JPH09505841A - プロテアーゼ含有クリーニング組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の置換で誘導されたプロテアーゼ酵素（前駆酵素で置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、以下の残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentus ズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）を含んでなるクリーニング組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ含有クリーニング組成物 この出願は１９９３年１０月１４日付で出願された米国出願第０８／１３６， ７９７号および１９９４年５月２日付で出願された米国出願第０８／２３７，９ ３８号の一部継続出願であり、双方ともそれら全体で引用することにより本明細 書の開示の一部とされる。 技術分野 本発明はカルボニルヒドロラーゼ変種である新規プロテアーゼ酵素を含んでな る様々なクリーニング組成物に関する。 背景 酵素は最大クラスの天然タンパク質である。各種の酵素は通常異なる種類の化 学反応を触媒する（すなわち、消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼと して知られる酵素は、他のタンパク質を加水分解する（開裂される化学結合のい ずれかの側における水分子のＨおよびＯＨ部分の取込みで化合物を２以上のより 簡単な化合物に分解する）ものとして知られている。タンパク質を加水分解する この能力は、天然タンパク質工学処理プロテアーゼを洗濯洗剤製品への添加剤と して配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタンパク質性で あり、広い特異性を有するプロテアーゼはこのような汚れの除去性を実質的に改 善するものである。 残念ながら、これらタンパク質の天然細菌環境下における効力レベルは比較的 に非天然の洗浄環境中にしばしば移行されていない。特に、熱安定性、ｐＨ安定 性、酸化安定性および基質特異性のようなプロテアーゼの特徴は、酵素の天然環 境外での利用のためには必ずしも最適化されていない。 プロテアーゼ酵素のアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定している。プロ テアーゼのアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えたり、あるい はアミノ酸配列における変化の位置、性質および／または大きさに応じて酵素を 不活化させることさえある。洗浄環境下のようなクリーニング用途でプロテアー ゼの効力を増加させることを目標として、それらの性質を改善する試みに際し、 プロテアーゼのアミノ酸配列を変えるいくつかの試みが行われてきた。これらの 試みには、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、 アミノ酸配列を変えることも含まれる。 当業界で記載された様々な試みにもかかわらず、様々な表面をクリーニングす る上で有用なプロテアーゼの新たに有効な変種に関する必要性が依然として存在 している。したがって、改善されたタンパク質分解活性、基質特異性、安定性お よび／または高性能特徴を有したカルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアー ゼ酵素を含有するクリーニング組成物を提供することが本発明の目的である。こ れらのおよび他の目的は、以下の詳細な記載から容易に明らかとなるであろう。 発明の要旨 本発明は （ａ）有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素は、天然で みられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるア ミノ酸により前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基を置換して誘導さ れたものであり、前駆酵素で置換された上記複数のアミノ酸残基は＋７６位と、 以下の残基：＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、十 ２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６ ６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、十２１７ 、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４のうち１以 上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブ チリシンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Ba cillus lentus ズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）、および （ｂ）プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質 を含んでなるクリーニング組成物に関する。 本発明は、本明細書に記載されたカルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテア ーゼ酵素と物品を接触させることからなる、クリーニングの必要な物品のクリー ニング方法にも関する。したがって、本発明には、好ましくは撹拌下で上記布帛 を上記プロテアーゼ酵素含有水性液と接触させることからなる、布帛クリーニン グ方法も含んでなる。その方法は約６０℃以下の温度で行えるが、もちろん沸騰 までの洗濯温度でればかなり有効である。本発明は、クリーニングの必要な皿を 本明細書に記載されたようなプロテアーゼ酵素と接触させることからなる、皿の クリーニング方法にも関する。本発明の方法には身体の洗浄方法も含まれ、その 方法はクリーニングの必要なヒトまたはそれより下等の動物身体の部分を本明細 書に記載されたようなプロテアーゼ酵素と接触させることからなる。 図面の簡単な説明 図１Ａ‐ＣはBacillus amyloliquefaciensズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ 酸配列と、この遺伝子の部分制限地図について示す（Seq.ID No.6）。 図２はBacillus amyloliquefaciens（ＢＰＮ）′およびBacillus lentus（野 生型）のズブチリシンの中に保存されたアミノ酸残基について示す。 図３Ａおよび３Ｂは４種ズブチリシンのアミノ酸配列について示す。最上列は Bacillus amyloliquefaciensのズブチリシン（ズブチリシンＢＰＮ′ともしばし ば称される）のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7）。第二列はBacillus subtillis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.8）。第三 列はＢ．licheniformis のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq,ID N o.9）。第四列はBacillus lentus のズブチリシン（ＰＣＴ ＷＯ８９／０６２ ７６ではズブチリシン３０９とも称されている）のアミノ酸配列について表す（ Seq.ID No.10）。記号^*はズブチリシンＢＰＮ′と比較した特定アミノ酸残基の 不存在について示す。 図４はプラスミドＧＧＡ２７４の作成について示す。 図５はこの出願で用いられるある発現プラスミドへの中間体であるＧＧＴ２７ ４の作成について示す。 図６Ａおよび６ＢはBacillus lentus のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸 配列について示す（Seq.ID No.11）。成熟ズブチリシンタンパク質はＡｌａに対 応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンによりコードされている 。 図７Ａおよび７Ｂは本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列につい て示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID No.12）。この図面におけるＤＮＡは７６ 位でアスパラギン酸、１０３位でアラニンおよび１０４位でイソロイシンについ てコードするように記載された方法で修飾されている。成熟ズブチリシン変種タ ンパク質はＡｌａに対応するコドンＧＣＧ（３３４‐３３６）で始まるコドンに よりコードされている。 図８はベクターｐＢＣＤＡＩＣＡＴの作成について示す。 図９はベクターｐＵＣＣＡＴＦＮＡの作成について示す。 図１０は液体洗剤処方中において野生型と比較した好ましい成熟酵素の安定性 について示す。 発明の具体的説明 １．プロテアーゼ酵素： 本発明には、非天然カルボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素が含 まれ、この酵素はそれが誘導される前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して、異 なるタンパク質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィルおよび／または 性能特徴を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼ でもまたは組換えヒドロラーゼであってもよい。このカルボニルヒドロラーゼ変 種は天然でみられないアミノ酸配列を有しており、異なるアミノ酸による前駆カ ルボニルヒドロラーゼの「複数アミノ酸残基」の置換により誘導されている。前 駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋７６位と、以下の残基：＋９９、＋１０１、 ＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１ ２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、十１９７、＋２０ ４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０ 、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上とに相当し、その番号位置はBa cillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒドロラ ーゼまたはズブチリシン、例えばBacillus lentus ズブチリシンの相当アミノ酸 残基に対応する。 本発明による組成物で有用なプロテアーゼ酵素であるカルボニルヒドロラーゼ 変種は、アミノ酸残基＋７６位の置換を、一以上の追加修飾と共に有する。好ま しくは、本発明において有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合せ：76/99; 76/ 101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 76/99/104; 76 /101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76 /99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/12 3; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/99/101/103/1 04/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/1 04/210; 76/103/104/126/265 および／または76/103/104/222 においてアミノ酸 残基の置換、欠失または挿入を有する。最も好ましくは、本発明において有用な 変種酵素は残基の下記組合せ：Ｂ．amyloliquefaciens ズブチリシンの76/99; 7 6/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/ 104および76/101/104においてアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を有する。 このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン変種をコードする変種 ＤＮＡ配列は、天然または組換え前駆酵素をコードする前駆ＤＮＡ配列から誘導 される。変種ＤＮＡ配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて７６、９９、 １０１、１０３、１０４、１０７、１２３、２７、１０５、１０９、１２６、１ ２８、１３５、１５６、１６６、１９５、１９７、２０４、２０６、２１０、２ １６、２１７、２１８、２２２、２６０、２６５および／または２７４位あるい はそのいずれかの組合せに相当する前駆ＤＮＡ配列によりコードされる１以上の 特定アミノ酸残基の置換についてコードするように前駆ＤＮＡ配列を修飾するこ とにより誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残基は（すべての ズブチリシンで残基位置を特定する上で常法になった）Ｂ．amyloliquefaciens に適用しうる番号付けに従い特定されているが、本発明において有用な好ましい 前駆ＤＮＡ配列は図６で示されたようなBacillus lentus のＤＮＡ配列である（ Seq.ID No.11）。 これらの変種ＤＮＡ配列は、１以上の追加修飾と共にアミノ酸残基７６の挿入 または置換についてコードしている。好ましくは、変種ＤＮＡ配列は下記組合せ ：76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123; 76/99/101; 76/99/103; 7 6/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123; 76 /107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104; 7 6/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76/99/103/104/123; 76/ 99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/1 03/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/1 07; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265および／または76/103/104/222でアミ ノ酸残基の置換または挿入についてコードしている。最も好ましくは、変種ＤＮ Ａ配列は残基の下記組合せ：76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/1 07; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104および76/101/104の修飾についてコ ードしている。これらの組換えＤＮＡ配列は、一般的に前駆カルボニルヒドロラ ーゼＤＮＡ配列によりコードされる酵素の同性質とは実質的に異なる少くとも１ つの性質と、新規アミノ酸配列を有する、カルボニルヒドロラーゼ変種について コードしている。このような性質にはタンパク質分解活性、基質特異性、安定性 、変化したｐＨプロフィルおよび／または向上した性能特徴が含まれる。 ここで有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ酸残基位置で１９種天然 Ｌ‐アミノ酸のうちいずれかの置換を有している。このような置換はいかなる前 駆ズブチリシン（原核、真核、哺乳動物など）においても行える。この出願全般 にわたり、共通１および３文字コードで様々なアミノ酸を表している。このよう なコードはDale,J.W.(1989),Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley & So ns,Ltd.,Appendix Bと同じである。 好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる置換には、７６位におけ るＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、ＰおよびＮを含めた置換；９９位におけるＤ、Ｔ、 Ｎ、Ｑ、ＧおよびＳを含めた置換；１０１位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ａ、Ｅ、 ＳおよびＲを含めた置換；１０３位におけるＱ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、 ＳおよびＡを含めた置換；１０４位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換 ；１０７位におけるＶ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、Ｓ、Ａ、ＮおよびＩを含 めた置換；１２３位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換；２ ７位におけるＫ、Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換；１０５位におけるＡ、Ｄ、 Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換；１０７位におけるＡ、Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、 ＳおよびＡを含めた置換；１０９位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含め た置換；１２６位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換；１２８位にお けるＧ、ＬおよびＡを含めた置換；１３５位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを 含めた置換；１５６位におけるＤ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換；１６ ６位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；１９５位におけるＥを含めた 置換； １９７位におけるＥを含めた置換；２０４位におけるＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤを 含めた置換；２０６位におけるＬ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換；２１０位 におけるＬ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換；２１６位におけるＶ、Ｅ、Ｔお よびＫを含めた置換；２１７位における全１９種天然アミノ酸を含めた置換；２ １８位におけるＳ、Ａ、Ｇ、ＴおよびＶを含めた置換；２２２位における全１９ 種天然アミノ酸を含めた置換；２６０位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋお よびＤを含めた置換；２６５位におけるＮ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、ＹおよびＨを 含めた置換；２７４位におけるＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制限 されない。