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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vielfalt an Reinigungszusammensetzungen,
die neuartige Proteaseenzyme umfassen, bei denen es sich um Carbonylhydrolasevarianten
handelt.
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HINTERGRUND
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Enzyme
stellen die größte Klasse
natürlich
vorkommender Proteine dar. Jede Enzymklasse katalysiert (beschleunigt
eine Reaktion, ohne verbraucht zu werden) im Allgemeinen eine andere
Art von chemischer Reaktion. Eine Klasse von Enzymen, die als Proteasen
bekannt sind, ist für
ihre Fähigkeit
zum Hydrolysieren (Zerlegen einer Verbindung in zwei oder mehr einfachere
Verbindungen mit Aufnahme der H- und OH-Teile eines Wassermoleküls auf beiden
Seiten der aufgespaltenen chemischen Bindung) anderer Proteine bekannt. Diese
Fähigkeit
zum Hydrolysieren von Proteinen wird durch Einbeziehung natürlich vorkommender
und mittels Proteintechnik erzeugter Proteasen als Zusatzstoff für Wäschewaschmittelzubereitungen
genutzt. Viele Flecken auf Kleidung sind proteinhaltig, und Proteasen
mit breiter Spezifität
können
die Entfernung solcher Flecken wesentlich verbessern.
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Bedauerlicherweise
wird der Wirksamkeitsgrad dieser Proteine in ihrer natürlichen,
bakteriellen Umgebung häufig
nicht in die relativ unnatürliche
Waschumgebung übertragen.
Genauer sind Proteaseeigenschaften wie Wärmestabilität, pH-Stabilität, Oxidationsstabilität und Substratspezifität nicht notwendigerweise zur
Verwendung außerhalb
der natürlichen
Umgebung des Enzyms optimiert.
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Die
Aminosäuresequenz
des Proteaseenzyms bestimmt die Eigenschaften der Protease. Eine Änderung
der Aminosäuresequenz
der Protease kann je nach Ort, Art und/oder Ausmaß der Änderung
der Aminosäuresequenz
die Eigenschaften des Enzyms in unterschiedlichen Graden ändern oder
das Enzym sogar deaktivieren. Es wurden verschiedene Herangehensweisen
angewendet, um durch Änderung
der Aminosäuresequenz
von Proteasen zu versuchen, ihre Eigenschaften zu verbessern, mit
dem Ziel, die Wirksamkeit der Protease für Reinigungsanwendungen wie
in der Waschumgebung zu steigern. Zu diesen Herangehensweisen zählt das Ändern der
Aminosäuresequenz,
um unter ganz unterschiedlichen Bedingungen die Wärmestabilität zu erhöhen und
die Oxidationsstabilität
zu verbessern.
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Trotz
der Vielfalt an im Stand der Technik beschriebenen Herangehensweisen
besteht eine anhaltende Notwendigkeit für neue wirksame Proteasevarianten,
die zur Reinigung einer Vielfalt an Oberflächen geeignet sind. Daher ist
es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Reinigungszusammensetzungen
bereitzustellen, die Proteaseenzyme enthalten, bei denen es sich
um Carbonylhydrolasevarianten mit verbesserter proteolytischer Aktivität, Substratspezifität, Stabilität und/oder
verbesserten Leistungseigenschaften handelt. Diese und andere Aufgaben
werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung leicht
ersichtlich.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Reinigungszusammensetzungen, umfassend:
- (a) eine wirksame Menge an Proteaseenzym, bei
dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante mit einer Aminosäuresequenz
handelt, die nicht in der Natur vorkommt, und die von einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
abgeleitet ist, und wobei das Proteaseenzym eine Bacillus-lentus-Subtilisinvariante
ist, die ausgewählt ist
aus N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A;
N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S;
N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I;
N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I;
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S;
N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N;
N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I;
N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104I/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N
und N76D/S103A/V104I/M222A und Mischungen davon; wobei die bezifferte
Position natürlich
vorkommendem Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens oder äquivalenten
Aminosäureresten
in anderen Carbonylhydrolasen oder Subtilisinen (wie Bacillus-lentus-Subtilisin)
entspricht; und
- (b) ein oder mehrere Reinigungszusammensetzungsmaterialien,
die mit dem Proteaseenzym verträglich sind.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Reinigung von
Gegenständen,
die einer Reinigung bedürfen,
durch Inkontaktbringen des Gegenstands mit einem Proteaseenzym,
bei dem es sich um eine Carbonylhydrolasevariante handelt, wie hier
beschrieben. Daher umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung
von Textilien, umfassend das Inkontaktbringen, vorzugsweise unter
Hin- und Herbewegen,
der Textilien mit einer wässrigen
Flotte, die das Proteaseenzym enthält. Das Verfahren kann bei
Temperaturen von unter etwa 60°C
durchgeführt
werden, jedoch ist es natürlich
bei Wäschewaschtemperaturen
bis hin zum Kochen sehr wirksam. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch ein Verfahren zur Reinigung von Geschirr durch Inkontaktbringen
von Geschirr, das einer Reinigung bedarf, mit einem Proteaseenzym,
wie hier beschrieben. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen auch
Verfahren zur Körperreinigung
ein, wobei die Verfahren das Inkontaktbringen des Körperteils
eines Menschen oder niederen Tiers, der einer Reinigung bedarf,
mit einem Proteaseenzym, wie hier beschrieben, umfassen.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A–C
zeigen die DNA- und die Aminosäuresequenz
für Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin und
eine Teilrestriktionskarte dieses Gens (Seq.-ID Nr. 6).
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2 zeigt
die konservierten Aminosäurereste
in Subtilisinen von Bacillus amyloliquefaciens (BPN') und Bacillus lentus
(Wildtyp).
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Die
3A und
3B zeigen
die Aminosäuresequenz
von vier Subtilisinen. Die obere Reihe zeigt die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens (mitunter auch als
Subtilisin BPN' bezeichnet)
(Seq.-ID Nr. 7). Die zweite Reihe zeigt die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus subtilis (Seq.-ID Nr. 8). Die dritte
Reihe zeigt die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus B. icheniformis (Seq.-ID r. 9). Die vierte Reihe
zeigt die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus lentus (in PCT
WO89/06276 auch als Subtilisin 309
bezeichnet) (Seq.-ID Nr. 10). Das Symbol* kennzeichnet die Abwesenheit
von spezifischen Aminosäureresten
im Vergleich zu Subtilisin BPN'.
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4 zeigt
die Konstruktion des Plasmids GGA274.
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5 zeigt
die Konstruktion von GGT274, welches eine Zwischenverbindung für bestimmte
in dieser Anmeldung verwendete Expressionsplasmide ist.
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Die 6A und 6B zeigen
die DNA- und die Aminosäuresequenz
von Subtilisin aus Bacillus lentus (Seq.-ID Nr. 11). Das reife Subtilisinprotein
wird durch die Codons kodiert, die mit dem Codon GCG (334-336),
welches Ala entspricht, beginnen.
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Die 7A und 7B zeigen
die DNA- und die Aminosäuresequenz
einer bevorzugten Ausfürungsform
der Erfindung (N76D/S103A/V104I) (Seq.-ID Nr. 12). Die DNA in dieser
Figur wurde durch die beschriebenen Verfahren zur Kodierung von
Aspartat an Position 76, Alanin an Position 103 und Isoleucin an
Position 104 modifiziert. Das reife Subtilisinvarianten-Protein
wird durch die Codons kodiert, die mit dem Codon GCG (334-336),
welches Ala entspricht, beginnen.
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8 zeigt
die Konstruktion des Vektors pBCDAICAT.
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9 zeigt
die Konstruktion des Vektors pUCCATFNA.
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10 zeigt die Stabilität eines bevorzugten Mutantenenzyms
im Vergleich zum Wildtyp in einer flüssigen Reinigungsmittelformulierung.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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1. Proteaseenzyme:
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Die
Erfindung umfasst Proteaseenzyme, die keine natürlich vorkommenden Carbonylhydrolasevarianten
sind und Unterschiede hinsichtlich proteolytischer Aktivität, Stabilität, Substratspezifität, pH-Profil
und/oder Leistungseigenschaften im Vergleich zu der Vorläufer-Carbonylhydrolase
aufweisen, von der die Aminosäuresequenz
der Variante abgeleitet ist. Die Vorläufer-Carbonylhydrolase kann
eine natürlich
vorkommende Carbonylhydrolase oder eine rekombinierte Hydrolase
sein. Genauer besitzen solche Carbonylhydrolasevarianten eine Aminosäuresequenz,
die nicht in der Natur vorkommt und die durch Ersetzung einer Mehrzahl
von Aminosäureresten
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
durch andere Aminosäuren
abgeleitet wird. Die Mehrzahl von Aminosäureresten des Vorläuferenzyms
entspricht Position +76 in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden
Reste +103, +104, wobei die bezifferte Position natürlich vorkommendem
Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens oder äquivalenten Aminosäureresten
in anderen Carbonylhydrolasen oder Subtilisinen, wie Bacillus-lentus-Subtilisin,
entspricht.
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Die
Carbonylhydrolasevarianten, die in den Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung geeignete Proteaseenzyme sind, umfassen die Ersetzung
von Aminosäurerest
+76 in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen Modifikationen. Die
Varianten-Proteaseenzyme, die für
die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die Substitution,
Deletion oder Einfügung
von Aminosäureresten
in den folgenden Kombinationen: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104;
76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/99/101/103;
76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123;
76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260;
76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135;
76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265
und/oder 76/103/104/222. Vorzugsweise umfassen die für die vorliegende
Erfindung geeigneten Variantenenzyme die Substitution, Deletion
oder Einfügung
eines Aminosäurerests
in der folgenden Kombination von Resten: 76/104; 76/99/104; 76/103/104;
76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104 von
B.-amyloliquefaciens-Subtilisin.
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Varianten-DNA-Sequenzen,
die solche Carbonylhydrolase- oder Subtilisinvarianten kodieren,
sind von einer Vorläufer-DNA-Sequenz
abgeleitet, die ein natürlich
vorkommendes oder rekombiniertes Vorläuferenzym kodiert. Die Varianten-DNA-Sequenzen
werden abgeleitet durch Modifizieren der Vorläufer-DNA-Sequenz zur Kodierung
der Substitution eines oder mehrerer spezifischer, durch die Vorläufer-DNA-Sequenz
kodierter Aminosäurereste,
die den Positionen 76, 99, 101, 103, 104, 107, 123, 27, 105, 109,
126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218,
222, 260, 265 und/oder 274 in Bacillus amyloliquefaciens oder einer beliebigen
Kombination davon entsprechen, wobei die Variante mindestens an
den Positionen 76 und 103 oder 104 substituiert sein muss. Obwohl
die zur Modifikation hierin identifizierten Aminosäurereste
gemäß der auf B.
amyloliquefaciens anwendbaren Nummerierung identifiziert werden
(welche die herkömmliche
Methode zur Identifizierung von Restpositionen in allen Subtilisinen
geworden ist), ist die bevorzugte Vorläufer-DNA-Sequenz, die für die vorliegende
Erfindung geeignet ist, die DNA-Sequenz von Bacillus lentus, wie
in 6 gezeigt (Seq.-ID Nr. 11).
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Diese
Varianten-DNA-Sequenzen kodieren die Einfügung oder Substitution des
Aminosäurerests
76 in Kombination mit einer oder mehreren zusätzlichen Modifikationen. Die
Varianten-DNA-Sequenzen kodieren die Substitution oder Einfügung von
Aminosäureresten
in den folgenden Kombinationen: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104;
76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103;
76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104;
76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265;
76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126;
76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 und/oder 76/103/104/222.
Vorzugsweise kodieren die Varianten-DNA-Sequenzen für die Modifikation
der folgenden Kombinationen von Resten: 76/104; 76/99/104; 76/103/104;
76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104. Diese
rekombinierten DNA-Sequenzen kodieren Carbonylhydrolasevarianten
mit einer neuartigen Aminosäuresequenz
und im Allgemeinen mindestens einer Eigenschaft, die sich wesentlich
von der gleichen Eigenschaft des Enzyms unterscheidet, das durch
die DNA-Sequenz der Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodiert wird. Solche Eigenschaften umfassen proteolytische Aktivität, Substratspezifität, Stabilität, verändertes
pH-Profil und/oder verbesserte Leistungseigenschaften.
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Die
hierin geeigneten Proteaseenzyme umfassen die Substitution beliebiger
der neunzehn natürlich vorkommenden
L-Aminosäuren
an den bezeichneten Aminosäurerest-Positionen.
Solche Substitutionen können
in beliebigem Vorläufersubtilisin
(prokaryotisch, eukaryotisch, von Säugetieren usw.) vorgenommen
werden. In dieser gesamten Anmeldung wird durch gebräuchliche
ein- und dreibuchstabige Codes auf verschiedene Aminosäuren verwiesen.
Solche Codes sind in Dale, J. W., (1989), Molecular Genetics of
Bacteria, John Wiley & Sons,
Ltd., Anhang B, bestimmt.
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Vorzugsweise
umfasst die an den einzelnen identifizierten Aminosäurerest-Positionen
vorzunehmende Substitution, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:
Substitutionen an Position 76, einschließlich D, H, E, G, F, K, P und
N; Substitutionen an Position 99, einschließlich D, T, N, Q, G und S;
Substitutionen an Position 101, einschließlich G, D, K, L, A, E, S und
R; Substitutionen an Position 103, einschließlich Q, T, D, E, Y, K, G, R,
S und A; Substitutionen an Position 104, einschließlich aller
neunzehn natürlich
vorkommenden Aminosäuren;
Substitutionen an Position 107, einschließlich V, L, M, Y, G, E, F,
T, S, A, N und I; Substitutionen an Position 123, einschließlich N,
T, I, G, A, C und S; Substitutionen an Position 27, einschließlich K,
N, C, V und T; Substitutionen an Position 105, einschließlich A,
D, G, R und N; Substitutionen an Position 107, einschließlich A, L,
V, Y, G, F, T, S und A; Substitutionen an Position 109, einschließlich S,
K, R, A, N und D; Substitutionen an Position 126, einschließlich A,
F, I, V und G; Substitutionen an Position 128, einschließlich G,
L und A; Substitutionen an Position 135, einschließlich A,
F, I, S und V; Substitutionen an Position 156, einschließlich D,
E, A, G, Q und K; Substitutionen an Position 166, einschließlich aller
neunzehn natürlich
vorkommenden Aminosäuren;
Substitutionen an Position 195, einschließlich E; Substitutionen an
Position 197, einschließlich
E; Substitutionen an Position 204, einschließlich A, G, C, S und D; Substitutionen
an Position 206, einschließlich
L, Y, N, D und E; Substitutionen an Position 210, einschließlich L,
I, S, C und F; Substitutionen an Position 216, einschließlich V,
E, T und K; Substitutionen an Position 217, einschließlich aller
neunzehn natürlich
vorkommenden Aminosäuren;
Substitutionen an Position 218, einschließlich S, A, G, T und V; Substitutionen
an Position 222, einschließlich
aller neunzehn natürlich
vorkommenden Aminosäuren;
Substitutionen an Position 260, einschließlich P, N, G, A, S, C, K und
D; Substitutionen an Position 265, einschließlich N, G, A, S, C, K, Y und
H; und Substitutionen an Position 274, einschließlich A und S. Die besonders
bevorzugte Aminosäure
bzw. die besonders bevorzugten Aminosäuren, die an solchen einzelnen
Positionen zu substituieren sind, sind nachstehend in Tabelle I
bestimmt. Obwohl in Tabelle I spezifische Aminosäuren aufgeführt sind, sei klargestellt, dass
an den identifizierten Resten eine beliebige Aminosäure substituiert
werden kann. Tabelle
I
Aminosäurerest | Bevorzugte
zu substituierende/einzufügende
Aminosäure |
+76 | D,
H |
+99 | D,
T, N, G |
+101 | R,
G, D, K, L, A, E |
+103 | A,
Q, T, D, E, Y, K, G, R |
+104 | I,
Y, S, L, A, T, G, F, M, W, D, V, N |
+107 | V,
L, Y, G, F, T, S, A, N |
+123 | S,
T, I |
+27 | K |
+105 | A,
D |
+109 | S,
K, R |
+126 | A,
I, V, F |
+128 | G,
L |
+135 | I,
A, S |
+156 | E,
D, Q |
+166 | D,
G, E, K, N, A, F, I, V, L |
+195 | E |
+197 | E |
+204 | A,
G, C |
+206 | L |
+210 | I,
S, C |
+216 | V |
+217 | H,
I, Y, C, A, G, F, S, N, E, K |
+218 | S |
+222 | A,
Q, S, C, I, K |
+260 | P,
A, S, N, G |
+265 | N,
A, G, S |
+274 | A,
S |
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Diese
Proteaseenzyme, die in-vitro-Mutationen in B.-lentus-Subtilisin
an einem Aminosäurerest
enthalten, der zu +76 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent
ist, bilden Subtilisinvarianten, die eine veränderte Stabilität (z. B.
eine modifizierte autoproteolytische Stabilität) gegenüber Vorläufersubtilisinen aufweisen.
