親アルファ−アミラーゼの変異体が、それによって包含されることを理解されたい。
相同性（配列同一性）
相同性は、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。本発明のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６〜２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
本発明のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、上記参照）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、上記参照）、好ましくはバージョン３．０．０又はそれ以降を用いて決定される。必要に応じて用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。「最長同一性（longest identity）」と表示されたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）を同一率として用い、これは以下のように計算される。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメントの長さ−アライメント中のギャップの総数）
相同性又は配列同一性は、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２つの配列間の同一性の程度としても決定され得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるギャップ等の当該技術分野において既知のコンピュータプログラムの手段によって好適に決定され得る。したがって、ギャップＧＣＧｖ８は、同一性のためのデフォルトスコアリングマトリックス、及び以下のデフォルトパラメータ：それぞれ、核酸配列比較のための５．０のギャップ作成ペナルティ及び０．３のギャップ伸長ペナルティ、並びにそれぞれ、タンパク質配列比較のための３．０のギャップ作成ペナルティ及び０．１のギャップ伸長ペナルティと使用され得る。ギャップは、アライメントを作製し、同一性を計算するために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，ｐ．４４３〜４５３の方法を使用する。
例えば、ターマミルとアルファ−アミラーゼとの間の構造アライメントは、他のアルファ−アミラーゼにおける同等の／対応する位置を同定するために使用され得る。前記構造アライメントを得る１つの方法は、ギャップペナルティのデフォルト値、すなわち、３．０のギャップ作成ペナルティ及び０．１のギャップ伸長ペナルティを用いて、ＧＣＧパッケージのパイルアッププログラムを使用することである。他の構造アライメント方法には、疎水性クラスター分析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２２４，ｐｐ．１４９〜１５５）及びリバーススレッディング（Ｈｕｂｅｒ，Ｔ；Ｔｏｒｄａ，ＡＥ，ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１ ｐｐ．１４２〜１４９（１９９８）が含まれる。アルファ−アミラーゼの性質、すなわち、免疫学的交差反応は、関連したターマミル様アルファ−アミラーゼの少なくとも１つのエピトープに対して産生されるか、あるいはそれと反応する抗体を用いてアッセイされ得る。単クローン性又は多クローン性のいずれかであり得る抗体は、当該技術分野において既知の方法、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓによって説明される方法によって産生され得る。免疫学的交差反応性は、当該技術分野において既知のアッセイを用いて決定され得、その例には、例えば、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９によって説明されるようなウエスタンブロット法又は放射状免疫拡散アッセイがある。
ハイブリダイゼーション
一態様では、デンプン分解活性を有する親ポリペプチドは、非常に低いストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件、更により好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の部分配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。部分配列は、デンプン分解活性を有するポリペプチド断片をコードする。一態様では、相補鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３又は２５の成熟ポリペプチドコード配列の全長相補鎖である。
アルファ−アミラーゼ活性であり得る所望の性質によるアルファ−アミラーゼの特徴付けにおいて使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、問題のアルファ−アミラーゼの全又は部分ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて好適に調製され得る。
ハイブリダイゼーションを試験するための好適な条件は、５×ＳＳＣ（標準のクエン酸ナトリウム、１×ＳＳＣは０．１６５０ＭのＮａＣｌに相当する）中に予め浸す工程と、２０％のホルムアミド、５×デンハート液、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．８、及び５０ｍｇの変性超音波処理仔ウシ胸腺ＤＮＡの溶液中で、約４０℃で１時間予めハイブリダイズし、その後、１００ｍＭのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）で補充される同一の溶液中で、約４０℃で１８時間ハイブリダイズし、その後、４０℃（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、更により好ましくは約７５℃（非常に高いストリンジェンシー）で３０分間、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中でフィルタを３回洗浄する工程と、を伴う。ハイブリダイゼーション方法についての更なる詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９で見出すことができる。
本文脈において、「由来する」は、問題の生物の株によって産生されるか、あるいは産生可能であるアルファ−アミラーゼを表すだけでなく、そのような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、前記ＤＮＡ配列で形質転換される宿主生物中に産生されるアルファ−アミラーゼも表すよう意図される。最後に、本用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、問題のアルファ−アミラーゼの同定特性を有するアルファ−アミラーゼを表すよう意図される。本用語は、親アルファ−アミラーゼが、自然発生アルファ−アミラーゼの変異体、すなわち、自然発生アルファ−アミラーゼの１つ以上のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であり得ることも表すよう意図される。
アルファ−アミラーゼ変異体を調製するための方法
変異を遺伝子に導入するためのいくつかの方法が、当該技術分野において既知である。アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングを手短に議論した後、アルファ−アミラーゼをコードする配列内の特定の位置での変異を発生させるための方法を議論する。
アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知の種々の方法を用いて、問題のアルファ−アミラーゼを産生する任意の細胞又は微生物から単離され得る。最初に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリは、研究されるアルファ−アミラーゼを産生する生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築されるべきである。次に、アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列が既知の場合、相同性の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成及び使用して、問題の生物から調製されるゲノムライブラリ由来のアルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定し得る。あるいは、既知のアルファ−アミラーゼ遺伝子と相同の配列を含有する標識オリゴヌクレオチドプローブをプローブとして使用し、ハイブリダイゼーション及び比較的低いストリンジェンシーの洗浄条件を用いて、アルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。
アルファ−アミラーゼをコードするクローンを同定するための更に別の方法は、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミド等の発現ベクターに挿入する工程と、アルファ−アミラーゼ陰性細菌を結果として生じるゲノムＤＮＡライブラリで形質転換する工程と、その後、形質転換した細菌をアルファ−アミラーゼの基質を含有する寒天上にプレーティングし、それによって、アルファ−アミラーゼを発現するクローンを同定する工程と、を伴う。
あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準の方法、例えば、Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９によって説明されるホスホロアミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４），ＥＭＢＯ Ｊ．３ ８０１〜８０５によって説明される方法を用いて合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクター中でクローンされる。
最後に、ＤＮＡ配列は、標準の技法に従って、合成、ゲノム、若しくはｃＤＮＡ起源の連結断片（必要に応じて、全ＤＮＡ配列の種々の部分に対応する断片）によって調製される、ゲノム及び合成起源の混合、合成及びｃＤＮＡ起源の混合、又はゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合であり得る。ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号又はＲ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２３９ ｎｏ．４８３９ ｐｐ．４８７〜４９１に記載の特異的プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても調製され得る。
部位特異的変異誘発
アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列が単離され、変異の望ましい部位が同定された時点で、変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含有し、変異体ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特定の方法では、アルファ−アミラーゼをコードする配列を架橋するＤＮＡの一本鎖ギャップは、アルファ−アミラーゼ遺伝子を担持するベクター中に作成される。次に、所望の変異を担持する合成ヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡの相同部分にアニールされる。残りのギャップは、その後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で充填され、構築は、Ｔ４リガーゼを用いて連結される。この方法の具体例は、Ｍｏｒｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．１９８４ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２，ｐｐ ６３６〜６３９に記載されている。米国特許第４，７６０，０２５号は、カセットの比較的重要でない変更を行なうことによる、複数の変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入され得るため、更に多種多様の変異がＭｏｒｉｎａｇａ法によっていずれか１回で導入され得る。
変異をアルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に導入するための別の方法は、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｎｇ（１９８９）に記載されている。これは、ＰＣＲ反応におけるプライマーのうちの１つとして、化学的に合成されたＤＮＡ鎖を用いることによって導入される所望の変異を含有するＰＣＲ断片の３段階生成を伴う。変異を担持するＤＮＡ断片は、制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲによって生成された断片から切断によって単離され、発現プラスミドに再挿入され得る。
ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、示される問題のアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも３つの部分において、あるいは全体の遺伝子内で、局所的ランダム変異誘発又は領域特異的ランダム変異誘発のいずれかとして好適に行なわれる。
親アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のランダム変異誘発は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて好都合に行なわれ得る。
上述との関連で、本発明の更なる態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を生成するための方法に関し、例えば、変異体は、親と比較して変化したデンプン親和性を呈し、本方法は、
（ａ）親アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列をランダム変異誘発に供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた変異ＤＮＡ配列を宿主細胞で発現させる工程と、
（ｃ）親アルファ−アミラーゼと比較して変化したデンプン親和性を有するアルファ−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、を含む。
本発明の上述の方法の工程（ａ）は、好ましくは、ドープされたプライマーを用いて行なわれる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤を用いて、好適なオリゴヌクレオチドを用いて、又はＤＮＡ配列をＰＣＲによって発生した変異誘発に供することによって行なわれ得る。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤の任意の組み合わせを用いて行なわれ得る。変異誘発剤は、例えば、トランジション、トランスバージョン、反転、スクランブリング、欠失、及び／又は挿入を含む変異誘発剤であり得る。
本目的に好適な物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホン酸塩（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。そのような作用物質が使用されるとき、変異誘発は、典型的には、最適な変異誘発剤の存在下において、変異誘発を発生させるのに好適な条件下で、変異誘発される親酵素をコードするＤＮＡ配列をインキュベートすることによって、所望の性質を有する変異ＤＮＡを選択することによって行なわれる。オリゴヌクレオチドを用いて変異誘発が行なれるとき、オリゴヌクレオチドは、変化する位置でのオリゴヌクレオチドの合成中に３つの非親ヌクレオチドでドープ又はスパイクされ得る。不必要なアミノ酸のコドンが回避されるように、ドーピング又はスパイキングが行なわれ得る。ドープ又はスパイクされたオリゴヌクレオチドは、任意の公開された技法によって、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ又は適切であると見なされる任意のＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、アルファ−アミラーゼ酵素をコードするＤＮＡに組み込まれ得る。好ましくは、ドーピングは、それぞれの位置において、野生型及び変異の割合が予め定義される「一定のランダムドーピング」を用いて実行される。更に、ドーピングは、ある特定のヌクレオチドの導入の選好、及びそれによって、１つ以上の特定のアミノ酸残基の導入の選好に対して行なわれ得る。ドーピングは、例えば、それぞれの位置において、９０％の野生型及び１０％の変異の導入を可能にするように行なわれ得る。ドーピングスキームの選択における更に考慮すべき事項は、遺伝子、並びにタンパク質構造上の制約に基づいている。ドーピングスキームは、とりわけ、停止コドンの導入が回避されることを確実にするＤＯＰＥプログラムを用いて作製され得る。ＰＣＲによって発生した変異誘発が使用されるとき、親アルファ−アミラーゼをコードする化学的に処理された遺伝子又は処理されていない遺伝子のいずれかが、ヌクレオチドの誤組み込みを増加させる条件下でＰＣＲに供される（Ｄｅｓｈｌｅｒ １９９２，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（４），ｐｐ １０３〜１０６；Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１１〜１５）。大腸菌（Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１３３，ｐｐ．１７９〜１９１）、サッカロミセスセレビシエ、又は任意の他の微生物の変異誘発因子株は、例えば、親グリコシダーゼを含有するプラスミドを変異誘発因子株に形質転換し、プラスミドを有する変異誘発因子株を成長させ、変異プラスミドを変異誘発因子株から単離することによって、アルファ−アミラーゼをコードするＤＮＡのランダム変異誘発に使用され得る。変異プラスミドは、その後、発現生物に形質転換され得る。変異誘発されるＤＮＡ配列は、親アルファ−アミラーゼを発現する生物から調製されるゲノム又はｃＤＮＡライブラリ中に好都合に存在し得る。あるいは、ＤＮＡ配列は、それ自体が変異誘発剤とインキュベートされるか、あるいはさもなければそれに曝露され得るプラスミド又はバクテリオファージ等の好適なベクター上に存在し得る。変異誘発されるＤＮＡは、前記細胞のゲノムに統合されるか、あるいは細胞内に宿されるベクター上に存在するかのいずれかによって、宿主細胞中にも存在し得る。最後に、変異誘発されるＤＮＡは、単離した形態であり得る。ランダム変異誘発に供されるＤＮＡ配列は、好ましくは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列であることを理解されたい。場合によっては、発現工程ｂ）又はスクリーニング工程ｃ）を行なう前に変異ＤＮＡ配列を増幅するのが好都合であり得る。そのような増幅は、当該技術分野において既知の方法に従って行なわれ得、現在好ましい方法は、親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ＰＣＲによって発生する増幅である。変異誘発剤とのインキュベーション又はそれへの曝露の後、変異ＤＮＡは、発現を発生させる条件下でＤＮＡ配列を担持する好適な宿主細胞を培養することによって発現される。この目的のために使用される宿主細胞は、任意でベクター上に存在する、変異ＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞、又は変異誘発処理中に親酵素をコードするＤＮＡ配列を担持した宿主細胞であり得る。好適な宿主細胞の例には、以下：バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ロータス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンジエンシス、ストレプトマイセス・リビダンス、又はストレプトマイセス・ムリヌス等のグラム陽性細菌、及び大腸菌等のグラム陰性細菌がある。変異ＤＮＡ配列は、変異ＤＮＡ配列の発現を可能にする機能をコードするＤＮＡ配列を更に含み得る。
局所的ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、問題の親アルファ−アミラーゼの一部分に有利に局所化され得る。これは、例えば、酵素のある特定の領域が酵素の所与の性質にとって特に重要であると同定されたとき、及び改善された性質を有する変異体をもたらすよう修飾されることが予想されるときに有利であり得る。そのような領域は、通常、親酵素の三級構造が解明され、酵素の機能に関連したときに同定され得る。
局所的又は領域特異的ランダム変異誘発は、上述のＰＣＲによって発生した変異誘発技法、又は当該技術分野において既知の任意の他の好適な技法を用いて好都合に行なわれる。あるいは、修飾されるＤＮＡ配列の一部分をコードするＤＮＡ配列は、例えば、好適なベクターへの挿入によって単離され得、前記一部分は、その後、上述の変異誘発方法のうちのいずれかを用いて変異誘発に供され得る。
アルファ−アミラーゼ変異体をもたらす代替方法
本発明の変異体をもたらす代替方法には、例えば、国際特許第９５／２２６２５号（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）及び国際特許第９６／００３４３号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）に記載の方法を含む、当該技術分野において既知の遺伝子シャフリング法が含まれる。
アルファ−アミラーゼ変異体の発現
本発明に従って、上述の方法、又は当該技術分野において既知の任意の代替方法によって産生される変異体をコードするＤＮＡ配列は、典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意で、制御因子遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を含む発現ベクターを用いて、酵素形態で発現され得る。
本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を担持する組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順に好都合に供され得る任意のベクターであり得、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。したがって、本ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、バクテリオファージ又は染色体外素子、ミニ染色体若しくは人工染色体であり得、その複製は、染色体複製から独立している。あるいは、本ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、宿主細胞ゲノムに統合され、それが統合された（１つ又は複数の）染色体とともに複製されるベクターであり得る。
本ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、好適なプロモーター配列に操作可能に結合されるべきである。プロモーターは、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に相同又は非相同のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。特に細菌宿主において本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指向するのに好適なプロモーターの例には、大腸菌の乳糖オペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・ズブチルスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等がある。真菌宿主における転写について、有用なプロモーターの例には、アスペルギルスオリーゼＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、黒色アスペルギルス中性アルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸安定性アルファ−アミラーゼ、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスペルギルスオリーゼアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルスオリーゼトリオースリン酸イソメラーゼ、又はアスペルギルスニジュランスアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターがある。
本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物において、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合されるポリアデニル化配列も含み得る。終止及びポリアデニル化配列は、好適にプロモーターと同一の供給源に由来する。
ベクターは、ベクターを問題の宿主細胞中で複製することができるＤＮＡ配列を更に含み得る。そのような配列の例には、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、及びｐＩＪ７０２の複製の起源がある。
ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、バチルス・サブティリス又はバチルス・リケニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子等の宿主細胞における欠陥を補完する産物の遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン抵抗性等の抗生物質抵抗性を与える産物の遺伝子も含み得る。更に、ベクターは、ハイグロマイシン抵抗を引き起こすマーカーである、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣ等のアスペルギルス選択マーカーを含み得るか、あるいは選択は、例えば、国際特許第９１／１７２４３号に記載の同時形質転換によって達成され得る。
例えば、宿主細胞としてある特定の細菌を用いるとき、細胞内発現がある点において有利であり得る一方で、発現が細胞外であることが概して好ましい。概して、本明細書において言及されるバチルスアルファ−アミラーゼは、培養培地への発現したプロテアーゼの分泌を可能にする事前領域を含む。所望の場合、この事前領域は、異なる事前領域、又はそれぞれの事前領域をコードするＤＮＡ配列の置換によって好都合に達成されるシグナル配列によって置換され得る。
それぞれ、アルファ−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター、及び他の素子をコードする本発明のＤＮＡ構築物を連結し、それらを複製に必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照のこと）。
上で定義されるＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む細胞は、本発明で用いるアルファ−アミラーゼ変異体の組み換え産出における宿主細胞として有利に使用される。細胞は、（１つ以上の複製物中の）ＤＮＡ構築物を宿主染色体に好都合に統合することによって、本明細書の変異体をコードするＤＮＡ構築物で形質転換され得る。この統合は、ＤＮＡ配列が細胞中に安定して維持される可能性が高いため、概して、有利な点であると考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築物の統合は、従来の方法に従って、例えば、相同又は異種組み換えによって行なわれ得る。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連した上述の発現ベクターで形質転換され得る。
細胞は、哺乳動物又は昆虫等の高等生物の細胞であり得るが、好ましくは、微生物細胞、例えば、細菌又は真菌（酵母菌を含む）細胞である。
好適な細菌の例には、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ロータス、バチルス・メガテリウム、バチルス・スリンジエンシス、又はストレプトマイセス・リビダンス若しくはストレプトマイセス・ムリヌス等のグラム陽性細菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性細菌がある。細菌の形質転換は、例えば、それ自体既知の方法において、プロトプラスト形質転換によって、又はコンピテント細胞を用いることによってもたらされ得る。
酵母生物は、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセス種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエから好都合に選択され得る。糸状菌は、アスペルギルス種、例えば、アスペルギルス・オリザエ又は黒色アスペルギルスに有利に属し得る。真菌性細胞は、それ自体既知の方法において、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、その後、細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換に好適な手順は、欧州特許第２３８ ０２３号に記載されている。
本発明において用いられるアルファ−アミラーゼ変異体を産生する好適な方法は、変異体の産出に寄与する条件下で、上述のように宿主細胞を培養する工程と、変異体を細胞及び／又は培養培地から回収する工程と、を含む。
細胞を培養するのに使用される培地は、問題の宿主細胞を成長させ、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体の発現を得るのに好適な任意の従来の培地であり得る。好適な培地は、商業供給者から入手可能であるか、あるいは（例えば、ｃａｔａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されるような）公開されたレシピに従って調製され得る。
宿主細胞から分泌されるアルファ−アミラーゼ変異体は、遠心分離又は濾過によって細胞を培地から分離する工程と、硫酸アンモニウム等の塩を用いて培地のタンパク性成分を沈殿させ、その後、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、又は同等物等のクロマトグラフ手順を使用する工程と、を含む、周知の手順によって培養培地から好都合に回収され得る。
変異体指定の取り決め
いくつかの他のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と整列した配列番号６に開示のアルファ−アミラーゼのアミノ酸配列に由来する番号付けシステムを用いて、構造相同性の領域中のアルファ−アミラーゼにおけるアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。
本発明の種々のアルファ−アミラーゼ変異体を説明する際、参照を簡略化するために、以下に記載の命名法を適応する。いずれのケースでも、ＩＵＰＡＣによる１文字又は３文字の正式なアミノ酸略称を採用する。
本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字及び３文字のコードが使用される。参照を簡略化するために、本発明のアルファ−アミラーゼ変異体は、以下の命名法を用いて説明される：
（１つ又は複数の）最初のアミノ酸：（１つ又は複数の）位置：（１つ又は複数の）置換アミノ酸
この命名法に従って、例えば、３０位におけるアラニンのアスパラギンへの置換は、以下のように示され：
Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ
同一の位置におけるアラニンの欠失は、以下のように示され：
Ａｌａ３０＊又はＡ３０＊
リジン等の３０位以降の更なるアミノ酸残基の挿入は、以下のように示される：
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓ又はＡ３０ＡＫ
アミノ酸残基３０〜３３等の連続した一続きのアミノ酸残基の欠失は、（３０〜３３）＊又はΔ（Ａ３０〜Ｎ３３）と示される。単一のアミノ酸残基の欠失は、簡潔に、３０＊と開示され得る。
特定のアルファ−アミラーゼが他のアルファ−アミラーゼと比較して「欠失」を含有し、そのような位置においてが挿入行なわれる場合、これは、以下のように示され：
＊３６Ａｓｐ又は＊３６Ｄ
これは、３６位におけるアスパラギン酸の挿入についてである。
複数の変異は、プラス記号又はスペースで分けられ得、すなわち、
