JP2888986B2 - プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 この出願は1993年10月14日付で出願された米国出願第
08/136,626号および1994年５月２日付で出願された米国
出願第08/237,938号の一部継続出願であり、双方ともそ
れら全体で引用することにより本明細書の開示の一部と
される。

発明の分野 本発明は漂白組成物、特に洗濯洗剤と、カルボニルヒ
ドロラーゼ変種である１種以上のプロテアーゼ酵素およ
び１種以上の漂白剤、特にブリーチ活性剤含有の漂白系
を用いる方法に関する。

発明の背景 様々なタイプの酵素が布帛からのある種のしみの除去
に役立つ洗濯洗剤として常用されてきた。これらのしみ
は、典型的には脂質およびタンパク質汚れと関係があ
る。しかしながら、酵素は他のタイプの汚れおよびしみ
に対してはさほど有効でないことが知られている。

ペルオキシゲンブリーチは布帛からのしみおよび／ま
たは汚れ除去に有効であるが、このようなブリーチは温
度依存性であることも長く知られてきた。60℃の洗濯液
温度のとき、ペルオキシゲンブリーチは部分的に有効な
だけである。洗濯液温度が60℃より下がると、ペルオキ
シゲンブリーチは比較的無効になる。結果として、有効
な漂白系を開発する工業的研究が続けられている。

本発明によると、カルボニルヒドロラーゼ変種である
新規プロテアーゼ酵素と漂白剤、特にブリーチ活性剤と
の組合せは、有効なしみ除去および／または黒ずみ除去
効果を示すごとが見出された。したがって、改善された
しみ除去および／または黒ずみ除去効果および／または
布帛クリーニング効果および／または漂白性質を有する
漂白組成物、特に洗濯洗剤組成物を提供することが本発
明の目的である。

本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な記載
から明らかであろう。

背景技術 1987年１月６日付で発行されたBurnsら米国特許第4,6
34,551号明細書では、本発明において用いられるアミド
ペルオキシ酸漂白化合物とそれらの前駆体について開示
している。1989年８月１日付で発行されたBurnsら米国
特許第4,852,989号明細書も参照できる。1991年12月３
日付で発行されたLagerwaardらの米国特許第5,069,809
号明細書では、NOBSブリーチ活性剤とリパーゼ酵素LIPO
LASEとの組合せについて開示している。リパーゼ酵素と
ある種の漂白系との適合性問題の説明に関しては、1989
年11月15日付で公開されたLagerwaardらの欧州特許第34
1,947号明細書参照。1985年10月８日付で発行されたSan
dersonの米国特許第4,545,784号明細書では、過ホウ酸
ナトリウム一水和物への活性剤の吸収について開示して
いる。

発明の要旨 本発明は （ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有するカルボニ
ルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸による前駆
カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基の置換によ
り誘導された、有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、こ
の前駆酵素において置換された上記複数のアミノ酸残基
は＋76位と、以下の残基：＋99、＋101、＋103、＋10
4、＋107、＋123、＋27、＋105、＋109、＋126、＋12
8、＋135、＋156、＋166、＋195、＋197、＋204、＋20
6、＋210、＋216、＋217、＋218、＋222、＋260、＋265
および／または＋274のうち１以上とに相当し、その番
号位置はBacillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシ
ンあるいは他のカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリ
シン（例えば、Bacillus lentusズブチリシン）の相当
アミノ酸残基に対応する）、 （ｂ）有機ペルオキシ酸であるか、または組成物から形
成される漂白溶液中その場で活性剤と反応して有機ペル
オキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じることができる
ペルオキシゲン化合物とブリーチ活性剤との組合せであ
る漂白剤、 および （ｃ）プロテアーゼ酵素および漂白剤と適合する１種以
上のクリーニング組成物物質 を含んでなる漂白組成物を提供する。

本発明には、好ましくは撹拌しながら布帛を上記漂白
組成物含有水性液と接触させることからなる、布帛のク
リーニング方法も包含する。その方法は約60℃以下の温
度で行えるが、もちろん沸騰までの洗濯温度であるとか
なり有効である。水性洗濯液は、好ましくは少くとも約
300ppmの慣用的洗剤成分と、少くとも約25ppmのブリー
チ活性剤および少くとも約25ppmの漂白化合物を含む。
好ましくは、上記水性液は約900〜約20,000ppmの慣用的
洗剤成分と、約100〜約25,000ppmの漂白化合物および約
100〜約2500ppmの上記ブリーチ活性剤を含む。