(Siehe Tabellen IV und VI.)
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Ebenso
bilden in-vitro-Mutationen an Resten, die zu +99, +101, +103, +104,
+107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195,
+197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder
+274 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent
sind, allein oder in Kombination miteinander und in beliebiger Kombination
mit +76-Mutationen Subtilisinvarianten, die eine veränderte proteolytische
Aktivität,
eine veränderte
Wärmestabilität, ein verändertes
pH-Profil, eine veränderte
Substratspezifität
und/oder veränderte
Leistungseigenschaften aufweisen.
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Carbonylhydrolasen
sind Proteaseenzyme, die Verbindungen hydrolysieren, die
O
C-X
-Bindungen
enthalten, in denen X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie schließen natürlich vorkommende
Carbonylhydrolasen und rekombinierte Carbonylhydrola sen ein. Natürlich vorkommende
Carbonylhydrolasen schließen
hauptsächlich
Hydrolasen ein, z. B. Peptidhydrolasen wie Subtilisine oder Metallproteasen.
Peptidhydrolasen schließen α-Aminoacylpeptidhydrolase,
Peptidylaminosäurehydrolase,
Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallcarboxypeptidase,
Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metallproteinase ein. Serin-, Metall-,
Thiol- und Säureproteasen
sind eingeschlossen, ebenso wie Endo- und Exoproteasen.
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„Rekombinierte
Carbonylhydrolase" bezieht
sich auf eine Carbonylhydrolase, bei der die DNA-Sequenz, welche
die natürlich
vorkommende Carbonylhydrolase kodiert, modifiziert wird, um eine
Mutanten-DNA-Sequenz zu erzeugen, welche die Substitution, Einfügung oder
Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz
der Carbonylhydrolase kodiert. Geeignete Modifikationsverfahren
sind hierin und in
US-Patent
4,760,025 (RE 34,606),
US-Patent
5,204,015 und
US-Patent
5,185,258 eingeschlossen, deren Offenbarung durch Bezugnahme
hierin eingeschlossen ist.
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Subtilisine
sind Bakterien- oder Pilzcarbonylhydrolasen, die im Allgemeinen
so wirken, dass Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden aufgespalten
werden. Wie hier verwendet, bedeutet „Subtilisin" ein natürlich vorkommendes
Subtilisin oder ein rekombiniertes Subtilisin. Eine Reihe von natürlich vorkommenden Subtilisinen
wird bekanntermaßen
von verschiedenen mikrobiellen Spezies gebildet und oftmals sezerniert. Die
Aminosäuresequenzen
der Mitglieder dieser Reihe sind nicht vollständig homolog. Die Subtilisine
in dieser Reihe weisen jedoch die gleiche oder eine ähnliche
Art von proteolytischer Aktivität
auf. Diese Klasse von Serinproteasen weist eine gemeinsame Aminosäuresequenz
auf, die eine katalytische Triade bestimmt, die sie von der Chymotrypsin-verwandten
Klasse von Serinproteasen unterscheidet. Die Subtilisine und die
Chymotrypsin-verwandten Serinproteasen weisen jeweils eine katalytische
Triade auf, die Aspartat, Histidin und Serin umfasst. In den Subtilisin-verwandten
Proteasen lautet die relative Reihenfolge dieser Aminosäuren, vom
Amino- zum Carboxyterminus gesehen, Aspartat-Histidin-Serin. In
den Chymotrypsin-verwandten Proteasen lautet die relative Reihenfolge
jedoch Histidin-Aspartat-Serin. Daher bezieht sich Subtilisin hierin
auf eine Serinprotease mit der katalytischen Triade von Subtilisin-verwandten Proteasen.
Beispiele umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die in 3 hierin
identifizierten Subtilisine.
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„Rekombiniertes
Subtilisin" bezieht
sich auf ein Subtilisin, bei dem die DNA-Sequenz, die das Subtilisin kodiert,
modifiziert wird, um eine Varianten-(oder Mutanten-)DNA-Sequenz
zu erzeugen, welche die Substitution, Deletion oder Einfügung einer
oder mehrerer Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
von natürlich
vorkommendem Subtilisin kodiert. Geeignete Verfahren zur Erzeugung
einer solchen Modifikation, die mit den hierin offenbarten kombiniert
werden können,
schließen
diejenigen ein, die in
US-Patent
4,760,025 (RE 34,606),
US-Patent
5,204,015 und
US-Patent
5,185,258 offenbart sind.
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„Nichtmenschliche
Carbonylhydrolasen" und
die DNA, die sie kodiert, können
aus vielen prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gewonnen
werden. Geeignete Beispiele für
prokaryotische Organismen umfassen gramnegative Organismen wie E.
coli oder Pseudomonas und grampositive Bakterien wie Micrococcus
oder Bacillus. Beispiele für
eukaryotische Organismen, aus denen Carbonylhydrolase und deren Gene
gewonnen werden können,
umfassen Hefe wie Saccharomyces cerevisiae, Pilze wie Aspergillus
sp. und nichtmenschliche Säugetierquellen
wie beispielsweise bovine sp., aus denen das Gen, das die Carbonylhydrolase
Chymosin kodiert, gewonnen werden kann. Wie bei Subtilisinen kann
eine Reihe von Carbonylhydrolasen aus verschiedenen verwandten Spezies
gewonnen werden, die zwar Aminosäuresequenzen
aufweisen, die zwischen den Mitgliedern dieser Reihe nicht vollständig homolog
sind, jedoch trotzdem die gleiche oder eine ähnliche Art von biologischer
Aktivität
aufweisen. Somit weist nichtmenschliche Carbonylhydrolase, wie hier
verwendet, eine funktionelle Definition auf, die sich auf Carbonylhydrolasen
bezieht, die direkt oder indirekt mit prokaryotischen und eukaryotischen
Quellen verbunden sind.
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Eine „Carbonylhydrolasevariante" besitzt eine Aminosäuresequenz,
die von der Aminosäuresequenz einer „Vorläufer-Carbonylhydrolase" abgeleitet ist.
Die Vorläufer-Carbonylhydrolasen
(wie ein Subtilisin) umfassen natürlich vorkommende Carbonylhydrolasen
(Subtilisin) und rekombinierte Carbonylhydrolasen (Subtilisin).
Die Aminosäuresequenz
der Carbonylhydrolasevariante wird durch Substitution, Deletion
oder Einfügung
einer oder mehrerer Aminosäuren
der Vorläufer-Aminosäuresequenz
von der Aminosäuresequenz
der Vorläuferhydrolase „abgeleitet". Eine solche Modifikation
erfolgt an der „Vorläufer-DNA-Sequenz", welche die Aminosäuresequenz
der Vorläufer-Carbonylhydrolase
(Subtilisin) kodiert, und nicht durch Manipulation des Vorläufer-Carbonylhydrolase-(Subtilisin-)Enzyms
als solchem. Geeignete Verfahren für eine solche Manipulation
der Vorläufer-DNA-Sequenz umfassen
hierin offenbarte Verfahren sowie Verfahren, die Fachleuten bekannt
sind (siehe zum Beispiel
EP 0
328299 ,
WO89/06279 und
die US-Patente und -Anmeldungen, auf die hierin bereits verwiesen
wurde).
-
Spezifische
Reste, die Position +76 in Kombination mit einer oder mehreren der
folgenden Positionen +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105,
+109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210,
+216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274 von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin
entsprechen, sind hierin für
eine Mutation identifiziert. Die modifizierten Reste sind aus den
folgenden Kombinationen ausgewählt:
76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104;
76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104;
76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104;
76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260;
76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135;
76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265
und/oder 76/103/104/222; und am meisten bevorzugt sind 76/104; 76/99/104;
76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 und 76/101/104.
Diese Amino säure-Positionsnummern
beziehen sich auf diejenigen, die der in 1 dargestellten
Sequenz von reifem Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin zugewiesen
sind. Die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme
sind jedoch nicht auf die Mutation dieses bestimmten Subtilisins
beschränkt,
sondern erstrecken sich auch auf Vorläufer-Carbonylhydrolasen, die
Aminosäurereste
an Positionen enthalten, die zu den bestimmten identifizierten Resten
in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin „äquivalent" sind. Vorzugsweise ist das Vorläufersubtilisin
Bacillus-lentus-Subtilisin, und die Substitutionen, Deletionen oder
Einfügungen
werden an dem äquivalenten
Aminosäurerest
in B. lentus vorgenommen, der den vorstehend aufgeführten entspricht.
-
Ein
Rest (eine Aminosäure)
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
ist äquivalent
zu einem Rest von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin, wenn er
entweder homolog ist (d. h. der Position in der Primär- oder
Tertiärstruktur
entspricht) oder analog zu einem spezifischen Rest oder Teil dieses
Restes in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin ist (d. h. die gleiche
oder eine ähnliche
funktionelle Fähigkeit
zur chemischen Verbindung, Reaktion oder Interaktion aufweist).
-
Um
Homologie zu der Primärstruktur
festzustellen, wird die Aminosäuresequenz
einer Vorläufer-Carbonylhydrolase
direkt mit der Primärsequenz
von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin
und besonders mit einer Reihe von Resten verglichen, die bekanntermaßen in Subtilisinen,
deren Sequenz bekannt ist, invariant sind. 2 hierin
zeigt die konservierten Reste im Vergleich zwischen Amyloliquefaciens-Subtilisin und B.-lentus-Subtilisin.
Nach der Anordnung der konservierten Reste, die notwendige Einfügungen und
Deletionen ermöglicht,
um die Anordnung aufrechtzuerhalten (d. h. Vermeiden der Eliminierung
von konservierten Resten durch willkürliche Deletion und Einfügung), werden
die Reste bestimmt, die zu bestimmten Aminosäuren in der Primärsequenz
von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent
sind. Bei der Anordnung von konservierten Resten sollten vorzugsweise
100% solcher Reste konserviert werden. Die Anordnung von mehr als
75% oder nur 50% konservierten Resten ist jedoch ebenfalls zur Bestimmung von äquivalenten
Resten ausreichend. Die Konservierung der katalytischen Triade Asp32/His64/Ser221
sollte aufrechterhalten werden.
-
Beispielsweise
sind in 3 die Aminosäuresequenzen
von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis,
Bacillus licheniformis (carlsbergensis) und Bacillus lentus angeordnet,
um für
ein Höchstmaß an Homologie
zwischen den Aminosäuresequenzen
zu sorgen. Ein Vergleich dieser Sequenzen zeigt, dass in jeder Sequenz
mehrere konservierte Reste enthalten sind. Diese konservierten Reste
(im Vergleich zwischen BPN' und
B. lentus) sind in 2 identifiziert.
-
Diese
konservierten Reste können
somit verwendet werden, um die entsprechenden äquivalenten Aminosäurereste
von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin in anderen Carbonylhydrolasen
wie Subtilisin aus Bacillus lentus (PCT-Veröffentlichung Nr.
WO89/06279 , veröffentlicht am 13. Juli 1989),
dem hierin bevorzugten Subtilisin-Vorläuferenzym,
oder dem als PB92 bezeichneten Subtilisin (
EP O 328 299 ), das in hohem
Maße mit
dem bevorzugten Bacillus-lentus-Subtilisin homolog ist, zu bestimmen.
Die Aminosäuresequenzen
bestimmter dieser Subtilisine sind in den
3A und
3B zusammen
mit der Sequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin angeordnet, um eine maximale
Homologie der konservierten Reste zu erzielen. Wie zu sehen ist,
weist die Sequenz von Bacillus-lentus- im Vergleich zu Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin
mehrere Deletionen auf. So ist beispielsweise die äquivalente
Aminosäure
zu Val165 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin in den anderen
Subtilisinen von B. lentus und B. licheniformis Isoleucin.
-
So
ist zum Beispiel sowohl in B. -amyloliquefaciens- als auch in B.
-lentus-Subtilisin Asparagin (N) die Aminosäure an Position +76. In der
bevorzugten Subtilisinvariante, die in der Erfindung geeignet ist,
ist die Aminosäure,
die zu +76 in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent
ist, jedoch durch Aspartat (D) substituiert. Ein Vergleich aller
hierin zur Substitution identifizierten Aminosäurereste mit der bevorzugten
Substitution für
solche einzelnen Positionen ist in Tabelle II zu Veranschaulichungszwecken
aufgeführt. Tabelle
II
| +76 | +99 | +101 | +103 | +104 | +107 | +123 |
B.
amyloliquefaciens (Wildtyp) | N | D | S | Q | Y | I | N |
B.
lentus (Wildtyp) | N | S | S | S | V | I | N |
Bevorzugteste
Substitution | D | D | R | A | I/Y | V | S |
-
Für eine Vorläufer-Carbonylhydrolase,
deren Tertiärstruktur
durch Röntgenkristallographie
bestimmt wurde, können äquivalente
Reste auch durch Bestimmung der Homologie auf der Ebene der Tertiärstruktur bestimmt
werden. Äquivalente
Reste sind als diejenigen definiert, bei denen die Atomkoordinaten
von zwei oder mehr der Hauptkettenatome eines bestimmten Aminosäurerests
der Vorläufer-Carbonylhydrolase
und von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin (N auf N, CA auf CA,
C auf C und O auf O) nach der Anordnung innerhalb von 0,13 nm und
vorzugsweise 0,1 nm liegen. Die Anordnung wird erreicht, nachdem
das beste Modell so ausgerichtet und positioniert wurde, dass sich
eine maximale Überlappung
der Atomkoordinaten von Nichtwasserstoff-Proteinatomen der jeweiligen
Carbonylhydrolase mit dem Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin
ergibt. Das beste Modell ist das kristallographische Modell, das
den niedrigsten R-Faktor für
experimentelle Diffraktionsdaten bei der höchsten verfügbaren Auflösung ergibt.
-
-
Äquivalente
Reste, die funktionell analog zu einem spezifischen Rest von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin
sind, sind als diejenigen Aminosäuren
der Vorläufer-Carbonylhydrolasen
definiert, die eine solche Konformation annehmen können, dass
sie Proteinstruktur, Substratbindung oder Katalyse in einer Weise ändern, modifizieren
oder dazu beitragen, die für
einen spezifischen Rest des Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisins
definiert ist und diesem zugeschrieben wird. Ferner sind sie diejenigen
Reste der Vorläufer-Carbonylhydrolase
(für die
eine Tertiärstruktur
durch Röntgenkristallographie
erhalten wurde), die eine analoge Position in dem Maße einnehmen,
dass, obwohl die Hauptkettenatome des bestimmten Rests möglicherweise
nicht die Äquivalenzkriterien
auf der Grundlage der Einnahme einer homologen Position erfüllen, die
Atomkoordinaten von mindestens zwei der Seitenkettenatome des Rests
auf 0,13 nm genau mit den entsprechenden Seitenkettenatomen von
Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin übereinstimmen. Die Koordinaten
der dreidimensionalen Struktur von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin sind in
der
EPO-Veröffentlichung
Nr. 0 251 446 (entspricht der
US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/212,291 ,
deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist) dargelegt
und können
wie vorstehend umrissen zur Bestimmung von äquivalenten Resten auf der
Ebene der Tertiärstruktur
verwendet werden.
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Einige
der für
Substitution, Einfügung
oder Deletion identifizierten Reste sind konservierte Reste, andere
dagegen nicht. Im Falle von Resten, die nicht konserviert sind,
ist die Ersetzung einer oder mehrerer Aminosäuren auf Substitutionen beschränkt, die
eine Variante mit einer Aminosäuresequenz
ergeben, die nicht einer in der Natur vorkommenden entspricht. Im
Falle von konservierten Resten sollten solche Ersetzungen nicht zu
einer natürlich
vorkommenden Sequenz führen.
Die in der vorliegenden Erfindung geeigneten Carbonylhydrolasevarianten
schließen
die reifen Formen von Carbonylhydrolasevarianten sowie die Pro-
und Präproformen
solcher Hydrolasevarianten ein. Die Präproformen stellen den bevorzugten
Aufbau dar, da dies die Expression, Sekretion und Reifung der Carbonylhydrolasevarianten
erleichtert.
-
„Prosequenz" bezieht sich auf
eine an den N-terminalen Teil der reifen Form einer Carbonylhydrolase gebundene
Sequenz von Aminosäuren,
deren Entfernung zum Auftreten der „reifen" Form der Carbonylhydrolase führt. Viele
proteolytische Enzyme kommen in der Natur als Translations-Proenzymprodukte
vor und werden auf diese Weise expressiert, wenn sie nach der Translation
nicht verarbeitet werden. Eine bevorzugte Prosequenz für die Bildung
von Carbonylhydrolasevarianten, besonders Subtilisinvarianten, ist
die mutmaßliche
Prosequenz von Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin, obwohl andere
Subtilisin-Prosequenzen
verwendet werden können.
In den Beispielen wird die mutmaßliche Prosequenz des Subtilisins
aus Bacillus lentus (ATCC 21536) verwendet.