Ａｌａ３０Ａｓｎ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
Ａｌａ３０Ａｓｎ Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３ＯＮ Ｅ３４Ｓ
それぞれ、アラニン及びグルタミン酸をアスパラギン及びセリンに置換する３０位及び３４位における変異を表している。
あるいは、複数の変異は、コンマ又はセミコロンで分けられ得、すなわち、以下の通りである：
Ａｌａ３０Ａｓｎ，Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ，Ｅ３４Ｓ
更により簡潔化された複数の変異は、スペースによって分けられ得、例えば、以下の通りである：
Ａｌａ３０Ａｓｎ Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ Ｅ３４Ｓ
あるいは、複数の変異は、コンマ又はセミコロンで分けられ得る。
１つ以上の代替のアミノ酸残基が所与の位置に挿入されるとき、それは、以下のように示される：
Ａ３０Ｎ、Ｅ又は
Ａ３０Ｎ若しくはＡ３０Ｅ
あるいは、１つ以上の代替のアミノ酸残基が所与の位置に挿入され得、それは、以下のように示される：
Ａ３０［Ｎ，Ｅ］又はＡ３０［Ｎ Ｅ］、あるいは、Ａ３０｛Ｎ，Ｅ｝又はＡ３０｛Ｎ Ｅ｝
簡潔化のため、ある特定の位置で置換され得る代替のアミノ酸は、以下のように示され得る：
Ａ３０ Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ又はＶ
更に、修飾に好適な位置が、任意の特定の修飾が示唆されることなく、本明細書において同定されるとき、任意のアミノ酸残基が、その位置に存在するアミノ酸残基に置換され得ることを理解されたい。したがって、例えば、３０位におけるアラニンの修飾が言及されるが、特定されないとき、アラニンが、任意の他のアミノ酸すなわち、以下のうちのいずれかに欠失又は置換され得ることを理解されたい：
Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ
更に、「Ａ３０Ｘ」とは、以下の置換のうちの任意の１つを意味する：
Ａ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、若しくはＡ３０Ｖ、又は短縮して、Ａ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ
あるいは例えば、Ａ３０［Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ］
当業者は、例えば、配列番号６による番号付けを用いることは、計数のために配列番号６を用いて、親が必ず配列番号６であることを意味するのではなく、単に変更される位置が配列番号６に従って定義されることを意味すると理解するであろう。したがって、特定の置換を説明する別の方法は、変更されるアミノ酸をＸで示すことである。したがって、Ｘ３０Ｎは、異なるアルファ−アミラーゼが親アルファ−アミラーゼとして使用され得ることを反映して、３０位に存在する任意のアミノ酸がＮで置換され得ることを意味する。
したがって、命名法「Ｘ３０Ｎ」又は「Ｘ３０Ｖ」は、親アルファ−アミラーゼの３０位に存在し得る任意のアミノ酸がアスパラギン又はバリンによって置換されることを意味する。
アミノ酸残基の特性
荷電アミノ酸：
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
陰性荷電アミノ酸（最も陰性の残基の順に）：
Ａｓｐ、Ｇｌｕ
陽性荷電アミノ酸（最も陽性の残基の順に）：
Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
中性アミノ酸：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
疎水性アミノ酸残基（最も疎水性の残基を最後に記載）：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、
親水性アミノ酸（最も親水性の残基を最後に記載）：
Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
この命名法は、特定の共通の性質を有するアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失を伴う修飾に特に関連している。そのような修飾は、（１つ又は複数の）保守的なアミノ酸修飾と称される。保守的な修飾の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群の範囲内にある。概して比活性を変更しないアミノ酸修飾は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにこれらの逆である（Ｔａｙｌｏｒ，１９８６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１９：２０５〜２１８）。
本発明において有用な変異体
好ましい変異体は、親アルファ−アミラーゼの領域１９３〜２１３中の１つ以上、又は１つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における（１つ又は複数の）変更を含む。特に好ましい実施形態では、変異体は、１８１、１８２、１８３、若しくは１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失、及び更に領域１９３〜２１３中の１つ以上又は１つ若しくはいくつかのアミノ酸残基における変更を含み、番号付けは、すなわち、配列番号６による番号付けを用いて、配列番号６の成熟ポリペプチドに相当する。本発明者は、そのような変更が、具体的には、以下の「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９．０ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８．０ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７．０ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６．０ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５．０ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４．０ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３．０ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２．０ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１．０ｍＭ未満の濃度のキレート剤が遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるとき、キレート剤を含む組成物において増加した安定性を有する変異体をもたらすことを見出した。
本発明の第１の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む洗浄組成物に関し、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３〜２１３の範囲の１つ以上の位置での置換を含み、任意で少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
第２の態様は、親アルファ−アミラーゼの変異体を含む組成物を提供し、変異体アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１８、及び２２と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号６による番号付けを用いて、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、任意で、少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
更なる態様は、（配列番号６による番号付けを用いて）１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１つ以上の位置での置換を含む変異体を含む洗浄組成物を提供し、前記組成物は、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
更なる態様は、（配列番号６による番号付けを用いて）１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３を含む群から選択される１つ以上の位置での置換を含む変異体を含む洗浄組成物を提供し、変異体は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６からなる群からのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１８、及び配列番号２２を含み、前記組成物は、少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、洗浄補助剤と、を更に含む。
第３の態様は、洗浄組成物に関し、１０ｍＭ未満の濃度のキレート剤は、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
第４の態様は、洗浄組成物に関し、１０ｍＭ未満の濃度のキレート剤は、「材料及び方法」に記載のアッセイで測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
したがって、本発明の好ましい態様において、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの１９３〜２１３位に相当する範囲内の１つ以上の位置での少なくとも１つの置換を含む。「による番号付けを用いて」又は「に相当する」という用語は、本明細書において使用される番号付けシステムを指し、２つの表現は、本明細書において同義に使用される。したがって、１９５位は、配列番号６における１９５位に相当するアミノ酸である。したがって、（それぞれのアミノ酸配列間の可能性のある最良のアミノ酸配列アライメントから決定されるような）（１つ又は複数の）同等の位置において修飾される他の親アルファ−アミラーゼの変異体は、それによって包含されることを理解されたい。欠失が存在するとき、欠失が存在しないかのように計数される。
特に好ましい実施形態では、組成物は、変異体を含み、その変異体は、（配列番号６による番号付けを用いて）１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更、並びに１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を含む。
特に好ましい実施形態では、組成物は、変異体を含み、その変異体は、（配列番号６による番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、若しくは１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失、並びに１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２３４からなる群から選択される位置に相当する１つ以上又は１つ若しくはいくつかの位置での更なる変更、並びに１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を含む。
本発明の一態様では、洗浄組成物は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、若しくは１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上又は１つ若しくはいくつかの位置での置換を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体を含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８、又は２２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有し、変異体は、残存活性が、ＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイ（詳細については「材料及び方法」を参照のこと）に記載されるように、キレート剤の存在下で、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性、好ましくは少なくとも１００％の残存活性、好ましくは少なくとも１０５％の残存活性、好ましくは少なくとも１１０％の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、以下に説明されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明による組成物は、好ましくは、アルファ−アミラーゼを含み、親アルファ−アミラーゼは、１９３が、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］であるか、１９５位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９７位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９８位が、［Ｑ又はＮ］であるか、２００位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０３位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０６位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＨ］であるか、２１０位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２１２位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、又は２１３位が［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］である置換のうちの少なくとも１つによって修飾され、位置は、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明による組成物は、好ましくは、１８１、１８２、１８３、若しくは１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含むアルファ−アミラーゼ変異体変異体を含み、親アルファ−アミラーゼは、１９３が、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］であるか、１９５位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９７位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９８位が、［Ｑ又はＮ］であるか、２００位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０３位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０６位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ又はＶ、Ｈ］であるか、２１０位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２１２位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、又は２１３位が［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］であるかの置換のうちの少なくとも１つによって更に修飾され、位置は、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
具体的には、本発明は、アルファ−アミラーゼ含む組成物に関し、アミノ酸配列は、１９３がＴであるか、１９５位がＦ又はＹであるか、１９７位がＦ又はＬであるか、１９８位がＮであるか、２００位がＦであるか、２０３位がＦであるか、２０６位がＦ、Ｌ又はＹであるか、２１０位がＹであるか、２１２位がＶであるか、２１３位がＡである置換のうちの少なくとも１つによって修飾され、位置は、配列番号６を有する成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
更なる態様において、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、前記変異体は、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される２つ以上又は２つ若しくはいくつかの位置での置換を含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」の項で記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
更に更なる態様では、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、変異体は、１８１、１８２、１８３、若しくは１８４のアミノ酸領域における少なくとも２つ以上、又は少なくとも３つ以上の欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される２つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当し、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、変異体は、残存活性が、ＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイ（詳細については「材料及び方法」を参照のこと）に記載されるように、キレート剤の存在下で、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性、好ましくは少なくとも１００％の残存活性、好ましくは少なくとも１０５％の残存活性、好ましくは少なくとも１１０％の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、以下に説明されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
好ましい実施形態では、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも２つの欠失は、１８１＊＋１８２＊、１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊、１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊、及び１８３＊＋１８４＊からなる群から選択される。
更に更なる態様では、組成物は、アルファ−アミラーゼ変異体を含み、変異体は、（配列番号６による番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される２つ以上の位置での置換であって、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する、置換と、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される位置に相当する１つ以上又は１つ若しくはいくつかの位置での変更と、を更に含み、少なくとも１つのキレート剤を更に含み、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明の一態様では、組成物は、少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、以下のアミラーゼ変異体のうちの１つ以上又は１つ若しくはいくつかを含む：ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ。
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ。
ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；
ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ。
本発明の別の実施形態は、洗浄組成物に関し、変異体残存活性は、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、例えば少なくとも１１５％の残存活性であり、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明の更なる実施形態は、洗浄組成物に関し、変異体の残存活性は、親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善されており、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。親と比較した変異体の残存活性における百分率点（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。
したがって、本発明の特定の態様において、組成物は、リン含有、非リン含有、カルボン酸塩含有、窒素含有又は非窒素含有キレート剤からなる群から選択されるキレート剤を含み、好ましいキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ及びＨＥＤＰ、並びにこれらの混合物である。
本発明の好ましい態様において、変異体は、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２及び２１３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。
本発明の特に好ましい態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。好ましい実施形態において、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも２つの欠失は、１８１＊＋１８２＊、１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊、１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊及び１８３＊＋１８４＊からなる群から選択される。
本発明の別の好ましい態様では、変異体は、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３及びからなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される１つ以上又は１つ若しくはいくつかの位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。
本発明の更に好ましい態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。
更なる態様において、変異体は、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２３５、２４３、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される２つ以上の位置での置換を含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。
更に更なる態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２３５、２４３、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される２つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当する。
好ましくは、上で同定される位置のうちの１つ以上での変更を含む変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較して、洗剤等のキレート剤を含む組成物、好ましくは液体洗剤における増加した安定性を有する。
したがって、本発明による変異体は、好ましい実施形態において、１つ以上のキレート剤の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。好ましい態様において、本発明による変異体は、１つ以上のキレート剤及び低カルシウム濃度の存在下で、その親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有する。更に好ましい態様では、本発明による変異体は、キレート剤の存在下でその親アミラーゼと比較して、改善された安定性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
特定の態様において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換と、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３８、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での置換と、を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当し、変異体は、キレート剤の存在下で、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を更に有し、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、以下に記載されるように２１℃及びｐＨ ８．０で、残存活性が、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｋアッセイ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。好ましい実施形態では、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも２つの欠失は、１８１＊＋１８２＊、１８１＊＋１８３＊、１８２＊＋１８３＊、１８１＊＋１８４＊、１８２＊＋１８４＊及び１８３＊＋１８４＊からなる群から選択される。
別の特定の態様において、変異体は、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、位置は、配列番号６の成熟ポリペプチドの位置に相当し、変異体は、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を更に有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼの残存活性と比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｋアッセイ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ＤＴＰＡの存在下で、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
本発明による変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、強力なキレート剤に対してより安定するという利点を有するが、同時に、それらは、洗浄性能又は食器洗浄性能等の親アルファ−アミラーゼの性能性質を維持している。好ましい実施形態において、本発明による変異体は、キレート剤に対してより安定するという利点を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。これらの好ましいキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ及びこれらの混合物から選択され得るが、それらに制限されない。
したがって、本発明において有用な変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、金属イオン、具体的には、カルシウムイオンに結合するキレート剤の存在下で、増加した安定性を有する。洗濯プロセスの有益な効果のため、通常、洗剤にキレート剤を包含するが、増加した安定性は、フィチン酸塩又はクエン酸塩等の天然キレート剤を含む植物原料が存在する条件においても明らかであり得る。具体的には、強力なキレート剤は、カルシウムイオンのために、カルシウム感受性のアルファ−アミラーゼと競合し、アルファ−アミラーゼの安定性又は活性が減少するという結果を伴って、それらの構造において結合されるカルシウムイオンのために、アルファ−アミラーゼをある程度欠乏させることができる。
したがって、本発明の変異体は、それらの親アルファ−アミラーゼと比較して、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ及びこれらの混合物等のキレート剤の存在下で、改善された安定性及び／又は活性を有する。
親アルファ−アミラーゼと比較した、キレート剤に対して増加した安定性に加えて、本発明の変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較したとき、保持又は改善された洗浄性能を有する。改善された洗浄性能は、「材料及び方法」に記載されるようにビーカーを用いて、ＡＭＳＡ又は洗浄性能試験において測定され得る。
したがって、本発明の特定の実施形態では、変異体は、残存活性が、キレート剤の存在下で、（「材料及び方法」に記載の）ＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、少なくとも７０％の残存活性、好ましくは少なくとも７５％の残存活性、好ましくは少なくとも８０％の残存活性、好ましくは少なくとも８５％の残存活性、好ましくは少なくとも９０％の残存活性、好ましくは少なくとも９５％の残存活性を有するか、あるいは親アルファ−アミラーゼ残存活性と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｐｐ改善された残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、以下に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、変異体は、「材料及び方法」に記載されるようにビーカーを用いて、ＡＭＳＡ又は洗浄性能試験において測定されるとき、親アルファ−アミラーゼと比較して、少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の改善された洗浄性能を更に有する。
本発明の好ましい態様において、組成物は、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤の存在下で、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも１００％の残存活性を有する変異体を含み、１０ｍＭ未満、好ましくは９．５ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、好ましくは８．５ｍＭ未満、好ましくは８ｍＭ未満、好ましくは７．５ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６．５ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５．５ｍＭ未満、好ましくは、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４．５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、好ましくは３．５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満、好ましくは２．５ｍＭ未満、好ましくは２ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、実施例２ａに記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、並びに残存活性が、「材料及び方法」に記載のＥｎｚＣｈｅｋ又はＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後に決定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
したがって、本発明の特定の態様において、組成物は、リン含有、非リン含有、窒素含有、又は非窒素含有キレート剤からなる群から選択されるキレート剤を含み、好ましくは、キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ及びこれらの混合物である。