このような各位置で置換される特に好ましいアミノ酸は下記表Ｉで表 示されている。特定のアミノ酸が表Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も特 定残基で置き換わっていてよいことが理解されるべきである。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋７６に相当するアミノ酸残基に おいてＢ．lentusズブチリシンでインビトロ変異を有するこれらのプロテアーゼ 酵素は、前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例えば、修正された自己タ ンパク質分解安定性）を示すズブチリシン変種を生じる（表IVおよびVI参照）。 しかも、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋９９、＋１０１ 、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋ １２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２ ０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６ ０、＋２６５および／または＋２７４に相当する残基のインビトロ変異は、単独 でまたは互いの組合せで、＋７６変異と一緒になって、変化したタンパク質分解 活性、 変化した熱安定性、変化したｐＨプロフィル、変化した基質特異性および／また は変化した性能特徴を示すズブチリシン変種を生じる。 カルボニルヒドロラーゼは、Ｃ（Ｏ）‐Ｘ結合（Ｘは酸素または窒素である） を有した化合物を加水分解するプロテアーゼ酵素である。それらには天然カルボ ニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼがある。天然カルボニル ヒドロラーゼには主としてヒドロラーゼ、例えばズブチリシンまたはメタロプロ テアーゼのようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒドロラーゼとしては α‐アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、ア シルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペ プチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキシルプロテイナーゼおよびメタ ロプロテイナーゼがある。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼと、 エンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。 “組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボニルヒドロラーゼをコー ドするＤＮＡ配列が、カルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列において１以上のア ミノ酸の置換、挿入または欠失についてコードする変異ＤＮＡ配列を生じるよう に修飾されてなる、カルボニルヒドロラーゼを意味する。適切な修飾法は本明細 書、ならびに米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４，６０６）、米国特許 第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号明細書に開示さ れており、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチド結合を開裂するように 通常作用する細菌または真菌カルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる “ズブチリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味する。 天然ズブチリシンのシリーズは様々な微生物種により産生されて、しばしば分泌 されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列は完全に相 同的ではない。しかしながら、このシリーズのズブチリシンは同一または類似タ イプのタンパク質分解活性を示す。この種のセリンプロテアーゼは、それらとキ モトリプシン関連のセリンプロテアーゼとを区別する触媒三残基(catalytictria d)を規定する共通アミノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリプシ ン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンか らなる触媒三残基を有している。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これ らアミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけて読取ると、アスパ ラギン酸‐ヒスチジン‐セリンである。しかしながら、キモトリプシン関連プロ テアーゼでは、相対順序がヒスチジン‐アスパラギン酸‐セリンである。このた め、本ズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三残基を有するセリ ンプロテアーゼに関する。例には本図３で特定されたズブチリシンがあるが、そ れに限定されない。 “組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコードするＤＮＡ配列が天然ズ ブチリシンアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコ ードする変種（または変異）ＤＮＡ配列を生じるように修飾されたズブチリシン を意味する。このような修飾を生じて、本明細書において開示されたものと組み 合わせてもよい適切な方法には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ３４， ６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５ ８号明細書に開示されものがある。 “非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらをコードするＤＮＡは、多く の原核および真核生物から得られる。原核生物の適切な例には、E.coliまたはPs eudomonas のようなグラム陰性生物と、Micrococcus またはBacillusのようなグ ラム陽性細菌がある。カルボニルヒドロラーゼおよびそれらの遺伝子が得られる 真核生物の例には、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、Aspergillus sp． のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例えばカルボニルヒドロラーゼキモシンつ いてコードする遺伝子が得られるウシsp．がある。ズブチリシンの場合のように 、 カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリーズのメンバー間で完全に相同的 ではないアミノ酸配列を有するが、それでもなお同一または類似タイプの生物活 性を示す、様々な関連種から得られる。このため、ここで用いられるような非ヒ トカルボニルヒドロラーゼは、原核および真核源と直接または間接的に関連した カルボニルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。 “カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニルヒドロラーゼ”のアミ ノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ（ 例えばズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）および 組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）がある。カルボニルヒドロラー ゼ変種のアミノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失ま たは挿入により、前駆ヒドロラーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このよう な修飾は、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）酵素自体の操作よりも むしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）のアミノ酸配列をコード する“前駆ＤＮＡ配列”においてなされるものである。前駆ＤＮＡ配列のこのよ うな操作に適した方法には本明細書において開示された方法と、当業者に公知の 方法がある（例えば、ＥＰ Ｏ ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９とそこで 既に参照された米国特許および出願参照）。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの下記位置：＋９９、＋１０１、＋ １０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２ ６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４ 、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、 ＋２６５および／または＋２７４のうち１以上と共に＋７６位に相当する特定残 基が本発明においては変異のために特定されている。好ましくは、修飾される残 基は下記組合せ76/99; 76/101; 76/103; 76/104; 76/107; 76/123;76/99/101; 7 6/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104;76/104 /107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/10 4; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104; 76 /99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105; 76/103/104/135; 76/103/1 04/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 および／また は76/103/104/222、最も好ましくは76/99; 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76 /104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 および 76/101/104 から選択さ れる。これらのアミノ酸位置番号は、図１で表された成熟Bacillus amyloliquef aciensズブチリシン配列に当てはめられた場合に関する。しかしながら、本発明 において有用なプロテアーゼ酵素はこの具体的ズブチリシンの変異に制限されず 、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの具体的な特定残基に“相当”する 位置でアミノ酸残基を有する前駆カルボニルヒドロラーゼにもおよぶ。好ましく は、前駆ズブチリシンはBacillus lentus ズブチリシンであり、置換、欠失また は挿入は上記場合に対応するＢ．lentusの相当アミノ酸残基において行われる。 前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、それが相同的である（即 ち、一次または三次構造の位置に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciens ズブチリシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloliquefaciensズブチ リシンにおける特定残基またはその残基の一部と類似している（即ち、化学的に 化合、反応または相互作用する上で同一または類似した機能的能力を有する）。 一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カルボニルヒドロラーゼのア ミノ酸配列はBacillus amyloliquefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公 知であるズブチリシンにおいて非変種であることが知られた残基セットと直接比 較される。図２はamyloliquefaciensズブチリシンとＢ．lentusズブチリシンと の間における保存残基について示している。保存残基を並べて、並びを維持する （即ち、予定にない欠失および挿入による保存残基の除去を避ける）ために必要 な挿入および欠失を行った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの一次 配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかにされる。保存残基の並びは、 好ましくはこのような残基の１００％を保存しているべきである。しかしながら 、保存残基の７５％以上または５０％もの少ない並びでも、相当残基を明らかに する上で十分である。触媒三残基Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存 は維持されているべきである。 例えば、図３において、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtillis、 Bacillus licheniformis(carisbergensis)およびBacillus lentus のズブチリシ ンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を与えるように並べら れている。これら配列の比較では、各配列に多くの保存残基が含まれていること を示している。これらの保存残基（ＢＰＮ′およびＢ．lentus間）は図２で特定 されている。 このため、これらの保存残基は、Bacillus lentus のズブチリシン（１９８９ 年７月１３日付で公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０６２７９）、ここで 好ましいズブチリシン前駆酵素、または好ましいBacillus lentus ズブチリシン と高度に相同的であるＰＢ９２として称されるズブチリシン（ＥＰＯ ３２８２ ９９）のような他のカルボニルヒドロラーゼで、Bacillus amyloliquefaciensズ ブチリシンの対応する相当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。これ らズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、保存残基の最大ホモロジーを 生じるBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの配列と共に、図３Ａおよび３ Ｂにおいて並べられている。この図にみられるように、Bacillus amyloliquefac iensズブチリシンと比較してBacillus lentus の配列にいくつかの欠失がある。 このため、例えば、他のズブチリシンにおいてBacillus amyloliquefaciensズブ チリシンのＶａｌ１６５に相当するアミノ酸は、Ｂ．lentusおよびＢ．lichenif ormis の場合にイソロイシンである。 このため、例えば、＋７６位のアミノ酸はＢ．amyloliquefaciens およびＢ． lentusズブチリシン双方でアスパラギン（Ｎ）である。しかしながら、本発明に おいて有用な好ましいズブチリシン変種において、Bacillus amyloliquefaciens ズブチリシンで＋７６に相当するアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されて いる。ここで置換について特定されたすべてのアミノ酸残基vs.このような各位 置で好ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示されている。 相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆カルボニルヒドロラーゼ の三次構造レベルでホモロジーを調べることにより明らかにしてもよい。