-
Eine „Signalsequenz" oder „Präsequenz" bezieht sich auf
eine beliebige an den N-terminalen Teil einer Carbonylhydrolase
oder an den N-terminalen Teil einer Prohydrolase gebundene Sequenz
von Aminosäuren, die
an der Sekretion der reifen Form oder der Proform der Hydrolase
beteiligt sein kann. Diese Definition von Signalsequenz ist eine
funktionelle, die alle diejenigen durch den N-terminalen Teil des
Subtilisingens oder anderer sezemierbarer Carbonylhydrolasen kodierten
Aminosäuresequenzen
einschließen
soll, die an der Bewirkung der Sekretion von Subtilisin oder anderen
Carbonylhydrolasen unter nativen Bedingungen beteiligt sind. Die
für die
vorliegende Erfindung geeigneten Proteaseenzyme nutzen solche Sequenzen,
um die Sekretion der Carbonylhydrolasevarianten, wie hier beschrieben,
zu bewirken. Eine bevorzugte Signalsequenz, die in den Beispielen
verwendet wird, umfasst die ersten sieben Aminosäurereste der Signalsequenz
von Bacillus-subtilis-Subtilisin, fusioniert mit dem Rest der Signalsequenz
des Subtilisins aus Bacillus lentus (ATCC 21536).
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Eine „Präpro"-Form einer Carbonylhydrolasevariante
besteht aus der reifen Form der Hydrolase mit einer Prosequenz,
die operabel mit dem Aminoterminus der Hydrolase verbunden ist,
und einer „Prä"- oder „Signal"-Sequenz, die operabel
mit dem Aminoterminus der Prosequenz verbunden ist.
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„Expressionsvektor" bezieht sich auf
ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die operabel mit einer
geeigneten Steuersequenz verbunden ist, die in der Lage ist, die
Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken.
-
Solche
Steuersequenzen umfassen einen Promotor zur Bewirkung einer Transkription,
eine fakultative Operatorsequenz zur Regulierung der Transkription,
eine Sequenz, die geeignete mRNA-Ribosomenbindungsstellen kodiert,
und Sequenzen, die das Ende von Transkription und Translation steuern.
Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach ein
potenzielles genomisches Insert sein. Sobald der Vektor in einen
geeigneten Wirt transformiert wurde, kann er sich replizieren und
unabhängig
vom Wirtsgenom funktionieren oder sich in einigen Fällen in
das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" mitunter austauschbar
verwendet, da das Plasmid gegenwärtig
die am häufigsten
verwendete Vektorform ist. Hierin eingeschlossen sind jedoch solche
anderen Formen von Expressionsvektoren, die äquivalente Funktionen erfüllen und
die im Stand der Technik bekannt sind oder bekannt werden.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten „Wirtszellen" sind im Allgemeinen
prokaryotische oder eukaryotische Wirte, die vorzugsweise durch
die in
US-Patent 4,760,025 (RE
34,606) offenbarten Verfahren manipuliert wurden, damit sie keine
enzymatisch aktive Endoprotease sezernieren können. Eine bevorzugte Wirtszelle
zum Expressieren von Subtilisin ist der Bacillus-Stamm BG2036, der
keine enzymatisch aktive neutrale Protease und alkalische Protease
(Subtilisin) aufweist. Der Aufbau des Stamms BG2036 ist in
US-Patent 5,264,366 ausführlich beschrieben.
Andere Wirtszellen zum Expressieren von Subtilisin umfassen Bacillus subtilis
I168 (ebenfalls in
US-Patent
4,760,025 (RE 34,606) und
US-Patent
5,264,366 beschrieben, deren Offenbarungen durch Bezugnahme
hierin eingeschlossen sind) sowie einen beliebigen geeigneten Bacillus-Stamm
wie B. licheniformis, B. lentus usw.
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Wirtszellen
werden mit Vektoren transformiert oder transfiziert, die mit Hilfe
rekombinierter DNA-Techniken konstruiert wurden. Solche transformierten
Wirtszellen sind in der Lage, entweder Vektoren zu replizieren,
welche die Carbonylhydrolasevarianten kodieren, oder die gewünschte Carbonylhydrolasevariante
zu expressieren. Im Falle von Vektoren, welche die Prä- oder Präproform
der Carbonylhydrolasevariante kodieren, werden solche Varianten,
wenn sie expressiert werden, in der Regel aus der Wirtszelle in
das Wirtszellenmedium sezerniert.
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„Operabel
verbunden" bedeutet
bei der Beschreibung der Beziehung zwischen zwei DNA-Regionen einfach,
dass sie funktionell in Beziehung zueinander stehen. Beispielsweise
ist eine Präsequenz
operabel mit einem Peptid verbunden, wenn sie als Signalsequenz
fungiert, die an der Sekrektion der reifen Form des Proteins beteiligt
ist, die höchstwahrscheinlich
die Aufspaltung der Signalsequenz einschließt. Ein Promotor ist operabel
mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription
der Sequenz steuert; eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel mit
einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist,
dass sie eine Translation erlaubt.
-
Die
Gene, welche die natürlich
vorkommende Vorläufer-Carbonylhydrolase
kodieren, können
nach den allgemeinen Verfahren gewonnen werden, die Fachleuten bekannt
sind. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Synthetisieren von
markierten Sonden mit mutmaßlichen
Sequenzen, welche die Regionen der jeweiligen Hydrolase kodieren,
die Herstellung von Genombibliotheken von Organismen, welche die
Hydrolase expressieren, und das Screening der Bibliotheken auf das
jeweilige Gen durch Hybridisierung an die Sonden. Anschließend werden
positiv hybridisierende Klone kartiert und sequenziert. Das in den
Beispielen verwendete B.-lentus-Gen wird geklont, wie in Beispiel
1 von
US-Patent 5,185,258 beschrieben,
dessen Offenbarung hierin eingeschlossen ist. Das in den Beispielen
verwendete BPN'-Gen
wird geklont, wie in Beispiel 1 in RE 34,606 beschrieben, dessen
Offenbarung hierin eingeschlossen ist.
-
Anschließend wird
die geklonte Carbonylhydrolase zur Transformation einer Wirtszelle
verwendet, um die Hydrolase zu expressieren. Anschließend wird
das Hydrolasegen in ein High-copy-number-Plasmid ligiert. Dieses
Plasmid repliziert sich in Wirten in dem Sinne, dass es die wohl
bekannten Elemente enthält,
die zur Plasmidreplikation erforderlich sind: einen operabel mit
dem jeweiligen Gen verbundenen Promotor (der, falls er vom Wirt
erkannt, d. h. transkribiert, wird, als der eigene homologe Promotor
des Gens bereitgestellt werden kann), eine Region für Transkriptionsende
und Polyadenylierung (in bestimmten eukaryotischen Wirtszellen für die Stabilität der durch
den Wirt aus dem Hydrolasegen transkribierten mRNA erforderlich),
die exogen ist oder durch den endogenen Terminatorbereich des Hydrolasegens
bereitgestellt wird, und wünschenswerterweise ein
Selektionsgen, wie ein Gen für
Antibiotikaresistenz, das die kontinuierliche Aufrechterhaltung
von Kulturen plasmidinfizierter Wirtszellen durch Wachstum in antibiotikahaltigen
Medien ermöglicht.
High-copy-number-Plasmide
enthalten auch einen Replikationsursprung für den Wirt und ermöglichen
dadurch das Erzeugen einer großen
Anzahl von Plasmiden im Zytoplasma ohne Chromosomenbeschränkungen.
Es liegt jedoch innerhalb des Schutzumfangs hierin, die multiplen
Kopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Dies
wird durch prokaryotische und eukaryotische Organismen erleichtert,
die besonders anfällig
für homologe Rekombination
sind.
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Die
in den vorliegenden Beispielen verwendeten Gene sind ein natürliches
B.-lentus-Gen und ein natürliches
B.-amyloliquefaciens-Gen. Als Alternative kann ein synthetisches
Gen, das eine natürlich
vorkommende oder mutante Vorläufer-Carbonylhydrolase
(Subtilisin) kodiert, hergestellt werden. Bei einer solchen Herangehensweise
wird die DNA- und/oder die Aminosäuresequenz der Vorläuferhydrolase
(Subtilisin) bestimmt. Danach werden multiple, überlappende synthetische Einzelstrang-DNA-Fragmente
synthetisiert, die bei Hybridisierung und Ligation eine synthetische
DNA bilden, welche die Vorläuferhydrolase
kodiert. Ein Beispiel für
die Konstruktion eines synthetischen Gens ist in Beispiel 3 von
US-Patent 5,204,015 dargelegt,
dessen Offenbarung durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist.
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Sobald
das natürlich
vorkommende oder synthetische Vorläufer-Carbonylhydrolase-Gen geklont wurde,
wird eine Reihe von Modifikationen durchgeführt, um die Nutzung des Gens über die
Synthese der natürlich vorkommenden
Vorläufer-Carbonylhydrolase
hinaus zu erweitern. Solche Modifikationen umfassen die Bildung
von rekombinierten Carbonylhydrolasen, wie in
US-Patent 4,760,025 (RE 34,606) und
in der
EPO-Veröffentlichung
Nr. 0 251 446 offenbart, und die Bildung von hierin beschriebenen
Carbonylhydrolasevarianten.
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Das
folgende Kassettenmutagenese-Verfahren kann angewendet werden, um
die Konstruktion und Identifikation der in der vorliegenden Erfindung
geeigneten Carbonylhydrolasevarianten zu erleichtern, obwohl andere
Verfahren, einschließlich
ortsgerichteter Mutagenese, angewendet werden können. Zuerst wird das natürlich vorkommende
Gen, das die Hydrolase kodiert, gewonnen und ganz oder teilweise
sequenziert. Anschließend
wird die Sequenz nach einer Stelle abgesucht, an der eine Mutation
(Deletion, Einfügung
oder Substitution) einer oder mehrerer Aminosäuren in dem kodierten Enzym
vorgenommen werden soll. Die Sequenzen, die diese Stelle flankieren,
werden auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen für das Ersetzen
eines kurzen Gensegments durch einen Oligonukleotid-Pool beurteilt,
der verschiedene Mutanten kodiert, wenn er expressiert wird. Solche
Restriktionsstellen sind vorzugsweise nur einmal vorhandene Stellen
innerhalb des Hydrolasegens, um die Ersetzung des Gensegments zu
erleichtern. Es kann jedoch eine beliebige geeignete Restriktionsstelle,
die nicht in übermäßig hoher
Anzahl in dem Hydrolasegen vorhanden ist, verwendet werden, mit
der Maßgabe,
dass die durch die Restriktionsverdauung erzeugten Genfragmente
in der richtigen Sequenz wieder zusammengesetzt werden können. Wenn
an Orten innerhalb eines angemessenen Abstands von der ausgewählten Stelle
(von 10 bis 15 Nukleotide) keine Restriktionsstellen vorhanden sind,
werden solche Stellen erzeugt, indem Nukleotide in dem Gen so substituiert
werden, dass in dem endgültigen
Aufbau weder der Leserahmen noch die kodierten Aminosäuren geändert werden.
Eine Mutation des Gens, um seine Sequenz so zu ändern, dass sie mit der gewünschten
Sequenz übereinstimmt,
wird durch M13-Primerextension nach allgemein bekannten Verfahren
erreicht. Die Aufgabe der Lokalisierung von geeigneten Flankenregionen
und der Bewertung der erforderlichen Änderungen, um zwei geeignete
Restriktionsstellen-Sequenzen zu finden, wird durch die Redundanz
des genetischen Codes, eine Restriktionsenzymkarte des Gens und
die große
Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme zur Routine. Es ist zu beachten,
dass für
den Fall, dass eine geeignete flankierende Restriktionsstelle verfügbar ist,
das vorstehende Verfahren nur in Verbindung mit der Flankenregion
angewendet werden muss, die keine Stelle enthält.
-
Sobald
die natürlich
vorkommende DNA oder die synthetische DNA geklont wurde, werden
die Restriktionsstellen, welche die zu mutierenden Positionen flankieren,
mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, und eine Vielzahl
von zu Endtermini komplementären
Oligonukleotidkassetten wird in das Gen ligiert. Die Mutagenese
wird durch dieses Verfahren vereinfacht, da alle Oligonukleotide
so synthetisiert werden können,
dass sie die gleichen Restriktionsstellen aufweisen, und keine synthetischen
Linker erforderlich sind, um die Restriktionsstellen zu erzeugen.
-
Wie
hier verwendet, ist proteolytische Aktivität als die Geschwindigkeit der
Hydrolyse von Peptidbindungen pro Milligramm aktives Enzym definiert.
Zur Messung der proteolytischen Aktivität bestehen zahlreiche wohl
bekannte Verfahren (K. M. Kalisz, „Microbial Proteinases", Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology, Hrsg. A. Fiechter, 1988). Zusätzlich oder
als Alternative zu modifizierter proteolytischer Aktivität können die
Variantenenzyme der vorliegenden Erfindung andere modifizierte Eigenschaften
wie Km, Kcat, das Verhältnis Kcat/Km und/oder eine
modifizierte Substratspezifität
und/oder ein modifiziertes pH-Aktivitätsprofil aufweisen. Diese Enzyme
können
auf das bestimmte Substrat zugeschnitten werden, das der Erwartung
nach vorhanden ist, beispielsweise für hydrolytische Prozesse wie
Wäschewaschanwendungen.
-
Eine
Aufgabe kann darin liegen, eine Varianten-Carbonylhydrolase zu gewinnen,
die eine veränderte proteolytische
Aktivität
im Vergleich zu der Vorläufer-Carbo nylhydrolase
aufweist, da die Erhöhung
einer solchen Aktivität
(numerisch größer) ermöglicht,
dass das Enzym so verwendet wird, dass es an einem Zielsubstrat
wirksamer ist. Ebenfalls von Interesse sind Variantenenzyme mit
einer veränderten
Wärmestabilität und/oder
einer veränderten
Substratspezifität
im Vergleich zum Vorläufer.
Vorzugsweise ist die zu mutierende Carbonylhydrolase ein Subtilisin.
In den Beispielen werden spezifische Aminosäuren dargestellt, die dazu
geeignet sind, solche Ergebnisse bei subtilisinartigen Carbonylhydrolasen
an Resten zu erzielen, die zu +76, +99, +101, +103, +104, +107,
+123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197,
+204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 und/oder +274
oder einer beliebigen Kombination davon in Bacillus-amyloliquefaciens-Subtilisin äquivalent
sind. In einigen Fällen
kann eine geringere proteolytische Aktivität wünschenswert sein. Dagegen kann
es in einigen Fällen
wünschenswert
sein, die proteolytische Aktivität
des Variantenenzyms gegenüber
seinem Vorläufer
zu erhöhen.
Darüber
hinaus können
Erhöhungen
oder Verringerungen (Änderung)
der Stabilität
der Variante, ob alkalische Stabilität oder Wärmestabilität, wünschenswert sein. Erhöhungen oder
Verringerungen von Kcat, Km oder
Kcat/Km sind spezifisch
für das
Substrat, das zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet
wird.
-
Außerdem wurde
festgestellt, dass zu +76 äquivalente
Reste in Kombination mit einer Reihe von anderen Modifikationen
in Subtilisin wichtig bei der Modulierung der Gesamtstabilität und/oder
der proteolytischen Gesamtaktivität des Enzyms sind. Daher kann,
wie in den Beispielen dargelegt, in den bevorzugten Proteaseenzymen
das Asparagin (N) in Bacillus-lentus-Subtilisin an der äquivalenten
Position +76 durch Aspartat (D) in Kombination mit der Modifikation
eines oder mehrerer der folgenden Aminosäurereste +103, +104 substituiert
werden, um eine verbesserte Stabilität und/oder eine verbesserte
Aktivität
des resultierenden Mutantenenzyms zu erzielen.
-
Die
am meisten bevorzugten Proteaseenzyme, die in dieser Erfindung geeignet
sind, sind in den Beispielen dargelegt. Diese schließen die
folgenden spezifischen Kombinationen von substituierten Resten ein: N76D/V104I;
N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V
und N76D/S101R/S103A/V104I. Diese Substitutionen werden in Bacillus-lentus-Subtilisin
(rekombiniert oder nativ) vorgenommen, obwohl die Substitutionen
in beliebigem Bacillus-Subtilisin vorgenommen werden können.
-
Auf
der Grundlage der mit diesem und anderen Varianten-Subtilisinen
erzielten Ergebnisse ist offensichtlich, dass Reste in Carbonylhydrolasen
(vorzugsweise Subtilisin), die den Positionen +76, +99, +101, +103,
+104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166,
+195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265
und/oder +274 in Bacillus amyloliquefaciens entsprechen, wichtig
für die proteolytische
Aktivität,
die Leistung und/oder die Stabilität dieser Enzyme und die Reinigungs-
oder Waschleistung solcher Variantenenzyme sind.
-
Das
Nachfolgende wird als Beispiel für
die Herstellung von Proteaseenzymen, die in den Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, aufgeführt.