好ましい態様において、本発明による変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の更なる一態様では、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を更に含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様において、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１つ以上の１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３又は２４３位での置換、及び１つ以上の１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８位での置換を含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様において、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１つ以上の１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３又は２４３位での置換、及び１つ以上の１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８位での置換を更に含み、変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一態様では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する配列のうちのいずれかであり得る親アルファ−アミラーゼと比較して、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、１０置換未満、例えば９置換未満、例えば８置換未満、例えば７置換未満、例えば６置換未満、例えば５置換未満、例えば４置換未満、例えば３置換未満、例えば２置換未満であり、並びに／あるいは欠失の数は、１０欠失未満、例えば９欠失未満、例えば８欠失未満、例えば７欠失未満、例えば６欠失未満、例えば５欠失未満、例えば４欠失未満、例えば３欠失未満、例えば２欠失未満、例えば１欠失未満であるか、あるいは変異体は、欠失を含まない場合もあり、並びに／あるいは挿入の数は、１０挿入未満、例えば９挿入未満、例えば８挿入未満、例えば７挿入未満、例えば６挿入未満、例えば５挿入未満、例えば４挿入未満、例えば３挿入未満、例えば２挿入未満、例えば１挿入未満であるか、あるいは変異体は、挿入を含まない場合もある。
一態様では、変異体は、１９３位に相当する位置での置換を含む。別の態様では、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの［Ｇ、Ａ、Ｔ又はＭ］を有する１９３位に相当する位置での置換を含む。特定の一実施形態において、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｓ１９３Ｔを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１９５位での置換を含み、好ましい態様では、変異体は、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９５位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆを含み、親は、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位での置換としてＹを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９５位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆを含み、親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位での置換としてＹを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｙを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１９７位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、１９７位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９７位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｎ１９７Ｆを含み、親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９７位での置換としてＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９７Ｌを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９７位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、１９７位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９７位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｎ１９７Ｆを含み、親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９７位での置換としてＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９７Ｌを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１９８位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、１９８位での、［Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ又はＨ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９８位でＮを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ１９８Ｎを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８、２０又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９８位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、１９８位での、［Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ又はＨ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、１９８位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ１９８Ｎを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２００位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２００位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２００位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２００Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２００位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２００位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２００位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２００Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２０３位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２０３位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２０３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０３位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２０３位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２０３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２０６位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、Ｄ又はＥ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２０６位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、２０６位でＹを含み、更に別の態様では、変異体は、２０６位でＬを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
特定の一実施形態において、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｙを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｙを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｆを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｆを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｌを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｌを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｈを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｈを含む。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０６位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、Ｄ又はＥ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２０６位でＦを含み、別の好ましい態様では、変異体は、２０６位でＹを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｙを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｙを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｌを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｌを含む。
特定の一実施形態において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｈを含む。別の特定の実施形態では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６Ｈを含む。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２１０位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１０位でＹを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｈ２１０Ｙを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２１０位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１０位でＹを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｈ２１０Ｙを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２１２位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２１２位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１２位でＶを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｅ２１２Ｖを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２１２位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２１２位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１２位でのＶを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｅ２１２Ｖを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２１３位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２１３位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１３位でＡを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｖ２１３Ａを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２１３位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２１３位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２１３位でＡを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｖ２１３Ａを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、２４３位での置換を含み、好ましい態様において、変異体は、２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２４３位でＦを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２４３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
一態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２４３位での置換を更に含み、好ましい態様において、変異体は、２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含み、別の好ましい態様では、変異体は、２４３位でＡを含み、更に別の好ましい態様では、変異体は、置換Ｙ２４３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｍ又はＱ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での置換として、それぞれ、Ｔ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での置換として、それぞれ、Ｔ及びＹを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３位及び１９５位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３位及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｍ又はＱ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での置換として、それぞれ、Ｔ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９３位及び１９５位での置換として、それぞれ、Ｔ及びＹを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６の成熟ポリペプチドの置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、１９５位及び１９８位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び１９８位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ又はＱ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び１９８位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＮを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ１９８Ｎを含み、親は、配列番号６、８、１０、又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び１９８位での置換として、それぞれ、Ｙ及びＮを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ１９８Ｎを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６の番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び１９８位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び１９８位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ又はＱ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び１９８位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＮを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ１９８Ｎを更に含み、親は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び１９８位での置換として、それぞれ、Ｙ及びＮを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ１９８Ｎを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位及び２０６位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２０６位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ及びＩ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ又はＨ］を含む。別の態様では、変異体は、１９５及び２０６での置換として、それぞれ、Ｙ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ、Ｎ］を含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２０６位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２０６位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ及びＶ２０６［Ｆ又はＹ］を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２０６位での置換として、それぞれ、Ｙ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位及び２１０位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２１０位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＹを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙを含み、親は、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び２１０位での置換として、Ｙを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｈ２１０Ｙを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２１０位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２１０位での置換として、それぞれ、Ｆ及びＹを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１８は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び２１０位に相当する位置での置換として、Ｙを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｈ２１０Ｙを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９８位及び２０６位に相当する位置での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９８位及び２０６位での、［Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９８位及び２０６位での置換として、それぞれ、Ｎ及び［Ｆ又はＹ］を含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９８位及び２０６位に相当する位置での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９８位及び２０６位での、［Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９８位及び２０６位での置換として、それぞれ、Ｎ及び［Ｆ又はＹ］を含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｙ１９８Ｎ＋Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］を更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、２０６位及び２１３位での置換を含む。
別の態様では、変異体は、２０６位及び２１３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、２０６位及び２１０位での置換として、それぞれ、［Ｆ又はＹ］及びＡを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６Ｆ又はＹ＋Ｖ２１３Ａを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｖ２１３Ａを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０６位及び２１３位での置換を更に含む。
別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０６位及び２１３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、２０６位及び位２１０での置換として、それぞれ、［Ｆ又はＹ］及びＡを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｖ２１３Ａを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｖ２１３Ａを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｆ及びＹ２４３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２４３位に相当する位置での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位及び２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９５位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、２０６位及び２４３位での、［Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、それぞれ、２０６位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、２０６位及び２４３位での、［Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、それぞれ、２０６位及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位に相当する位置での置換として、それぞれ、Ｔ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｆ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｌを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位に相当する位置での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｆを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位に相当する位置での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｙ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｌを含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３位、１９５位、及び１９７位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換として、それぞれ、Ｔ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｆを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｆ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｎ１９７Ｌを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｆを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。別の態様では、変異体は、１９３位、１９５位、及び１９７位での置換として、それぞれ、Ｔ、Ｙ及びＬを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、置換Ｓ１９３Ｔ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｎ１９７Ｌを更に含み、親アルファ−アミラーゼは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２２、好ましくは、配列番号６、８、１０又は１２を有する成熟ポリペプチドのうちのいずれかである。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｎ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｎ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｈ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｈ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｆ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｆ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。別の態様では、変異体は、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｙ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｌ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｎ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｎ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｎ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｈ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｈ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｈ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
別の態様では、親アルファ−アミラーゼの変異体は、配列番号６による番号付けを用いて、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５位、２０６位及び２４３位での、［Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＨ］での置換を更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｆ、Ｆ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｆ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１９５位、２０６位、及び２４３位での置換として、それぞれ、Ｙ、Ｆ及びＦを含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号６又は１２の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。別の態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、配列番号８又は１０の成熟ポリペプチドの置換Ｎ１９５Ｙ＋Ｉ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆを更に含む。