相当残 基は、前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliquefaciensズブチリ シンの特定アミノ酸残基の２以上の主鎖原子（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣ、お よびＯとＯ）の原子座標が並べた後に０．１３ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ以内 である場合として明らかにされる。ベストモデルがBacillus amyloliquefaciens ズブチリシンに対して問題のカルボニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の 原子座標の最大オーバーラップを与えるように配向および配置された後で、並び が実現される。ベストモデルは利用できる最高解像能で実験回折データについて 最低Ｒ因子を与える結晶学モデルである。 Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基と機能的に類似した相当 残基とは、それらがBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限ら れかつ属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒作用を変更、修飾 またはそれに寄与するようなコンホメーションをとる前駆カルボニルヒドロラー ゼのアミノ酸として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原子が相同位 置を占めることに基づく一致性の基準を満たさないが、残基の側鎖原子の少くと も２つの原子座標がBacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原子の ０．１３ｎｍ内に存在する程度まで類似した位置を占める（三次構造がＸ線結晶 学で得られた）前駆カルボニルヒドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliqu efaciensズブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開Ｎｏ．０ ２５１ ４４ ６（米国特許出願第０８／２１２，２９１号に相当する、その開示は引用するこ とにより本明細書の開示の一部とされる）に示され、三次構造のレベルで相当残 基を決めるために上記のように使用できる。 置換、挿入または欠失について特定された残基の一部は保存残基であるが、そ の他はそうではない。保存されていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は 天然でみられるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を生じる置換に限定 される。保存残基の場合、このような置換は天然配列で起こらないはずである。 本発明において有用なカルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニルヒドロラー ゼ変種の成熟形とこのようなヒドロラーゼ変種のプロおよびプレプロ形がある。 プレプロ形は、これがカルボニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟を促 進することから、好ましい構造である。 “プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒドロラーゼの“成熟”形を 出現させる、カルボニルヒドロラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ 酸の配列に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産物として天然で みられ、翻訳後プロセッシングがないとこのまま発現される。カルボニルヒドロ ラーゼ変種、特にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacillus amylo liquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であるが、他のズブチリシンプロ配列 も用いてよい。例では、Bacillus lentus（ＡＴＣＣ ２１５３６）のズブチリ シンの推定プロ配列が用いられる。 “シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニルヒドロラーゼのＮ末端 部分、あるいはヒドロラーゼの成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラ ーゼのＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグナル配列のこの定 義は機能的なもので、天然条件下でズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラ ーゼの分泌の実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カルボニルヒ ドロラーゼのＮ末端部分によりコードされるすべてのアミノ酸配列を含めた意味 である。本発明で有用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニルヒド ロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を利用する。例で用いられる好 ましいシグナル配列は、Bacillus lentus（ＡＴＣＣ ２１５３６）ズブチリシ ンのシグナル配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズブチリシン からのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基を含んでなる。 カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒドロラーゼのアミノ末端 に作動的に結合されたプロ配列と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された “プレ”または“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼの成熟形からなる。 “発現ベクター”とは、適切な宿主でＤＮＡの発現を行える適切な制御配列に 作動的に結合されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ組立体に関する。このような制御配 列には、転写を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オペレーター 配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位についてコードする配列と、転写およ び翻訳の終結を制御する配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒 子または単純に可能なゲノムインサートである。適切な宿主に形質転換されると 、ベクターは宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、あるいは一部の場 合にはゲノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、“プラスミド”およ び“ベクター”は時々互換的に用いられるが、プラスミドが現在最も常用される 形 のベクターである。しかしながら、相当する機能を発揮して、当業界で知られる かまたは知られるようになった、このような他の形の発現ベクターもここに含ま れる。 本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵素的に活性なエンドプロ テアーゼを分泌しないように操作された、好ましくは米国特許第４，７６０，０ ２５号（ＲＥ３４，６０６）で開示された方法により操作された、原核または真 核宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい宿主細胞は、酵素的に活 性な天然プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBaci llus株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の作成は米国特許第５，２６４，３ ６６号明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現させる上で他の宿主 細胞には、Bacillus subtilis １１６８（米国特許第４，７６０，０２５号（Ｒ Ｅ３４，６０６）および米国特許第５，２６４，３６６号明細書でも記載されて おり、それらの開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる）とＢ ．licheniformis、Ｂ．lentusなどのようないずれか適切なBacillus株がある。 宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて作成されたベクターで形質転換またはト ランスフェクトされる。このような形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒド ロラーゼ変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラーゼ変種を発現 するベクターを複製することができる。カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよ びプレプロ形についてコードするベクターの場合、このような変種は発現される と、典型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌される。 “作動的に結合された”とは、２つのＤＮＡ領域間の関係について表すとき、 それらが互いに機能的に関連していることを単純に意味する。例えば、プレ配列 は、それがシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の分泌に関与し、 おそらくシグナル配列を開裂させるならば、ペプチドに作動的に結合されている 。プロモーターはそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動的に結合 さ れており、リボソーム結合部位はそれが翻訳を行えるように配置されているなら ばコード配列に作動的に結合されている。 天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られる一 般的方法に従い得られる。その方法では通常目的のヒドロラーゼの領域をコード する推定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼを発現する生物から ゲノムライブラリーを作り、プローブとのハイブリッド形成により目的とする遺 伝子についてライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハイブリッド形 成クローンの酵素地図が作成され、配列決定される。例で用いられるＢ．lentus 遺伝子は米国特許第５，１８５，２５８号明細書の例１で記載されたようにクロ ーニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 例で用いられるＢＰＮ′遺伝子はＲＥ３４，６０６明細書の例１で記載されたよ うにクローニングされ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部と される。 次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細胞を形質転換してヒドロ ラーゼを発現させるために用いられる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数 プラスミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要な周 知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に結合されたプロモーター（それが宿主によ り認識、即ち転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターとして供給さ れる）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ遺伝子の内在ターミネーター領域に より供給される（ある真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写された ｍＲＮＡの安定性にとり必要な）転写終結およびポリアデニル化領域と、望まし くは抗生物質含有培地中の増殖でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行え る抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという意味で、宿主で複 製される。高コピー数プラスミドは宿主用の複製起点も含み、それにより染色体 制限なしに細胞質で多数のプラスミドを生成させることができる。しかしながら 、 ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲノム中に組込むこともこの本範囲に含 まれる。これは、特に相同的組換えを受けやすい原核および真核生物で容易化さ れる。 本例で用いられる遺伝子は天然Ｂ．lentus遺伝子および天然Ｂ．amyloliquefa ciens遺伝子である。一方、天然または変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブ チリシン）についてコードする合成遺伝子も作成してよい。このようなアプロー チで、前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列 が決定される。その後多数の重複合成一本鎖ＤＮＡ断片が合成され、ハイブリッ ド形成および結合により前駆ヒドロラーゼについてコードする合成ＤＮＡを生じ る。合成遺伝子作成例は米国特許第５，２０４，０１５号明細書の例３で示され 、その開示は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子がクローニングされると、 いくつかの修飾が天然前駆カルボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用 を高めるために行われる。このような修飾には、米国特許第４，７６０，０２５ 号（ＲＥ３４，６０６）およびＥＰＯ公開第０ ２５１ ４４６号明細書で開示 されたような組換えカルボニルヒドロラーゼの生産と、ここで記載されたカルボ ニルヒドロラーゼ変種の生産がある。 下記カセット変異誘発法も本発明で有用なカルボニルヒドロラーゼ変種の作成 および同定を容易にするために用いられるが、部位特異的変異誘発を含めた他の 方法も用いてよい。最初に、ヒドロラーゼについてコードする天然遺伝子が得ら れ、全部または一部が配列決定される。次いで配列がコードされた酵素で１以上 のアミノ酸の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる箇所について 走査される。この箇所に隣接する配列は、発現されたときに様々な変異体につい てコードするオリゴヌクレオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換するた めの制限部位の存在について評価される。このような制限部位は、好ましくは遺 伝子セグメントの置換を容易にするためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位で ある。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複していない好都合な制限 部位はいずれも用いうるが、但し制限切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で 再アセンブリーできねばならない。制限部位が選択された箇所から好都合な距離 内の位置（１０〜１５ヌクレオチド）に存在しないならば、このような部位は読 取枠だけでなくコードされたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺伝子でヌ クレオチドを置換させることにより作成される。その配列を変えて望ましい配列 にするための遺伝子の変異は、通常知られる方法に従いＭ１３プライマー伸長に より行われる。適切な隣接領域を配置して、２つの好都合な制限部位配列にする ために必要な変化を評価する作業は、遺伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素 地図および多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。好都合な隣接制限部 位が利用しうるならば、上記方法は部位を含まない隣接領域だけと併用される必 要があることに留意すべきである。 天然ＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローニングされると、変異される位置に隣接 した制限部位は同族制限酵素で切断され、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカ セットがその遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌクレオチドが 同様の制限部位を有するように合成できて、合成リンカーが制限部位を作成する 上で不要であるため、この方法により簡易化される。 ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素ｍｇ当たりのペプチド結合 の加水分解速度として規定される。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定 するために存在する（K.M.Kalisz,″Microbial Proteinases″,Advances in Bio chemical Engineering/Biotechnology,A.Fiechter ed.,1988）。