-
Proteaseherstellungsbeispiel
-
Konstruktion für die Expression des GG36-Gens
in B. subtilis
-
Die
Klonung und die Konstruktion für
die Expression des Subtilisingens aus B. lentus werden im Wesentlichen
auf dieselbe Weise durchgeführt
wie in
US-Patent 5,185,258 beschrieben.
Das Plasmid GGA274 (in
4 hierin beschrieben) wird
ferner auf die folgende Weise modifiziert, wie in
5 gezeigt.
Die PstI-Stelle, die während
der Konstruktion des Plasmids GGA274 eingeführt wird, wird durch die nachfolgend
beschriebene Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese mit einem Oligonukleotid
mit der folgenden Sequenz entfernt: 5' GAAGCTGCA
ACTCGTTAAA
3' (Seq.-ID Nr.
1). Der unterstrichene Rest „A" eliminiert die Erkennungssequenz des
Restriktionsenzyms PstI und ändert
den entsprechenden Aminosäurerest
an Position 274 von Alanin in Threonin. Threonin an Position 274
ist der Wildtyp-Rest, der ur sprünglich
in den geklonten Gensequenzen von B.-lentus-Subtilisin zu finden
war. Das DNA-Segment, das Subtilisin kodiert, wird durch EcoRI-
und BamHI-Verdau aus dem Plasmid GGA274 oder dessen Derivaten (GGT274
in
5 gezeigt) exzidiert. Das DNA-Fragment wird für die Mutagenese
zurück
in Vektoren, die auf dem Bakteriophagen M13 basieren, wie MP19,
subgeklont. Nach der Mutagenese werden der EcoRI- und der HindIII-Verdau,
gefolgt von Klonung, durchgeführt,
um das mutierte Subtilisingen wieder in ein Expressionsplasmid wie
GGA274 für
die Expression und die Wiedergewinnung mutierter Subtilisinproteine
zurückzuführen.
-
Oligonukleotid-gerichtete
Mutagenese
-
Eine
Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wird durchgeführt, wie
in Zoller, M., et al. (1983), Methods Enzymol., 100: 468-500, beschrieben.
Als Beispiel wird ein synthetisches Oligonukleotid mit der Sequenz
5' GCTGCTCTAGACAATTCG
3' (Seq.-ID Nr.
2) verwendet, um den Aminosäurerest
an Position 76 von Asparagin (N) in Asparaginsäure (D), oder N76D, zu ändern. Die
unterstrichenen Reste „G" und „C" kennzeichnen Änderungen
gegenüber
der Wildtyp-Gensequenz. CA hält das Leucin
an Position +75 und ändert
die Aminosäuresequenz,
um eine XbaI-Erkennungsregion des XbaI-Restriktionsenzyms (TCTAGA)
einzuführen,
während
durch die Änderung
an GAC Asparagin an +76 in
Aspartat geändert
wird.
-
Für eine Mutagenese
an den Positionen 99, 101, 103 und 104 können je nach der gewünschten
Kombination von Mutationen verschiedene Oligonukleotide verwendet
werden. Beispielsweise wird ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT
3' (Seq.-ID Nr.
3) verwendet, um gleichzeitig die folgenden Änderungen vorzunehmen: S99D,
S101R, S103A und V104I in einem einzigen Subtilisinmolekül. In ähnlicher
Weise werden Oligonukleotide mit der Sequenz 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (Seq.-ID Nr. 4)
und 5' CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG
3' (Seq.-ID Nr.
5) verwendet, um I107V bzw. N123S zu erzeugen. Die unterstrichenen
Reste kennzeichnen wiederum Änderungen
gegenüber
den Wildtyp-Sequenzen, durch die gewünschte Änderun gen von Aminosäuresequenzen
oder Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen erzielt werden.
-
Proteolytische Aktivität von Subtilisinvarianten
-
Unter
Befolgung der vorstehenden Verfahren der Oligonukleotid-gerichteten
Mutagenese werden die in Tabelle III aufgeführten Varianten hergestellt.
Die proteolytische Aktivität
dieser einzelnen Subtilisinvarianten ist in Tabelle III angegeben.
Die kinetischen Parameter k
cat, K
M und k
cat/K
M werden für die Hydrolyse des synthetischen
Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid unter Anwendung des
Verfahrens gemessen, das in P. Bonneau et al. (1991), J. Am. Chem.
Soc., Bd. 113, Nr. 3, S. 1030, beschrieben ist. Kurz gesagt, wird
ein kleiner Aliquot der Stammlösung
einer Subtilisinvariante in eine 1-cm-Küvette gegeben, die in 0,1 M
Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, gelöstes
und auf 25°C
thermostatiertes Substrat enthält.
Der Reaktionsfortschritt wird spektralphotometrisch durch Überwachung
der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm verfolgt.
Die kinetischen Parameter werden unter Anwendung eines Algorithmus
für nichtlineare
Regression erhalten, um die Reaktionsgeschwindigkeit und die Produktkonzentration
für jede
Reaktion an die Michaelis-Menten-Gleichung anzupassen. Tabelle
III Kinetische
Parameter k
cat, K
M und
k
cat/K
M Gemessen
für Bacillus
lentus Subtilisin und Varianten
Protease Nr. | Enzymvarianten | kcat(s –1) | KM(M) | kcat/KM (s–1M–1) |
- | B.-lentus-Subtilisin | 170 | 0,00078 | 2,18 × 105 |
- | N76D | 219 | 0,0008 | 2,74 × 105 |
1 | N76D/S99D | 88 | 0,00061 | 1,44 × 105 |
2 | N76D/S101R | 371 | 0,0013 | 2,85 × 105 |
3 | N76D/S103A | 400 | 0,0014 | 2,86 × 105 |
4 | N76D/V104I | 459 | 0,0011 | 4,17 × 105 |
5 | N76D/I107V | 219 | 0,0011 | 1,99 × 105 |
6 | N76D/N123S | 115 | 0,0018 | 6,40 × 104 |
7 | N76D/S99D/S101R | 146 | 0,00038 | 3,84 × 105 |
8 | N76D/S99D/S103A | 157 | 0,0012 | 1,31 × 105 |
9 | N76D/S99D/V104I | 247 | 0,00097 | 2,55 × 105 |
10 | N76D/S101R/S103A | 405 | 0,00069 | 5,90 × 105 |
11 | N76D/S101R/V104I | 540 | 0,00049 | 1,10 × 106 |
12 | N76D/S103A/V104I | 832 | 0,0016 | 5,20 × 105 |
13 | N76D/V104I/I107V | 497 | 0,00045 | 1,10 × 106 |
14 | N76D/V104Y/I107V | 330 | 0,00017 | 1,90 × 106 |
15 | N76D/V104I/N123S | 251 | 0,0026 | 9,65 × 104 |
16 | N76D/I107V/N123S | 147 | 0,0035 | 4,20 × 104 |
17 | N76D/S99D/S101R/S103A | 242 | 0,00074 | 3,27 × 105 |
18 | N76D/S99D/S101R/V104I | 403 | 0,00072 | 5,60 × 105 |
19 | N76D/S99D/S103A/V104I | 420 | 0,0016 | 2,62 × 105 |
20 | N76D/S101R/S103A/V104I | 731 | 0,00065 | 1,12 × 106 |
21 | N76D/S103A/V104I/N123S | 321 | 0,0026 | 1,23 × 105 |
22 | N76D/V104I/I107V/N123S | 231 | 0,003 | 7,70 × 104 |
23 | N76D/S99D/S101R/S103A/V104I | 624 | 0,00098 | 6,37 × 105 |
24 | N76D/S99D/S103A/V104I/N123S | 194 | 0,0043 | 4,51 × 104 |
25 | N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S | 311 | 0,0023 | 1,35 × 105 |
-
Die
in Tabelle III aufgeführten
Ergebnisse lassen darauf schließen,
dass alle getesteten Subtilisinvarianten proteolytische Aktivität beibehalten.
Ferner macht eine detaillierte Analyse der Daten deutlich, dass
die proteolytische Aktivität
bei Bacillus-lentus-Subtilisin durch die verschiedenen Kombinationen
von Substitutionen an Aminosäureresten,
die zu den Positionen 76, 99, 101, 103, 104, 107 und 123 in Bacillus
amyloliquefaciens äquivalent
sind, erheblich verändert
wird.
-
Wärmestabilität von Subtilisinvarianten
-
Ein
Vergleich der beobachteten Wärmestabilität für Bacillus-lentus-Subtilisin
und die Varianten der vorliegenden Erfindung, die durch das vorstehende
Verfahren der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese hergestellt
wurden, ist in Tabelle IV aufgeführt.
Gereinigtes Enzym, 15 μg/ml
in 0,1 M Glycin, 0,01% Tween-80, pH 10,0, mit oder ohne 50 mM CaCl
2, wird in kleine Röhrchen aliquotiert und bei 10°C 5 Minuten
lang, bei 10°C bis
60°C über 1 Minute
und bei 60°C
20 Minuten lang inkubiert. Anschließend werden die Röhrchen 10
Minuten lang auf Eis gelegt. Aliquots aus den Röhrchen werden auf Enzymaktivität getestet,
indem sie in 1-cm-Küvetten gegeben
werden, die 1,2 mM des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid,
gelöst
in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, thermostatiert auf 25°C, enthalten.
Die anfängliche
lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung
der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als
Funktion der Zeit verfolgt. Die Daten werden als prozentuale Aktivität vor dem
Erhitzen angegeben. Die in Tabelle IV aufgeführten Ergebnisse lassen darauf
schließen,
dass unter der Testbedingung mit Zugabe von 50 mM CaCl
2 eine
große
Mehrzahl von Varianten eine Wärmestabilität zeigt,
die mit Bacillus-lentus-Subtilisin vergleichbar ist (24 von 26).
Unter der Testbedingung ohne Zugabe von 50 mM CaCl
2 ist
eine große
Mehrzahl von Varianten (19 von 26) wesentlich stabiler als Bacillus-lentus-Subtilisin.
Ferner sind unter der Testbedingung ohne Zugabe von 50 mM CaCl
2 die Varianten N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I,
N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/I107V und N76D/S101R/S103A/V104I
wesentlich stabiler als die Einzelsubstitutionsvariante N76D. Tabelle
IV Gemessene
Wärmestabilität für Bacillus-lentus-Subtilisin
und Varianten Bei
pH 10, 60°C,
+/– Zugabe
von 50 mM CaCl
2 | Verbleibende
anfängliche
Aktivität
(%) |
Enzym | –CaCl, | +CaCl, |
B.-lentus-Subtilisin | 2 | 96 |
N76D | 34 | 97 |
N76D/S99D | 49 | 98 |
N76D/S101R | 0 | 82 |
N76D/S103A | 26 | 92 |
N76D/V104I | 58 | 98 |
N76D/I107V | 32 | 96 |
N76D/N123S | 0 | 97 |
N76D/S99D/S101R | 30 | 100 |
N76D/S99D/S103A | 36 | 100 |
N76D/S99D/V104I | 48 | 97 |
N76D/S101R/S103A | 26 | 100 |
N76D/S101R/V104I | 38 | 100 |
N76D/S103A/V104I | 58 | 100 |
N76D/V104I/I107V | 60 | 97 |
N76D/V104Y/I107V | 48 | 74 |
N76D/V104I/N123S | 0 | 98 |
N76D/I107V/N123S | 16 | 100 |
N76D/S99D/S101R/S103A | 38 | 100 |
N76D/S99D/S101/V104I | 33 | 100 |
N76D/S99D/S103A/V104I | 38 | 98 |
N76D/S101R/S103A/V104I | 40 | 99 |
N76D/S103A/V104I/N123S | 1 | 98 |
N76D/V104I/I107V/N123S | 3 | 99 |
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I | 36 | 99 |
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S | 2 | 95 |
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N
123S | 0 | 100 |
-
Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese mit
aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage
-
A. Konstruktion von B.-lentus-Varianten
-
Das
Mutageneseprotokoll ist im Wesentlichen das gleiche wie vorstehend
im Abschnitt über
Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese beschrieben. Die Einzelstrang-DNA-Vorlage
wird durch das Phagemid-Verfahren erzeugt. Um den Phagemid-Vektor
zur Erzeugung der Einzelstrang-DNA-Vorlage zu konstruieren, wird
zunächst
der Vektor pBCDAICAT konstruiert. Das Flussdiagramm für die Vektorkonstruktion
ist in 8 dargestellt. Zuerst wird
das ClaI-ClaI-Fragment, welches das CAT-Gen aus dem Plasmid pC194
kodiert (Horinouchi, S., und Weisblum, B., J. Bacteriol., 150: 8-15,
1982) in die AccI-Stelle der Polylinker-Region von pUC19 (New England
BioLabs, Beverly, MA) hineingeklont, um das Plasmid pUCCHL herzustellen,
und das 0,6-kb-EcoRI-DraI-Fragment aus dem 5'-Ende der GG36DAI-kodierenden DNA wird
in die Stellen EcoRI und EcoRV des Plasmids pBSKS (Stratagene, Inc.,
San Diego, CA) hineingeklont, um pBC2SK5 herzustellen. Die einzelne EcoRI-Stelle
des Plasmids pBC2SK5 wird durch EcoRI-Verdauung eliminiert, gefolgt
von Auffüllung
mit T4-katalysierter DNA-Polymerase und Religation zur Erzeugung
des Plasmids pBC2SK-5R, das nicht die EcoRI-Stelle aufweist. Das
EcoRI-DraI-Fragment, das in pBCSK-5R hineingeklont wird, wird als
ein PstI-HindIII-Fragment isoliert und in die PstI-HindIII-Stelle
des pUCCHL (Teil des Polylinkers von pUC19) hineingeklont, um das
Plasmid pUCCHL5R zu erzeugen. Die Kodierungssequenz des Gens GG36DAI
wird als ein EcoRI-BamHI-Fragment exzidiert und in die EcoRI-BamHI-Stellen
von pUCCHL5R hineingeklont, um pUCCAT herzustellen. Anschließend wird
das große
EcoRI-HindIII-Fragment von pUCCAT in die Stellen EcoRI und HindIII
von BS2KS+ hineingeklont, um das Plasmid pBCDAICAT herzustellen.
-
Um
Einzelstrang-DNA zu erzeugen, werden E.-coli-haltige pBCDAICAT nach
dem Protokoll, das in Russel, M., Kidd, S., und Kelley, M. R., GENE
45: 333-338, 1986, beschrieben ist, mit dem Phagen R408 (erhältlich von
Stratagene, San Diego, CA) infiziert. Sobald die Einzelstrang-DNA-Vorlage
verfügbar
ist, werden Standard-Mutageneseverfahren, wie vorstehend im Abschnitt über Oligonukleotid-gerichtete
Mutagenese beschrieben, durchgeführt.
Die Konstruktion bestimmter Mutanten wird nachfolgend zu Veranschaulichungszwecken
ausführlich
beschrieben.
-
Für die Konstruktion
von B. lentus (GG36) N76D/S103A/V104I/L217H wird ein EcoRI-BamHI-DNA-Fragment,
das GG36 N76D/S103A/V104I kodiert, bei der Konstruktion von pUCCAT
(siehe 8) zur Erzeugung des Plasmids
pBCDAICAT verwendet. Nachdem die Einzelstrang-DNA-Vorlage nach dem
vorstehend beschriebenen Protokoll hergestellt wurde, wird ein Mutagenese-Primer mit der folgenden
Sequenz
* *** ** x ClaI
5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT Ad T TCG ATG GCT 3' (Seq.-ID Nr. 13)
verwendet,
um L217H herzustellen. Wie zuvor kennzeichnen die unterstrichenen
Reste die Nukleotidänderungen,
die vorgenommen werden, und x ClaI weist daraufhin, dass die bestehende
ClaI-Stelle nach der Mutagenese eliminiert wird. Das Mutageneseprotokoll
entspricht dem vorstehend im Abschnitt über Oligonukleotid-gerichtete
Mutagenese beschriebenen. Nach der Mutagenese wird zunächst Plasmid-DNA
auf die Eliminierung der ClaI-Stelle hin gescreent, und diejenigen
Klone, bei denen die ClaI-Stelle fehlt, werden einer DNA-Sequenzanalyse
unterzogen, um die DNA-Sequenz, welche die Änderung von L in H am 217.
Aminosäurerest
bewirkt hat, zu überprüfen.
-
B. Konstruktion von BPN'-Varianten und ihre
Expression in B. subtilis
-
Die
Konstruktion von B. amyloliquefaciens (BPN') N76D/Q103A/Y104I/Y217L wird in ähnlicher
Weise durchgeführt,
außer
dass sie in zwei aufeinander folgenden Schritten erfolgt. Zuerst
wird N76D in BPN' Y217L eingeführt, um
BPN' N76D/Y217L
herzustellen, und eine zweite Mutagenese wird durchgeführt, um
BPN' N76D/Y217L
in BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L
umzuwandeln. Zur Erzeugung der Einzelstrang-DNA-Vorlage für die erste
Mutagenese wird ein EcoRI-BamHI-Fragment, das BPN' Y217L-Subtilisin
kodiert (abgeleitet aus dem Y217L-Plasmid, das in Wells, J., et
al., PNAS, 84, 5167, 1087, beschrieben ist), verwendet, um ein Plasmid
pUCCATFNA zu konstruieren (siehe 9). Das
Plasmid pUCCATFNA, das BPN' Y217L
enthält,
wird zur Konstruktion des Plasmids pBCFNACAT verwendet (9).