本発明の一態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、以下の置換Ｎ１９５［Ｆ若しくはＹ］、Ｎ１９７［Ｆ若しくはＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｉ２０６［Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｆ若しくはＹ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ若しくはＧ］、Ｖ２１３Ａのうちの１つ以上と、配列番号１０の成熟ポリペプチド配列の１つ以上の位置Ｍ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｎ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｙ２４３Ｆ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｒ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖでの置換、あるいは配列番号１０を有するアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、更に特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、以下の置換Ｎ１９５［Ｆ若しくはＹ］、Ｎ１９７［Ｆ若しくはＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｉ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ若しくはＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ若しくはＧ］、Ｖ２１３Ａ、又はＹ２４３Ｆのうちの１つ以上と、配列番号８の成熟ポリペプチド配列の１つ以上の位置Ｍ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｔ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｎ１７４Ｒ、Ｇ１８６Ｒ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｒ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖでの置換、あるいは配列番号８を有するアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、更に特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、以下の置換Ｎ１９５［Ｆ若しくはＹ］、Ｎ１９７［Ｆ若しくはＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ若しくはＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ若しくはＧ］、Ｖ２１３Ａ、又はＹ２４３Ｆのうちの１つ以上と、配列番号６の成熟ポリペプチド配列の１つ以上の位置Ｉ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｑ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｋ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖでの置換、あるいは配列番号６を有するアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、更に特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、以下の置換Ｎ１９５［Ｆ若しくはＹ］、Ｎ１９７［Ｆ若しくはＬ］、Ｙ１９８Ｎ、Ｙ２００Ｆ、Ｙ２０３Ｆ、Ｖ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ若しくはＮ］、Ｈ２１０Ｙ、Ｅ２１２［Ｖ若しくはＧ］、Ｖ２１３Ａ、又はＹ２４３Ｆのうちの１つ以上と、配列番号１２の成熟ポリペプチド配列の１つ以上の位置Ｉ１１６Ｔ、Ｑ１２９Ｌ、Ｇ１３３Ｅ、Ｅ１３４Ｙ、Ｋ１４２Ｒ、Ｐ１４６Ｓ、Ｇ１４７Ｅ、Ｇ１４９Ｒ、Ｎ１５１Ｒ、Ｙ１５２Ｈ、Ｑ１６９Ｅ、Ｑ１７４Ｒ、Ａ１８６Ｒ、Ｓ２４４Ｑ、Ｇ３０３Ｖ、Ｋ３２０Ｎ、Ｒ３５９Ｉ、Ｎ４１８Ｄ、Ａ４４７Ｖでの置換、あるいは配列番号１２を有するアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、特に好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９１％、特に好ましくは少なくとも９２％、特に好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、更に特により好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
したがって、本発明の一態様は、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体を含む組成物に関し、
（ａ）（１つ又は複数の）変更は、独立して、
（ｉ）その位置のすぐ下流でのアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び／又は
（ｉｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
（ｂ）変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
したがって、本発明の一態様は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での変更と、を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７及び４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体に関し、
（ａ）（１つ又は複数の）変更は独立して、
（ｉ）その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び／又は
（ｉｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
（ｂ）変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
好ましくは変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６、好ましくは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のうちの１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び更に最も好ましくは少なくとも約９７％程度の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、上で同定された位置のうちの１つ以上での変更を含む変異体は、親アルファ−アミラーゼと比較して、洗剤、好ましくは液体洗剤において増加した安定性を有する。
本発明者は、これらの変異体が、親アルファ−アミラーゼと比較して、キレート剤を含む組成物において、改善された安定性を有することを見出しており、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、「材料及び方法」に記載されるように、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
したがって、本発明の別の態様は、以下：
（ａ）アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドのアミノ酸配列を提供する工程、
（ｂ）配列番号６の成熟ポリペプチドの１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３位に相当する１つ以上の位置を占有する１つ以上のアミノ酸を選択し、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８，４３１、４３４、４４７、４５８位に相当する１つ以上の位置を更に選択する工程、
（ｃ）選択されたアミノ酸残基を置換若しくは欠失することによって、又は選択されたアミノ酸残基に下流で隣接した１つ以上のアミノ酸残基を挿入することによって、配列を修飾する工程、
（ｄ）修飾された配列を有する変異体ポリペプチドを産生する工程、
（ｅ）変異体ポリペプチドを、アミラーゼ活性及び安定性について試験する工程、及び
（ｆ）親ポリペプチドと比較して、キレート剤の存在下で、アミラーゼ活性及び増加した安定性を有する変異体ポリペプチドを選択する工程を含むポリペプチドを調製するための方法に関し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤は、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる。
好ましくは、変異体は、３つの位置、より好ましくは４つの位置、更により好ましくは５つの位置、及び最も好ましくは６つの位置での変更を含み、特に好ましい実施形態では、変異体は、（配列番号６による番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、更に１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される親アルファ−アミラーゼにおける位置に相当する１つ以上の位置での１つ以上の置換と、を含む。
したがって、好ましい態様は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失と、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での変更と、を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１３４、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８，４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含む親アルファ−アミラーゼの変異体に関し、
（ａ）（１つ又は複数の）変更は独立して、
（ｉ）その位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の欠失、及び／又は
（ｉｉｉ）その位置を占有するアミノ酸の置換であり、
（ｂ）変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、
（ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する。
好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、１つ以上の（いくつかの）アミノ酸欠失及び／又は置換及び／又は挿入を有する。特に好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、本明細書において配列番号６に示されるアミノ酸配列を有し、以下の変更：Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊（１８３位及び１８４位での欠失）を更に含むアルファ−アミラーゼを含み、この変異体は、キレート剤の存在下で、洗剤における良好な性能及び改善された安定性を示す。
好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊のうちのいずれかを含む、ＳＰ７０７（配列番号８）を含む。
別の好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のうちのいずれかを含む、ＳＰ７２２（配列番号６）を含む。
更に別の好ましい実施形態では、変異体アルファ−アミラーゼは、ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のうちのいずれかを含む、ＡＡ５６０（配列番号１０）を含む。
別の好ましい実施形態では、親アルファ−アミラーゼは、ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊のうちのいずれかを含む、ＳＰ６９０（配列番号１２）を含む。
「ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊」は、バチルス種アルファ−アミラーゼＳＰ７２２が位置Ｒ１８１＋Ｇ１８２における欠失によって変異されたことを意味し、番号付けは、配列番号６に相当する。
したがって、本発明の一態様では、変異体アルファ−アミラーゼは、以下のうちのいずれかを含む、ＳＰ７２２、ＳＰ６９０、ＳＰ７０７、又はＡＡ５６０のうちの任意の１つを含む：
ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊、ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊＋Ｄ１８３＊、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；
ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｈ４５８Ｋ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ；
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；
ＡＡ５６０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｔ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ
ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１８１Ｑ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１８１Ｑ；
ＳＰ７０７＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；
ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊、ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ、Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｍ２０２Ｌ；
ＳＰ６９０＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｍ２０２Ｌ；
ＳＰ６９０ ＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０ ＋Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０ ＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ。
「ＳＰ７２２＋Ｒ１８１＊ Ｇ１８２＊ Ｎ１９５Ｆ」は、バチルス種アルファ−アミラーゼＳＰ７２２が、位置Ｒ１８１＋Ｇ１８２での欠失及び１９５位でのＡｓｎ（Ｎ）からＰｈｅ（Ｆ）への置換によって変異されたことを意味し、番号付けは、配列番号６に相当する（欠失した位置が依然として存在するかのように計数する。すなわち、２つの位置を欠失するときに、番号付けが２つの位置によってシフトダウンしない）。
本発明の特定の好ましい実施形態では、変更は、以下の置換から選択される：
Ｘ１９３Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＳ１９３Ｔ、
Ｘ１９５Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＮ１９５［Ｆ又はＹ］、
Ｘ１９７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＮ１９７［Ｆ又はＬ］、
Ｘ１９８Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＹ１９８Ｎ、
Ｘ２００Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＹ２００Ｆ、
Ｘ２０３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＹ２０３Ｆ、
Ｘ２０６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＶ２０６［Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｈ又はＮ］、
Ｘ２１０Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＨ２１０Ｙ、
Ｘ２１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＥ２１２［Ｖ又はＧ］、及び
Ｘ２１３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、好ましくはＶ２１３Ａ、
Ｘ２４３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＹ２４３Ｆ。
別の好ましい実施形態では、変異体は、３つの位置、より好ましくは４つの位置、より好ましくは５つの位置、及びより好ましくは６つの位置での変更を含み、特に好ましい実施形態では、変異体は、（配列番号６による番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更と、１１６、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２４３、２４４、３０３、３２０、３５９、４１８、４４７からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更と、を更に含む。
したがって、本発明の特定の好ましい実施形態では、変更は、以下の置換から選択される：
Ｘ１１６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＮ１１６Ｔ
Ｘ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＲ１１８Ｋ
Ｘ１２９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＱ１２９Ｌ
Ｘ１３３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＧ１３３Ｅ
Ｘ１３４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＤ１３４Ｙ
Ｘ１４２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＫ１４２Ｒ
Ｘ１４６Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＰ１４６Ｓ
Ｘ１４７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＧ１４７Ｅ
Ｘ１４９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＧ１４９Ｒ
Ｘ１５１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＴ１５１Ｒ
Ｘ１５２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＹ１５２Ｈ
Ｘ１６９Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＱ１６９Ｅ
Ｘ１７４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＱ１７４Ｒ
Ｘ１８６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＡ１８６Ｒ
Ｘ２３５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＩ２３５Ｎ
Ｘ２４３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＹ２４３Ｆ
Ｘ２４４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＳ２４４Ｑ
Ｘ３０３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＧ３０３Ｖ
Ｘ３２０Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＫ３２０Ｎ
Ｘ３３９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＳ３３９Ｐ
Ｘ３５９Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＲ３５９Ｉ
Ｘ４１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＮ４１８Ｄ
Ｘ４３１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＳ４３１Ｔ
Ｘ４３４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＰ４３４Ｔ
Ｘ４４７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＡ４４７Ｖ
Ｘ４５８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、好ましくはＲ４５８Ｋ。
特定の好ましい実施形態において、変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を更に含む。
好ましい実施形態では、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、好ましくは１７置換、より好ましくは１６置換、より好ましくは１５置換、より好ましくは１４置換、より好ましくは１３置換、より好ましくは１２置換、より好ましくは１１置換、より好ましくは１０置換、より好ましくは９置換、より好ましくは８置換、より好ましくは７置換、より好ましくは６置換、より好ましくは５置換、より好ましくは４置換、更により好ましくは３置換、及び最も好ましくは２置換である。別の好ましい実施形態では、本発明の変異体におけるアミノ酸置換の数は、好ましくは１７置換、より好ましくは１６置換、より好ましくは１５置換、より好ましくは１４置換、より好ましくは１３置換、より好ましくは１２置換、より好ましくは１１置換、より好ましくは１０置換、より好ましくは９置換、より好ましくは８置換、より好ましくは７置換、より好ましくは６置換、より好ましくは５置換、より好ましくは４置換、更により好ましくは３置換、及び最も好ましくは２置換からなる。
具体的には、好ましい実施形態において、本発明による変異体は、異なる変更の組み合わせを含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明による変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失、好ましくは、１８３位及び１８４位での欠失を含み、１８６位及び１９５位での変更置換の以下の組み合わせ：１７４位及び２１２位での置換、２０６位及び２１２位での置換、２０６位、２１２位及び３０４位での置換、２０６位、２１２位、３０４位及び４４７位での置換、１１６位及び１３３位での置換、２３５位及び３３９位での置換、１９３位及び２０６位での置換、１１６位、１３３位及び１４２位での置換、１１６位、１３３位、１４２位及び１９８位での置換、１１６位、１３３位、１４２位、１９８位及び２０６位での置換、１３３位及び１９５位での置換、１３３位、１９５位及び１９８位での置換、１３３位、１９５位、１９８位及び２００位での置換、１１６位及び１９５位での置換、１１６位、１９５位及び１９８位での置換、１４２及び１４６位での置換、１４２位、１４６位及び１４９位での置換、１４２位、１４６位、１４９位及び１９５位での置換、１４２位、１４６位、１４９位、１９５位及び１９８位での置換、１４２位、１４６位、１４９位、１９５位、１９８位及び２０６位での置換、１５１及び２１０位での置換、１５１位、２１０位及び３２０位での置換、１８６位、１９５位、２１２位及び２１３位での置換、１５１位、２１０位、３２０位及び３５９位での置換、１５１位、２１０位、３２０位、３５９位及び４１８位での置換、１４７位及び１４９位での置換、１４７位、１４９位及び１６９位での置換、１４７位、１４９位、１６９位及び１９８位での置換、１４７位、１４９位、１６９位、１９８位及び２０３位での置換、１４７位、１４９位、１６９位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１３３位及び１４９位での置換、１３３位、１４９位及び１９５位での置換、１３３位、１４９位、１９５位及び１９８位での置換、１３３位、１４９位、１９５位、１９８位及び２０３位での置換、１４７位及び１５２位での置換、１４７位、１５２位及び１６９位での置換、１４７位、１５２位、１６９位及び１９８位での置換、１４７位、１５２位、１６９位、１９８位及び２０６位での置換、１９５位及び２０６位での置換、１９５位及び２４３位での置換、１９５位及び２１０位での置換、２０６位及び２１０位での置換、１８６位及び１９５位での置換、１９５位及び２０６位での置換、１９５位、２０６位及び２４３位での置換、２０６位及び２４３位での置換、１３３位及び１４９位での置換、１３３位、１４９位及び１９８位での置換、１３３位、１４９位、１９８位及び２０６位での置換、１１６位及び１３３位での置換、１１６位、１３３位及び１４７位での置換、１１６位、１３３位、１４７位及び１５２位での置換、１１６位、１３３位、１４７位、１５２位及び１９８位での置換、１１６位、１３３位、１４７位、１５２位、１９８位及び２０３位での置換、１１６位、１３３位、１４７位、１５２位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１４７位及び１４９位での置換、１４７位、１４９位及び１９５位での置換、１４７位、１４９位、１９５位及び１９８位での置換、１４７位、１４９位、１９５位、１９８位及び２０６位での置換、１３３位及び１４２位での置換、１３３位、１４２位及び１９５位での置換、１３３位、１４２位、１９５位及び１９８位での置換、１３３位及び１４９位での置換、１３３位、１４９位及び１５２位での置換、１３３位、１４９位、１５２位及び１９５位での置換、１３３位、１４９位、１５２位、１９５位及び１９８位での置換、１３３位、１４９位、１５２位、１９５位、１９８位及び２０６位での置換、１１６位及び１２９位での置換、１１６位、１２９位及び１４２位での置換、１１６位、１２９位、１４２位及び１９５位での置換、１１６位、１２９位、１４２位、１９５位及び１９８位での置換、１１６位、１２９位、１４２位、１９５位、１９８位及び２０３位での置換、１１６位、１２９位、１４２位、１９５位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１３３位及び１４９位での置換、１３３位、１４９位及び１５２位での置換、１３３位、１４９位、１５２位及び１９５位での置換、１３３位、１４９位、１５２位、１９５位及び１９８位での置換、１３３位、１４９位、１５２位、１９５位、１９８位及び２０３位での置換、１３３位、１４９位、１５２位、１９５位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１１６位及び１３３位での置換、１１６位、１３３位及び１４９位での置換、１１６位、１３３位、１４９位及び１９８位での置換、１１６位、１３３位、１４９位、１９８位及び２０３位での置換、１１６位、１３３位、１４９位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１９５位及び１９８位での置換、１９５位、１９８位及び２０３位での置換、１９５位、１９８位、２０３位及び２０６位での置換、１３３位、１４９位、１９５位、２０３位及び２０６位での置換のうちの１つを更に含む。
別の特定の好ましい実施形態では、本発明による変異体は、異なる変更の組み合わせを含む。したがって、好ましい実施形態では、本発明による変異体は、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失、好ましくは、１８３位及び１８４位での欠失を含み、１８６位での、［Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ］での変更置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での変更置換の以下の組み合わせのうちの１つを更に含む：１７４位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ］での置換、及び２１２位での置換、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；２０６位での、［Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換、及び２１２位での［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換、２１２位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び３０４位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換、２１２位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、３０４位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び４４７位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換；２３５位での、［Ｎ又はＬ］での置換、及び３３９位での、［Ｐ］での置換；１９３位での、［Ｇ、Ａ、Ｔ又はＭ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、又はＨ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１８６位での、［Ｒ、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、又はＶ］での置換、２１２位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、又はＶ］での置換、及び２１３位での、［Ａ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２００位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１４６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換；１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１４６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１４６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１４６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１４６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１５１位及び２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１５１位、２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び３２０位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１５１位、２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、３２０位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び３５９での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１５１位、２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、３２０位での、［Ｑ又はＮ］での置換、３５９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び４１８位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１６９位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換、及び２１０位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１８６位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、２０６及び２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；２０６位及び２４３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位及び２０６位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１４７位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位及び２０６位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位及び２０６位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１２９位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１４２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１５２位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、及び１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、及び１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１１６位での、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］での置換、１３３位での、［Ｅ又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、及び２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換；１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、１９８位での、［Ｑ又はＮ］での置換、２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ又はＨ］での置換；１３３位での、［Ｅ、又はＤ］での置換、１４９位での、［Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｑ又はＮ］での置換、１９５位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、又はＶ］での置換、２０３位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、又はＶ］での置換、及び２０６位での、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、又はＨ］での置換。