修正タンパク質 分解活性に加えてまたは代えて、本発明の変種酵素はＫ_m、Ｋ_Cat、Ｋ_Cat／Ｋ_m比 および／または修正基質特異性および／または修正ｐＨ活性プロフィルのような 他の修正された性質を有していてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用 途のような加水分解プロセスで存在することが予想される特定基質用に作ること ができる。 １つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して変化したタンパク質分解 活性を有する変種カルボニルヒドロラーゼを得ることであり、そうすればこのよ うな活性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率的に作用するよう に酵素を使用できるようになるからである。前駆体と比較して変化した熱安定性 および／または変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。好ましくは 、変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブチリシンである。Bacillus amyloli quefaciensズブチリシンの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋ １０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３ ５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０ 、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／また は＋２７４あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基においてズブチリシ ンタイプカルボニルヒドロラーゼでこのような結果を得るために有用な特定のア ミノ酸が以下の実施例において示されている。一部の場合には、低いタンパク質 分解活性が望ましい。逆に、一部の場合には、前駆体よりも変種酵素のタンパク 質分解活性を増加させることが望まれる。加えて、アルカリまたは熱安定性であ ろうと、変種の安定性の増加または減少（変更）が望まれる。Ｋ_cat、Ｋ_mまたは Ｋ_cat／Ｋ_mの増加または減少は、これらの動力学的パラメーターを決定するため に用いられる基質に特異的である。 しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋７６位に相当する残基は酵 素の全体的安定性および／またはタンパク質分解活性を調節する上で重要なこと がわかった。このため、例で示されたように、相当する＋７６位におけるBacill us lentus ズブチリシンのアスパラギン（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定 性および／または高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋９９、＋１０１ 、 ＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１ ２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０ ４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０ 、＋２６５および／または＋２７４のうち１以上の修飾と共に、好ましいプロテ アーゼ酵素でアスパラギン酸（Ｄ）により置換することができる。 本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で示されている。これらに は置換残基の下記特定組合せ：N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D /S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V 104Iがある。これらの置換は好ましくはBacillus lentus（組換えまたは天然型 ）ズブチリシンで行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシンで行っても よい。 このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基づくと、Bacillus amylo liquefaciensの＋７６、＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋ １２３、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５ ６、＋１６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６ 、＋２１７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４ 位に相当するカルボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残基が、 これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／または安定性と、このような変 種酵素のクリーニングまたは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。 以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造例により示されている。 プロテアーゼ製造例 Ｂ．subti1isでＧＧ３６遺伝子発現用の作成 Ｂ．lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのクローニングおよび作成 は、米国特許第５，１８５，２５８号明細書で記載された場合と本質的に同様に 行う。プラスミドＧＧＡ２７４（図４に記載）が図５で示されたように下記のや り方で更に修飾される。ＧＧＡ２７４プラスミドの作成時に導入されたＰｓｔＩ 部位は、下記配列：５′ＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＴＡＡＡ３′（Seq．I D No.1）を有するオリゴヌクレオチドで、下記のオリゴヌクレオチド特異的変異 誘発により除去される。下線“Ａ”残基は制限酵素PｓｔＩの認識配列を除いて 、２７４位でアラニンからトレオニンに対応アミノ酸残基を変える。２７４位の トレオニンはクローン化Ｂ．lentusズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生 型残基である。ズブチリシンについてコードするＤＮＡセグメントは、ＥｃｏＲ ＩおよびＢａｍＨＩ切断でプラスミドＧＧＡ２７４またはその誘導体（図５で示 されたＧＧＴ２７４）から切り出される。ＤＮＡ断片は、変異誘発のために、Ｍ Ｐ１９のようなバクテリオファージＭ１３ベースベクター中に逆サブクローニン グされる。変異誘発後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断、その後クローニン グが、変異ズブチリシンタンパク質の発現および回収のために、ＧＧＡ２７４の ような発現プラスミド中に変異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行われる 。 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et al.(1983),Methods Enzymo l.,100:468-500で記載されたように行われる。例として、配列５′ＧＣＴＧＣＴＣ ＴＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧ３′（Seq.ID No.2）の合成オリゴヌクレオチドが７ ６位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）、即ちＮ７ ６Ｄに変えるために用いられる。下線“Ｇ”および“Ｃ”残基は野生型遺伝子配 列からの変化を表す。ＣＡは＋７５位でロイシンを保ち、Ｘｂａｌ制限酵素のＸ ｂａｌ認識部位（ＴＣＴＡＧＡ）を導入するようにアミノ酸配列を変化させ、一 方ＧＡＣの変化は＋７６のアスパラギンをアスパラギン酸に変化させる。 ９９、１０１、１０３および１０４位の変異誘発には、異なるオリゴヌクレオ チドが望ましい変異の組合せに応じて使用できる。例えば、配列５′ＧＴＡＴＴ ＡＧＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＴ３′ （Seq.ID No.3）のオリゴヌクレオチドが単一ズブチリシン分子で下記変化：Ｓ ９９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３ＡおよびＶ１０４Ｉを同時に行うために用いられ る。同様に、配列５′ＴＣＡＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＣＣＡ ＡＧＧＡＴＴＧ３′（Seq.ID No.4）および５′ＣＡＣＧＴＴＧＣＴＡＧＣＴＴ ＧＡＧＴＴＴＡＧ３′（Seq.ID No.5）のオリゴヌクレオチドがＩ１０７Ｖおよ びＮ１２３Ｓを各々作るために利用される。同じく、下線残基はアミノ酸配列ま たは制限酵素認識配列で望ましい変化を生じさせる野生型配列からの変化を表す 。 ズブチリシン変種のタンパク質分解活性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従い、表III で掲載された変 種が作られる。これらズブチリシン変種の各々のタンパク質分解活性は表III で 示されている。動力学的パラメーターｋ_cat、Ｋ_mおよびｋ_cat／Ｋ_mは、P.Bonnea u et al.(1991)J.Am.Chem.Soc.,Vol.113,No.3,p.1030 に記載された方法を用い て、合成ペプチド基質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐ Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリドの加水分解に関して測定される。簡単にいえば、少 量のズブチリシン変種ストック溶液がｐＨ８．６の０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ緩衝液 に溶解された基質を含む１ｃｍキュベットに加えられ、２５℃で恒温される。反 応の進行は４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターする ことにより分光測定で追跡される。動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴ リズムを用いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis-Menten式に当 てはめることにより得られる。 表III に掲載された結果は、試験されたズブチリシン変種のすべてがタンパク 質分解活性を留めていることを示している。更に、データの詳しい分析では、タ ンパク質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで７６、９９、１０１、１０３ 、１０４、１０７および１２３位に相当するアミノ酸残基において置換の様々な 組合せによりBacillus lentus ズブチリシンで有意に変わっていることを示して いる。 ズブチリシン変種の熱安定性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスにより作られた本発明のBa cillus lentus ズブチリシンおよび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示 されている。５０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有または非含有０．１Ｍグリシン、０．０ １％Tween-80ｐＨ１０．０中の精製酵素１５μg/mlを小さな管中に入れ、１０℃ で５分間、１０〜６０℃で１分間および６０℃で２０分間インキュベートする。 次いで管を氷上に１０分間おく。管からの一部は、２５℃に恒温された０．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基質サク シニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニリ ドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について調べる。初期 の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニ リンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。データは加熱前に 対する活性％として表示される。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（２６ 例中２４）が５０ｍＭ ＣａＣｌ₂添加試験条件下でBacillus lentus ズブチリ シンに匹敵する熱安定性を発揮することを示している。５０ｍＭ ＣａＣｌ₂非 添加試験条件下でも、大多数の変種（２６例中１９）がBacillus lentus ズブチ リシンよりも有意に安定である。更に、変種N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D /V104I、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S 101R/S103A/V104Iは５０ｍＭ ＣａＣｌ₂非添加試験条件下で単一置換変種Ｎ ７６Ｄよりも有意に安定である。 ファージミドから作られた一本鎖ＤＮＡ鋳型による オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 Ａ．Ｂ．lentus変種の作成 変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記された場合 と本質的に同様である。一本鎖ＤＮＡ鋳型はファージミド法で作る。一本鎖ＤＮ Ａ鋳型作成用のファージミドベクターを作成するために、我々はベクターｐＢＣ ＤＡＩＣＡＴを最初に作成した。ベクター作成のフローチャートは図８で示され ている。初めに、ｐＣ１９４プラスミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bac teriol.,150: 8-15,1982）のＣＡＴ遺伝子についてコードするＣ１ａＩ−Ｃ１ａ Ｉ断片をｐＵＣ１９（New England BioLabs,Beverly,MA）のポリリンカー領域の ＡｃｃＩ部位中にクローニングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬを作り、ＧＧ３６Ｄ ＡＩコードＤＮＡの５′末端からのＥｃｏＲＩ‐ＤｒａＩ ０．６ＫＢ断片をｐ ＢＳＫＳプラスミド（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のＥｃｏＲＩおよびＥｃ ｏＲＶ部位中にクローニングしてｐＢＣ２ＳＫ５を作る。プラスミドｐＢＣ２Ｓ Ｋ５の単一ＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩ切断により除去し、その後Ｔ４ＤＮＡポ リメラーゼ触媒で補充し、再結合させて、ＥｃｏＲＩ部位を有しないプラスミド ｐＢＣ２ＳＫ‐５Ｒを作る。ｐＢＣＳＫ‐５Ｒ中にクローニングされたＥｃｏＲ Ｉ‐ＤｒａＩ断片をＰｓｔＩ−ＨｉｎｄIII 断片として単離し、ｐＵＣＣＨＬの ＰｓｔＩ‐ＨｉｎｄIII 部位（ｐＵＣ１９のポリリンカーの一部）中にクローニ ングしてプラスミドｐＵＣＣＨＬ５Ｒを作る。ＧＧ３６ＤＡＩ遺伝子のコード配 列をＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ断片として切出し、ｐＵＣＣＨＬ５ＲのＥｃｏＲＩ ‐ＢａｍＨＩ部位中にクローニングしてｐＵＣＣＡＴを作る。次いでｐＵＣＣＡ Ｔの大きなＥｃｏＲＩ‐ＨｉｎｄIII 断片をＢＳ２ＫＳ＋のＥｃｏＲＩおよびＨ ｉｎｄIII 部位中にクローニングしてプラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。 一本鎖ＤＮＡを作るために、ｐＢＣＤＡＩＣＡＴを含むE.coliをRessel,M., Kidd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45: 333-338,1986に記載されたプロトコールに従 いファージＲ４０８（Stratagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。 一本鎖ＤＮＡ鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で前記さ れたような標準変異誘発方法を実施する。ある変異体の作成は説明目的で以下に 詳述されている。 Ｂ．lentus（ＧＧ３６）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成では、ＧＧ３６ N76D /S103A/V104IについてコードするＥｃｏＲＩ‐ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片をｐＵＣ ＣＡＴの作成（図８参照）に用いて、プラスミドｐＢＣＤＡＩＣＡＴを作る。一 本鎖ＤＮＡ鋳型を前記プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プライ マー ｘＣ１ａｌ ５′ ＴＡＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＣＧ ＡＴＧ ＧＣＴ ３′（Seq.ID No.13） を用いて、Ｌ２１７Ｈを作る。前記のように、下線残基は行われたヌクレオチド 変化を表し、ｘＣ１ａＩは存在するＣ１ａＩ部位が変異誘発後に除去されたこと を示す。変異誘発プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発で記載 されたとおりである。変異誘発後、プラスミドＤＮＡを初めにＣ１ａＩ部位の除 去についてスクリーニングし、Ｃ１ａＩ部位を欠いたクローンをＤＮＡ配列分析 に付して、２１７位アミノ酸残基でＬからＨに変化したＤＮＡ配列について確認 する。 