Einzelstrang-DNA wird erzeugt, wie vorstehend beschrieben. Um BPN' N76D/Y217L zu erzeugen,
wird ein Oligonukleotid-Primer mit der Sequenz
* *** ** XbaI
5' C ACA GTT GCG GCT
CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3' (Seq.-ID Nr. 14)
verwendet, um
die Änderung
N76D zu erzeugen. Anschließend
wird Einzelstrang-DNA aus dem Plasmid pBCFNACAT, welches das BPN' N76D/Y217L enthält (das
Plasmid pBCFNACAT nach N76D-Mutagenese) hergestellt und mit einem
anderen Oligonukleotid mit der Sequenz
* *** ** x PvuII
5' GCT GAC GGT TCC
GGC GCT ATT AGT TGG
ATC ATT 3' (Seq.-ID
Nr. 15)
mutagenisiert, um BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L zu erhalten.
Alle Schritte, die in die Klonung, die Herstellung von Einzelstrang-DNA,
die Mutagenese und das Screening auf Mutanten eingeschlossen sind,
werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Expression des BPN'-Gens und seiner
Varianten wird erreicht, indem Plasmid-DNA (pBCFNACAT, die das BPN'-Gen der verschiedenen
Varianten enthält)
direkt in einen proteasearmen Stamm von Bacillus subtilis integriert
wird, wie in RE 34,606 beschrieben.
-
Zahlreiche
Varianten werden gemäß den Lehren
dieser Beispiele für
die Proteaseherstellung hergestellt. Kinetische Daten und Stabilitätsdaten
werden für
solche Varianten generiert. Die kinetischen Daten werden unter Anwendung
der vorstehend beschriebenen Verfahren generiert und sind in Tabelle
V aufgeführt.
Die Stabilitätsdaten
werden generiert, wie hierin ausführlich beschrieben. Die Ergebnisse
sind in Tabelle VI aufgeführt.
-
Wärmestabilitätstest-Verfahren
-
Gereinigtes
Enzym wird einem Pufferaustausch in 0,1 M Glycin, pH 10,0, 0,01%
Tween-80 unterzogen, indem das Enzym in eine Säule aus Sephadex G-25, das
mit diesem Puffer äquilibriert
ist, gegeben und unter Verwendung desselben Puffers aus der Säule eluiert
wird.
-
Das
einem Pufferaustausch unterzogene Enzym wird in ein Röhrchen gegeben,
das 0,1 M Glycin, 0,01% Tween-80, pH 10,0, thermostatiert auf 60°C, enthält, um eine
endgültige
Enzymkonzentration von 15 μg/ml
zu ergeben.
-
Aliquots
werden zu verschiedenen Zeitpunkten aus der 60°C-Inkubation entfernt und sofort
auf Enzymaktivität
getestet, indem sie in eine 1-cm-Küvette gegeben werden, die 1,2
mM des synthetischen Peptidsubstrats Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilid,
gelöst
in 0,1 M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, thermostatiert auf 25°C, enthält. Die
anfängliche
lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung
der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als
Funktion der Zeit verfolgt.
-
Die
Halbwertszeit, bei der es sich um die Zeitdauer handelt, die für eine 50%ige
Enzymdeaktivierung erforderlich ist, wird anhand des Diagramms erster
Ordnung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Inkubationszeit
bei 60°C
bestimmt.
-
Die
Daten sind in Tabelle VI als Prozentsatz der Halbwertszeit aufgeführt, die
für Bacillus-lentus-Subtilisin
(GG36) unter identischen Bedingungen bestimmt wurde. Tabelle
V
Enzym | kcat
(s–1) | KM
(mM) | kcat/kM
(s–1M–1) |
B.-lentus-Subtilisin | 170 | 0,78 | 2,20E
+ 05 |
N76D/S103G/V104I* | 380 | 1,4 | 2,70E
+ 05 |
N76D/S103A/V104F | 730 | 0,33 | 2,20E
+ 06 |
N76D/S103A/V104N | 790 | 2,8 | 2,80E
+ 05 |
N76D/S103A/V104S | 170 | 0,83 | 2,00E
+ 05 |
N76D/S103A/V104T | 370 | 1,9 | 2,00E
+ 05 |
N76D/S103A/V104W | 880 | 0,31 | 2,80E
+ 06 |
N76D/S103A/V104Y | 690 | 0,5 | 1,40E
+ 06 |
K27R/N76D/V104Y/N123S | 500 | 1,2 | 4,20E
+ 05 |
N76D/S101G/S103A/V104I* | 620 | 1,3 | 4,80E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/S105A* | 550 | 1,3 | 4,20E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/S105D* | 440 | 1,7 | 2,60E
+ 05 |
N76D/S103A/V104T/I107A* | 120 | 5,7 | 2,10E
+ 04 |
N76D/S103A/V104T/I107L* | 310 | 3,2 | 9,70E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/L126A | 90 | 2,2 | 4,10E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/L126F | 180 | 1,9 | 9,50E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/L126I | 100 | 2,4 | 4,20E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/L126V | 64 | 3,2 | 2,00E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/S128G* | 560 | 1,7 | 3,30E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/S128L* | 430 | 3,8 | 1,10E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L135A | 140 | 0,76 | 1,80E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L135F | 390 | 0,69 | 5,70E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L135I | 110 | 0,73 | 1,50E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L135V | 140 | 0,86 | 1,60E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/S156E* | 170 | 2,6 | 6,50E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/S166D* | 160 | 3,5 | 4,60E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/D197E | 510 | 1,4 | 3,60E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/N204A* | 530 | 1,1 | 4,80E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/N204G* | 580 | 1,4 | 4,10E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/N204C* | 370 | 1,3 | 2,90E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/P210I* | 500 | 1,2 | 4,20E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L217H* | 80 | 0,63 | 1,30E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/M222A | 70 | 3,1 | 2,30E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/M222S | 80 | 3,1 | 2,60E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/T260P | 660 | 1,5 | 4,40E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/S265N | 590 | 1,3 | 4,50E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S | 220 | 1,4 | 1,60E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/D197E | 430 | 1,1 | 3,90E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C | 400 | 1,1 | 3,60E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/Q206L | 440 | 1,2 | 3,70E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V | 440 | 1,2 | 3,70E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/N218S | 760 | 0,98 | 7,80E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/T260P | 410 | 1,2 | 3,40E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/T274A | 390 | 1 | 3,90E
+ 05 |
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N | 170 | 2,1 | 8,10E
+ 04 |
N76D/S103A/V104I/S156E/S
166D* | 40 | 6,3 | 6,40E
+ 03 |
K27R/N76D/V104V/N123S/G195E/G197E | 410 | 0,98 | 4,20E
+ 05 |
K27R/N76D/V104V/N123S/G195E/N218S | 540 | 0,66 | 8,20E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S | 770 | 0,79 | 9,80E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S | 610 | 0,99 | 6,20E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S | 580 | 0,78 | 7,40E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P | 660 | 1 | 6,60E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A | 590 | 0,89 | 6,60E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N 123S/N218S/T274A | 520 | 1 | 5,20E
+ 05 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S | 460 | 0,65 | 7,10E
+ 05 |
B.-amyloliquefaciens-Subtilisin
(BPN') | 50 | 0,14 | 3,60E
+ 05 |
BPN'-N76D/Y217L* | 380 | 0,46 | 8,30E
+ 05 |
- * Diese Mutanten werden gemäß Oligonukleotid-gerichteter
Mutagenese mit aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage hergestellt,
alle anderen werden gemäß vorstehender
Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese hergestellt.
Tabelle
VI Enzym | Wärmestabilität (Halbwertszeit
des nativen Enzyms in %) |
B.-lentus-Subtilisin | 100 |
N76D | 590 |
N76D/S99D | 840 |
N76D/S103A | 390 |
N76D/V104I | 660 |
N76D/I107V | 710 |
N76D/N123S | 70 |
N76D/S99D/S101R | 610 |
N76D/S99D/S103A | 590 |
N76D/S99D/V104I | 910 |
N76D/S101R/S103A | 930 |
N76D/S101R/V104I | 500 |
N76D/S103A/V104I | 460 |
N76D/S103G/V104I* | 370 |
N76D/S103A/V104F | 480 |
N76D/S103A/V104N | 230 |
N76D/S103A/V104S | 230 |
N76D/S103A/V104T | 370 |
N76D/S103A/V104W | 280 |
N76D/S103A/V104Y | 400 |
N76D/V104I/I107V | 940 |
N76D/V104Y/I107V | 820 |
N76D/V104I/N123S | 80 |
N76D/I107V/N123S | 150 |
K27R/N76D/V104Y/N123S | 100 |
N76D/S99D/S101R/S103A | 570 |
N76D/S99D/S101R/V104I | 1000 |
N76D/S99D/S103A/V104I | 680 |
N76D/S101G/S103A/V104I* | 390 |
N76D/S101R/S103A/V104I | 470 |
N76D/S103A/V104I/S105A* | 360 |
N76D/S103A/V104I/S105D* | 370 |
N76D/S103A/V104T/I107A* | 270 |
N76D/S103A/V104T/I107L* | 230 |
N76D/S103A/V104I/N123S | 110 |
N76D/V104I/I107V/N123S | 220 |
N76D/S103A/V104I/L126A | 270 |
N76D/S103A/V104I/L126F | 950 |
N76D/S103A/V104I/L1261 | 410 |
N76D/S103A/V104I/L126V | 320 |
N76D/S103A/V104I/S128G
* | 640 |
N76D/S103A/V104I/S128L* | 760 |
N76D/S103A/V104I/L135A | 230 |
N76D/S103A/V104I/L135F | 200 |
N76D/S103A/V104I/L135I | 510 |
N76D/S103A/V104I/L135V | 500 |
N76D/S103A/V104I/S156E* | 120 |
N76D/S103A/V104I/S166D* | 590 |
N76D/S103A/V104I/D197E | 460 |
N76D/S103A/V104I/N204A* | 230 |
N76D/S103A/V104I/N204G* | 240 |
N76D/S103A/V104I/N204C* | 500 |
N76D/S103A/V104I/P210I* | 1370 |
N76D/S103A/V104I/L217H* | 60 |
N76D/S103A/V104I/M222A | 520 |
N76D/S103A/V104I/M222S | 490 |
N76D/S103A/V104I/T260P | 490 |
N76D/S103A/V104I/S265N | 360 |
K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S | 210 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E | 120 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C | 110 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L | 380 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V | 140 |
IC27R/N76D/V104Y/N123S/N218S | 270 |
K27R/N76D/V104V/N123S/T260P | 40 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A | 60 |
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I | 590 |
N76D/S99D/S103A/V104I/N123S | 110 |
N76D/S103A/V104I/L126F/S265N | 810 |
N76D/S103A/V104I/S156E/S166D* | 220 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E | 90 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S | 250 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S | 270 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S | 460 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S | 1400 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P | 310 |
IC27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A | 180 |
N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S | 90 |
K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A | 230 |
K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S | 240 |
B.-amyloliquefaciens-Subtilisin
(BPN') | 100 |
BPN'-N76D/Y217L* | 420 |
- * Diese Mutanten werden gemäß Oligonukleotid-gerichteter
Mutagenese mit aus Phagemid erzeugter Einzelstrang-DNA-Vorlage hergestellt,
alle anderen werden gemäß vorstehender
Oligonukleotid-gerichteter Mutagenese hergestellt.
-
2. Reinigungszusammensetzungsmaterialien:
-
Die
Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen
außerdem
zusätzlich
zu dem vorstehend beschriebenen Proteaseenzym ein oder mehrere mit
dem Proteaseenzym verträgliche Reinigungszusammensetzungsmaterialien.
Der Ausdruck „Reinigungszusammensetzungsmaterialien", wie hier verwendet,
bedeutet ein beliebiges flüssiges,
festes oder gasförmiges
Material, das für
die gewünschte bestimmte
Art von Reinigungszusammensetzung und die Form des Produkts (z.
B. Flüssigkeit,
Granalie, Sprühzusammensetzung)
ausgewählt
wird, wobei die Materialien auch mit dem in der Zusammensetzung
verwendeten Proteaseenzym verträglich
sind. Die spezifische Auswahl von Reinigungszusammensetzungsmaterialien
erfolgt auf einfache Weise, indem die zu reinigende Oberfläche oder
der zu reinigende Gegenstand oder textile Stoff und die gewünschte Form
der Zusammensetzung für
die Reinigungsbedingungen während
der Verwendung (z. B. während
der Waschmittelverwendung) berücksichtigt
werden. Der Ausdruck „verträglich", wie hier verwendet,
bedeutet, dass die Reinigungszusammensetzungsmaterialien die proteolytische
Aktivität des
Proteaseenzyms nicht in einem solchen Maße verringern, dass die Protease
in Situationen des normalen Gebrauchs nicht wie gewünscht wirksam
ist. Spezifische Reinigungszusammensetzungsmaterialien sind nachfolgend
ausführlich
beispielhaft beschrieben.
-
Eine
wirksame Menge eines oder mehrerer der vorstehend beschriebenen
Proteaseenzyme ist in Zusammensetzungen eingeschlossen, die zum
Reinigen einer Vielfalt an Oberflächen geeignet ist, bei denen proteinhaltige
Flecken entfernt werden müssen.
Solche Reinigungszusammensetzungen umfassen Reinigungsmittelzusammensetzungen
zum Reinigen harter Oberflächen
in uneingeschränkter
Form (z. B. flüssig und
granulös),
Waschmittelzusammensetzungen zum Reinigen von Textilien in uneingeschränkter Form
(z. B. granulöse,
flüssige
und stückförmige Formulierungen),
Geschirrspülzusammensetzungen
(in uneingeschränkter
Form), Mundreinigungszusammensetzungen in uneingeschränkter Form
(z. B. Zahncreme-, Zahnpasta- und Mundspülformulierungen) und Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
in uneingeschränkter
Form (z. B. Flüssigkeit,
Tablette). Wie hier verwendet, bezieht sich „wirksame Menge an Proteaseenzym" auf die Menge an
vorstehend beschriebenem Proteaseenzym, die erforderlich ist, um
die in der spezifischen Reinigungszusammensetzung erforderliche
enzymatische Aktivität
zu erzielen. Solche wirksamen Mengen werden vom Fachmann ohne weiteres
ermittelt und basieren auf zahlreichen Faktoren, wie der verwendeten
speziellen Enzymvariante, der Reinigungsanwendung, der spezifischen
Zusammensetzung der Reinigungszusammensetzung und darauf, ob eine
flüssige
oder trockene (z. B. granulöse,
stückförmige) Zusammensetzung
benötigt wird,
und dergleichen.
-
Vorzugsweise
umfassen die Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
von etwa 0,0001% bis etwa 10% ein oder mehrere Proteaseenzyme, mehr
bevorzugt von etwa 0,001% bis etwa 1%, noch mehr bevorzugt von etwa
0,001% bis etwa 0,1%. Mehrere Beispiele für verschiedene Reinigungszusammensetzungen,
in denen die Proteaseenzyme eingesetzt werden können, werden nachfolgend ausführlicher besprochen.
Alle hierin verwendeten Anteile, Prozentangaben und Verhältnisse
sind auf das Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.
-
Wie
hier verwendet, umfassen „Reinigungszusammensetzungen
für andere
Oberflächen
als Textilien" Reinigungszusammensetzungen
für harte
Oberflächen,
Geschirrspülzusammensetzungen,
Mundreinigungszusammensetzungen, Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
und Körperreinigungszusammensetzungen.
-
A. Reinigungszusammensetzungen für harte
Oberflächen,
Geschirr und Textilien
-
Die
Proteaseenzyme können
in einer beliebigen Reinigungsmittelzusammensetzung verwendet werden,
bei der eine starke Schäumung
und/oder eine gute Entfernung von unlöslichem Substrat gewünscht werden.
Somit können
die Proteaseenzyme mit verschiedenen herkömmlichen Bestandteilen verwendet
werden, um vollständig
formulierte Reiniger für
harte Oberflächen,
Geschirrspülzusammensetzungen,
Zusammensetzungen zum Waschen von Textilien und dergleichen bereitzustellen.
Solche Zusammensetzungen können
in Form von Flüssigkeiten,
Granalien, Stückformen
und dergleichen vorliegen. Solche Zusammensetzungen können als
moderne „konzentrierte" Reinigungsmittel,
die eine so hohe Menge wie 30 Gew.-% bis 60 Gew.-% Tenside enthalten,
formuliert werden.
-
Die
vorliegenden Reinigungszusammensetzungen können wahlweise, und vorzugsweise,
verschiedene anionische, nichtionische, zwitterionische usw. Tenside
enthalten. Solche Tenside sind typischerweise in Konzentrationen
von etwa 0,1% bis etwa 60%, vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 35%
der Zusammensetzungen vorhanden.