本発明における特定の有用な変異体は、（配列番号６の番号付けを用いて）以下を含む：
Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ｓ３３９Ｐ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；Ｎ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；Ｄ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ Ｑ４９０Ｈ；Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ、Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ。
好ましい実施形態では、本発明において有用な変異体は、以下を含む：
ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ７２２ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ｓ３３９Ｐ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７２２＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ７２２＋Ｄ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＳＰ７２２＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ。
好ましい一実施形態において、変異体は、以下から選択される：ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｎ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｈ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ。
別の好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む：
ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ４３４Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ、ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７０７＋Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ７０７＋Ｅ１３４Ｙ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ７０７＋ Ｔ１５１Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｒ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ ；ＳＰ７０７＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１４７Ｅ Ｑ１６９Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ７０７ ；ＳＰ７０７＋Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｈ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｈ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ７０７＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ。
好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む：
ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ４３４Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｒ、Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＡＡ５６０＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｉ；ＡＡ５６０＋Ｅ１３４Ｙ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｔ１５１Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｒ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ、ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｍ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｄ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｉ２０６Ｙ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ。
好ましい実施形態では、本発明による変異体は、以下を含む：
ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９７Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ２７７Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ４３１Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｐ４３４Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２３５Ｎ Ａ３３９Ｐ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｌ３５１Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｄ Ｎ１９５Ｆ Ｅ２１２Ｖ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｒ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ Ｑ１７４Ｒ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｅ２１２Ｖ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｅ２１２Ｇ Ｇ３０４Ｖ Ａ４４７Ｖ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２００Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ６９０＋Ｋ１４２Ｒ Ｐ１４６Ｓ Ｇ１４９Ｋ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｉ；ＳＰ６９０＋Ｅ１３４Ｙ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊；ＳＰ６９０＋Ｎ１５１Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｈ２１０Ｙ Ｋ３２０Ｎ Ｒ３５９Ｉ Ｎ４１８Ｄ；ＳＰ６９０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｑ１６９Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｑ１６９Ｅ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｉ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２１３Ａ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ａ１８６Ｔ Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｄ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４７Ｅ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１４７Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｙ１９８Ｎ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｑ１２９Ｌ Ｋ１４２Ｒ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｙ１５２Ｈ Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｙ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｎ１１６Ｔ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｇ１８２＊ Ｔ１８３＊ Ｙ１９８Ｎ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｙ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ、ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｒ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１１８Ｋ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ Ｒ３２０Ｋ Ｒ４５８Ｋ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｎ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｈ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｖ２０６Ｆ Ｙ２４３Ｆ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｎ１９５Ｆ Ｖ２０６Ｌ Ｈ２１０Ｙ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｓ１９３Ｔ Ｖ２０６Ｌ；ＳＰ６９０＋Ｔ１８３＊ Ｇ１８４＊ Ｇ１３３Ｅ Ｇ１４９Ｒ Ｎ１９５Ｙ Ｙ２０３Ｆ Ｖ２０６Ｌ。
洗浄組成物
本発明は、好ましくは、消費者用又は業務用のエアケア、カーケア、食器洗浄、布地柔軟剤（軟化剤を含む）、洗濯洗浄力、洗濯及びリンス剤及び／又はケア、塗装面洗浄及び／又はトリートメント、並びに他の洗浄のための特許請求される組成物に関する方法及び／又はその使用のための製品に関する。本発明による、上述のアルファ−アミラーゼ変異体は、典型的には、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物又は食器洗浄洗剤組成物等の洗浄組成物中の構成要素であり得る。液体洗濯洗剤組成物が特に好ましい。
そのような洗浄組成物は、上で定義されるようなキレート剤ではない洗浄／洗剤添加物を含み、好ましくは、構成要素の混合物を含む。典型的には、洗浄補助剤は、０．００１〜９９．９重量％、より典型的には、０．０１〜８０重量％の洗浄補助剤の量で構成要素の混合物中に存在する。好適な洗浄補助剤は、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白触媒、着色剤、漂白ブースター、染料移行剤、沈着補助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒物質、漂白活性剤、過酸化水素、過酸化水素源、蛍光増白剤、光活性剤、蛍光剤、布地色相剤、布地柔軟剤、予備形成過酸、ポリマー分散剤、粘土質土壌除去／再付着防止剤、充填塩、ハイドロトロープ、光沢剤、石鹸泡抑制剤、構造伸縮剤、布地軟化剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、殺菌剤、防カビ剤、変色防止剤、防食剤、アルカリ度源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、染料、香料並びにｐＨ調整剤を含む。例えば、これらは、イミン漂白ブースター等の漂白成分；過炭酸塩及び／又は過ホウ酸塩等の過酸化水素源、特に炭酸塩及び／又は硫酸塩等の材料でコーティングされた過炭酸塩、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、及びこれらの任意の混合物；カプセル形態の予備過酸を含む予備過酸；遷移金属触媒；シリコーンベースの石鹸泡抑制剤及び／又は脂肪酸ベースの石鹸泡抑制剤等の石鹸泡抑制剤又は抑制剤系；粘土、シリコーン及び／又は四級アンモニウム化合物等の布地柔軟剤；ポリエチレンオキシド等の凝集剤；ポリビニルピロリドン、ポリ４−ビニルピリジンＮ−オキシド、並びに／又はビニルピロリドン及びビニルイミダゾールのコポリマー等の染料移行阻害剤；イミダゾール及びエピクロルヒドリンの縮合によって産生されるオリゴマー等の布地統合成分；エトキシ化ポリアミン及びエトキシ化エチレンイミンポリマー等の土壌分散剤及び土壌再付着防止補助剤；ポリエステル等の再付着防止成分；マレイン酸ポリマー等のカルボン酸ポリマー又はマレイン酸及びアクリル酸のコポリマー；香料マイクロカプセル、デンプンカプセル型調和剤、スプレー式香料等の香料；石鹸リング；美的粒子；染料；硫酸ナトリウム等の充填材（組成物が充填材を実質的に含まないことが好ましいが）；１．６Ｒ及び２．０Ｒケイ酸ナトリウムを含むケイ酸ナトリウム等のケイ酸塩、又はメタケイ酸ナトリウム；ジカルボン酸及びジオールのコポリエステル；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエトキシセルロース、又は他のアルキル若しくはアルキルアルコキシセルロース等のセルロースポリマー；１，２プロパンジオール、モノエタノールアミン等の溶媒；ジエチレングリコール、エタノール、及びこれらの任意の混合物；クメンスルホン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、及びこれらの任意の混合物等のヒドロトロープ；クエン酸等の有機酸；並びにこれらの任意の組み合わせを含み得る。
別の好ましい態様では組成物は、非イオン性を含む半極性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は両性イオン性及び／又は両性及び／又は半極性非イオン性及び／又はこれらの混合物であり得る１つ以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、典型的には、０．１重量％〜６０重量％又は０．５〜５０重量％又は１〜４０重量％の組成物のレベルで存在する。
それに含まれるとき、洗浄組成物は、通常、線状アルキルベンゼンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート、アルキルサルフェート（高級アルコール硫酸エステル塩）、アルコールエトキシサルフェート、二級アルカンスルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸等の約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤を含有する。
それに含まれるとき、洗浄剤は、通常、アルコールエトキシレート、ノニル−フェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミン−オキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミン、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）等の約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤を含有する。
洗浄組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素、例えば、別のアルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトース生成アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ及び／若しくはセルラーゼ、マンナナーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，ＤｅｎｍａｒｋのＭＡＮＮＡＷＡＹ（商標）等）、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、並びに／又はラッカーゼ等の１つ以上の他の酵素を含み得る。
概して、選択された（１つ又は複数の）酵素の性質は、選択された洗剤と適合すべきであり（すなわち、ｐＨ最適条件、他の酵素及び非酵素成分との適合性等）、（１つ又は複数の）酵素は、有効量で存在すべきである。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、サブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）などの、中性又はアルカリ性の微生物セリンプロテアーゼを含めた、メタロプロテアーゼ及び／又はセリンプロテアーゼが挙げられる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物起源のものが挙げられる。一態様では、そのような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものとすることができる。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの、化学修飾された又は遺伝子組み換えされた、突然変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどの、セリンプロテアーゼとすることができる。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、米国特許第５，６７９，６３０号、米国特許第４，７６０，０２５号、米国特許第７，２６２，０４２号、及び国際公開第０９／０２１８６７号に記載のバチルス・レンタス、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・サブティリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス及びバチルス・ギブソニイ等のに由来するバチルスサブチリシンを含む、サブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）。
（ｂ）トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ（国際公開第８９／０６２７０号に記述されているフサリウムプロテアーゼ、及び同第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記述されているＣｅｌｌｕｍｏｎａｓに由来するキモトリプシンプロテアーゼを含む）。
（ｃ）メタロプロテアーゼ（国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記述されているＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓから誘導されたものを含む）。
好ましいプロテアーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｉｂｓｏｎｉｉ又はＢａｃｉｌｌｕｓ Ｌｅｎｔｕｓから誘導されたものが挙げられる。
好適な市販のプロテアーゼ酵素には、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）の商標名、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）、及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）で販売されているプロテアーゼ酵素、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの商標名、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）で販売されているプロテアーゼ酵素、Ｓｏｌｖａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓの商標名、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）で販売されているプロテアーゼ酵素、Ｈｅｎｋｅｌ／ Ｋｅｍｉｒａから入手可能なプロテアーゼ酵素、すなわち、ＢＬＡＰ（以下の変異：Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１ Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを伴う米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示される配列、以下、ＢＬＡＰと称される）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを伴うＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを伴うＢＬＡＰ）、及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを伴うＢＬＡＰ）（すべてＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａ）；並びにＫａｏのＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを伴うバチルス・アルカロフィルスサブチリシン）が含まれる。
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。有用なリパーゼの例には、フミコーラ（別名、サーモミセス）由来、例えば、欧州特許第２５８ ０６８号及び欧州特許第３０５ ２１６号に記載のフミコーラ・ラヌギノーサ（サーモミセス・ラノギノサス）由来又は国際特許第９６／１３５８０号に記載のフミコーラ・インソレンス由来のリパーゼ；例えば、シュードモナス・アルカリゲネス又はシュードモナス・シュードアルカリゲネス（欧州特許第２１８ ２７２号）、シュードモナス・セパシア（欧州特許第３３１ ３７６号）、シュードモナス・スツッツェリ（英国特許第１，３７２，０３４号）、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス種株ＳＤ ７０５（国際特許第９５／０６７２０号及び国際特許第９６／２７００２号）、シュードモナス・ウィスコンシネシス（国際特許第９６／１２０１２号）由来のシュードモナスリパーゼ；例えば、バチルス・サブティリス（Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１，２５３〜３６０）、バチルス・ステアロサーモフィルス（日本特許第６４／７４４９９２号）、又はバチルス・プミルス（国際特許第９１／１６４２２号）由来のバチルス・リパーゼが挙げられる。
リパーゼは、米国特許第６，９３９，７０２（Ｂ１）号及び米国特許第２００９／０２１７４６４号に記載のリパーゼ等の「第１のサイクルリパーゼ」であり得る。一態様では、リパーゼは、第一洗浄リパーゼ、好ましくは、Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ変異を含む、サーモミセス・ラノギノサス由来の野生型リパーゼの変異体である。野生型配列は、Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ Ｏ５９９５２の受け入れ番号Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｏ５９９５２の、（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）由来の）２６９個のアミノ酸（アミノ酸２３〜２９１）である。好ましいリパーゼは、商標名、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（登録商標）、及びＬｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）で販売されているリパーゼを含むであろう。セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号、同第５，６４８，２６３号、同第５，６９１，１７８号、同第５，７７６，７５７号、及び国際特許第８９／０９２５９号に開示のフミコーラ・インソレン、ミセリオフトラ・サーモフィラ、及びフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌性セルラーゼが含まれる。
セルラーゼ：好適なセルラーゼとしては、細菌由来又は真菌由来のセルラーゼが挙げられる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス属、シュードモナス属、フミコーラ属、フザリウム属、チエラビア属、アクレモニウム属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号、同第５，６４８，２６３号、同第５，６９１，１７８号、同第５，７７６，７５７号、及び国際特許第８９／０９２５９号に開示のフミコーラ・インソレン、ミセリオフトラ・サーモフィラ、及びフザリウム・オキシスポルムから産生される真菌性セルラーゼが含まれる。
特に好適なセルラーゼは、色彩維持利点のある（colour care benefits）アルカリ性セルラーゼ又は中性セルラーゼである。かかるセルラーゼの例は、欧州特許第０ ４９５ ２５７号、同第０ ５３１ ３７２号、国際公開特許第９６／１１２６２号、同第９６／２９３９７号、同第９８／０８９４０号に記載されたセルラーゼである。他の例は、国際公開特許第９４／０７９９８号、欧州特許第０ ５３１ ３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、同第５，６８６，５９３号、同第５，７６３，２５４号、国際公開特許第９５／２４４７１号、同第９８／１２３０７号及び国際出願第ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号に記載されたもののようなセルラーゼ変異体である。
市販のセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（登録商標）及びＣａｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（花王）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾された変異体又は改質されたタンパク質変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例には、コプリナス由来、例えば、国際特許第９３／２４６１８号、同第９５／１０６０２号、及び同第９８／１５２５７号に記載されるようなコプリナス・シネレウス及びその変異体由来のペルオキシダーゼが挙げられる。
市販のペルオキシダーゼには、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が含まれる。
他の酵素：他の好ましい酵素には、商標名、Ｐｅｃｔａｗａｓｈ（登録商標）、Ｐｅｃｔａｗａｙ（登録商標）で販売されているペクチン酸リアーゼ、及び商標名、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）（以上すべてＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、及びＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で販売されているマンナナーゼが含まれる。
（１つ又は複数の）洗剤酵素は、１つ以上の酵素を含有する別個の添加物を添加することによって、又はこれらの酵素のすべてを含む混合添加物を添加することによって、洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加物、すなわち、別個の添加物又は混合添加物は、例えば、粒状、液体、スラリー等に製剤化され得る。好ましい洗剤添加物製剤は、粒状、具体的には、非ダスティング粒状、液体、具体的には、安定化された液体、又はスラリーである。
非ダスティング粒状は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示されるように産生され得、当該技術分野において既知の方法で、任意でコーティングされ得る。ワックスコーティング材の例として、１０００〜２００００の平均分子量を有するポリ（エチレンオキシド）産物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニル−フェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する、エトキシ化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドがある。流動床技法による適用に好適なフィルム形成コーティング材の例は、英国特許第１４８３５９１号に定められている。液体酵素の調製は、例えば、実証されている方法に従って、プロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸などのポリオールを加えることにより安定化させることができる。被保護酵素は、欧州特許第２３８，２１６号に開示の方法に従って調製され得る。
組成物は、布地色相剤を含み得る。好適な布地色相剤には、好ましくは、以下の本明細書に記載の試験方法１の要件を満たす染料、染料粘土共役体、及び色素が含まれる。好適な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレット、及びベーシックレッドのカラーインデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に該当する染料、又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられ、例えば次のものが挙げられる。
（１）以下の式のトリス−アゾ系ダイレクトブルー染料
Figure 2013519757
 式中、ナプチル環Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも２つがスルホネート基で置換されており、環Ｃは５位をＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよく、Ｘは２つ以下のスルホネート基で置換されているベンジル又はナフチル環あり、２位をＯＨ基で置換してもよく、更にＮＨ２又はＮＨＰｈ基で置換してもよい。
（２）以下の式のビス−アゾ系ダイレクトバイオレット染料
Figure 2013519757
 式中、ＺはＨ又はフェニルあり、環Ａは矢印で示される位置が好ましくはメチル及びメトキシ基で置換されており、環Ａはナフチル環あってもよく、Ｙ基はベンジル又はナフチル環あり、サルフェート基で置換されており、メチル基により一又は二置換されてもよい。
（３）以下の式のブルー又はレッドアシッド染料
Figure 2013519757
 式中、Ｘ及びＹの少なくとも１つは芳香族基でなければならない。一態様では、芳香族基はいずれも置換ベンジル又はナフチル基であってよく、このベンジル又はナフチル基はアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよく、Ｘ及びＹはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換されなくてもよい。他の態様では、Ｘはニトロ基で置換されたベンジル基あり、Ｙはベンジル基ある。