上記方法で用いられる慣用的洗剤成分には、約１〜約
99.8％、好ましくは約５〜約80％の洗浄界面活性剤を含
む。場合により、洗浄組成物は約５〜約80％の洗剤ビル
ダーも含むことができる。他の任意洗浄成分も本発明に
より提供される完全処方洗剤／ブリーチ組成物に含有さ
れる。

すべてのパーセンテージ、比率および割合は、他で指
摘されないかぎり重量による。引用されたすべての文献
は本明細書の開示の一部とされる。

図面の簡単な説明 図1A−ＣはBacillus amyloliquefaciensズブチリシン
のDNAおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地
図について示す（Seq.ID No.6）。

図２はBacillus amyloliquefaciens（BPN）′およびB
acillus lentus（野生型）のズブチリシンの中に保存さ
れたアミノ酸残基について示す。

図3Aおよび3Bは４種ズブチリシンのアミノ酸配列につ
いて示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブ
チリシン（ズブチリシンBPN′とも時々称される）のア
ミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7）。第二列はBac
illus subtillisのズブチリシンのアミノ酸配列につい
て示す（Seq.ID No.8）。第三列はB.licheniformisのズ
ブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.
9）。第四列はBacillus lentusのズブチリシン（PCT WO
89/06276ではズブチリシン309とも称されている）のア
ミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号^＊はズ
ブチリシンBPN′と比較した特定アミノ酸残基の不在に
ついて示す。

図４はプラスミドGGA274の作成について示す。

図５はこの出願で用いられるある発現プラスミドへの
中間体であるGGT274の作成について示す。

図6Aおよび6BはBacillus lentusのズブチリシンのDNA
およびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成
熟ズブチリシンタンパク質はAlaに対応するコドンGCG
（334−336）で始まるコドンによりコードされている。

図7Aおよび7Bは本発明の好ましい態様のDNAおよびア
ミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID
No.12）。この図面におけるDNAは76位でアスパラギン
酸、103位でアラニンおよび104位でイソロイシンについ
てコードするように記載された方法で修飾されている。
熟成ズブチリシン変種タンパク質はAlaに対応するコド
ンGCG（334−336）で始まるコドンによりコードされて
いる。

図８はベクターpBCDAICATの作成について示す。

図９はベクターpUCCATFNAの作成について示す。

発明の具体的説明 本発明において用いられる漂白組成物は、布帛の有効
で効率的なクリーニングを行い、それにより布帛からし
みおよび／または汚れを除去する。プロテアーゼ酵素と
組合せた漂白系は、タンパク質および脂質汚れ、黒ずん
だ汚れとしつこい汚れ、特に求核性および身体の汚れを
含めて、布帛から様々なタイプの汚れを除去する上で特
に効率的である。

ここで有用なプロテアーゼ酵素、漂白剤（ペルオキシ
酸および漂白系を含む）およびクリーニング組成物物質
は、以下で詳細に記載されている。

（１）漂白剤 本漂白組成物は漂白剤を含有し、これは好ましくは組
成物の約0.5〜約20wt％である。漂白剤は実質上不溶性
で好ましくは固体の有機ペルオキシ酸、または過酸化水
素を生じることができるペルオキシゲン漂白化合物とブ
リーチ活性剤からなる漂白系、あるいは双方の組合せで
ある。組成物中にあるか、または活性剤およびペルオキ
シゲン化合物の組合せにより形成される過酸は、約３〜
約6.5の範囲内の親水性−親油性バランス（“H.L.B."）
値を有する対応カルボン酸を有することが好ましい。し
たがって、本発明で有用な好ましいペルオキシ酸（活性
剤からまたは前形成ペルオキシ酸として）を特徴付ける
ために使用できる方法は、引用することにより本明細書
の開示の一部とされるDavies,J.T.,Proc.2nd Internat.
Congr.Surface Activity,1,426,Butterworths,London
（1957）に記載されたような“H.L.B.スケール”であ
る。このようなH.L.B.スケール（親水性−親油性バラン
ス）は、親水（水様）と親油（油様）相への界面活性剤
の分配を表す手段として界面活性剤の研究で用いられて
きた。このやり方だと、H.L.B.値は洗液中における活性
漂白種の親油（疎水）特性の指標（即ち、洗液から離れ
て汚れ／界面に集まるペルオキシ酸の能力）として用い
ることができる。