-
Nichteinschränkende Beispiele
für hierin
geeignete Tenside umfassen die herkömmlichen C
11-C
18-Alkylbenzolsulfonate und primären und
statistischen Alkylsulfate, die sekundären (2,3) C
10-C
18-Alkylsulfate der Formeln CH
3(CH
2)x(CHOSO
3)
–M
+)CH
3 und CH
3(CH
2)y(CHOSO
3 –M
+)
CH
2CH
3, worin x
und (y + 1) ganze Zahlen von mindestens etwa 7, vorzugsweise mindestens
etwa 9 sind und M ein wasserlöslich
machendes Kation, besonders Natrium, ist, die C
10-C
18-Alkylalkoxysulfate (besonders EO 1-7-Ethoxysulfate),
C
10-C
18-Alkylalkoxycarboxylate
(besonders die EO 1-7-Ethoxycarboxylate), die C
10-C
18-Alkylpolyglycoside
und ihre entsprechenden sulfatierten Polyglycoside, alphasulfonierte
C
12-C
18-Fettsäureester,
C
12-C
18-Alkyl- und
-Alkylphenolalkoxylate (besonders Ethoxylate und gemischtes Ethoxy/Propoxy),
C
12-C
18-Betaine
und -Sulfobetaine („Sultaine"), C
10-C
18-Aminoxide, C
8-C
24-Sarcosinate (besonders Oleoylsarcosinat)
und dergleichen. Die Alkylalkoxysulfate (AES) und Alkylalkoxycarboxylate
(ABC) sind hierin bevorzugt. (Die Verwendung solcher Tenside in
Kombination mit den oben erwähnten
Aminoxid- und/oder Betain- oder
Sultaintensiden ist je nach den Wünschen des Herstellers ebenfalls
bevorzugt.) Andere herkömmliche
geeignete Tenside sind in Standardtexten aufgeführt. Besonders geeignete Tenside
schließen
die C
10-C
18-N-Methylglucamide ein,
die in
US-Patent 5,194,639 , Connor
et al., erteilt am 16. März
1993, durch Bezugnahme hierin eingeschlossen, offenbart sind.
-
Besonders
geeignet ist die Klasse der nichtionischen Tenside, die Kondensate
von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Einheit sind, um ein Tensid
mit einem durchschnittlichen Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht (HLB)
im Bereich von 5 bis 17, vorzugsweise von 6 bis 14, mehr bevorzugt
von 7 bis 12 bereitzustellen. Die hydrophobe (lipophile) Einheit
kann aliphatische oder aromatische Eigenschaften aufweisen, und
die Länge der
Polyoxyethylengruppe, die mit einer beliebigen bestimmten hydrophoben
Gruppe kondensiert wird, kann ohne weiteres eingestellt werden,
um eine wasserlösliche
Verbindung mit dem gewünschten
Maß an
Gleichgewicht zwischen hydrophilen und hydrophoben Elementen zu
ergeben. Besonders bevorzugt sind die primären C9-C15-Alkoholethoxylate (oder gemischtes Ethoxy/Propoxy)
mit 3-8 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol, besonders die primären C14-C15-Alkohole mit
6-8 Mol Ethylenoxid pro Mol Alkohol, die primären C12-C15-Alkohole mit 3-5 Mol Ethylenoxid pro Mol
Alkohol und Mischungen davon.
-
Eine
große
Vielfalt an anderen Bestandteilen, die in Reinigungsmittelzusammensetzungen
geeignet sind, können
in die vorliegenden Zusammensetzungen eingeschlossen werden, einschließlich anderer
aktiver Bestandteile, Träger,
hydrotroper Verbindungen, Verarbeitungshilfsmittel, Farbstoffe oder
Pigmente, Lösungsmittel
für flüssige Formulierungen
usw. Wenn eine weitere Zunahme der Schäumung gewünscht wird, können Schaumverstärker wie
die C10-C16-Alkolamide
in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden, typischerweise in
Konzentrationen von etwa 1% bis etwa 10%. Die C10-C14-Monoethanol- und -Diethanolamide veranschaulichen
eine typische Klasse solcher Schaumverstärker. Die Verwendung solcher
Schaumverstärker
mit stark schäumenden
Zusatztensiden wie den oben genannten Aminoxiden, Betainen und Sultainen
ist ebenfalls vorteilhaft. Falls gewünscht, können lösliche Magnesiumsalze wie MgCl2, MgSO4 und dergleichen
in Konzentrationen von typischerweise von etwa 0,1% bis etwa 2%
hinzugegeben werden, um für
zusätzliche
Schäumung
zu sorgen.
-
Die
vorliegenden flüssigen
Reinigungsmittelzusammensetzungen können Wasser und andere Lösungsmittel
als Träger
enthalten. Niedermolekulare primäre
oder sekundäre
Alkohole, für
die Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol Beispiele sind,
sind geeignet. Einwertige Alkohole werden für lösungsvermittelnde Tenside bevorzugt,
jedoch können
Polyole, wie diejenigen mit etwa 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen
und etwa 2 bis etwa 6 Hydroxygruppen (z. B. 1,3-Propandiol, Ethylenglycol,
Glycerin und 1,2-Propandiol), ebenfalls verwendet werden. Die Zusammensetzungen
können
von etwa 5% bis etwa 90%, typischerweise von etwa 10% bis etwa 50%
solche Träger
enthalten.
-
Die
vorliegenden Reinigungsmittelzusammensetzungen werden vorzugsweise
so formuliert, dass während
des Gebrauchs in wässrigen
Reinigungsvorgängen
das Waschwasser einen pH-Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 11,0 aufweist.
Endprodukte werden daher in der Regel in diesem Bereich formuliert.
Verfahren zum Regulieren des pH-Werts bei empfohlenen Gebrauchskonzentrationen
schließen
die Verwendung von Puffer, Alkalien, Säuren usw. ein und sind Fachleuten
wohl bekannt.
-
Beim
Formulieren der Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen und
Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann
der Hersteller nach Belieben verschiedene Builder in Konzentrationen
von etwa 5 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% einsetzen. Typische Builder
schließen
die Zeolithe von 1-10 Mikrometern, Polycarboxylate wie Citrat und
Oxydisuccinate, Schichtsilicate, Phosphate und dergleichen ein.
Andere herkömmliche
Builder sind in Standard-Formelbüchern
aufgeführt.
-
Ebenso
kann der Hersteller nach Belieben verschiedene zusätzliche
Enzyme wie Cellulasen, Lipasen, Amylasen, Peroxidasen und Proteasen
in solchen Zusammensetzungen einsetzen, typischerweise in Konzentrationen
von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-%. Verschiedene Reinigungs-
und Textilpflegeenzyme sind im Stand der Technik für Wäschewaschmittel
wohl bekannt.
-
Verschiedene
Bleichmittelverbindungen, wie die Percarbonate, Perborate und dergleichen,
können
in solchen Zusammensetzungen verwendet werden, typischerweise in
Konzentrationen von etwa 1 Gew.-% bis etwa 15 Gew.-%. Falls gewünscht, können solche
Zusammensetzungen auch Bleichaktivatoren wie Tetraacetylethylendiamin,
Nonanoyloxybenzolsulfonat und dergleichen enthalten, die ebenfalls
im Stand der Technik bekannt sind. Die Gebrauchskonzentrationen
liegen in der Regel im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%.
-
Verschiedene
Schmutzabweisemittel, besonders vom anionischen Oligoester-Typ,
verschiedene Chelatbildner, besonders die Aminophosphonate und Ethylendiamindisuccinate,
verschiedene Tonschmutzentfernungsmittel, besonders ethoxyliertes
Tetraethylenpentamin, verschiedene Dispergiermittel, besonders Polyacrylate
und Polyaspartate, verschiedene Aufheller, besonders anionische
Aufheller, verschiedene Farbstoffübertragungshemmer, wie Polyvinylpyrrolidon,
verschiedene Schaumunterdrücker,
besonders Silikone und sekundäre
Alkohole, verschiedene Textilweichmacher, besonders Smectittone
und Tonflockungspolymere (z. B. Poly(oxyethylen)) und dergleichen
können
alle in Konzentrationen im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 35 Gew.-%
in solchen Zusammensetzungen verwendet werden. Standard-Formelbücher und
veröffentlichte
Patente enthalten viele ausführliche
Beschreibungen solcher herkömmlichen
Materialien.
-
Enzymstabilisatoren
können
in den Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls
verwendet werden. Solche Enzymstabilisatoren umfassen Propylenglycol
(vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 10%), Natriumformiat (vorzugsweise
von etwa 0,1% bis etwa 1%) und Calciumformiat (vorzugsweise von
etwa 0,1% bis etwa 1%).
-
1. Reinigungszusammensetzungen
für harte
Oberflächen
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich „Reinigungszusammensetzung
für harte
Oberflächen" auf flüssige und
granulöse
Reinigungsmittelzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen wie
Fußböden, Wänden, Badezimmerfliesen
und dergleichen. Erfindungsgemäße Reinigungszusammensetzungen
für harte
Oberflächen
umfassen eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme,
vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt
von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von
etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives
Proteaseenzym. Zusätzlich
dazu, dass sie ein oder mehrere Proteaseenzyme umfassen, umfassen
solche Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen in
der Regel ein Tensid und einen wasserlöslichen maskierenden Builder.
In bestimmten Spezialprodukten wie Scheibenreinigersprays werden
die Tenside jedoch mitunter nicht verwendet, da sie einen film-/streifenartigen
Rückstand
auf der Glasoberfläche
erzeugen können.
-
Der
Tensidbestandteil, wenn vorhanden, kann eine so geringe Menge wie
0,1% der vorliegenden Zusammensetzungen umfassen, jedoch enthalten
die Zusammensetzungen in der Regel von etwa 0,25% bis etwa 10%,
mehr bevorzugt von etwa 1% bis etwa 5% Tensid.
-
In
der Regel enthalten die Zusammensetzungen von etwa 0,5% bis etwa
50% einen Reinigungsbuilder, vorzugsweise von etwa 1% bis etwa 10%.
Der pH-Wert sollte vorzugsweise im Bereich von etwa 8 bis 12 liegen.
Herkömmliche
pH-Wert-Regler wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Salzsäure können verwendet
werden, wenn eine Einstellung notwendig ist.
-
Lösungsmittel
können
in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Geeignete Lösungsmittel umfassen,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Glycolether, wie Diethylenglycolmonohexylether, Diethylenglycolmonobutylether,
Ethylenglycolmonobutylether, Ethylenglycolmonohexylether, Propylenglycolmonobutylether,
Dipropylenglycolmonobutylether, und Diole, wie 2,2,4-Trimethyl-1,3-pentandiol
und 2-Ethyl-1,3-hexandiol. Wenn solche Lösungsmittel verwendet werden,
sind sie in der Regel in Konzentrationen von etwa 0,5% bis etwa
15%, vorzugsweise von etwa 3% bis etwa 11% vorhanden.
-
Außerdem können stark
flüchtige
Lösungsmittel
wie Isopropanol oder Ethanol in den vorliegenden Zusammensetzungen
verwendet werden, um eine schnellere Verdampfung der Zusammensetzung
von Oberflächen
zu erleichtern, wenn die Oberfläche
nach Auftragen der Zusammensetzung „in voller Stärke" auf die Oberfläche nicht
abgespült
wird. Wenn flüchtige
Lösungsmittel
verwendet wer den, sind sie in der Regel in Konzentrationen von etwa
2% bis etwa 12% in den Zusammensetzungen vorhanden.
-
Die
Ausführungsform
der Reinigungszusammensetzung für
harte Oberflächen
der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden nichteinschränkenden
Beispiele veranschaulicht. (In den folgenden Beispielen verweist
der Bezug auf „Protease
Nr." in den Beispielen
auf die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignete
Variante mit der jeweiligen Nummer in der vorstehenden Tabelle III.)
-
Beispiele 1-6
-
Flüssige
Reinigungszusammensetzungen für
harte Oberflächen
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
Protease Nr. 12 | 0,05 | 0,20 | 0,02 | 0,03 | 0,10 | 0,03 |
Protease Nr. 4 | - | - | - | - | 0,20 | 0,02 |
EDTA** | - | - | 2,90 | 2,90 | - | - |
Na-Citrat | - | - | - | - | 2,90 | 2,90 |
NaC12-Alkylbenzol-sulfonat | 1,95 | - | 1,95 | - | 1,95 | - |
NaC12-Alkylsulfat | - | 2,20 | - | 2,20 | - | 2,20 |
NaC12-(Ethoxy)-***
sulfa | - | 2,20 | - | 2,20 | - | 2,20 |
Na-Cumolsulfonat | 1,30 | - | 1,30 | - | 1,30 | - |
Hexylcarbitol*** | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 | 6,30 |
Wasser**** | ad 100% |
- ** Na4-Ethylendiamindiessigsäure
- *** Diethylenglycolmonohexylether
- **** Alle Formulierungen auf pH 7 eingestellt
-
In
den Beispielen 1-4 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 5 und 6 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr. 4
durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 7-12
-
Sprühzusammensetzungen
zur Reinigung harter Oberflächen
und Entfernung von Haushaltsschimmel
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
Protease Nr. 12 | 0,20 | 0,05 | 0,10 | 0,30 | 0,20 | 0,30 |
Protease Nr. 4 | - | - | - | - | 0,30 | 0,10 |
Natriumoctylsulfat | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 |
Natriumdodecylsulfat | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 |
Natriumhydroxid | 0,80 | 0,80 | 0,80 | 0,80 | 0,80 | 0,80 |
Silicat (Na) | 0,04 | 0,04 | 0,04 | 0,04 | 0,04 | 0,04 |
Duftstoff | 0,35 | 0,35 | 0,35 | 0,35 | 0,35 | 0,35 |
Wasser | ad 100% |
-
Der
Produkt-pH-Wert beträgt
etwa 7.
-
In
den Beispielen 7-10 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 11 und 12 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
2. Geschirrspülzusammensetzungen
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen Geschirrspülzusammensetzungen ein oder
mehrere Proteaseenzyme. Wie hier ver wendet, bezieht sich „Geschirrspülzusammensetzung" auf alle Formen
für Zusammensetzungen
zur Reinigung von Geschirr, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
granulöse
und flüssige
Formen. Die Ausführungsform
der Geschirrspülzusammensetzung
der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 13-18
-
Geschirrspulzusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 |
Protease Nr. 12 | 0,05 | 0,50 | 0,02 | 0,40 | 0,10 | 0,03 |
Protease Nr. 4 | - | - | - | - | 0,40 | 0,02 |
C12-C14-N-Methylglucamid | 0,90 | 0,90 | 0,90 | 0,90 | 0,90 | 0,90 |
C 12-Ethoxy-(1)-sulfat | 12,00 | 12,00 | 12,00 | 12,00 | 12,00 | 12,00 |
2-Methylundecansäure | 4,50 | 4,50 | - | 4,50 | 4,50 | - |
C12-Ethoxy-(2)-carboxylat | 4,50 | 4,50 | 4,50 | 4,50 | 4,50 | 4,50 |
C12-Alkoholethoxylat
(4) | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 |
C12-Aminoxid | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 | 3,00 |
Natriumcumolsulfonat | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 2,00 |
Ethanol | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 |
Mg++ (als MgCl2) | 0,20 | 0,20 | 0,20 | 0,20 | 0,20 | 0,20 |
Ca++ (als CaCl2) | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 |
Wasser | ad 100% |
-
Der
Produkt-pH-Wert wird auf 7 eingestellt.
-
In
den Beispielen 13-16 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 17 und 18 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiel 19
-
Granulöse Maschinen-Geschirrspülzusammensetzung
Bestandteil | A | B | C |
Citronensäure | 15,0 | - | - |
Citrat | 4,0 | 29,0 | 15,0 |
Acrylat/Methacrylat-Copolymer | 6,0 | - | |
Acrylsäure/Maleinsäure-Copolymer | - | 3,7 | - |
Trockenzusatz-Carbonat | 9,0 | - | 20,0 |
Alkalimetallsilicat | 8,5 | 17,0 | 9,0 |
Paraffin | - | 0,5 | - |
Benzotriazol | - | 0,3 | - |
Termamyl
60T | 1,5 | 1,5 | 1,0 |
Protease
Nr. 12 (4,6% Prill) | 1,6 | 1,6 | 1,6 |
Percarbonat
(AvO) | 1,5 | - | - |
Perboratmonohydrat | - | 0,3 | 1,5 |
Perborattetrahydrat | - | 0,9 | - |
Tetraacetylethylendiamin | 3,8 | 4,4 | - |
Diethylentriaminpentamethylphosphonsäure (Mg-Salz) | 0,13 | 0,13 | 0,13 |
Alkylethoxysulfat – 3-fach ethoxyliert | 3,0 | - | - |
Nichtionisches
Alkylethoxypropoxy-Tensid | - | 1,5 | - |
Schaumunterdrücker | 2,0 | - | - |
Nichtionisches
Tensid Olin SLF18 | - | - | 2,0 |
Sulfat | ad 100% |
-
In
den Beispielen 19 A-C wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle
III aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 19 A-C Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
3. Textilreinigungszusammensetzungen
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen Textilreinigungszusammensetzungen
ein oder mehrere Proteaseenzyme. Wie hier verwendet, bezieht sich „Textilreinigungszusammensetzung" auf alle Formen
für Waschmittelzusammensetzungen
zur Reinigung von Textilien, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf,
granulöse
Formen, flüssige
Formen und Stückformen.