（４）以下の構造のレッドアシッド染料
Figure 2013519757
 式中、Ｂはアルキル、アルキルオキシ、又はアリールオキシ基などの非水溶化基で置換されてもよいナフチル又はベンジル基であり、Ｂはスルホネート又はカルボキシレートなどの水溶化基で置換されなくてもよい。
（５）以下の構造のジアゾ染料、並びにそれらの対応する塩及び混合物：
Figure 2013519757
 式中、Ｘ及びＹはそれぞれ、相互から独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４−アルコキシであり、Ｒαは、水素又はアリールであり、Ｚは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、又はカルボキシルであり、ｎは、１又は２であり、ｍは、０、１又は２である。
（６）以下の構造のトリフェニルメタン染料
Figure 2013519757
Figure 2013519757
 及びこれらの混合物である。別の態様では、好適な小分子染料には、カラーインデックス（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＵＫ）番号ダイレクトバイオレット９、ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトバイオレット９９、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドバイオレット４９、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー４５、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０、及びアシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９並びにこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が含まれる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK））番号がアシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４５、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１及びこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。別の態様では、適切な小分子染料としては、カラーインデックス（染色業者及びカラーリスト協会（Society of Dyers and Colourists, radford, UK））番号が、アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３又はこれらの混合物からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。
好適な高分子染料には、共役色原体を含むポリマー（染料−ポリマー共役体）、ポリマーの骨格に共重合した色原体を有するポリマー及びこれらの混合物からなる群から選択される高分子染料が挙げられる。
他の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ、Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ、Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）の名称で市販されている布地直接着色剤、及び少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、１級アミン部分、２級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーから形成されている染料−ポリマー共役体が挙げられる。更に他の態様では、好適なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ、Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ、Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）バイオレットＣＴ、リアクティブブルー、リアクティブバイオレット又はリアクティブレッド染料ＣＭＣが共役されているものとしては、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（アイルランド、ウイックロー）からＡＺＯ−ＣＭ−セルロースの商品名、商品コードＳ−ＡＣＭＣで市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９、アルコキシル化トリフェニール−メタン重合着色料、アルコキシル化チオフェン重合着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。
適切な染料粘土共役体には、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。他の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のＣ．Ｉ．からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される粘土。更に別の態様では、好適な染料粘土共役体には、以下からなる群から選択される染料粘土共役体が含まれる：モンモリロナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体及びこれらの混合物。
好適な色素には、フラバントロン、インダントロン、１〜４個の塩素原子を含有する塩素化インダントロン、ピラントロン、ジクロロピラントロン、モノブロモジクロロピラントロン、ジブロモジクロロピラントロン、テトラブロモピラントロン、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基は、Ｃ１〜Ｃ３−アルキル又はフェニル又は複素環ラジカルによって非置換又は置換され得、フェニル及び複素環ラジカルは、水溶性を与えない置換基を更に担持し得る）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン、イソビオラントロン、ジオキサジン色素、１個の分子につき最大２個の塩素原子を含有する銅フタロシアニン、ポリクロロ銅フタロシアニン又は１個の分子につき最大１４個の臭素原子を含有するポリブロモクロロ銅フタロシアニン及びこれらの混合物からなる群から選択される色素が含まれる。
別の態様では、好適な色素には、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．色素ブルー２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．色素バイオレット１５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される色素が含まれる。
前述の布地色相剤は、組み合わせて使用することができる（布地色相剤の任意の混合物を使用することができる）。好適な布地色相剤を、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ；Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；ＢＡＳＦ，Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｄａｙｇｌｏ Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ；Ｏｒｇａｎｉｃ Ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒｈｏｄｅ Ｉｓｌａｎｄ，ＵＳＡ；Ｄｙｓｔａｒ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｌａｎｘｅｓｓ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ；Ｃｌａｒｉａｎｔ，Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；Ａｖｅｃｉａ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫから購入することができ、及び／又は本明細書に包含される実施例に従って作製することができる。好適な色調剤については、詳しくは米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
試験方法１
染料又は顔料物質が本発明の意図する布地色相剤であるかどうかを定義するための手順プロトコルを以下に記載する。
１．）２つのターゴトメーターポットを、８００ｍＬの英国ニューカッスルアポンタインの水（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａｎ Ｗａｔｅｒ，Ｐｉｔｙ Ｍｅ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｃｏ．Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫによって供給される、１米国ガロンにつき約１２グラムの全硬度）で充填する。
２）実験期間中、水温を３０℃に調整し、撹拌を４０ｒｐｍに設定して、ポットをターゴトメーターに挿入する。
３）各ポットにＩＥＣ−Ｂ洗剤（（ＩＥＣ ６０４５６ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｂａｓｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｔｙｐｅ Ｂ）、ｗｆｋ（Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から供給）を４．８ｇ加える。
４）２分後、第１のポットに活性着色剤を２．０ｍｇ加える。
５）１分後、５ｃｍ×５ｃｍの材料見本に切断した平坦な綿肌着（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫから供給）５０ｇを各ポットに加える。
６）１０分後、ポットを排水し、硬度１４．４（イギリスクラーク硬度）を有し、カルシウム対マグネシウムのモル比が３：１の冷水（１６℃）を再充填する。
７）２分間すすいだ後、布地を取り出す。
８）同じ処理を用いて更に３回のサイクルで工程３〜７を繰り返す。
９）布地を収集し、屋内で１２時間自然乾燥させる。
１０）Ｄ６５光源及びＵＶＡ遮断フィルタを取り付けたハンターミニスキャン（Hunter Miniscan）スペクトロメーターを使用して材料見本を分析し、ハンターａ（赤−緑軸）及びハンターｂ（黄−青軸）値を得る。
１１）各組の布地についてハンターａ及びハンターｂ値の平均値を計算する。着色剤で処理した評価対象布地がａ軸又はｂ軸のいずれかにおいて平均で０．２単位より大きい色相の差を示した場合、本発明の意図する布地色相剤であると判断される。
洗浄組成物は、ゼオライトＡ、ゼオライトＭＡＰ（最大アルミニウムＰ型）等のゼオライトであり得る炭酸塩、重炭酸塩又はケイ酸塩に基づくビルダー等のビルダーを更に含有し得る。洗濯に使用可能なゼオライトは、好ましくは、式Ｎａ１２（ＡｌＯ２）１２（ＳｉＯ２）１２・２７Ｈ２Ｏを有し、粒径は、通常、ゼオライトＡにおいて１〜１０μｍ、及びゼオライトＭＡＰにおいて０．７〜２ｕｍである。他のビルダーは、メタケイ酸ナトリウム（Ｎａ２ＳｉＯ３・ｎＨ２Ｏ又はＮａ２Ｓｉ２Ｏ５・ｎＨ２Ｏ）強アルカリ性であり、好ましくは、食器洗浄において使用される。好ましい実施形態では、洗剤ビルダーの量は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、又は５０％超であり得、また８０％未満、６５％未満であり得る。食器洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には、４０〜６５％、特に５０〜６５％、又は更には７５〜９０％である。
組成物は、カプセル剤を含み得る。一態様では、カプセル剤は、コア、内面及び外面を有するシェルを含み、前記シェルは、前記コアをカプセル化する。
前記カプセル剤の一態様では、前記コアは、以下からなる群から選択される材料を含み得る：香料、光沢剤、染料、防虫剤、シリコーン、ワックス、フレーバー、ビタミン、布地軟化剤、スキンケア剤、一態様では、パラフィン、酵素、抗菌剤、漂白剤、感覚剤、及びこれらの混合物、並びに前記シェルは、以下からなる群から選択される材料を含み得る：ポリエチレン、ポリアミド、ポリスチレン、ポリイソプレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート、アミノプラスト（一態様では、前記アミノプラストは、ポリ尿素、ポリウレタン、及び／又はポリ尿素ウレタンを含み得、一態様では、前記ポリ尿素は、ポリオキシメチレン尿素及び／又はメラミンホルムアルデヒドを含み得る）、ポリオレフィン、多糖類、（一態様では、前記多糖類は、アルギン酸塩及び／又はキトサンを含み得る）、ゼラチン、セラック、エポキシ樹脂、ビニルポリマー、水溶性無機物、シリコーン、及びこれらの混合物である。
前記カプセル剤の一態様では、前記コアは、香料を含み得る。
前記カプセル剤の一態様では、前記シェルは、メラミンホルムアルデヒド及び／又は架橋メラミンホルムアルデヒドを含み得る。
一態様では、好適なカプセル剤は、コア材料及びシェルを含み得、前記シェルが少なくとも部分的に前記コア材料を包囲するカプセル剤が開示される。少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％の前記カプセル剤は、約０．２ＭＰａ〜約１０ＭＰａ、約０．４ＭＰａ〜約５ＭＰａ、約０．６ＭＰａ〜約３．５ＭＰａ、又は更には約０．７ＭＰａ〜約３ＭＰａの破壊強度、及び０％〜約３０％、０％〜約２０％、又は更には０％〜約５％の有益剤漏れを有し得る。
一態様では、少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％の前記カプセル剤は、約１マイクロメートル〜約８０マイクロメートル、約５マイクロメートル〜６０マイクロメートル、約１０マイクロメートル〜約５０マイクロメートル、又は更には約１５マイクロメートル〜約４０マイクロメートルの粒径を有し得る。
一態様では、少なくとも７５％、８５％、又は更には９０％の前記カプセル剤は、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１８０ｎｍ又は更には約１００ｎｍ〜約１６０ｎｍの粒子壁厚を有し得る。
一態様では、前記カプセル剤のコア材料は、香料原材料からなる群から選択される材料、及び／又は任意で、以下からなる群から選択される材料を含み得る：ヒマシ油、ココナッツ油、綿実油、菜種油、大豆油、トウモロコシ油、ヤシ油、亜麻仁油、ベニバナ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム核油、ヒマシ油、レモン油及びこれらの混合物を含むストレート及び／又はブレンド植物油を含む植物油；植物油のエステル（エステルは、アジピン酸ジブチル、フタル酸ジブチル、アジピン酸ブチルベンジル、アジピン酸ベンジルオクチル、リン酸トリクレジル、リン酸トリオクチル及びこれらの混合物を含む）；約８０℃を超える沸点を有する直鎖又は分枝鎖炭化水素を含む、直鎖又は分枝鎖炭化水素；部分的に水素化したテルフェニル、フタル酸ジアルキル、モノイソプロピルビフェニルを含むアルキルジフェニル、ジプロピルナフタレンを含むアルキル化ナフタレン、灯油、鉱油及びこれらの混合物を含むペトロリウムスピリット；ベンゼン、トルエン及びこれらの混合物を含む芳香族溶媒；シリコーン油；並びにこれらの混合物である。
一態様では、前記カプセル剤の壁材料は、アルデヒド及びアミンの反応生成物を含む好適な樹脂を含み得、好適なアルデヒドには、ホルムアルデヒドが含まれる。好適なアミンには、メラミン、尿素、ベンゾグアナミン、グリコールウリル、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なメラミンには、メチロールメラミン、メチル化メチロールメラミン、イミノメラミン及びこれらの混合物が挙げられる。好適な尿素には、ジメチロール尿素、メチル化ジメチロール尿素、尿素−レゾルシノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
一態様では、好適なホルムアルデヒドスカベンジャーは、カプセル剤とともに、例えば、カプセルスラリー中に採用され得、及び／又はカプセル剤が消費者製品に添加される前、添加中若しくは添加した後に、そのような消費者製品に添加され得る。
好適なカプセルを、米国特許出願第２００８／０３０５９８２（Ａ１）号及び／又は米国特許出願第２００９／０２４７４４９（Ａ１）号の教示に従って作製することができる。あるいは、好適なカプセルは、Ａｐｐｌｅｔｏｎ Ｐａｐｅｒｓ Ｉｎｃ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）から購入することができる。
加えて、上述のカプセル剤を作製するための材料を、Ｓｏｌｕｔｉａ Ｉｎｃ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ｃｙｔｅｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、ＣＰ Ｋｅｌｃｏ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、ＢＡＳＦ ＡＧ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｒｈｏｄｉａ Ｃｏｒｐ．（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）、Ａｇｒｉｕｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）、ＩＳＰ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｓｔｒｏｅｖｅｒ Ｓｈｅｌｌａｃ Ｂｒｅｍｅｎ（Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）、Ｂａｙｅｒ ＡＧ（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から入手することができる。
一態様では、組成物は、（ａ）カルシウム塩、マグネシウム塩及びこれらの混合物からなる群から選択される無機塩、（ｂ）オリゴ糖、多糖類及びこれらの混合物からなる群から選択される炭水化物、（ｃ）フェニルボロン酸及びその誘導体からなる群から選択される質量効率的可逆プロテアーゼ阻害剤、並びに（ｄ）これらの混合物からなる群から選択される酵素安定剤を含み得る。
別の実施形態では、組成物は、（１）ホウ素含有化合物等の可逆プロテアーゼ阻害剤、（２）１〜２プロパンジオール、（３）ギ酸カルシウム及び／又はギ酸ナトリウム、並びに（４）その任意の組み合わせを含む。
一態様では、組成物は、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロースベースの材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、並びにこれらの混合物からなる群から選択される構造剤を含み得る。
洗剤は、１つ以上のポリマーを含み得る。例には、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリル酸塩等のポリカルボン酸塩、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸コポリマーがある。
洗剤は、テトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート等の過酸形成漂白活性化剤と合わせることができる過ホウ酸塩又は過炭酸塩等のＨ２Ｏ２源を含み得る漂白系を含有し得る。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミド、又はスルホン型のペルオキシ酸を含み得る。
一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、標記洗浄組成物の約０．１重量％〜約５０重量％、又は更に約０．１重量％〜約２５重量％の漂白剤を含んでよい。
本発明の酵素変異体は、従来の安定化剤、並びに／又はプロテアーゼ阻害剤、例えば、プロピレングリコール若しくはグリセロール等のポリオール、糖類若しくは糖アルコール、塩化ナトリウム及び塩化カリウム等の塩、乳酸、ギ酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、又は４−ホルミルフェニルボロン酸等のフェニルボロン酸誘導体、又はジ−、トリ−、若しくはテトラペプチドアルデヒド又はアルデヒド類似体等のペプチドアルデヒドを用いて安定化され得、これらのいずれかはＢ１−Ｂ０−Ｒを形成し、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＸ３、ＣＨＸ２、若しくはＣＨ２Ｘであり（Ｘ＝ハロゲン）、Ｂ０は、単一アミノ酸残基であり（好ましくは、任意で置換された脂肪族側鎖又は芳香族側鎖を有する）、並びにＢ１は、任意でＮ末端保護基を含むか、あるいは国際公開第０９１１８３７５号、同第９８／１３４５９号）に記載の１つ以上のアミノ酸残基（好ましくは１つ、２つ又は３つ）、あるいはＲＡＳＩ、ＢＡＳＩ、ＷＡＳＩ（稲、大麦及び小麦の二官能性アルファ−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤）、又はＣＩ２若しくはＳＳＩ等のタンパク質型のプロテアーゼ阻害剤からなる。組成物を、例えば、国際特許第９２／１９７０９号及び同第９２／１９７０８号又は米国特許６４７２３６４号に記載されるように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において採用される酵素は、以下のようなイオンを酵素に提供する最終組成物中で、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））の存在によって安定化される。
組成物は、例えば、布地調整剤を含む粘度、起泡力増進剤、石鹸泡抑制剤、防食剤、土壌沈殿防止剤、土壌再堆積防止剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇り防止剤、エタノール等の有機溶媒、又は香料等の他の従来の洗剤成分も含有し得る。更に、洗剤は、全般的な洗浄レベルを増加させるために洗濯物に付加される事前染み抜き又は増進剤を含有し得、これらの添加物のうちのいずれかは、洗浄工程前に織物に適用される前処理剤としても使用され得る。
洗剤組成物中の任意の酵素、具体的には、本発明の酵素は、洗浄液１リットル当たり０．００１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液１リットル当たり０．００５〜５ｍｇの酵素タンパク質、より好ましくは洗浄液１リットル当たり０．０１〜１ｍｇの酵素タンパク質、及び具体的には、洗浄液１リットル当たり０．１〜１ｍｇの酵素タンパク質に相当する量で添加され得ることが、現在企図されている。しかしながら、本発明の組成物は、少なくとも０．０００１〜約０．１重量％、例えば、約０．０００１重量％〜約０．０１重量％、約０．００１重量％〜約０．０１重量％、又は約０．００１重量％〜約０．０１重量％の純酵素タンパク質を含む。しかしながら、製剤化された酵素を用いるとき、洗剤組成物は、約０．０２％〜約２０重量％、又は例えば約０．０５重量％〜約１５重量％、又は約０．０５重量％〜約２０重量％、又は約０．０５重量％〜約５重量％、又は約０．０５重量％〜約３重量％を含む。
本発明において有用なアルファ−アミラーゼ変異体は、国際特許第９７／０７２０２号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示の洗剤製剤に更に組み込まれ得る。
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、タブレット、粉末、顆粒、ペースト、ゲル、又は液体であり得る。組成物は、粉末形態の汎用「強力」洗浄剤、ペースト形態の汎用及び強力な液体タイプ、上質布地用液体タイプ、手洗い用食器洗浄剤、軽質の食器洗浄剤、泡立ち良好タイプ、食器洗い機用洗浄剤、種々のタブレットタイプ、食器洗浄顆粒タイプ、食器洗浄液体タイプ、泡切れ良好タイプであり得る。組成物は、当該技術分野において既知のもの、並びに水溶性、不水溶性、及び／又は透水性のものを含む単位用量包装であり得る。液体洗剤は、典型的には、最大７０％の水及び０〜３０％の有機溶媒を含有する水性の液体洗剤であるか、非水性であるか、あるいは０．５ｇ／Ｌを超える洗剤組成物を含有する溶液であり得る。
本発明の組成物は、例えば、染みのついた布地の前処理に好適な洗濯添加組成物及びすすぎ添加布地柔軟剤組成物を含む手洗い用又は機械用洗濯洗剤組成物として製剤化され得るか、全般的な家庭の硬表面洗浄作業で用いる洗剤組成物として製剤化され得るか、あるいは手洗い用又は機械用食器洗浄作業のために製剤化され得る。洗剤は、粉末若しくは粒状形態であり得るか、液体、ゲル、若しくはペーストの形態、又はタブレット若しくは多区画ポーチを含むポーチ等の単位用量製品の形態であり得るか、あるいは洗剤は、シート形態であり得る。
実施例：洗濯洗剤組成物
以下はそれぞれ、トップローディング全自動洗濯機（１及び２）並びにフロントローディング洗濯機（３）に特に好適な液体洗濯洗剤組成物である。
Figure 2013519757
Figure 2013519757
 １ ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
２ １つの−ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３ 両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、１つの−ＮＨにつき２４個のエトキシレート基と、１つの−ＮＨにつき１６個のプロポキシレート基とを有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
実施例：食器洗浄洗剤
以下の例、食器洗浄洗剤４〜８はゲル形態である。
Figure 2013519757
 １ ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により商品名Ｐｏｌｙｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）ＳＬＦ−１８で販売。
２ Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）により販売。
３ 本発明のカプセル化プロテアーゼ。
４ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により販売。好適なプロテアーゼ錠剤は、商品名ＦＮ３（登録商標）及びＰｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）で販売。
６ Ａｌｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，ＵＳＡ）により販売。
７ そのような好適なポリマーの１つは、Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｋｕｂａｉ（Ｊａｐａｎ）により商品名Ａｑｕａｌｉｃ ＴＬで販売。
８ Ａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓｍｙｒｎａ，Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）により販売。
９ Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ）により販売。
２．０Ｒケイ酸塩は、ＰＱＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）から供給されている。
炭酸ナトリウムは、Ｓｏｌｖａｙ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）から供給されている。
Ｓｏｌｖａｙ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）から供給されている、過炭酸ナトリウム（２Ｎａ２ＣＯ３・３Ｈ２Ｏ２）。
ヒドロキシエタンジホスホン酸塩（ＨＥＤＰ）は、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）から供給されている。
食器洗浄洗剤組成物
本発明の酵素を、以下を含む食器洗浄洗剤組成物において使用することもできる：
１）粉末全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
２）粉末全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
３）粉末全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
４）粉末全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
５）粉末全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
６）洗浄界面活性剤系を有する粉末及び液体食器洗浄組成物
Figure 2013519757
７）非水性液体全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
８）非水性液体食器洗浄組成物
Figure 2013519757
９）チキソトロピー性液体全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
１０）液体全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
１１）保護された漂白粒子を含有する液体全自動食器洗浄組成物
Figure 2013519757
１２）過ホウ酸塩が過炭酸塩によって置換される、１）、２）、３）、４）、６）及び１０）に記載の全自動食器洗浄組成物。
１３）マンガン触媒を更に含有する、１）〜６）に記載の全自動食器洗浄組成物マンガン触媒は、例えば、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，１９９４，ｐｐ．６３７〜６３９に記載の化合物のうちの１つであり得る。
本発明は、洗浄のためにアルファ−アミラーゼ変異体を含む組成物を使用するための方法も対象とする。
変異体アルファ−アミラーゼは、好ましくは、洗剤組成物、例えば、洗濯洗剤組成物、例えば、家庭用洗濯洗剤組成物、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれ、及び／又はそれらとともに使用される。具体的には、洗剤は、少なくとも１つのキレート剤を含み、洗剤組成物は、典型的には、従来の洗剤添加物／成分等の界面活性剤（アニオン性、カチオン性、非イオン性、両性イオン性、両性）、ビルダー、漂白剤、ポリマー、他の酵素、及び例えば、国際特許第２００７／１３０５６２号及び同第２００７／１４９８０６号に記載の他の成分を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本発明の有用な態様において、本発明による組成物を洗浄プロセスに添加する工程を含む洗浄方法が提供される。好ましい実施形態では、前記洗浄プロセスは、洗濯、食器洗浄、工業又は企業洗浄プロセスにおける少なくとも１つの洗浄工程からなる群から選択される。
アルカリｐＨ値におけるそれらの活性のため、本発明のα−アミラーゼは、多種多様の工業プロセスでの使用に非常に好適であり、具体的には、酵素は、洗浄、食器洗浄及び硬表面洗浄洗剤組成物中の構成要素としての可能性のある用途を見出すが、デンプン由来の甘味料及びエタノールの製造においても有用であり得る。従来のデンプン変換プロセス及び液化及び／又は糖化プロセスの条件は、例えば、米国特許第３，９１２，５９０号並びに欧州特許公開第２５２，７３０号及び同第６３，９０９号に記載されている。
材料及び方法
酵素：
ＳＰ７２２：配列番号：６、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから入手可能であり、国際特許第９５／２６３９７号に開示される。
ＳＰ７０７又は＃７０７：配列番号８
ＡＡ５６０：配列番号１０
一般的な分子生物学方法：
別途言及されない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換を、分子生物学の標準の方法を用いて行なった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ（１９９０）。
アルファ−アミラーゼ及び変異体の発酵
発酵を、当該技術分野において周知の方法によって、又は以下のように行なうことができる。関連した発現プラスミドを持つバチルス・サブティリス株を、関連した抗生物質を有するＬＢ−寒天プレート上でストリーキングし、３７℃で一晩成長させる。コロニーを、５００ｍＬの振盪フラスコ中の関連した抗生物質（例えば、１０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール）で補充された１００ｍＬのＢＰＸ培地に移す。