Ｂ．ＢＰＮ′変種の作成およびＢ．subtillsでのそれらの発現 Ｂ．amyloliquefaciens（ＢＰＮ′）N76D/Q103A/Y104I/Y217Lの作成を２つの 連続工程のほかは同様の方式で行う。Ｎ７６Ｄを最初にＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌ中に 導入してＢＰＮ′N76D/Y217Lを作り、第二の変異誘発を行ってＢＰＮ′N76D/Y21 7LをＢＰＮ′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発用の一本鎖ＤＮ Ａ鋳型を作るために、ＢＰＮ′Ｙ２１７ＬズブチリシンについてコードするＥｃ ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（Wells,J.,et al.,PNAS,84,5167,1087 で記載されたＹ ２１７Ｌプラスミドから誘導される）を用いて、プラスミドｐＵＣＣＡＴＦＮＡ を作る（図９参照）。ＢＰＮ′Ｙ２１７Ｌを含むｐＵＣＣＡＴＦＮＡプラスミド を用いて、ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミドを作成する（図９）。一本鎖ＤＮＡを 前記のように作る。ＢＰＮ′N76D/Y217Lを作るために、下記配列のオリゴヌクレ オチドプライマー Ｘbal ５′ Ｃ ＡＣＡ ＧＴＴ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＡＡＣ Ｔ ＣＡ ＡＴＣ ＧＧＴ Ｇ ３′(Seq.ID No.14)を用いて、変化Ｎ７６Ｄを作る 。次いで一本鎖ＤＮＡをＢＰＮ′N76D/Y217L保有ｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド （Ｎ７６Ｄ変異誘発後のｐＢＣＦＮＡＣＡＴプラスミド）から作り、下記配列の もう１つのオリゴヌクレオチド ｘＰvull ５′ ＧＣＴ ＧＡＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＴＴ ３′（Seq.ID No.15）で変異誘発させて、ＢＰＮ′ N76D/Q103A/Y104I/Y217Lを得る。クローニング、一本鎖ＤＮＡ作成、変異誘発お よび変異体のスクリーニングに関係するすべての工程は前記のように実施する。 ＢＰＮ′遺伝子およびその変種の発現は、ＲＥ３４，６０６に記載されたような Bacillus subtilis のプロテアーゼ欠失株中に直接プラスミドＤＮＡ（異なる変 種のＢＰＮ′遺伝子を含むｐＢＣＦＮＡＣＡＴ）を組込むことにより行う。 多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どおりに作る。動力学的デー タおよび安定性データはこのような変種について作る。動力学的データは前記方 法を用いて作り、表Ｖで示されている。安定性データはここで詳述されたように 作成した。結果は表VIで示されている。熱安定性アッセイ操作 精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G-25 からなるカラムに酵素を適 用し、同緩衝液を用いてカラムから酵素を溶出させることにより、０．１Ｍグリ シンｐＨ１０．０、０．０１％Tween-80中に緩衝液交換する。 ６０℃に恒温された０．１Ｍグリシン、０．０１％Tween-80ｐＨ１０．０を含 有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、１５μg/mlの最終酵素濃度にする。 一部を様々な時間に６０℃インキュベートから取出し、２５℃に恒温された０ ．１Ｍ tris-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭの合成ペプチド基 質サクシニル‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ａｌａ‐Ｌ‐Ｐｒｏ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロ アニリドを含有する１ｃｍキュベットへの添加により、酵素活性について直ちに 調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ ‐ニトロアニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。 ５０％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、６０℃でインキュベー ト時間の関数として反応速度の一次プロットから決める。 データは同一条件下でBacillus lentus ズブチリシン（ＧＧ３６）について決 められた半減期の％として表VIに掲載されている。 ２．クリーニング組成物物質： 本発明のクリーニング組成物は、前記プロテアーゼ酵素に加えて、プロテアー ゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる。ここで用い られる“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるクリーニング組成物 の具体的タイプおよび製品の形（例えば、液体、顆粒、スプレー組成物）につい て選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意味し、しかもその物質は組 成物で用いられるプロテアーゼ酵素と適合している。クリーニング組成物物質の 具体的選択は、クリーニングされる表面、物品または布帛と使用中（例えば、洗 浄洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物の望ましい形について考慮する ことにより容易に行われる。ここで用いられる“適合する”という用語は、プロ テアーゼが通常の使用状況中に望んでいるほど有効でなくなる程度までにはクリ ーニング組成物物質がプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させないこ とを意味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細に例示されている 。 １種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク質汚れ除去の必要な様々 な表面をクリーニングする上で有用な組成物中に含有される。このようなクリー ニング組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆粒）、硬質表面を クリーニングするための洗剤組成物；形態上制限されない（例えば、顆粒、液体 及び固形処方）、布帛をクリーニングするための洗剤組成物；皿洗い組成物（形 態上制限されない）；形態上制限されない（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口 液処方）オーラルクリーニング組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠 剤）義歯クリーニング組成物がある。ここで記載される“プロテアーゼ酵素の有 効量”とは、特定のクリーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な前 記プロテアーゼ酵素の量に関する。このような有効量は当業者により容易に確認 でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の 具体的組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどうかな どのような多くのファクターに基づいている。 好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約０．０００１〜約１０％、更に 好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０．００１〜約０．１ ％の１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。プロテアーゼ酵素が用いられた 様々なクリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細に記載されている 。ここで用いられるすべての部、パーセンテージ及び比率は、他で指摘されない かぎり重量による。 ここで用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニング 組成物、皿洗い組成物、口内洗浄組成物、義歯クリーニング組成物及び身体洗浄 組成物がある。 Ａ．硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物 プロテアーゼ酵素は、高い起泡性および／または良好な不溶性基質除去性が望 まれるあらゆる洗剤組成物で用いることができる。このため、プロテアーゼ酵素 は、完全に処方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物など を提供するために、様々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成 物は液体、顆粒、固形物などの形をとることができる。このような組成物は３０ 〜６０重量％もの界面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよ い。 本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系、ノニ オン系、双極性などの界面活性剤を含有することができる。このような界面活性 剤は、典型的には組成物の約０．１〜約６０％、好ましくは約１〜約３５％のレ ベルで存在する。 ここで有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なＣ₁₁‐Ｃ₁₈アルキルベンゼ ンスルホネートと一級およびランダムアルキルサルフェート、 式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_x（ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₃およびＣＨ₃（ＣＨ₂）_y（ＣＨＯＳ Ｏ₃ ^-Ｍ⁺）ＣＨ₂ＣＨ₃のＣ₁₀‐Ｃ₁₈二級（２，３）アルキルサルフェート（式中 ｘおよび（ｙ＋１）は少くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍ は水溶性カチオン、特にナトリウムである）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルアルコキシサ ルフェート（特に、ＥＯ１〜７エトキシサルフェート）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アルキルア ルコキシカルボキシレート（特に、ＥＯ１〜７エトキシカルボキシレート）、Ｃ₁₀ ‐Ｃ₁₈アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコ シド、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈α‐スルホネート化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈アルキルおよ びアルキルフェノールアルコキシレート（特に、エトキシレー トおよび混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ベタインおよびスルホベタイ ン（“スルタイン”）、Ｃ₁₀‐Ｃ₁₈アミンオキシド、Ｃ₈‐Ｃ₂₄サルコシネート （特にオレオイルサルコシネート）などがある。アルキルアルコキシサルフェー ト（ＡＥＳ）およびアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）がここでは 好ましい（このような界面活性剤と前記アミンオキシドおよび／またはベタイン またはスルタイン界面活性剤との併用も、処方者の希望に応じて好ましい）。他 の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面 活性剤には、引用することにより本明細書の開示の一部とされる１９９３年３月 １６日付で発行されたConnorらの米国特許第５，１９４，６３９号明細書で開示 されたＣ₁₀‐Ｃ₁₈Ｎ‐メチルグルカミドがある。 ５〜１７、好ましくは６〜１４、更に好ましくは７〜１２範囲内の平均親水性 ‐親油性バランス（ＨＬＢ）を有する界面活性剤を与えるエチレンオキシドと疎 水性部分との縮合物であるノニオン系界面活性剤のクラスが特に有用である。疎 水性（親油性）部分は性質上脂肪族でもまたは芳香族でもよく、いずれか特定の 疎水基と縮合されたポリエチレン基の長さは親水性および疎水性要素間で望まし いバランス度を有する水溶性化合物を生じるように容易に調整できる。アルコー ル１モル当たりエチレンオキシド３〜８モルを含むＣ₉‐Ｃ₁₅一級アルコールエ トキシレート（または混合エトキシ／プロポキシ）、特にアルコール１モル当た りエチレンオキシド６〜８モルを含むＣ₁₄‐Ｃ₁₅一級アルコール、アルコール１ モル当たりエチレンオキシド３〜５モルを含むＣ₁₂‐Ｃ₁₅一級アルコールおよび それらの混合物が特に好ましい。 他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロピー剤、加工助剤、色素または顔料、液 体処方用溶媒などを含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分を 本組成物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、Ｃ₁₀ ‐Ｃ₁₆アルコールアミドのような起泡増進剤が典型的には約１〜約１０％レ ベルで組成物中に配合できる。Ｃ₁₀‐Ｃ₁₄モノエタノールおよびジエタノールア ミドがこのような起泡増進剤の典型的クラスである。このような起泡増進剤と前 記のアミンオキシド、ベタインおよびスルタインのような高起泡性補助界面活性 剤との併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄などのような可 溶性マグネシウム塩が、更に起泡性を出すために、典型的には約０．１〜約２％ のレベルで添加できる。 本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水および他の溶媒を含有することができ る。メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールで例示され る低分子量一級または二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性 剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキ シ基を含んだようなポリオール（例えば、１，３‐プロパンジオール、エチレン グリコール、グリセリンおよび１，２‐プロパンジオール）も使用できる。組成 物は約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％のこのようなキャリヤを含有 する。 本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８〜約１ １．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終製品は 典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用量レベルでｐＨをコントロー ルするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸などの使用があり、これは当業者に 周知である。 本発明の硬質表面クリーニング組成物および布帛クリーニング組成物を処方す る場合、処方者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを用いようとす るであろう。典型的ビルダーには１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキシ レート、例えばシトレートおよびオキシジサクシネート、積層シリケート、ホス フェートなどがある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。 同様に、処方者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、 ペルオキシダーゼおよびプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約 ０．００１〜約１重量％のレベルで用いようとするであろう。様々な洗浄および 布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知である。 ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な漂白化合物が、典型的に は約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中で使用できる。所望であれ ば、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ ンゼンスルホネートなどのようなブリーチ活性剤も含有することができ、これら も当業界で知られている。使用量レベルは、典型的には約１〜約１０重量％の範 囲である。 様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化 剤、特にアミノホスホネートおよびエチレンジアミンジサクシネート、様々な土 汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特に ポリアクリレートおよびポリアルパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増 白剤、様々な色素移動阻止剤、例えばポリビニルピロリドン、様々な起泡抑制剤 、特にシリコーンおよび二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、特にスメクタイト 土および土凝集ポリマー（例えば、ポリ（オキシエチレン））などはすべて約１ 〜約３５重量％範囲のレベルでこのような組成物に使用できる。