-
a. Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
-
Die
granulösen
Textilreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten
eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise
von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa
0,005 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis
etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Proteaseenzym. Zusätzlich zu
einem oder mehreren Proteaseenzymen umfassen die granulösen Textilreinigungszusammensetzungen
in der Regel mindestens ein Tensid, einen oder mehrere Builder und,
in einigen Fällen,
ein Bleichmittel.
-
Die
Ausführungsform
der granulösen
Textilreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird
durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 20-23
-
Granulöse
Textilreinigungszusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 20 | 21 | 22 | 23 |
Protease Nr. 12 (4% Prill) | 0,10 | 0,20 | 0,03 | 0,05 |
Protease Nr. 4 (4% Prill) | - | - | 0,02 | 0,05 |
Lineares C13-Alkylbenzolsulfonat | 22,00 | 22,00 | 22,00 | 22,00 |
Phosphat (als Natrium-tripolyphosphate) | 23,00 | 23,00 | 23,00 | 23,00 |
Natriumcarbonat | 23,00 | 23,00 | 23,00 | 23,00 |
Natriumsilicat | 14,00 | 14,00 | 14,00 | 14,00 |
Zeolith | 8,20 | 8,20 | 8,20 | 8,20 |
Chelant (Diethylentriamin-pentaessigsäure) | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 |
Natriumsulfat | 5,50 | 5,50 | 5,50 | 5,50 |
Wasser | ad 100% |
-
In
den Beispielen 20-21 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 22 und 23 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 24-27
-
Granulöse
Textilreinigungszusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 24 | 25 | 26 | 27 |
Protease Nr. 12 (4% Prill) | 0,10 | 0,20 | 0,03 | 0,05 |
Protease Nr. 4 (4% Prill) | - | - | 0,02 | 0,05 |
C12-Alkylbenzolsulfonat | 12,00 | 12,00 | 12,00 | 12,00 |
Zeolith A (1-10 Mikrometer) | 26,00 | 26,00 | 26,00 | 26,00 |
2-Butyloctansäure | 4,00 | 4,00 | 4,00 | 4,00 |
Sekundäres (2,3) C12-C14-Alkylsulfat, | 5,00 | 5,00 | 5,00 | 5,00 |
Na-Salz | | | | |
Natriumcitrat | 5,00 | 5,00 | 5,00 | 5,00 |
Optischer Aufheller | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,10 |
Natriumsulfat | 17,00 | 17,00 | 17,00 | 17,00 |
Füllstoffe, Wasser, geringfügige Bestandteile | ad 100% |
-
In
den Beispielen 24 und 25 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle
III aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 26 und 27 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 28 und 29
-
Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
Bestandteile | Beispiel
Nr. |
| 28 | 29 |
Lineares
Alkylbenzolsulfonat | 11,4 | 10,70 |
Talgalkylsulfat | 1,80 | 2,40 |
C14-15-Alkylsulfat | 3,00 | 3,10 |
C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert | 4,00 | 4,00 |
Talgalkohol,
11-fach ethoxyliert | 1,80 | 1,80 |
Dispergiermittel | 0,07 | 0,1 |
Silikonflüssigkeit | 0,80 | 0,80 |
Trinatriumcitrat | 14,00 | 15,00 |
Citronensäure | 3,00 | 2,50 |
Zeolith | 32,50 | 32,10 |
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer | 5,00 | 5,00 |
Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure | 1,00 | 0,20 |
Protease
Nr. 12 (4% Prill) | 0,30 | 0,30 |
Lipase | 0,36 | 0,40 |
Amylase | 0,30 | 0,30 |
Natriumsilicat | 2,00 | 2,50 |
Natriumsulfat | 3,50 | 5,20 |
Polyvinylpyrrolidon | 0,30 | 0,50 |
Perborat | 0,5 | 1 |
Phenolsulfonat | 0,1 | 0,2 |
Peroxidase | 0,1 | 0,1 |
Geringfügige Bestandteile | Up
to 100 | Up
to 100 |
-
Beispiele 30 und 31
-
Granulöse Textilreinigungszusammensetzungen
| Beispiel
Nr. |
Bestandteile | 30 | 31 |
Lineares
C12-Natriumalkylbenzolsulfonat | 6,5 | 8,0 |
Natriumsulfat | 15,0 | 18,0 |
Zeolith
A | 26,0 | 22,0 |
Natriumnitrilotriacetat | 5,0 | 5,0 |
Polyvinylpyrrolidon | 0,5 | 0,7 |
Tetraacetylethylendiamin | 3,0 | 3,0 |
Borsäure | 4,0 | - |
Perborat | 0,5 | 1 |
Phenolsulfonat | 0,1 | 0,2 |
Protease
Nr. 12 (4% Prill) | 0,4 | 0,4 |
Füllstoffe
(z. B. Silicate, Carbonate, Duftstoffe, Wasser) | Up
to 100 | Up
to 100 |
-
Beispiel 32
-
Kompakte
granulöse
Textilreinigungszusammensetzung
Bestandteile | Gewichtsprozent |
Alkylsulfat | 8,0 |
Alkylethoxysulfat | 2,0 |
Mischung
aus C25- und C45-Alkohol, 3- und 7-fach ethoxyliert | 6,0 |
Polyhydroxyfettsäureamid | 2,5 |
Zeolith | 17,0 |
Schichtsilicat/Citrat | 16,0 |
Carbonat | 7,0 |
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer | 5,0 |
Schmutzabweisungspolymer | 0,4 |
Carboxymethylcellulose | 0,4 |
Poly(4-vinylpyridin)-N-oxid | 0,1 |
Copolymer
aus Vinylimidazol und Vinylpyrrolidon | 0,1 |
PEG2000 | 0,2 |
Protease
Nr. 12 (4% Prill) | 0,5 |
Lipase | 0,2 |
Cellulase | 0,2 |
Tetraacetylethylendiamin | 6,0 |
Percarbonat | 22,0 |
Ethylendiamindibernsteinsäure | 0,3 |
Schaumunterdrücker | 3,5 |
Dinatrium-4,4'-bis-(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-ylamino)-stilben-2,2'-disulfonat | 0,25 |
Dinatrium-4,4'-bis-(2-sulfostyril)-biphenyl | 0,05 |
Wasser,
Duftstoff und geringfügige
Bestandteile | Up
to 100 |
-
Beispiel 33
-
Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
Bestandteil | Gewichtsprozent |
Lineares
Alkylbenzolsulfonat | 7,6 |
C16-C18-Alkylsulfat | 1,3 |
C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert | 4,0 |
Kokosalkyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid | 1,4 |
Dispergierm
ittel | 0,07 |
Silikonflüssigkeit | 0,8 |
Trinatriumcitrat | 5,0 |
Zeolith
4A | 15,0 |
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer | 4,0 |
Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure | 0,4 |
Perborat | 15,0 |
Tetraacetylethylendiamin | 5,0 |
Smectitton | 10,0 |
Poly(oxyethylen)
(MG 300.000) | 0,3 |
Protease
Nr. 12 (4% Prill) | 0,4 |
Lipase | 0,2 |
Amylase | 0,3 |
Cellulase | 0,2 |
Natriumsilicat | 3,0 |
Natriumcarbonat | 10,0 |
Carboxymethylcellulose | 0,2 |
Aufheller | 0,2 |
Wasser,
Duftstoff und geringfügige
Bestandteile | Up
to 100 |
-
Beispiel 34
-
Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
Bestandteil | Gewichtsprozent |
Lineares
Alkylbenzolsulfonat | 6,92 |
Talgalkylsulfat | 2,05 |
C14-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert | 4,4 |
C12-15-Alkylethoxysulfat – 3-fach ethoxyliert | 0,16 |
Zeolith | 20,2 |
Citrat | 5,5 |
Carbonat | 15,4 |
Silicat | 3,0 |
Maleinsäure/Acrylsäure-Copolymer | 4,0 |
Carboxymethylcellulase | 0,31 |
Schmutzabweisungspolymer | 0,30 |
Protease
Nr. 12 (4% Prill) | 0,2 |
Lipase | 0,36 |
Cellulase | 0,13 |
Perborattetrahydrat | 11,64 |
Perboratmonohydrat | 8,7 |
Tetraacetylethylendiamin | 5,0 |
Diethylentriaminpentamethylphosphonsäure | 0,38 |
Magnesiumsulfat | 0,40 |
Aufheller | 0,19 |
Duftstoff,
Silikon, Schaumunterdrücker | 0,85 |
Geringfügige Bestandteile | Up
to 100 |
-
In
jedem der Beispiele 28-34 hierin wird Protease Nr. 12 durch die
in Tabelle III aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 28-34 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
b. Flüssige
Textilreinigungszusammensetzungen
-
Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge eines oder
mehrerer Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis
etwa 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 1
Gew.-% und am meisten bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 0,1
Gew.-% der Zusammensetzung aktives Proteaseenzym. Solche flüssigen Textilreinigungszusammensetzungen
umfassen in der Regel zusätzlich
ein anionisches Tensid, eine Fettsäure, einen wasserlöslichen
Reinigungsbuilder und Wasser.
-
Die
Ausführungsform
der flüssigen
Textilreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird
durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 35-39
-
Flüssige
Textilreinigungszusammensetzungen
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 |
Protease Nr. 12 | 0,05 | 0,03 | 0,30 | 0,03 | 0,10 |
Protease Nr. 4 | - | - | - | 0,01 | 0,20 |
C12-C14-Alkylsulfat, Na | 20,00 | 20,00 | 20,00 | 20,00 | 20,00 |
2-Butyloctansäure | 5,00 | 5,00 | 5,00 | 5,00 | 5,00 |
Natriumcitrat | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
C10-Alkoholethoxylat
(3) | 13,00 | 13,00 | 13,00 | 13,00 | 13,00 |
Monoethanolamin | 2,50 | 2,50 | 2,50 | 2,50 | 2,50 |
Wasser/Propylenglycol/Ethanol
(100:1:1) | ad 100% |
-
In
den Beispielen 35-37 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 38 und 39 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 40-41
-
Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
| Beispiel
Nr. |
Bestandteil | 40 | 41 |
C12-14-Alkenylbernsteinsäure | 3,0 | 8,0 |
Citronensäuremonohydrat | 10,0 | 15,0 |
C12-15-Natriumalkylsulfat | 8,0 | 8,0 |
Natriumsulfat
von C12-15-Alkohol, 2-fach ethoxyliert | - | 3,0 |
C12-15-Alkohol, 7-fach ethoxyliert | - | 8,0 |
C12-15-Alkohol, 5-fach ethoxyliert | 8,0 | - |
Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure) | 0,2 | - |
Ölsäure | 1,8 | - |
Ethanol | 4,0 | 4,0 |
Propandiol | 2,0 | 2,0 |
Protease
Nr. 12 | 0,2 | 0,2 |
Polyvinylpyrrolidon | 1,0 | 2,0 |
Schaumunterdrücker | 0,15 | 0,15 |
NaOH | | bis
pH 7,5 |
Perborat | 0,5 | 1 |
Phenolsulfonat | 0,1 | 0,2 |
Peroxidase | 0,4 | 0,1 |
Wasser
und geringfügige
Bestandteile | ad 100 Teile |
-
In
jedem der Beispiele 40 und 41 hierin wird Protease Nr. 12 durch
die in Tabelle III aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 40 und 41 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteasen, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
c. Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen
-
Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung, die zur Handwäsche von verschmutzten Textilien
geeignet sind, enthalten eine wirksame Menge eines oder mehrerer
Proteaseenzyme, vorzugsweise von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10 Gew.-%,
mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 1 Gew.-% der Zusammensetzung.
-
Die
Ausführungsform
der stückförmigen Textilreinigungszusammensetzung
der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 42-45
-
Stückförmige Textilreinigungszusammensetzungen
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 42 | 43 | 44 | 45 |
Protease Nr. 12 | 0,3 | - | 0,1 | 0,02 |
Protease Nr. 4 | - | - | 0,4 | 0,03 |
C12-C16-Alkylsulfat, Na | 20,0 | 20,0 | 20,0 | 20,00 |
C12-C14-N-Methylglucamid | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,00 |
C11-C13-Alkylbenzolsulfonat, Na | 10,0 | 10,0 | 10,0 | 10,00 |
Natriumcarbonat | 25,0 | 25,0 | 25,0 | 25,00 |
Natriumpyrophosphat | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,00 |
Natriumtripolyphosphat | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,00 |
Zeolith A (0,1-0,10 μ) | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,00 |
Carboxymethylcellulose | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,20 |
Polyacrylat (MG 1400) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,20 |
Kokos-monoethanolamid | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,00 |
Aufheller, Duftstoff | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,20 |
CaSO4 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,00 |
MgSO4 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,00 |
Wasser | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,00 |
Füllstoff* | ad 100% |
- * Kann aus geeigneten Materialien wie CaCO3, Talk, Ton, Silicaten und dergleichen ausgewählt werden.
-
In
den Beispielen 42 und 43 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle
III aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
In
den Beispielen 44 und 45 werden Protease Nr. 12 und Protease Nr.
4 durch eine beliebige Kombination der in den Tabellen III, V und
VI aufgeführten,
in der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
B. Weitere Reinigungszusammensetzungen
-
Neben
den vorstehend besprochenen Reinigungszusammensetzungen für harte
Oberflächen,
Geschirrspülzusammensetzungen
und Textilreinigungszusammensetzungen können ein oder mehrere Proteaseenzyme
in eine Vielfalt an anderen Reinigungszusammensetzungen eingeschlossen
werden, bei denen die Hydrolyse eines unlöslichen Substrats erwünscht ist.
Solche zusätzlichen
Reinigungszusammensetzungen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,
Mundreinigungszusammensetzungen, Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
und Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen.
-
1. Mundreinigungszusammensetzungen
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutisch annehmbare Menge
eines oder mehrerer Proteaseenzyme in Zusammensetzungen eingeschlossen,
die zum Entfernen von proteinhaltigen Flecken von Zähnen oder
Zahnprothesen geeignet sind. Wie hier verwendet, bezieht sich „Mundreinigungszusammensetzungen" auf Zahncremes,
Zahnpasten, Zahngele, Zahnpulver, Mundspülungen, Mundsprays, Mundgele,
Kaugummis, Pastillen, Beutel, Tabletten, Biogele, Prophylaxepasten,
Zahnbehandlungslösungen
und dergleichen. Vorzugsweise umfassen Mundreinigungszusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-%
ein oder mehrere Proteaseenzyme, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-%
bis etwa 10 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis
etwa 5 Gew.-% der Zusammensetzung und einen pharmazeutisch annehmbaren
Träger.
Wie hier verwendet, bedeutet „pharmazeutisch
annehmbar", dass
Arzneimittel, Medikamente oder inerte Bestandteile, die der Ausdruck
beschreibt, zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen
und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Unverträglichkeit,
Instabilität,
Reizung, Allergiereaktion und dergleichen bei einem angemessenen
Nutzen/Risiko-Verhältnis
geeignet sind.
-
Typischerweise
umfassen die pharmazeutisch annehmbaren Mundreinigungsträgerbestandteile
der Mundreinigungsbestandteile der Mundreinigungszusammensetzungen
im Allgemeinen von etwa 50 Gew.-% bis etwa 99,99 Gew.-%, vorzugsweise
von etwa 65 Gew.-% bis etwa 99,99 Gew.-%, mehr bevorzugt von etwa 65
Gew.-% bis etwa 99 Gew.-% der Zusammensetzung.
-
Die
pharmazeutisch annehmbaren Trägerbestandteile
und fakultativen Bestandteile, die in die Mundreinigungszusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden können, sind
Fachleuten wohl bekannt. Eine große Vielfalt an Zusammensetzungsarten,
Trägerbestandteilen
und fakultativen Bestandteilen, die in den Mundreinigungszusammensetzungen
geeignet sind, sind in
US-Patent
5,096,700 , Seibel, erteilt am 17. März 1992,
US-Patent 5,028,414 , Sampathkumar,
erteilt am 2. Juli 1991, und
US-Patent
5,028,415 , Benedict, Bush und Sunberg, erteilt am 2. Juli
1991, die alle durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind, offenbart.