Figure 2013519757
培養物を、２７０ｒｐｍ、３７℃で４〜５日間振盪する。
細胞及び細胞残屑を、４５００ｒｐｍで２０〜２５分間の遠心分離によって、発酵ブロスから除去する。その後、上清を濾過して、完全に透明な溶液を得る。濾液を濃縮し、ＵＦ−フィルタ（１００００カットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液は、例えば、透析又はゲル濾過によって、ｐＨ ５．５の２０ｍＭの酢酸塩に変化する。ＵＦ−濾液を、Ｓ−セファロースＦ．Ｆ．（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、カチオン交換、マトリックス：架橋アガロース、官能基：−ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３）上に塗布し、同一の緩衝液中の０．２ＭのＮａＣｌでの溶出工程によって溶出を実行する。溶出液を、ｐＨ ９．０の１０ｍＭのトリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）に対して透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、アニオン交換、マトリックス：架橋アガロース、官能基：−ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３）上に塗布し、６カラム体積にわたって０〜０．３ＭのＮａＣｌから線形勾配で溶出する。活性（ＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイによって測定される）を含有する画分をプールし、ｐＨをｐＨ ７．５に調整し、０．５％ ｗ／ｖｏｌの活性石炭での５分間の処理によって、残りの色を除去する。例えば、透析又はゲル濾過によって、好ましくは、保管中にアミラーゼを安定化する少濃度のカルシウム（例えば、０．１ｍＭ）、及び容器及びピペットへの酵素タンパク質の吸着の危険性を減少させる約０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有する、それ自体の洗浄結果に影響を及ぼさない緩衝系、例えば、ＥＰＰＳ緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸塩緩衝液、又は同等物に、更なる緩衝液交換工程を付加することは、更に有利であり得る。
モデル洗剤
Figure 2013519757
Figure 2013519757
遊離カルシウムイオンの測定のためのアッセイ。
以下のアッセイを、溶液中の遊離カルシウムイオンの測定のため、ひいては、遊離カルシウムイオンの濃度（Ｃａ２＋）を、ｐＨ ８で、例えば、２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるキレート剤（キレート化物）能力の決定のために使用することができる。
アッセイの原理：
種々の量のキレート化物を、２．０ｍＭのＣａ２＋の溶液に添加し、遊離Ｃａ２＋の濃度を、一定のｐＨ及び温度でカルシウムイオン選択性電極を用いることによって決定する。遊離カルシウムの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、キレート化物の濃度に対して測定される遊離カルシウム濃度のプロットから決定することができる。本アッセイにおいて、遊離カルシウムの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、ｐＨ ８及び２１℃で、塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で測定する。
溶液：
電解液：超純水（ミリＱ水）中の４Ｍの塩化カリウム。
ｐＨ ８の緩衝液：最小限の１Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ８．０に調整した５０ｍＭのＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸）。
カルシウム原液：ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏから作製される、ｐＨ ８の緩衝液中の２５ｍＭのＣａ２＋。
キレート原液：最小限の１Ｍ ＮａＯＨ又は１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ ８．０に再調整した、ｐＨ ８の緩衝液中の１５ｍＭのキレート化物（１００％乾燥キレート化剤に基づく）。
すべての緩衝液及び溶液の調製のために、超純水（ミルＱ水）を使用する。
設備：
塩化カルシウム標準溶液に対して較正される、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号９７２０ＢＮＷＰ）のカルシウムイオン選択性電極。本電極を、本電極に付随するガイドラインで説明されるように較正する。
手順：
全容積を５０ｍＬに調整するためにｐＨ ８の緩衝液を用いて、それぞれ、４ｍＬのカルシウム原液（最終濃度２．０ｍＭ）、１ｍＬの電解液（最終濃度８０ｍＭの塩化カリウム）、種々の量（０〜４５ｍＬ）のキレート原液を含有する一連のバイアルを調製する。本アッセイにおけるＥＰＰＳの最終濃度は、４９ｍＭである。
混合後、遊離Ｃａ２＋の濃度をカルシウム電極で測定する。遊離カルシウム濃度は、それぞれのキレート化物を試験するのに十分な異なるキレート化物濃度で決定されるはずであり、データセットが、２．０ｍＭの遊離カルシウムイオンから０．１０ｍＭ未満の値までの全範囲を包含することを確実にするか、あるいはアッセイにおける最終キレート化物濃度は、１０．０ｍＭよりも高い。好適なデータ点の数は、８以上である。最初の２．０ｍＭの遊離カルシウムイオンを０．１０ｍＭに減少させるのに必要なキレート化物濃度は、内挿によってキレート化剤濃度に対して測定された遊離カルシウムイオン濃度のプロットから得られる。
溶液を、所望の温度に平衡化し、所望の温度は、本アッセイにおいて２１℃である。
ｌｏｇＫの決定
キレート剤はまた、キレート剤（キレート化剤）及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けられ得る。この定数を、ＡＤ Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＣＣ Ｆｕｇｌｓａｎｇ ａｎｄ Ｐ Ｗｅｓｔｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．３１４（２００３）ｐａｇｅ ２２７〜２３４、及びＴ Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｓ Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＪＦ Ｂｒａｎｄｔｓ ａｎｄ Ｌ−Ｎ Ｌｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１７９（１９８９）ｐａｇｅ １３１〜１３７によって説明されるＩＴＣ（等温滴定熱量計）によって決定することができる。
使用するすべてのガラス製品及びプラスチックボトルを、１％（ｗ／ｗ）のＥＤＴＡ溶液で洗浄し、その後、Ｃｈｅｌｅｘ １００処理超純水（ミルＱ水）中で完全にすすぐ。溶液をプラスチックボトル中に保管し、使用するまで５℃で保持する。
緩衝液：
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）、ｐＨ ８、超純水（ミルＱ水）で調整。
２０ｍＭのグリシン、ｐＨ １０、超純水（ミルＱ水）で調整。
溶液：
−２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の１２５μＭのキレート化物、ｐＨ ８、又は２０ｍＭのグリシン中の１２５μＭのキレート化物、ｐＨ １０。
−２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の４ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ ８、又は２０ｍＭのグリシン中の４ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ １０。
−超純水（ミルＱ水）
カルシウムイオンを除去するために、すべての緩衝液を、Ｃｈｅｌｅｘ １００カラム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ−７９０１、メチル基を介する芳香環へのマトリックス１％架橋ポリスチレンマトリックス活性基イミノ二酢酸（ナトリウム形態）マトリックス付着）に通過させる。実験前に、すべての溶液を真空下で撹拌して脱気する。
計器：
ＭＣＳ−ＩＴＣ（ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）
手順
参照細胞を超純水（ミルＱ水）で充填する。試料細胞を、選択されたｐＨのキレート化物液で充填し、注射器を、選択されたｐＨのカルシウム溶液で充填する。溶液を、所望の温度、例えば、１９℃に平衡化する。
次に、試料細胞中のキレート化剤液を、３０〜４０一定分量の８μＬのカルシウム溶液で滴定する。
次に、ＩＴＣから得たシグナルを、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｉｎｃから供給されるＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて統合する。結合等温線を得るために、同一のソフトウェアパッケージを用いて回帰ルーチンを作製する。次に、これらのデータを、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアに埋め込まれたルーチンを用いてモデルに当てはめる。一般的に使用されるキレート剤の大部分への最善のフィットをもたらす「ワンサイト」モデルが現在好ましく、すなわち、残差が約ゼロに均等に分配される。Ｋ値から、ｌｏｇ Ｋを、Ｋ値の対数（１０を底とする）として計算する。
洗浄性能を決定するためのアッセイ
洗剤組成物中のアルファ−アミラーゼ変異体の洗浄性能を評価するために、洗浄実験を行うことができる。酵素を、自動機械的ストレスアッセイ（ＡＭＳＡ）を用いて試験するか、又はビーカーを用いて洗浄実施試験をする。ＡＭＳＡ試験で、大量の少容量酵素−洗剤溶液の洗浄性能を試験することが可能である。ＡＭＳＡプレートは、試験溶液のための多くのスロット及び洗浄される繊維製品の材料見本をスロットの全開口部にしっかりと締め付けるリッドを有している。洗浄期間中、プレート、試験溶液、織物及びリッドを、試験溶液を織物と接触させ、規則的及び周期的な振動様式で機械的ストレスを印加するために、精力的に振盪する。更なる説明に関して、国際特許第０２／４２７４０号、特に２３〜２４ページの段落「Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ」を参照されたい。
一般的な洗浄性能記述：
水（１５度ｄＨ）、０．８ｇ／Ｌの洗剤、例えば、上述のモデル洗剤Ａ若しくはＢ、又は５０ｍＭのＨＣＯ３−、並びに例えば、１リットル当たり０、０．２、０．４、０．８及び／若しくは１．２ｍｇの酵素タンパク質濃度の本発明の酵素を含む試験溶液を調製する。デンプン（例えば、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＣＳ−２８）で染色した布地を添加し、２０℃で３０分間洗浄する。水道水を流して完全にすすぎ、暗所で乾燥させた後、続いて、染色した布地の光強度又は反射率の値を、洗浄性能の尺度として測定する。デルタレミッション値を得るために、０ｍｇの酵素タンパク質／Ｌを有する試験物を、ブランクとして使用する。好ましくは、機械的な動きを、例えば、布地を有する洗浄液の振盪、回転又は撹拌の形態で、洗浄工程中に適用する。
ＡＭＳＡ洗浄性能実験を、以下に指定される実験条件下で実行することができる。
Figure 2013519757
試験系にＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、及びＮａＨＣＯ３（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋：ＨＣＯ３ −＝４：１：７．５、モルベース）を添加して、水の硬度を１５°ｄＨに調整する。洗浄後、織物を水道水で洗い流し、暗所で乾燥させる。
酵素変異体の性能を、特定のアミラーゼで洗浄した織物の色の輝度として測定する。白色光で照射するとき、輝度を、試料から反射される光の強度として表すこともできる。試料が染色されると、反射光の強度は、きれいな試料の反射光の強度よりも低い。したがって、反射光の強度を、アミラーゼ洗浄性能を測定するために使用することができる。
洗浄した織物の画像を捕捉するために使用する、専門のフラットベッドスキャナー（Ｋｏｄａｋ ｉＱｓｍａｒｔ，Ｋｏｄａｋ）を用いて色測定を行うことができる。
スキャンした画像から光強度の値を抽出するために、画像からの２４ビットピクセル値を、ＲＧＢ値としても既知である、レッド（ｒ）、グリーン（ｇ）及びブルー（ｂ）の値に変換する。ＲＧＢ値をベクターとして合計し、その後、結果として生じるベクターの長さを算出して、強度値（Ｉｎｔ）を計算する：
Figure 2013519757
織物：織物試料ＣＳ−２８（綿上の米デンプン）を、Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １２０，３１３３ ＫＴ Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手することができる。
ビーカーを用いた洗浄性能試験は、トップローダー洗濯機の小型モデルにおけるアッセイであり、アミラーゼの洗浄性能を評価するために使用される。２５０ｍＬのビーカー、及び１分間当たり８０回の振動数で、それぞれの方向に１８０度の振動回転運動を提供するパドル撹拌器を用いたビーカー洗浄性能試験は、以下の工程：５０ｍＭのＮａＨＣＯ３及び０．４ｍｇ／Ｌの酵素を含有する１００ｍＬの洗浄液（６℃、１５度ｄＨ、ｐＨ ８．０）を提供する工程と、ＣＳ−２８（５×５ｃｍ）の２つの見本及びＥＭＰＡ１６２（５×５ｃｍ）の２つの見本を、洗浄液に添加して、洗浄を開始する工程と、撹拌速度を８０ｒｐｍに設定する工程と、６０分後に撹拌を停止する工程と、見本を冷たい水道水ですすぎ流す工程と、すすいだ見本を暗所で一晩乾燥させる工程と、以下に説明されるカラーアイを用いて、４６０ｎｍで入射光のレミッションを測定して、洗浄性能を評価する工程と、を含む。
機器及び材料
循環水浴（５℃）、ガラスビーカー（２５０ｍＬ）、１００ｍＬ容量の洗浄液を有する１つのビーカーにつき１つの回転アーム、試験見本：Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＣＳ−２８（綿上の米デンプン）及びＥＭＰＡ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＡＧ，Ｓｔ．Ｇａｌｌｅｎ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＥＭＰＡ１６２（綿上の米デンプン／ポリエステル）、見本を５×５ｃｍに切断する。
洗浄液：５０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ ８．０、水の硬度：１５度ｄＨ、カルシウム：マグネシウム比４：１。
アミラーゼ原液：１ｍＬにつき１ｍｇの酵素タンパク質。超純水（ミリＱ水）中の０．１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び０．１ｍＭのＣａＣｌ２の溶液を、アミラーゼの希釈のために使用する（アミラーゼ希釈緩衝液）。
カラーアイ測定
洗浄性能を、デルタレミッション値（ΔＲｅｍ）として表す。非常に小さい、すなわち、０．７ｃｍ２（約０．７×１．０ｃｍ）の楕円形口径を有するＭａｃｂｅｔｈカラーアイ７０００反射分光光度計を用いて、見本の光反射率評価を行った。入射光中の紫外線なしで測定を行い、４６０ｎｍでのレミッションを抽出した。測定開口部に対して見本を押し上げるピストンからの反射を減少させるために、見本を測定する前に、測定する見本を同一の種類の別の見本の上部に設置した。アミラーゼで洗浄した見本のレミッション値から、添加アミラーゼ（対照）なしで洗浄した見本のレミッション値を引くことによって、個々の見本のデルタレミッション値を計算した。
デンプン分解活性（アルファ−アミラーゼ活性）の測定のためのアッセイ
ＥｎｚＣｈｅｋアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性を、以下のＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイによって決定することができる。基質は、トウモロコシデンプン誘導体、ＤＱ（商標）デンプン（トウモロコシデンプンＢＯＤＩＰＹ ＦＬ共役体）であり、蛍光を消す程度にＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）染料で標識されるトウモロコシデンプンである。約１ｍｇの凍結乾燥基質を含有する１つのバイアルを、ｐＨ ４．０、１００μＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム中に溶解する。バイアルを２０秒間ボルテックスし、溶解するまで時折混合しながら室温で暗所に留置した。次に、９５０μＬの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０））、ｐＨ ５．０を添加し、完全にボルテックスし、使用する準備が整うまで室温で暗所に保存する。基質作用液を、５ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％（ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．０と混合して、１ｍＬのこの溶液から調製する。
洗剤を含有する酵素を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ ７．０中で、１５ｎｇの酵素タンパク質／ｍＬの濃度に希釈する（６８２６．７倍の希釈）。アッセイのために、２５μＬの基質作用液を、黒色３８４ウェルマイクロタイタープレート中で２５μＬの希釈酵素と１０秒間混合する。蛍光強度を、２５℃で、それぞれのウェル中で、２分に１回、３０分間測定し（励起：４８５ｎｍ、発光：５５５ｎｍ）、Ｖ最大を、時間に対する蛍光強度のプロットの勾配として計算する。プロットは線形であるべきであり、希釈した参照酵素溶液が活性アッセイの線形範囲内であるように、残存活性アッセイを調整しなければならない。
少数例で、アッセイにおいてアミラーゼを有しない洗剤からの著しい妨害がある。そのような場合、代替のアミラーゼアッセイを使用することができる。既知量のアミラーゼを２つのレベルで洗剤に添加し、その後、２つの試料の活性を測定することによって、アミラーゼアッセイにおける洗剤からの妨害を試験することができる。測定した活性の差異が、添加したアミラーゼ間のレベルの差異に相当する場合、アッセイを用いて、保管後のアミラーゼの残存活性を決定することができる。
ＰＮＰ−Ｇ７アッセイ
アルファ−アミラーゼ活性を、ＰＮＰ−Ｇ７基質を採用する方法によって決定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７は、４，６−エチリデン（Ｇ７）−ｐ−ニトロフェニル（Ｇ１）−α、Ｄ−マルトヘプタオシドの省略形であり、アルファ−アミラーゼ等のエンドアミラーゼで切断することができるブロックオリゴ糖である。切断後、キット中に含まれるアルファ−グルコシダーゼは、加水分解基質を更に消化して、黄色を有する遊離ＰＮＰ分子を自由にし、ひいては、λ＝４０５ｎｍ（４００〜４２０ｎｍ）で、可視分光測光で測定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７基質及びアルファ−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ（カタログ番号１１８７６４７３）によって製造される。
試薬：
このキットのＧ７−ＰＮＰ基質は、２２ｍＭの４，６−エチリデン−Ｇ７−ＰＮＰ及び５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸）（ｐＨ ７．０）を含有する。
アルファ−グルコシダーゼ試薬は、５２．４ｍＭのＨＥＰＥＳ、８７ｍＭのＮａＣｌ、１２．６ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０７５ｍＭのＣａＣｌ２、≧４ｋＵ／Ｌのアルファ−グルコシダーゼ）を含有する。
１ｍＬのアルファ−グルコシダーゼ試薬を０．２ｍＬのＧ７−ＰＮＰ基質と混合して、基質作用液を作製する。この基質作用液を、使用直前に作製する。
希釈緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ（ｎ＝９〜１０）））、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ ７．０。
手順：
分析するアミラーゼ試料を、希釈試料のｐＨが７になるように、希釈緩衝液中で希釈した。２０μＬの希釈酵素試料を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、８０μＬの基質作用液を添加することによって、アッセイを行なった。溶液を混合し、室温で１分間事前インキュベートし、吸収を２０秒毎に５分間、ＯＤ ４０５ｎｍで測定する。
時間依存吸収曲線の勾配（１分間当たりの吸収度）は、所与の一連の条件下での問題のアルファ−アミラーゼの比活性（１ｍｇ酵素当たりの活性）に直接比例する。アミラーゼ試料を、勾配が１分間当たり０．４吸収度単位未満のレベルに希釈すべきである。
百分率点（ｐｐ）の決定
親と比較した変異体の残存活性（安定性）における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異、すなわち、変異体残存活性−親の残存活性として計算する。
実施例１変異体の調製
配列番号６ ＳＰ７２２のアミラーゼ変異体を、標準の手順、手短に言うと、ランダム及び／又は部位特異的変異を遺伝子に導入する工程、バチルス・ズブチルス宿主細胞を変異遺伝子で形質転換する工程、（例えば、国際特許第２００４／１１１２２０号の実施例１に記載されるように）形質転換した宿主細胞を発酵させる工程、並びに発酵ブロスからアミラーゼを精製する工程によって調製した。類似した様式で、参照アミラーゼ（配列番号６）をバチルス・ズブチルスにおいて組み換え的に産生した。
実施例２：キレート剤の特徴付け
実施例２ａ
遊離カルシウムイオンの測定
キレート剤（キレート化物）を、遊離カルシウムイオンの濃度（Ｃａ２＋）をｐＨ ８で２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるそれらの能力でランク付けすることができ、Ｍ．Ｋ．Ｎａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．６１，ｎｏ．９（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８４），ｐｐ．１４７５〜１４７８によって説明される方法から開発された。遊離カルシウムイオンの測定のための「材料及び方法」における上述のアッセイを用いた。
したがって、水の硬度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるのに必要なキレート化物の濃度を、上述のように決定した。２１℃及びｐＨ ８の緩衝液を用いて実験を実行した。
使用したキレート化物の最終濃度及び測定された遊離Ｃａ２＋濃度が、以下の表Ｉに示される。
Figure 2013519757
これらのデータから、遊離Ｃａ２＋濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭ未満に減少させるのに必要なキレート剤の濃度を、内挿によって決定し、結果は、表ＩＩに提示される。
いくつかのキレート化物を、本アッセイを用いて特徴化し、４９ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液及び８０ｍＭの塩化カリウム中の、遊離カルシウムイオンの濃度をｐＨ ８．０で２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させるのに必要なキレート化剤濃度が、表ＩＩに示される。
Figure 2013519757
実施例２ｂ
ｌｏｇ Ｋの決定
あるいは、キレート剤は、キレート剤（キレート化剤）及びカルシウムイオンの結合定数によって特徴付けることができる。この定数を、ＡＤ Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＣＣ Ｆｕｇｌｓａｎｇ ａｎｄ Ｐ Ｗｅｓｔｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．３１４（２００３）ｐａｇｅ ２２７〜２３４、及びＴ Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｓ Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ，ＪＦ Ｂｒａｎｄｔｓ ａｎｄ Ｌ−Ｎ Ｌｉｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１７９（１９８９）ｐａｇｅ １３１〜１３７によって説明されるＩＴＣ（等温滴定熱量計）によって決定することができる。ｌｏｇ Ｋを決定するための手順を説明する。
この手順を用いて、以下のｌｏｇ Ｋ値をｐＨ １０で決定する（表ＩＩＩを参照のこと）。
Figure 2013519757
実施例３：キレート剤とのインキュベーション後の残存活性
ＥｎｚＣｈｅｋアッセイ
アミラーゼ活性又は残存アミラーゼ活性は、本発明において、上述のようにＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイによって決定される。概して、モデル洗剤Ｂにおける残存アミラーゼ活性を、３１℃で１８時間のインキュベーション後に決定し、その後、活性を、上述のように４℃で１８時間インキュベートした参照の活性と比較した。
キレート化物を有する洗剤中のアミラーゼ変異体の安定性試験
洗剤中のアミラーゼの安定性を決定するために、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／Ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００中（ｐＨ ８．０）での希釈によって、試験した酵素を０．６ｍｇ／ｍＬの酵素タンパク質の濃度に調整した。開始のアミラーゼ濃度が低すぎる場合、それを、１０ｋＤａのカットオフを有するＵＦ膜を用いて、限外濾過（ＵＦ）によって濃縮することができる。
２５μＬのアミラーゼ溶液及び１２５μＬの洗剤（モデル洗剤Ｂ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに４回に分けて移した。１つの小さい磁石（５×２ｍｍ）をそれぞれのウェルに設置し、配合物を磁気撹拌器で、室温で５分間混合した。２つの同一のプレートを調製した。これらのプレートのうちの一方を、４℃で１８時間インキュベートし（参照試料）、他方のプレートを３１℃で１８時間インキュベートした（３１℃試料）。
インキュベーションの直後、洗剤中の残存アミラーゼ活性を決定するために、プレート上の試料を、アミラーゼ活性についてＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイに記載されるように分析した。アッセイ上で酵素よりも他の洗剤成分からの妨害を減少させるために、参照及び３１℃試料の両方を同一のタンパク質濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及び３１℃試料の両方の活性を、同一の３８４ウェルプレート上で決定した。参照アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、１００×Ｖ最大（３１℃試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算した。
結果は、参照アミラーゼ（親）としてＳＰ７２２又はＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊のいずれかを用いて、表ＩＶに示される。親と比較した変異体の残存活性における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性割合と親の残存活性割合との間の差異として計算する。
Figure 2013519757
Figure 2013519757
Figure 2013519757
結果は、本発明の変異体が、参照アルファ−アミラーゼよりも強力なキレート剤の存在にかなりの耐性を示すことを明確に示す。少数例で、残存活性は１００を超え、本アッセイの分析的相違を反映する。
結果は、参照アルファ−アミラーゼと比較して、本発明の変異体が、ｐＨ ８．０で、安定性も改善したことを示し、それは、アミノ酸１８３及び１８４が欠失された配列番号６である、配列番号６ ＳＰ７２２又は配列番号６＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊であり得る。
実施例４：ｐＨ ８及びｐＨ １０でのキレート剤とのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、キレート剤ＤＴＰＡの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定するが、ＥｎｚＣｈｅｃｋアッセイを用いて活性を決定する原理は、上述と同一である。概して、残存アミラーゼ活性を、キレート剤を含有する緩衝液中で、ｐＨ ８及び４９℃又はｐＨ １０及び４２℃のいずれかで１時間インキュベーションした後に決定し、その後、その活性を、上述の「材料及び方法」に記載されるように、４℃で１時間インキュベートした参照の活性と比較する。
ｐＨ ８及びｐＨ １０の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理：
酵素試料を、ｐＨ ８．０の緩衝液中で、１．５％の最終濃度のＤＴＰＡと４９℃で１時間インキュベートし、参照試料を、４℃で１時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、ｐＨ １０．０の緩衝液中で、１．５％の最終濃度のＤＴＰＡと４２℃で１時間インキュベートし、それらの参照試料を、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
試薬：
ＤＴＰＡを有するｐＨ ８緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ ８．０
ＤＴＰＡを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ １０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭのＥＰＰＳ中の０．２５及び０．５ｍｇの活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．０
手順：
１６０μＬ緩衝液（ＤＴＰＡを有するｐＨ ８緩衝液又はＤＴＰＡを有するｐＨ １０緩衝液）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに２回に分けて移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。最終濃度のＤＴＰＡは、それぞれのウェルにおいて１．５％であった。それぞれのウェルの２０μＬを、４℃で設置した新しいＰＣＲマイクロタイタープレート（ＰＣＲ ＭＴＰ）に移した（参照試料）。ＰＣＲ ＭＴＰを、緩衝液がｐＨ ８．０を有した場合、４９℃で１時間（ｐＨ ８、４９℃試料）、緩衝液がｐＨ １０．０を有した場合、４２℃で１時間（ｐＨ １０、４２℃試料）、ＰＣＲ機器内でインキュベートした。
インキュベーションの直後、ＰＣＲプレート上の試料を、希釈緩衝液中で１０倍に希釈し、ＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、アミラーゼ活性について分析した。アッセイ上でのキレート剤、ここではＤＴＰＡからの妨害を減少させるために、参照及びｐＨ ８で４９℃の試料／ｐＨ １０で４２℃の試料の両方を、残存活性について分析する前に同一の濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及びｐＨ ８で４９℃の試料又はｐＨ １０で４２℃の試料の両方の活性を、同一の９６ウェルプレート上で決定した。親アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、１００×Ｖ最大（ｐＨ ８で４２℃又はｐＨ １０で４９℃の試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算し、結果が表Ｖに示される。百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
Figure 2013519757
 結果は、本発明の変異体が、変異体の残存活性を親の残存活性と比較したとき、及び変異体の百分率点改善を考察したときの両方で、ｐＨ ８で４９℃及びｐＨ １０で４２℃での１時間のインキュベーション後に、高度に安定し、高い残存活性を有することを明確に示す。相対的に、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊アミラーゼは、２０％の残存活性を有し、ＳＰ７２２は、更に低い残存活性を有する。