標準処方集と公 開特許では、このような慣用物質の多数の詳細な記載を含んでいる。 酵素安定剤も本発明のクリーニング組成物で用いてよい。このような酵素安定 剤にはプロピレングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム （好ましくは、約０．１〜約１％）およびギ酸カルシウム（好ましくは、約０． １〜約１％）がある。 １．硬質表面クリーニング組成物 ここで用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タイル などのような硬質表面をクリーニングするための液体および顆粒洗剤組成物に関 する。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアー ゼ酵素、好ましくは組成物の約０．０００１〜約１０重量％、更に好ましくは約 ０．００１〜約５％、更に一層好ましくは約０．００１〜約１％の活性プロテア ーゼ酵素を含有する。１種以上のプロテアーゼ酵素を含有することに加えて、こ のような硬質表面クリーニング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオ ン封鎖ビルダーを含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのよ うなある特殊製品では界面活性剤が時々用いられないが、その理由はそれらがガ ラス表面で薄膜状／すじ状残留物を形成するかもしれないからである。 界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％と少ないが、典型的には組 成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性剤を含有 する。 典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄 ビルダーを含有する。好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。 水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムまたは塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調 整が必要ならば使用できる。 溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはグリコールエーテル、例えば ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチル エーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘ キシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリ コールモノブチルエーテルと、ジオール、例えば２，２，４‐トリメチル‐１， ３‐ペンタンジオールおよび２‐エチル‐１，３‐ヘキサンジオールがあるが、 それらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５ 〜約１５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。 加えて、イソプロパノールまたはエタノールのような高揮発性溶媒は、表面へ の組成物の“フルストレンクス”適用後に表面が洗い落とされないとき、表面か ら組成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いら れる場合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在す る。 本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記非制限例で説明される（下 記例において、例中の“プロテアーゼ＃”は前記表III で該当番号を有する本発 明組成物で有用な変種に関するものである）。 例１〜６ 液体硬質表面クリーニング組成物 例１〜４において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３〜 ２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含め て、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例５および６において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用な プロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２ およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 例７〜１２ 硬質表面をクリーニングして家庭内のカビを除去するためのスプレー組成物 製品ｐＨは約７である。 例７〜１０において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１３ 〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含 めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１１および１２において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 ２．皿洗い組成物 本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は１種以上のプロテアーゼ酵 素を含んでいる。ここで用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されないが顆粒 および液体形を含めて、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成物に関 する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明される。 例１３〜１８ 皿洗い組成物 製品ｐＨは７に調整する。 例１３〜１６において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例１７および１８において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 例１９ 顆粒自動皿洗い組成物 例１９Ａ〜Ｃにおいて、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも例１９Ａ 〜Ｃにおいて、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテアー ゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 ３．布帛クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は１種以上のプロ テアーゼ酵素を含んでいる。ここで用いられる“布帛クリーニング組成物”とは 、限定されないが顆粒、液体および固形を含めて、布帛をクリーニングするため のすべての形態の洗剤組成物に関する。 ａ．顆粒布帛クリーニング組成物 本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵 素、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０ ０５〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％の活性プロテアーゼ酵素を含 有する。１種以上のプロテアーゼ酵素に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は 典型的には少くとも１種の界面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には 漂白剤を含む。 本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。 例２０〜２３ 顆粒布帛クリーニング組成物 例２０〜２１において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例２２および２３において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 例２４〜２７ 顆粒布帛クリーニング組成物 例２４および２５において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１およ び１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアー ゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例２６および２７において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 例２８および２９ 顆粒布帛クリーニング組成物 例３０および３１ 顆粒布帛クリーニング組成物 例３２ コンパクト顆粒布帛クリーニング組成物 成分 重量％ アルキルサルフェート 8.0 アルキルエトキシサルフェート 2.0 ３および７回エトキシル化Ｃ₂₅およびＣ₄₅アルコールの混合物 6.0 ポリヒドロキシ脂肪酸アミド 2.5 ゼオライト 17.0 積層シリケート／シトレート 16.0 カーボネート 7.0 マレイン酸アクリル酸コポリマー 5.0 汚れ放出ポリマー 0.4 カルボキシメチルセルロース 0.4 ポリ（４‐ビニルピリジン）‐Ｎ‐オキシド 0.1 ビニルイミダゾールおよびビニルピロリドンのコポリマー 0.1 ＰＥＧ２０００ 0.2 プロテアーゼ＃１２（４％小球） 0.5 リパーゼ 0.2 セルラーゼ 0.2 テトラアセチルエチレンジアミン 6.0 ペルカーボネート 22.0 エチレンジアミンジコハク酸 0.3 起泡抑制剤 3.5 ４，４′‐ビス（２‐モルホリノ‐４‐アニリノ‐ｓ‐トリアジン 0.25 ‐６‐イルアミノ）スチルベン‐２，２′‐ジスルホン酸二ナトリウム ４，４′‐ビス（２‐スルホスチリル）ビフェニルニナトリウム 0.05 水、香料、その他 100%まで 例３３ 顆粒布帛クリーニング組成物 成分 重量％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネート 7.6 Ｃ₁₆‐Ｃ₁₈アルキルサルフェート 1.3 Ｃ_14-15アルコール７回エトキシル化物 4.0 ココアルキルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド 1.4 分散剤 0.07 シリコーン液 0.8 クエン酸三ナトリウム 5.0 ゼオライト４Ａ 15.0 マレイン酸アクリル酸コポリマー 4.0 ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸 0.4 ペルボレート 15.0 テトラアセチルエチレンジアミン 5.0 スメクタイト土 10.0 ポリ（オキシエチレン）（ＭＷ３００，０００） 0.3 プロテアーゼ＃１２（４％小球） 0.4 リパーゼ 0.2 アミラーゼ 0.3 セルラーゼ 0.2 ケイ酸ナトリウム 3.0 炭酸ナトリウム 10.0 カルボキシメチルセルロース 0.2 増白剤 0.2 水、香料、その他 100%まで 例３４ 顆粒布帛クリーニング組成物 成分 重量％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネート 6.92 タロウアルキルサルフェート 2.05 Ｃ_14-15アルコール７回エトキシル化物 4.4 Ｃ_12-15アルキルエトキシサルフェート‐３回エトキシル化 0.16 ゼオライト 20.2 シトレート 5.5 カーボネート 15.4 シリケート 3.0 マレイン酸アクリル酸コポリマー 4.0 カルボキシメチルセルロース 0.31 汚れ放出ポリマー 0.30 プロテアーゼ＃１２（４％小球） 0.2 リパーゼ 0.36 セルラーゼ 0.13 ペルボレート四水和物 11.64 ペルボレート一水和物 8.7 テトラアセチルエチレンジアミン 5.0 ジエチレントリアミンペンタメチルホスホン酸 0.38 硫酸マグネシウム 0.40 増白剤 0.19 香料、シリコーン、起泡抑制剤 0.85 その他 100%まで 例２８〜３４の各々において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１お よび１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテア ーゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、 例２８〜３４において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプ ロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き 代わる。 ｂ．液体布帛クリーニング組成物 本発明の液体布帛クリーニング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵 素、好ましくは組成物の約０．０００１〜約１０重量％、更に好ましくは約０． ００１〜約１％、最も好ましくは約０．００１〜約０．１％の活性プロテアーゼ 酵素を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は、典型的にはアニオ ン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含んでいる。 本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。 例３５〜３９ 液体布帛クリーニング組成物 例３５〜３７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例３８および３９において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 ｃ．固形布帛クリーニング組成物 手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、有効量の １種以上のプロテアーゼ酵素を、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重量 ％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。 本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。 例４２〜４５ 固形布帛クリーニング組成物 例４２および４３において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１およ び１３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアー ゼを含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。 例４４および４５において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有 用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃ １２およびプロテアーゼ＃４に置き代わる。 Ｂ．追加クリーニング組成物 前記の硬質表面クリーニング、皿洗いおよび布帛クリーニング組成物に加えて 、１種以上のプロテアーゼ酵素も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のク リーニング組成物中に配合してよい。このような追加クリーニング組成物にはオ ーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物およびコンタクトレンズク リーニング組成物があるが、それらに限定されない。 １．口内洗浄組成物 本発明のもう１つの態様において、薬学上許容される量の１種以上のプロテア ーゼ酵素が歯または義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物中に含 有される。ここで用いられる“口内洗浄組成物”とは、歯磨剤、練歯磨剤、歯磨 ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、ロゼン ジ、小袋、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関する。好まし くは、本発明の口内洗浄組成物は組成物の約０．０００１〜約２０重量％、更に 好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好ましくは約０．０１〜約５％の １種以上のプロテアーゼ酵素と、薬学上許容されるキャリヤを含む。ここで用い られる“薬学上許容される”とは、その用語が表す薬物、薬剤または不活性成分 が妥当な利益／危険比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、ア レルギー反応などなくヒトおよびそれより下等の動物の組織と接触する使用に適 していることを意味する。 典型的には、口内洗浄組成物の口内洗浄成分の薬学上許容される口内洗浄キャ リヤ成分は、通常組成物の約５０〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５〜約 ９９．９９％、更に好ましくは約６５〜約９９％である。 本発明の口内洗浄組成物に含有させてもよい薬学上許容されるキャリヤ成分と 任意成分は当業者に周知である。口内洗浄組成物で有用な様々な組成タイプ、キ ャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で発行されたSeibelの米国特 許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で発行されたSampathkumarの 米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２日付で発行されたBenedict ,Bush およびSunberg の米国特許第５，０２８，４１５号明細書に開示されてお り、それらすべてが引用することにより本明細書の開示の一部とされる。 本発明の口内洗浄組成物態様は下記例で説明される。 