-
Die
Ausführungsform
der Mundreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird
durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 46-49
-
Zahncremezusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 46 | 47 | 48 | 49 |
Protease Nr. 12 | 2,000 | 3,500 | 1,500 | 2,000 |
Sorbit (70% wässrige Lösung) | 35,000 | 35,000 | 35,000 | 35,000 |
PEG-6* | 1,000 | 1,000 | 1,000 | 1,000 |
Silica-Dentalschleifmittel** | 20,000 | 20,000 | 20,000 | 20,000 |
Natriumfluorid | 0,243 | 0,243 | 0,243 | 0,243 |
Titandioxid | 0,500 | 0,500 | 0,500 | 0,500 |
Natriumsaccharin | 0,286 | 0,286 | 0,286 | 0,286 |
Natriumalkylsulfat (27,9%
wässrige Lösung) | 4,000 | 4,000 | 4,000 | 4,000 |
Geschmacksstoff | 1,040 | 1,040 | 1,040 | 1,040 |
Carboxyvinylpolymer*** | 0,300 | 0,300 | 0,300 | 0,300 |
Carrageenan**** | 0,800 | 0,800 | 0,800 | 0,800 |
Wasser | ad 100% |
- * PEG-6 = Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht
von 600.
- ** Ausgefälltes
Siliciumdioxid, gekennzeichnet als Zeodent 119, angeboten von J.
M. Huber.
- *** Carbopol, angeboten von B. F. Goodrich Chemical Company.
- **** Iota-Carrageenan, angeboten von Hercules Chemical Company.
-
In
den Beispielen 46-49 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle 111
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 46-49 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V, VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 50-53
-
Mundspülungszusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 50 | 51 | 52 | 53 |
Protease Nr. 12 | 3,00 | 7,50 | 1,00 | 5,00 |
SDA 40-Alkohol | 8,00 | 8,00 | 8,00 | 8,00 |
Geschmacksstoff | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
Emulgator | 0,08 | 0,08 | 0,08 | 0,08 |
Natriumfluorid | 0,05 | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
Glycerin | 10,00 | 10,00 | 10,00 | 10,00 |
Süßstoff | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,02 |
Benzoesäure | 0,05 | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
Natriumhydroxid | 0,20 | 0,20 | 0,20 | 0,20 |
Farbstoff | 0,04 | 0,04 | 0,04 | 0,04 |
Wasser | ad 100% |
-
In
den Beispielen 50-53 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 50-53 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 54-57
-
Pastillenzusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 54 | 55 | 56 | 57 |
Protease Nr. 12 | 0,01 | 0,03 | 0,10 | 0,02 |
Sorbit | 17,50 | 17,50 | 17,50 | 17,50 |
Mannit | 17,50 | 17,50 | 17,50 | 17,50 |
Stärke | 13,60 | 13,60 | 13,60 | 13,60 |
Süßstoff | 1,20 | 1,20 | 1,20 | 1,20 |
Geschmacksstoff | 11,70 | 11,70 | 11,70 | 11,70 |
Farbstoff | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,10 |
Maisstärkesirup | ad 100% |
-
In
den Beispielen 54-57 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 54-57 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiele 58-61
-
Kaugummizusammensetzung
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 58 | 59 | 60 | 61 |
Protease Nr. 12 | 0,03 | 0,02 | 0,10 | 0,05 |
Sorbitkristalle | 38,44 | 38,40 | 38,40 | 38,40 |
Paloja-T-Kaumasse* | 20,00 | 20,00 | 20,00 | 20,00 |
Sorbit (70% wässrige Lösung) | 22,00 | 22,00 | 22,00 | 22,00 |
Mannit | 10,00 | 10,00 | 10,00 | 10,00 |
Glycerin | 7,56 | 7,56 | 7,56 | 7,56 |
Geschmacksstoff | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
- * Geliefert von L. A. Dreyfus Company.
-
In
den Beispielen 58-61 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 58-61 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
2. Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
zum Reinigen von Zahnprothesen außerhalb der Mundhöhle ein
oder mehrere Proteaseenzyme. Solche Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen
umfassen eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteaseenzyme,
vorzugsweise von etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 50 Gew.-% ein oder
mehrere Proteaseenzyme, mehr bevorzugt von etwa 0,001 Gew.-% bis
etwa 35 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa
20 Gew.-% der Zusammensetzung, und einen Zahnprothesenreinigungsträger. Verschiedene
Formate für
Zahnprothesenreinigungszusammensetzungen, wie Sprudeltabletten und
dergleichen, sind im Stand der Technik wohl bekannt (siehe zum Beispiel
US-Patent 5,055,305 , Young,
durch Bezugnahme hierin eingeschlossen) und sind im Allgemeinen
für den
Einschluss eines oder mehrerer Proteaseenzyme zur Entfernung proteinhaltiger
Flecken von Zahnprothesen geeignet.
-
Die
Ausführungsform
der Zahnprothesenreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird
durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiele 62-65
-
Zweischichtige sprudelnde Zahnprothesenreinigungstablette
| Beispiel Nr. |
Bestandteil | 62 | 63 | 64 | 65 |
Saure Schicht |
Protease Nr. 12 | 1,0 | 1,5 | 0,01 | 0,05 |
Weinsäure | 24,0 | 24,0 | 24,00 | 24,00 |
Natriumcarbonat | 4,0 | 4,0 | 4,00 | 4,00 |
Sulfaminsäure | 10,0 | 10,0 | 10,00 | 10,00 |
PEG 20.000 | 4,0 | 4,0 | 4,00 | 4,00 |
Natriumhydrogencarbonat | 24,5 | 24,5 | 24,50 | 24,50 |
Kaliumpersulfat | 15,0 | 15,0 | 15,00 | 15,00 |
Natriumsäurepyrophosphat | 7,0 | 7,0 | 7,00 | 7,00 |
Pyrogenes Silica | 2,0 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
Tetraacetylethylendiamin | 7,0 | 7,0 | 7,00 | 7,00 |
Ricinoleylsulfosuccinat | 0,5 | 0,5 | 0,50 | 0,50 |
Geschmacksstoff | 1,0 | 1,0 | 1,00 | 1,00 |
Alkalische Schicht |
Natriumperboratmonohydrat | 32,0 | 32,0 | 32,00 | 32,00 |
Natriumhydrogencarbonat | 19,0 | 19,0 | 19,00 | 19,00 |
EDTA | 3,0 | 3,0 | 3,00 | 3,00 |
Natriumtripolyphosphat | 12,0 | 12,0 | 12,00 | 12,00 |
PEG 20.000 | 2,0 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
Kaliumpersulfat | 26,0 | 26,0 | 26,00 | 26,00 |
Natriumcarbonat | 2,0 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
Pyrogenes Silica | 2,0 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
Farbstoff/Geschmacksstoff | 2,0 | 2,0 | 2,00 | 2,00 |
-
In
den Beispielen 62-65 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle 111
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 62-65 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen 111, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
3. Körperreinigungszusammensetzungen
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfassen Körperreinigungszusammensetzungen
zum Reinigen der Haut (in flüssiger
Form und in Stückform)
ein oder mehrere der Proteaseenzyme. Solche Zusammensetzungen umfassen
typischerweise von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% Proteaseenzym,
vorzugsweise von etwa 0,005 Gew.-% bis etwa 2 Gew.-% und am meisten
bevorzugt von etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 0,8 Gew.-% der Zusammensetzung.
Bevorzugte Körperreinigungszusammensetzungen,
in die Proteaseenzyme, wie hier beschrieben, eingeschlossen werden
können,
werden in den
US-Patentanmeldungen
SN 08/121,623 und
SN
08/121,624 , beide von Visscher et al., ein gereicht am 14.
September 1993, deren Offenbarungen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme
hierin eingeschlossen sind, gelehrt. Solche Zusammensetzungen werden
durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
-
Beispiel 66
-
Flüssige seifenhaltige
Körperreinigungszusammensetzungen
Bestandteil | Gewichtsprozent |
Seife
(K oder Na) | 15,00 |
30%
Laurat | |
30%
Myristat | |
25%
Palmitat | |
15%
Stearat | |
Fettsäuren (vorstehende
Anteile) | 4,50 |
Na-Laurylsarcosinat | 6,00 |
Natriumlaureth-3-sulfat | 0,66 |
Cocamidopropylbetain | 1,33 |
Glycerin | 15,00 |
Propylenglycol | 9,00 |
Polyquaternium
10 | 0,80 |
Ethylenglycoldistearat
(EDTA) | 1,50 |
Propylparaben | 0,10 |
Methylparaben | 0,20 |
Protease
Nr. 12 | 0,10 |
KOH
oder NaOH | Falls
zur Einstellung des pH-Werts erforderlich |
Calciumsulfat | 3 |
Essigsäure | 3 |
Wasser | ad
100 |
-
Beispiel 67
-
Strückförmige Körperreinigungszusammensetzungen
Bestandteil | Gewichtsprozent |
Natriumcocoylisethionat | 47,20 |
Natriumcetearylsulfat | 9,14 |
Paraffin | 9,05 |
Natriumseife
(in situ) | 3,67 |
Natriumisethionat | 5,51 |
Natriumchlorid | 0,45 |
Titandioxid | 0,4 |
Trinatrium-EDTA | 0,1 |
Trinatrium-Etidronat | 0,1 |
Duftstoff | 1,20 |
Na2SO4 | 0,87 |
Protease
Nr. 12 | 0,10 |
Wasser/geringfügige Bestandteile | ad
100 |
-
In
den Beispielen 66-67 wird Protease Nr. 12 durch die in Tabelle III
aufgeführten
Proteasen Nr. 1-11 und 13-25, neben anderen, einschließlich der
in den Tabellen V und VI beschriebenen zusätzlichen Proteasen, die in
der vorliegenden Erfindung geeignet sind, mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert. Außerdem
wird in den Beispielen 66-67 Protease Nr. 12 durch eine beliebige
Kombination der in den Tabellen III, V und VI aufgeführten, in
der vorliegenden Erfindung geeigneten Proteaseenzyme, neben anderen,
mit im Wesentlichen ähnlichen
Ergebnissen substituiert.
-
Beispiel 68
-
Waschleistungstest
-
Die
Waschleistung der in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
geeigneten Varianten wird durch Messen der Entfernung von Flecken
von EMPA 116-Gewebemustern (Blut/Milch/Ruß auf Baumwolle) (Testfabrics,
Inc., Middlesex, NJ 07030) bewertet.
-
Sechs
EMPA 116-Muster, zugeschnitten auf 7,3 × 11,4 cm (3 × 4 1/2
Zoll) mit gezackten Rändern
werden in die einzelnen Gefäße eines
Terg-O-Tometers, Modell 7243S (United States Testing Co., Inc.,
Hoboken, NJ), gelegt, die 1000 ml Wasser, Härte 3,9 g/l (15 gpg) (Ca
++:Mg
++::3:1::w:w),
7 g Waschmittel und Enzym, wie jeweils zutreffend, enthalten. Der
Waschmittelgrundbestandteil ist WFK1-Waschmittel von wfk-Testgewebe GmbH,
Adlerstraße
42, Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Deutschland:
Bestandteil | %
der Endformulierung |
Zeolith
A | 25% |
Natriumsulfat | 25% |
Wasserfreie
Soda | 10% |
Lineares
Alkylbenzolsulfonat | 8,8% |
Alkoholethoxylat
(7-8 EO) | 4,5% |
Natriumseife | 3% |
Natriumsilicat
(SiO2:Na2O::3,3:1) | 3% |
-
Zu
diesem Grundwaschmittel wird Folgendes hinzugefügt:
Bestandteil | %
der Endformulierung |
Natriumperboratmonohydrat | 13% |
Copolymer
(Sokalan CP5) | 4% |
TAED
(Mykon ATC Green) | 3% |
Enzym | 0,5% |
Aufheller
(Tinopal AMS-GX) | 0,2% |
-
Natriumperboratmonohydrat
ist von Degussa Corporation, Ridgefield-Park, NJ 07660, erhältlich.
Sokalan CP5 ist von BASF Corporation, Parsippany, NJ 07054, erhältlich.
Mykon ATC Green (TAED, Tetraacetylethylendiamin) ist von Warwick
International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, England,
erhältlich. Tinopal
AMS GX ist von Ciba-Geigy Corporation, Greensboro, NC 27419, erhältlich.
-
Sechs
EMPA 116-Muster werden in Waschmittel mit Enzym 30 Minuten lang
bei 60°C
gewaschen und anschließend
zweimal 5 Minuten lang jeweils in 1000 ml Wasser gespült. Die
Enzyme werden in Endkonzentrationen von 0,05 bis 1 ppm für Standardkurven
und 0,25 ppm für
Routineanalysen hinzugegeben. Die Muster werden getrocknet und gebügelt, und
der Reflexionsgrad der Muster wird anhand des L-Werts auf der L*a*b*-Skala
eines Minolta-Chromameters, Modell CR-200 (Minolta Corporation,
Ramsey, NJ 07446), gemessen. Die Leistung wird protokolliert als
Prozentsatz der Leistung von B.-lentus-(GG36)Protease und berechnet durch
Dividieren der Menge an B.-lentus-(GG36)Protease durch die Menge
an Variantenprotease, die für
die gleiche Fleckenentfernungsleistung benötigt wird, X 100. Die Daten
sind in Tabelle VII aufgeführt. Tabelle
VII
Enzym | Waschleistung |
B.-lentus-Subtilisin | 100 |
N76D | 310 |
N76D/S103A | 230 |
N76D7V104I | 130 |
N76D/V107V | 160 |
N76D/S99D/S101R | 370 |
N76D/S99D/S103A | 290 |
N76D/S101R/S103A | 130 |
N76D/S101R/V104I | 300 |
N76D/S103A/V104I | 320 |
N76D/S103G/V104I | 160 |
N76D/S103A/V104F | 210 |
N76D/S103A/V104N | 110 |
N76D/S103A/V104T | 170 |
N76D7V104I/I107V | 210 |
N76D/S99D/S101R/S103A | 220 |
N76D/S99D/S101R/V104I | 140 |
N76D/S101G/S103A/V104I | 170 |
N76D/S101R/S103A/V104I | 150 |
N76D/S103A/V104I/S105A | 170 |
N76D/S103A/V104T/I107A | 120 |
N76D/S103A/V104T/I107L | 110 |
N76D/S103A/V104I/L126F | 110 |
N76D/S103A/V104I/S128G | 280 |
N76D/S103A/V104I/L135I | 160 |
N76D/S103A/V104I/L135V | 160 |
N76D/S103A/V104I/D197E | 170 |
N76D/S103A/V104I/N204A | 160 |
N76D/S103A/V104I/N204G | 150 |
N76D/S103A/V104I/P210I | 470 |
N76D/S103A/V104I/M222A | 100 |
N76D/S103A/V104I/T260P | 280 |
N76D/S103A/V104I/S265N | 190 |
-
Beispiel 69
-
Proteasestabilität in einer
Flüssigwaschmittelformulierung
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Ein
Vergleich zwischen Proteasestabilität und -deaktivierung in einer
Flüssigwaschmittelformulierung wird
für Bacillus-lentus-Subtilisin
und dessen Variantenenzym N76D/S103A/V104I gemäß dem hierin umrissenen Verfahren
vorgenommen. Die Waschmittelformulierung für die Untersuchung ist eine
im Handel erhältliche Flasche
Tide Ultra-Flüssigwäschewaschmittel,
die in den USA von The Procter & Gamble
Company hergestellt wird. Eine Wärmebehandlung
der Waschmittelformulierung ist notwendig, um Protease in situ zu
deaktivieren.
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Dies
wird durch Inkubieren des Waschmittels bei 96°C für einen Zeitraum von 4,5 Stunden
erreicht. Anschließend
werden konzentrierte Zubereitungen des B.-lentus-Subtilisins und
der Variante N76D/S103A/V104I im Bereich von 20 Gramm/Liter Enzym
bei Raumtemperatur bis zu einer Endkonzentration von 0,3 Gramm/Liter
Enzym in der Waschmittelformulierung zu dem wärmebehandelten Tide Ultra hinzugegeben.
Anschließend
wird das wärmebehandelte
Waschmittel mit Protease in einem auf 50°C thermostatierten Wasserbad
inkubiert. Aus den Inkubationsröhrchen
werden in Zeitintervallen von 0, 24, 46, 76 und 112 Stunden Aliquots
entnommen und durch Zugabe in eine 1-cm-Küvette mit 1,2 mM des synthetischen
Peptidsubstrats Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilid, gelöst in 0,1
M Tris-HCL-Puffer, pH 8,6, und auf 25°C thermostatiert, auf Enzymaktivität getestet.
Die anfängliche
lineare Reaktionsgeschwindigkeit wird spektralphotometrisch durch Überwachung
der Extinktion des Reaktionsprodukts p-Nitroanilin bei 410 nm als
Funktion der Zeit verfolgt. Wie in 10 gezeigt,
wird bei der Variante N76D/S103A/V104I eine wesentlich höhere Stabilität gegenüber Deaktivierung
beobachtet als bei dem nativen B.-lentus-Enzym. Die geschätzten Halbwertszeiten
für die
Deaktivierung in der Tide Ultra-Waschmittelformulierung betragen
für die
zwei Enzyme unter den angegebenen Testbedingungen 45 Stunden für B.-lentus-Subtilisin
und 125 Stunden für
die Variante N76D/S103A/V104I.
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