実施例５：１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡを有するｐＨ ８及びｐＨ １０の緩衝液中でのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、キレート剤ＤＴＰＡの存在下でのインキュベーション後のＳＰ７２２変異体の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ ８又はｐＨ １０のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、４℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
ｐＨ ８及びｐＨ １０の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理：
酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＤＴＰＡを有するｐＨ ８．０の緩衝液中で、指示された温度及びインキュベーション時間でインキュベートし、参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＤＴＰＡを有するｐＨ １０．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
試薬：
ＤＴＰＡを有するｐＨ ８緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ ８．０
ＤＴＰＡを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ １０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭのＥＰＰＳ中の０．２５及び０．５ｍｇの活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．０
手順：
１６０μＬ緩衝液（ＤＴＰＡを有するｐＨ ８緩衝液又はＤＴＰＡを有するｐＨ １０緩衝液）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに２回に分けて移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。最終濃度のＤＴＰＡは、それぞれのウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。それぞれのウェルの２０μＬを、４℃で設置したマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移した（参照試料）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス試料）を、以下の表に示されるように、ＰＣＲ機器内でインキュベートした。
インキュベーションの直後、ＰＣＲプレート上の試料を、希釈緩衝液中で１０倍に希釈し、ＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、アミラーゼ活性について分析した。アッセイ上のキレート剤、ここではＤＴＰＡからの妨害を減少させるために、参照及びストレス試料の両方を、残存活性について分析する前に同一の濃度に希釈したことに留意すべきである。参照試料及びストレス試料の両方の活性を、同一の９６ウェルプレート上で決定した。親アミラーゼのすべての試験マイクロタイタープレート上への包含を確実にした。残存活性を、１００×Ｖ最大（ストレス試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。結果を表５．１に示す。
Figure 2013519757
残存活性から、ＳＰ７２２変異体がＤＴＰＡの存在下でより安定していることが明確に見られ、これは、親と比較して変異体の安定性における百分率点改善にも反映される。
実施例６：ｐＨ １０のＨＥＤＰとのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、上述のＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、キレート剤ＨＥＤＰの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ １０のキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、４℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
ｐＨ １０の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理：
酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＨＥＤＰを有するｐＨ １０．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
試薬：
ＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ＣＡＳ番号２８０９−２１−４）、ｐＨ １０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭのＥＰＰＳ中の０．２５及び０．５ｍｇの活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．０
手順：
１６０μＬの緩衝液（ＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに２回に分けて移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。最終濃度のＨＥＤＰは、それぞれのウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。それぞれのウェルの２０μＬを、４℃で設置したマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移した（参照試料）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス試料）を、以下の表６．１に示されるように、ＰＣＲ機器内でインキュベートした。残存活性を、１００×Ｖ最大（ストレス試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
Figure 2013519757
結果は、親と比較して、変異体が、ＨＥＤＰの存在下でインキュベートされるときにより安定していることを明確に示す。
実施例７：１．５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰを有するＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊及びその変異体の安定性
本実施例では、上述のＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、キレート剤ＨＥＤＰの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ ８又はｐＨ １０のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、４℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
ｐＨ ８及びｐＨ １０の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理：
酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＨＥＤＰを有するｐＨ ８．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＨＥＤＰを有するｐＨ １０．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
試薬：
ＨＥＤＰを有するｐＨ ８緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ＣＡＳ番号２８０９−２１−４）、ｐＨ ８．０
ＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ＣＡＳ番号２８０９−２１−４）、ｐＨ １０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭのＥＰＰＳ中の０．２５及び０．５ｍｇの活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．０
手順：
１６０μＬの緩衝液（ＨＥＤＰを有するｐＨ ８緩衝液又はＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに２回に分けて移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。最終濃度のＨＥＤＰは、それぞれのウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。それぞれのウェルの２０μＬを、４℃で設置したマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移した（参照試料）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス試料）を、以下の表７．１に示されるように、ＰＣＲ機器内でインキュベートした。残存活性を、１００×Ｖ最大（ストレス試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
Figure 2013519757
結果は、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊の変異体が、キレート剤ＨＥＤＰの存在下でインキュベートしたとき、はるかにより安定していることを明確に示す。
実施例８：１．５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ又は１．５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰの存在下でのＡＡ５６０変異体の安定性
本実施例では、上述のＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、キレート剤ＤＴＰＡ又はＨＥＤＰの存在下でのインキュベーション後の残存アミラーゼ活性を決定する。概して、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ ８又はｐＨ １０のいずれかのキレート剤を含有する緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベーションした後に決定し、その後、活性を、材料及び方法に記載されるように、４℃でインキュベートした参照の活性と比較する。
ｐＨ ８及びｐＨ １０の緩衝液中でのキレート剤とのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
原理：
酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度のＤＴＰＡ又はＨＥＤＰを有するｐＨ ８．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。加えて、酵素試料を、１．５％（ｗ／ｖ）最終濃度のＤＴＰＡ又はＨＥＤＰを有するｐＨ １０．０の緩衝液中で、指示された温度で指示されたインキュベーション時間インキュベートし、それらの参照試料を、４℃で同一のインキュベーション時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて残存活性を決定した。
試薬：
ＤＴＰＡを有するｐＨ ８緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ ８．０
ＤＴＰＡを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ＣＡＳ番号６７−４３−６）、ｐＨ １０．０
ＨＥＤＰを有するｐＨ ８緩衝液：５０ｍＭのＥＰＰＳ、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ＣＡＳ番号２８０９−２１−４）、ｐＨ ８．０
ＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液：５０ｍＭのグリシン、０．０１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、１．８７５％（ｗ／ｖ）のＨＥＤＰ（１−ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ＣＡＳ番号２８０９−２１−４）、ｐＨ １０．０
アミラーゼ溶液：５ｍＭのＥＰＰＳ中の０．２５及び０．５ｍｇの活性アミラーゼタンパク質／ｍＬ、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．０
手順：
１６０μＬの緩衝液（ＤＴＰＡ若しくはＨＥＤＰを有するｐＨ ８緩衝液又はＤＴＰＡ若しくはＨＥＤＰを有するｐＨ １０緩衝液）及び４０μＬのアミラーゼ溶液を、９６ウェルＰＣＲマイクロタイタープレートに２回に分けて移し、内容物を１分間混合した（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。最終濃度のＤＴＰＡ又はＨＥＤＰは、それぞれのウェルにおいて１．５％（ｗ／ｖ）であった。それぞれのウェルの２０μＬを、４℃で設置したマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に移した（参照試料）。ＰＣＲ ＭＴＰ（ストレス試料）を、以下の表８．１及び表８．２に示されるように、ＰＣＲ機器内でインキュベートした。残存活性を、１００×Ｖ最大（ストレス試料）／Ｖ最大（参照試料）として計算した。親と比較した変異体の安定性における百分率点（ｐｐ）改善を、変異体の残存活性−親の残存活性として計算する。
Figure 2013519757
Figure 2013519757
実施例９：キレート剤を有する洗剤中でのインキュベーション後の残存活性
本実施例では、ＰＮＰ−Ｇ７アッセイを用いて、実施例５に記載されるように、キレート化の存在下で洗剤中でインキュベーションした後、残存アミラーゼ活性を決定する。
概して、残存アミラーゼ活性を、ｐＨ ８．２のキレート剤ＤＴＰＭＰ及びＨＥＤＰを含有する洗剤Ｃ中で、３０℃で３週間及び６週間インキュベーションした後に決定した。その後、アミラーゼの残存活性を、以下に記載されるように、第０日の新たに作製した洗剤（インキュベーション前）中でのアミラーゼの活性と比較する。
Figure 2013519757
 ＊Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏの商標名Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）で販売されているこれは、活性プロテアーゼ酵素である洗剤の割合として表される（すなわち、産物におけるこの％は、酵素の１００％活性を想定する）。
ｐＨ ８．２のキレート剤を有する洗剤中でのインキュベーション後のアミラーゼ変異体の安定性試験
方法：それぞれが、本発明のアミラーゼ変異体又はＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊とも称される以下の２つの欠失：Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊を有する配列番号６（ＳＰ７２２）を含有するｐＨ ８．２の洗剤Ｃ試料を、調製した。それぞれの洗剤試料を、インキュベーション前に最初の残存酵素活性について決定した（参照試料）。
それぞれの試料の残存酵素活性を、３０℃で３週間及び６週間インキュベーションした後に決定し、それらの参照試料と比較した。残存活性を、ＰＮＰ−Ｇ７アミラーゼ活性アッセイを用いて決定した。
アミラーゼ溶液：ｐＨ ８．２の１００ｇの洗剤Ｃ中の１３．７７ｍｇの活性アミラーゼタンパク質
手順：
アミラーゼを含有するｐＨ ８．２の５ｇの洗剤Ｃを、エアタイトリッドを有する７ｍＬのガラスバイアルに二重に設置した。最初の二重の試料の残存酵素活性を、インキュベーション前に決定した。
試料を、３０℃で３週間及び６週間、インキュベータに設置した。インキュベーションの直後、ＰＮＰ−Ｇ７アッセイに記載されるように、試料を残存アミラーゼ活性について分析した。この試験において、１００％の残存活性は、インキュベーション前の最初の残存酵素活性（参照試料）と比較して、喪失がないアミラーゼ活性と等しい。親と比較した変異体の残存活性（安定性）における百分率点（ｐｐ）改善は、変異体の残存活性と親の残存活性との間の差異として計算される。
Figure 2013519757
結果は、本発明の変異体が、ｐＨ ８．２の洗剤Ｃ中での３０℃で３週間及び６週間のインキュベーション後、高度に安定しており、高い残存活性を有することを明確に示す。相対的に、ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊ Ｇ１８４＊アミラーゼは、３週間後に１９％、６週間後に３％の残存活性を有する。
種々の参照が本明細書において引用され、それらの開示は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本明細書に記載され、特許請求される本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態が本発明のいくつかの態様の説明として意図されるため、これらの実施形態によって範囲を限定するものではない。任意の同等の実施形態は、本発明の範囲内であるよう意図されている。実際、本明細書に示され、記載される修正に加えて、本発明の種々の修正は、前述の記述から当業者には明らかとなる。
そのような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に収まるよう意図されている。不一致が生じた場合、定義を含む本開示が支配する。
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙された正確な数値に厳しく制限されるものとして理解されるべきでない。それよりむしろ、特に指定されない限り、そのような各寸法は、列挙された値とその値周辺の機能的に同等の範囲との両方を意味することを意図する。例えば、「４０ｍｍ」として開示された寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。

Claims (15)

  1. 洗浄組成物であって、
    （ａ）親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号６による番号付けを用いて、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
    （ｂ）好ましくは、０．０１〜９９．９重量％の量の洗浄補助剤と、任意で、
    （ｃ）少なくとも１つのキレート剤であって、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。
  2. キレート剤を含み、
    （ａ）１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、８０ｍＭの塩化カリウム及び４９ｍＭのＥＰＰＳ中で、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、及び／又は
    （ｂ）１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、実施例２ａに記載のアッセイで測定されるとき、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、及び／又は
    （ｃ）前記キレート剤が、８ｍＭ未満、好ましくは７ｍＭ未満、好ましくは６ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭ未満、好ましくは４ｍＭ未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、及び／又は
    （ｄ）前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８で測定されるとき、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、及び／又は
    （ｅ）前記キレート剤が、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度の０．７倍未満、例えば０．５倍未満、例えば０．３倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、請求項１に記載の組成物。
  3. 洗浄組成物であって、
    （ａ）親アルファ−アミラーゼの変異体であって、配列番号６による番号付けを用いて、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３及び２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での置換を含む、変異体と、
    （ｂ）好ましくは、０．０１〜９９．９重量％の量の洗浄補助剤と、任意で、
    （ｃ）少なくとも１つのキレート剤であって、２１℃及びｐＨ ８．０で測定されるとき、遊離カルシウムイオンを２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができるクエン酸塩の濃度の０．９倍未満のキレート剤濃度で、遊離カルシウムイオン濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができる、キレート剤と、を含む、洗浄組成物。
  4. （ａ）前記変異体が、配列番号６による番号付けを用いて、１９５、１９３、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３又は２４３位に相当する１つ以上の位置での少なくとも２つの置換を含み、及び／又は
    （ｂ）前記親アルファ−アミラーゼ配列が、１９３が、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］であるか、１９５位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９７位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、１９８位が、［Ｑ又はＮ］であるか、２００位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０３位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２０６位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｎ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｈ、Ｑ、Ｄ又はＥ］であるか、２１０位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、２１２位が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］であるか、又は２１３位が、［Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ又はＭ］であるか、あるいは２４３が、［Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ又はＶ］である置換のうちの少なくとも１つによって修飾され、及び／又は
    （ｃ）前記親アルファ−アミラーゼ配列が、１９３がＴであるか、１９５位がＦ又はＹであるか、１９７位がＦ又はＬであるか、１９８位がＮであるか、２００位がＦであるか、２０３位がＦであるか、２０６位がＹであるか、２１０位がＹであるか、２１２位がＶであるか、又は２１３位がＡであるか、あるいは２４３位がＦである置換のうちの少なくとも１つによって修飾され、かつ／あるいは前記変異体が、（配列番号６の番号付けを用いて）１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域における少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を更に含み、及び／又は
    （ｄ）前記変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの１９３、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３位に相当する１つ以上の位置での置換と、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８位に相当する１つ以上の位置での置換と、を含み、及び／又は
    （ｅ）前記変異体が、キレート剤の存在下で、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後、少なくとも６０％の残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、及び／又は
    （ｆ）前記変異体が、キレート剤の存在下で、ｐＨ ８及び３１℃で１８時間後、少なくとも７０％の残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、前記残存活性が、「材料及び方法」に記載されるように測定され、及び／又は
    （ｇ）前記変異体が、「材料及び方法」に記載のＡＭＳＡで測定されるとき、前記親アルファ−アミラーゼと比較して、改善された洗浄性能を有する、請求項１又は２に記載の組成物。
  5. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＭＧＤＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＭＰ、ＨＥＤＰ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、配列番号６の成熟ポリペプチドの１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される位置に相当する１つ以上の位置での変更を更に含み、
    （ａ）前記（１つ又は複数の）変更が独立して、
    （ｉ）前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
    （ｉｉ）前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び／又は
    （ｉｉｉ）前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
    （ｂ）前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
    （ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記親アルファ−アミラーゼの変異体が、１８１、１８２、１８３、又は１８４のアミノ酸領域において少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの欠失を含み、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０６、２１０、２１２、２１３、２４３からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含み、１１６、１１８、１２９、１３３、１４２、１４６、１４７、１４９、１５１、１５２、１６９、１７４、１８６、２３５、２４４、３０３、３２０、３３９、３５９、４１８、４３１、４３４、４４７、４５８からなる群から選択される１つ以上の位置での変更を更に含み、
    （ａ）前記（１つ又は複数の）変更が独立して、
    （ｉ）前記位置のすぐ下流で隣接したアミノ酸の挿入、
    （ｉｉ）前記位置を占有する前記アミノ酸の欠失、及び／又は
    （ｉｉｉ）前記位置を占有する前記アミノ酸の置換であり、
    （ｂ）前記変異体が、アルファ−アミラーゼ活性を有し、及び
    （ｃ）それぞれの位置が、配列番号６のアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列の位置に相当する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記変異体が、キレート剤を含む組成物において、前記親アルファ−アミラーゼと比較して、又は配列番号６と比較して、改善された安定性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、好ましくは、前記変異体が、キレート剤の存在下で、ｐＨ ８で１８時間後、少なくとも６０％の残存活性を有し、１０ｍＭ未満の濃度の前記キレート剤が、２１℃及びｐＨ ８．０で、遊離カルシウムイオンの濃度を２．０ｍＭから０．１０ｍＭに減少させることができ、前記残存活性が、「材料及び方法」に記載されるように測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. デンプン分解活性を有する前記変異体が、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２０の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. デンプン分解活性を有する前記親ポリペプチドが、好ましくは少なくとも低ストリンジェンシー条件、より好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件、更により好ましくは少なくとも中程度〜高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは少なくとも高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号５、７、９又は１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号５、７、９、１１、１７、１９の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記アミラーゼが、親アルファ−アミラーゼの変異体であり、前記親アルファ−アミラーゼが、配列番号６のものであり、前記変異体が、前記欠失Ｄ１８３＊及びＧ１８４＊と、
    （ａ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｈ２１０Ｙ、
    （ｂ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ、Ｈ、Ｙ、
    （ｃ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｈ２１０Ｙ、
    （ｄ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｙ＋Ｙ２４３Ｆ、
    （ｅ）ＮＳ１８０５６（我々が変異を得る場合）
    （ｆ）Ｓ１９３Ｔ＋Ｖ２０６Ｌ、
    （ｇ）Ｇ１３３Ｅ＋Ｇ１４９Ｒ＋Ｎ１９５Ｙ＋Ｙ２０３Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ、
    （ｈ）Ｉ２０６Ｌ、Ｙ、
    （ｉ）Ｙ２４３Ｆ、
    （ｊ）Ｎ１９５Ｆ＋Ｖ２０６Ｌ＋Ｙ２４３Ｆ、
    （ｋ）Ｎ１９５Ｆ、又は
    （ｌ）Ｖ２０６Ｆ＋Ｙ２４３Ｆの組の変異のうちの１つを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記キレート剤が、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＰ、ＭＧＤＡ、ＤＴＰＭＰ及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記洗浄補助剤が、香料マイクロカプセル、布地色相剤、プロテアーゼ、ポリエチレンイミンポリマー、リパーゼ、及びこれらの任意の混合物のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、液体洗濯洗剤組成物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 洗濯方法であって、好ましくは３０℃以下の温度で、又はより好ましくは２０℃以下の温度で、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物で衣類を洗濯する工程を含む、方法。
JP2012552988A 2010-02-10 2011-02-10 キレート剤の存在下で高安定性を有するアミラーゼ変異体を含む洗浄組成物 Active JP5823414B2 (ja)

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