例４６〜４９ 歯磨剤組成物 例４６〜４９において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例４６ 〜４９において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 例５０〜５３ 洗口液組成物 例５０〜５３において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５０ 〜５３において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 例５４〜５７ ロゼンジ組成物 例５４〜５７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５４ 〜５７において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 例５８〜６１ チューインガム組成物 例５８〜６１において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例５８ 〜６１において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 ２．義歯クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義 歯クリーニング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含有する。このような義 歯クリーニング組成物は、有効量の、好ましくは組成物の約０．０００１〜約５ ０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に一層好ましくは約０． ０１〜約２０％の１種以上のプロテアーゼ酵素と、義歯クリーニングキャリアを 含んでいる。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物フォーマットが 当業界で周知であり（例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされ るYoung の米国特許第５，０５５，３０５号明細書参照）、義歯からタンパク質 汚れを除去する上で１種以上のプロテアーゼ酵素の配合用に通常適している。 本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明される。 例６２〜６５ ２層発泡義歯クリーニング錠剤 例６２〜６６において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例６２ 〜６５において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 ３．身体洗浄組成物 本発明のもう１つの態様において、（液体および固形で）皮膚をクリーニング するためのパーソナルクレンジング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含有 している。このような組成物は、典型的には組成物の約０．００１〜約５重量％ 、好ましくは約０．００５〜約２％、最も好ましくは約０．０１〜約０．８％の プロテアーゼ酵素を含有する。ここで記載されたようなプロテアーゼ酵素を含有 できる好ましいパーソナルクレンジング組成物は、１９９３年９月１４日付で出 願された双方ともVisscherらによる米国特許出願第０８／１２１，６２３号およ び第０８／１２１，６２４号明細書で示され、それらの開示は引用することによ り本明細書の開示の一部とされる。このような組成物は下記例で説明される。 例６６ 液体身体洗浄組成物含有石鹸 成分 重量％ 石鹸（ＫまたはＮａ） 15.00 ３０％ラウレート ３０％ミリステート ２５％パルミテート １５％ステアレート 脂肪酸（上記比率） 4.50 Ｎａラウリルサルコシネート 6.00 ナトリウムラウレス‐３サルフェート 0.66 ココアミドプロピルベタイン 1.33 グリセリン 15.00 プロピレングリコール 9.00 ポリクォータニウム１０ 0.80 エチレングリコールジステアレート（ＥＤＴＡ） 1.50 プロピルパラベン 0.10 メチルパラベン 0.20 プロテアーゼ＃１２ 0.10 ＫＯＨまたはＮａＯＨ ｐＨ調整上必要量 硫酸カルシウム 3 酢酸 3 水 残部１００％まで 例６７ 固形身体洗浄組成物 成分 重量％ ナトリウムココイルイセチオネート 47.20 ナトリウムセテアリルサルフェート 9.14 パラフィン 9.05 ナトリウム石鹸（その場） 3.67 ナトリウムイセチオネート 5.51 塩化ナトリウム 0.45 二酸化チタン 0.4 ＥＤＴＡ三ナトリウム 0.1 エチドロン酸三ナトリウム 0.1 香料 1.20 Ｎａ₂ＳＯ₄ 0.87 プロテアーゼ＃１２ 0.10 水／その他 残部１００％まで 例６６〜６７において、表III で列挙されたプロテアーゼ＃１〜１１および１ ３〜２５は、特に表ＶおよびVIで記載された本発明で有用な追加プロテアーゼを 含めて、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代わる。しかも、例６６ 〜６７において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発明で有用なプロテア ーゼ酵素のいずれの組合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃１２に置き代 わる。 例６８ 洗浄性能試験 本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、ＥＭＰＡ１１６（コットン上に血液 ／ミルク／カーボンブラック）衣切れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030 ）から汚れの除去を調べることにより評価する。 ギザギザ端のある３×４-1/2インチに切断された６枚のＥＭＰＡ１１６布切れ を、水１０００ｍｌ、硬度１５ｇｐｇ（Ｃａ⁺⁺：Ｍｇ⁺⁺３：１ｗ：ｗ）、洗剤７ ｇおよび適宜に酵素を含有したモデル７２４３Ｓ Terg-O-Tometer（United Sta tes Testing Co.,Inc.,Hoboken,NJ）の各ポットに入れる。洗剤ベースはwfk-Tes tgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germanyの ＷＦＫ１洗剤である： 成分 最終処方の％ ゼオライトＡ ２５％ 硫酸ナトリウム ２５％ ソーダ灰 １０％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネート ８．８％ アルコールエトキシレート（７‐８ＥＯ） ４．５％ ナトリウム石鹸 ３％ ケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ₂：Ｎａ₂Ｏ ３：３：１） ３％ このベース洗剤に下記添加を行う： 成分 最終処方の％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物 １３％ コポリマー（Sokalan CP5） ４％ ＴＡＥＤ（Mykon ATC Green） ３％ 酵素 ０．５％ 増白剤（Tinopal AMS-GX） ０．２％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,Ridgefield-Park,NJ 076 60から得る。Sokalan CP5 はBASF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。 Mykon ATC Green（ＴＡＥＤ，テトラアセチルエチレンジアミン）はWarwick Int ernational,Limited,Mostyn,Holywell,Clwyd CH8 9HE,England から得る。Tinop al AMS GXはCiba-Geigy Corporation,Greensboro,NC 27419から得る。 ６枚のＥＭＰＡ１１６布切れを６０℃で３０分間酵素入り洗剤で洗浄し、その 後各回毎に水１０００ｍｌで５分間にわたり２回すすぎ洗いする。酵素を標準曲 線では０．０５〜１ｐｐｍ、ルーチン分析では０．２５ｐｐｍの最終濃度で加え る。布切れを乾燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Meter,Model CR-200(Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07446)のＬ^*ａ^*ｂ^*スケールでＬ値を用 いて測定する。性能はB.Lentus（ＧＧ３６）プロテアーゼの性能の％として報告 し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変種プロテアーゼの量でB.Lent us（ＧＧ３６）プロテアーゼの量を割り１００を掛けることにより計算する。デ ータは表VII で示されている。 例６９ 液体洗剤処方のプロテアーゼ安定性 液体洗剤処方で不活化に関するプロテアーゼ安定性の比較を、ここで記載され た操作に従いBacillus Lentus ズブチリシンおよびその変種酵素N76D/S103A/V10 4Iについて行う。研究用の洗剤処方はThe Procter & Gamble CompanyによりＵＳ Ａで作られたTide Ultra液体洗濯洗剤の市販ボトルである。洗剤処方の熱処理は その場のプロテアーゼを不活化する上で必要である。これは４．５時間にわたり ９６℃で洗剤をインキュベートすることにより行う。次いで酵素２０ｇ／ｌ範囲 内のB.LentusズブチリシンおよびN76D/S103A/V104I変種の濃縮製品を洗剤処方中 酵素０．３ｇ／ｌの最終濃度まで室温で熱処理Tide Ultraに加える。プロテアー ゼ添加熱処理洗剤を５０℃に恒温された水浴中でインキュベートする。一部を０ 、２４、４６、７６および１１２時間間隔でインキュベート管から取出し、２５ ℃に恒温した０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６に溶解された１．２ｍＭ の合成ペプチド基質sｕｃ‐Ａｌａ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ｐｈｅ‐ｐ‐ニトロアニ リドを含有した１ｃｍキュベットへの添加で酵素活性について調べる。初期の直 線的反応速度は、時間の関数として４１０ｎｍで反応生成物ｐ‐ニトロアニリン の吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。図１０で示されるよう に、N76D/S103A/V104I変種は天然B.Lentus酵素よりも不活化に関して有意に大き な安定性を有することが観察される。特定の試験条件下で２酵素についてTide U ltra洗剤処方中の不活化に関して評価された半減期は、B.Lentusズブチリシンで ４５時間およびN76D/S103A/V104I変種で１２５時間である。 本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び修正が本発 明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。本 発明の範囲内に属するすべてのこのような修正を添付された請求の範囲ではカバ ーしていると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:125） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グレイカー，トーマス ポール アメリカ合衆国カリフォルニア州、パシフ ィコ、マンザニータ、1166 (72)発明者 ボット，リチャード レイ アメリカ合衆国カリフォルニア州、バーリ ンゲーム、ヒルサイド、ドライブ、3032 (72)発明者 ウイルソン，ロリー ジーン アメリカ合衆国カリフォルニア州、ミルブ レー、エル、ボニート、ウェイ、33 (72)発明者 ブロード，フィリップ フレデリック ザ、サード アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 スクイレルスネスト、レイン、5780 (72)発明者 バーネット，ボビー リー アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 エルクウッド、ドライブ、12175 (72)発明者 ラビン，ドン ネルトン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 シード、ロード、8224

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ） プロテアーゼ酵素であって、Bacillus amyloliquefaciensズブ チリシンにおいて＋９９、＋１０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３ 、＋２７、＋１０５、＋１０９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋ １６６、＋１９５、＋１９７、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２ １７、＋２１８、＋２２２、＋２６０、＋２６５および／または＋２７４からな る群より選択された場合に相当する一以上のアミノ酸残基位置と、Bacillus amy loliqueiaciensズブチリシンにおいて＋７６位に相当する前駆カルボニルヒドロ ラーゼの位置とにおいて、複数のアミノ酸残基について異なるアミノ酸の置換を うけた、天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種で あって、前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、プロテアーゼ酵素の有効 量と、 （ｂ）プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質と を含んでなるクリーニング組成物。 ２． クリーニング組成物物質が界面活性剤、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出 剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵 素安定剤、ビルダー、漂白剤、色素、香料およびそれらの混合物からなる群より 選択されるものである、請求項１に記載のクリーニング組成物。 ３． クリーニング組成物物質が組成物の少くとも約１重量％の界面活性剤を 含み、上記界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェ ート、二級アルキルサルフェート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキル アルコキシカルボキシレート、アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サル フェート化ポリグリコシド、α‐スルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよ びアルキルフェノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベタイン、アミ ンオキシド、Ｎ‐メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエトキシレート 、ノニオン系一級アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物からな る群より選択される物質を含んでなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。 ４． ゼオライト、ポリカルボキシレート、積層シリケート、ホスフェートお よびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも約５％のビルダーを更に 含んでなる、請求項３に記載のクリーニング組成物。 ５． クリーニング組成物物質が少くとも１種の漂白剤を含んでなる、請求項 １に記載のクリーニング組成物。 ６． 漂白剤がペルカーボネート、ペルボレートおよびそれらの混合物からな る群より選択され、場合により少くとも１種のブリーチ活性剤を更に含んでなる 、請求項５に記載のクリーニング組成物。 ７． クリーニング組成物物質がセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテ アーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少く とも１種の酵素を含んでなる、請求項１に記載のクリーニング組成物。 ８． クリーニング組成物物質が少くとも１種の布帛柔軟剤を含んでなる、請 求項１に記載のクリーニング組成物。 ９． プロテアーゼ酵素用の前駆カルボニルヒドロラーゼがズブチリシンであ り、プロテアーゼ酵素がズブチリシン変種であって、置換の組合せが76/99、76/ 101、76/103、76/104、76/107、76/123、76/99/101、76/99/103、76/99/104、76 /101/103、76/101/104、76/103/104、76/104/107、76/104/123、76/107/123、76 /99/101/103、76/99/101/104、76/99/103/104、76/101/103/104、76/103/104/12 3、76/104/107/123、76/99/101/103/104、76/99/103/104/123、76/99/101/103/1 04/123、76/103/104/126、76/103/104/135、76/103/104/197、76/103/104/222、 76/103/104/260、76/103/104/265、76/103/104/126/265、27/76/104/123/274、2 7/76/104/109/123/274、27/76/104/123/218/274、27/76/104/123、 27/76/104/107/123、27/76/104/109/123、27/76/104/109/123/218/274、27/76/1 04/123/197、27/76/104/123/204、27/76/104/123/206、27/76/104/123/216、27/ 76/104/123/218、27/76/104/123/260、27/76/104/123/195/197、27/76/104/123/ 195/218、27/76/104/123/197/218、27/76/104/123/204/218、27/76/104/123/206 /218、27/76/104/123/218/260、27/76/104/123/195/197/218、76/103/104/217、 76/103/104/156、76/103/104/166、76/103/104/105、76/101/103/104、76/103/1 04/128、76/103/104/210、76/103/104/107、76/103/104/204、76/217、76/103/1 04/156/166および76/103/104/128に相当する位置で行われてなる、請求項１に記 載のクリーニング組成物。 １０． プロテアーゼ酵素が76/99、76/101、76/103、76/104、76/107、76/12 3、76/99/101、76/99/103、76/99/104、76/101/103、76/101/104、76/103/104、 76/104/107、76/104/123、76/107/123、76/99/101/103、76/99/101/104、76/99/ 103/104、76/101/103/104、76/103/104/123、76/104/107/123、76/99/101/103/1 04、76/99/103/104/123、76/99/101/103/104/123、76/103/104/128、76/103/104 /260、76/103/104/265、76/103/104/197、76/103/104/105、76/103/104/135、76 /103/104/126、76/103/104/107、76/103/104/210、76/103/104/126/265および／ または76/103/104/222 からなる群より選択されるズブチリシン変種である、請 求項９に記載のクリーニング組成物。 １１． 天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種 であって、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、有効量の プロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素はN76D/S99D、N76D/S101R、N 76D/S103A、N76D/V104I、N76D/I107V、N76D/N123S、N76D/S99D/S101R、N76D/S99 D/S103A、N76D/S99D/V104I、N76D/S101R/S103A、N76D/S101R/V104I、N76D/S103A /V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/V104I/N123S、N76D/I107V /N123S、N76D/S99D/S101R/S103A、N76D/S99D/S101R/V104I、N76D/S99D/S1 03A/V104I、N76D/S101R/S103A/V104I、N76D/S103A/V104I/N123S、N76D/V104I/I1 07V/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I/N123S、N76 D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S、N76D/S103A/V104I/S128G、N76D/S103A/V104I /T260P、N76D/S103A/V104I/S265N、N76D/S103A/V104I/D197E、N76D/S103A/V1041 /S105A、N76D/S103A/V104I/L135I、N76D/S103A/V104I/L126F、N76D/S103A/V104T /L107T、N76D/S103A/V104I/L126F/S265N、N76D/S103A/V104I/M222Aおよびそれら の混合物から選択されるズブチリシン変種である）と （ｂ）組成物の少くとも約５重量％の界面活性剤および少くとも約５％のビル ダーを含んだ、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質 を含んでなる布帛クリーニング組成物。 １２． 溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、 起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、香料および それらの混合物からなる群より選択されるクリーニング組成物物質を更に含んで なる、請求項１１に記載の布帛クリーニング組成物。 １３． 少くとも１種の漂白剤を更に含んでなる、請求項１１に記載の布帛ク リーニング組成物。 １４． セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダー ゼおよびそれらの混合物からなる群より選択される少くとも１種の酵素を更に含 んでなる、請求項１１に記載の布帛クリーニング組成物。 １５． 液体、顆粒または固体の形をとる、請求項１１に記載の布帛クリーニ ング組成物。 １６． プロテアーゼ酵素がN76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D /S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/S101R/S103A/V1041 、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S101R/V104Iおよびそれらの混合物から 選択されるズブチリシン変種である、請求項１１に記載の布帛クリーニング組 成物。 １７． プロテアーゼ酵素がN76D/V104I、N76D/S103A/V104Iおよびそれらの混 合物から選択されるBacillusズブチリシン変種である、請求項１１に記載の布帛 クリーニング組成物。 １８． （ａ）Bacillus lentus ズブチリシンから誘導されるN76D/S103A/V10 4Iズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素約０．０００１〜約１０％ （ｂ）少くとも約５％の界面活性剤 （ｃ）少くとも約５％のビルダー、および （ｄ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散剤 、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、 香料およびそれらの混合物からなる群より選択される、プロテアーゼ酵素と適合 する１種以上のクリーニング組成物物質 を含んでなる布帛クリーニング組成物。 １９． 界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェ ート、二級アルキルサルフェート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキル アルコキシカルボキシレート、アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サル フェート化ポリグリコシド、α‐スルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよ びアルキルフェノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベタイン、アミ ンオキシド、Ｎ‐メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエトキシレート 、ノニオン系一級アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物からな る群より選択され、更にビルダーがゼオライト、ポリカルボキシレート、積層シ リケート、ホスフェートおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求 項１８に記載の布帛クリーニング組成物。 ２０． 漂白剤、布帛柔軟剤および酵素からなる群より選択される１種以上の クリーニング組成物物質を更に含んでなる、請求項１９に記載の布帛クリーニン グ組成物。 ２１． 少くとも約３０％の界面活性剤を含んだ濃縮顆粒布帛クリーニング組 成物の形をとる、請求項１８に記載の布帛クリーニング組成物。 ２２． （ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラー ゼ変種であって、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、約 ０．０００１〜約１０％のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素は N76D/S99D、N76D/S101R、N76D/S103A、N76D/V104I、N76D/I107V、N76D/N123S、N 76D/S99D/S101R、N76D/S99D/S103A、N76D/S99D/V104I、76D/S101R/S103A、N76D/ S101R/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/ V104I/N123S、N76D/I107V/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A、N76D/S99D/S101R/V1 04I、N76D/S99D/S103A/V104I、N76D/S101R/S103A/V104I、N76D/S103A/V104I/N12 3S、N76D/V104I/I107V/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I、N76D/S99D/S103A /V104I/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S、N76D/S103A/V104I/S128G 、N76D/S103A/V104I/T260P、N76D/S103A/V104I/S265N、N76D/S103A/V104I/D197E 、N76D/S103A/V104I/S105A、N76D/S103A/V104I/L135I、N76D/S103A/V104I/L126F 、N76D/S103A/V104T/L107T、N76D/S103A/V104I/L126F/S265N、N76D/S103A/V104I /M222Aおよびそれらの混合物から選択されるズブチリシン変種である） （ｂ）約０．１〜約１０％の界面活性剤、および （ｃ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、分散剤、起泡抑制剤、酵素安定剤、 漂白剤、色素、香料およびそれらの混合物からなる群より選択される、プロテア ーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニング組成物物質 を含んでなる皿洗い組成物。 ２３． プロテアーゼ酵素がBacillus lentus ズブチリシンから誘導されるN7 6D/S103A/V104Iズブチリシン変種である、請求項２２に記載の皿洗い組成物。 ２４． （ａ）Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋９９、＋ １０１、＋１０３、＋１０４、＋１０７、＋１２３、＋２７、＋１０５、＋１０ ９、＋１２６、＋１２８、＋１３５、＋１５６、＋１６６、＋１９５、＋１９７ 、＋２０４、＋２０６、＋２１０、＋２１６、＋２１７、＋２１８、＋２２２、 ＋２６０、＋２６５および／または＋２７４からなる群より選択される場合に相 当する１以上のアミノ酸残基位置と、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン において＋７６位に相当する前駆カルボニルヒドロラーゼの位置とにおいて、複 数のアミノ酸残基について異なるアミノ酸の置換をうけた、天然でみられないア ミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変種であって、前駆カルボニルヒド ロラーゼから誘導された、約０．００１〜約５重量％のプロテアーゼ酵素、 （ｂ）約０．０１〜約９５重量％の界面活性剤系、および （ｃ）場合により、約０．０５〜約５０％の酵素安定剤 を含んでなる身体洗浄組成物。 ２５． プロテアーゼ酵素が約０．００１〜約２重量％のレベルである、請求 項２４に記載の組成物。 ２６． プロテアーゼ酵素が約０．０１〜約０．８重量％のレベルである、請 求項２５に記載の組成物。 ２７． 界面活性剤系がアニオン系カルボキシレート、アミンオキシド、アル キルグルコシド、グルコースアミド、アルキルサルフェート、アルキルエーテル サルフェート、アシルイセチオネート、アルキルスルホサクシネート、アルキル ホスフェートエステル、エトキシル化ホスフェートエステル、アルキルグリセリ ルエーテルスルホネートまたはそれらの混合物からなる群より選択される界面活 性剤を含んでなる、請求項２４に記載の組成物。 ２８． 界面活性剤系が石鹸、アシルグルタメート、アルキルサルコシネート 、 ラウラミドオキシド、コカミドオキシド、コカミドプロピルアミンオキシド、デ シルグルコシド、ラウリルサルフェート、ラウレスサルフェート、Ｃ₁₂‐Ｃ₁₈ア シルイセチオネートまたはそれらの混合物からなる群より選択される界面活性剤 を含んでなる、請求項２４に記載の組成物。 ２９． 界面活性剤が組成物の少くとも約２重量％のレベルにある石鹸である 、請求項２８に記載の組成物。 ３０． 石鹸が組成物の少くとも約１０重量％のレベルである、請求項２９に 記載の組成物。 ３１． 石鹸が組成物の少くとも約２５重量％のレベルである、請求項３０に 記載の組成物。 ３２． 石鹸対プロテアーゼ酵素の比率が約２０００：１〜約８：１である、 請求項２８に記載の組成物。 ３３． 石鹸対プロテアーゼ酵素の比率が約４００：１〜約４０：１である、 請求項３２に記載の組成物。 ３４． プロテアーゼ酵素が天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニ ルヒドロラーゼ変種であり、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導 され、プロテアーゼ酵素がN76D/S99D、N76D/S101R、N76D/S103A、N76D/V104I、N 76D/I107V、N76D/N123S、N76D/S99D/S101R、N76D/S99D/S103A、N76D/S99D/V104I 、N76D/S101R/S103A、N76D/S101R/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V 、N76D/V104Y/I107V、N76D/V104I/N123S、N76D/I107V/N123S、N76D/S99D/S101R/ S103A、N76D/S99D/S101R/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I、N76D/S101R/S103A/V1 04I、N76D/S103A/V104I/N123S、N76D/V104I/I107V/N123S、N76D/S99D/S101R/S10 3A/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 、N76D/S103A/V104I/S128G、N76D/S103A/V104I/T260P、N76D/S103A/V104I/S265N 、N76D/S103A/V104I/D197E、N76D/S103A/V104I/S105A、N76D/S103A/V 104I/L135I、N76D/S103A/V104I/L126F、N76D/S103A/V104T/L107T、N76D/S103A/V 104I/L126F/S265N、N76D/S103A/V104I/M222Aおよびそれらの混合物から選択され るズブチリシン変種である、請求項２８に記載の組成物。 ３５． クリーニングの必要な布帛を、Bacillus lentus ズブチリシンから誘 導されたN76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素と接触させ ることからなる、布帛のクリーニング方法。 ３６． クリーニングの必要な皿を、Bacillus lentus ズブチリシンから誘導 されたN76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素と接触させる ことからなる、皿のクリーニング方法。 ３７． クリーニングの必要なヒトまたはそれより下等の動物身体の一部を、 天然でみられないアミノ酸配列を有し、ズブチリシン前駆カルボニルヒドロラー ゼから誘導され、プロテアーゼ酵素がN76D/S99D、N76D/S101R、N76D/S103A、N76 D/V104I、N76D/I107V、N76D/N123S、N76D/S99D/S101R、N76D/S99D/S103A、N76D/ S99D/V104I、N76D/S101R/S103A、N76D/S101R/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V 104I/I107V、N76D/V104Y/I107V、N76D/V104I/N123S、N76D/I107V/N123S、N76D/S 99D/S101R/S103A、N76D/S99D/S101R/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I、N76D/S101 R/S103A/V104I、N76D/S103A/V104I/N123S、N76D/V104I/I107V/N123S、N76D/S99D /S101R/S103A/V104I、N76D/S99D/S103A/V104I/N123S、N76D/S99D/S101R/S103A/V 104I/N123S、N76D/S103A/V104I/S128G、N76D/S103A/V104I/T260P、N76D/S103A/V 104I/S265N、N76D/S103A/V104I/D197E、N76D/S103A/V104I/S105A、N76D/S103A/V 104I/L135I、N76D/S103A/V104I/L126F、N76D/S103A/V104T/L107T、N76D/S103A/V 104I/L126F/S265N、N76D/S103A/V104I/M222Aおよびそれらの混合物から選択され るズブチリシン変種であるカルボニルヒドロラーゼ変種と接触させることからな る、身体洗浄方法。