選択されたペルオキシ酸について（対応カルボン酸と
して）計算されたH.L.B.値は下記表Ａで示されている。
H.L.B.値を計算するために用いられる式は HLB＝合計（親水基数）−合計（疎水基数）＋７ として示すことができる。

親水基数の値は〔−Ｃ（Ｏ）OH ＆ −Ｎ（Ｈ）Ｃ
（Ｏ）−＝2.1〕であり、疎水基数の値は〔脂肪族／芳
香族炭素＝0.475 ＆ 極性基間の脂肪族炭素原子は炭
化水素鎖中脂肪族炭素の値の1/2＝（0.475）/2〕であ
る。参考のため、H.L.B.値＞７は物質が主に水溶性であ
ることを示し、H.L.B.値＜７は界面活性および疎水性が
増加していることを示す。

前記のように、（直接加えられるかまたはその場で生
成される）本発明のペルオキシ酸に関する（対応カルボ
ン酸の）H.L.B.値の好ましい範囲は約3.0〜約6.5の範囲
内である。（直接加えられるかまたはその場で生成され
る）本発明で有用なペルオキシ酸に関する（カルボン酸
としての）H.L.B.値の更に好ましい範囲は約4.0〜6.5の
範囲内である。（直接加えられるかまたはその場で生成
される）本発明のペルオキシ酸に関する（カルボン酸と
しての）H.L.B.値の最も好ましい範囲は約4.0〜約6.0の
範囲内である。

（ａ）ペルオキシ酸 本発明は、有効量のプロテアーゼ酵素と、少くとも約
0.1％、好ましくは約0.1〜約50重量％の実質上不溶性の
有機ペルオキシ酸を含む漂白系を含んでなる洗剤組成物
にも関する。ここで有用なペルオキシ酸は、好ましくは
組成物の約0.5〜約20、更に好ましくは約１〜約10、最
も好ましくは約２〜約7wt％である。

好ましい有機ペルオキシ酸は、４−ノニルアミノ−４
−オキソペルオキシ酪酸、６−（ノニルアミノ）−６−
オキソペルオキシカプロン酸、1,12−ジペルオキシドデ
カン二酸、ヘプチルスルホニルペルプロピオン酸、デシ
ルスルホニルペルプロピオン酸、ヘプチル−、オクチル
−、ノニル−、デシル−スルホニルペル酪酸およびそれ
らの混合物からなる群より選択される。

有機ペルオキシ酸の中では、アミドペルオキシ酸（ア
ミド置換ペルオキシカルボン酸）が好ましい。ここで使
用上適切なアミドペルオキシ酸は、双方とも引用するこ
とにより本明細書の開示の一部とされる、各々1987年１
月６日付および1987年８月11日付で発行された双方とも
Burnsらの米国特許第4,634,551号および第4,686,063号
明細書で記載されている。適切なアミドペルオキシ酸は
下記式である： 上記式中R¹は約１〜約14の炭素原子を有するアルキ
ル、アリールまたはアルカリール基であり（好ましく
は、R¹は約６〜約12の炭素原子を有するアルキル基であ
る）、R²は約１〜約14の炭素原子を有するアルキレン、
アリレンまたはアルカリレン基であり（好ましくは、R²
は約１〜約６の炭素原子を有するアルキレン基であ
る）、R⁵はＨあるいは約１〜約10の炭素原子を有するア
ルキル、アリールまたはアルカリール基である（好まし
くは、R⁵はＨである）。更に好ましくは、R¹は約８〜約
10の炭素原子を有するアルキル基であり、R²は約２〜約
４の炭素原子を有するアルキレン基である。

引用することにより本明細書の開示の一部とされる19
89年８月１日付で発行されたBurnsらの米国特許第4,85
2,989号明細書で記載されたペルオキシフマレートと、
すべて引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る、各々1988年７月19日付、1988年４月25日付および19
91年４月２日付で発行されたすべてDryoffらの米国特許
第4,758,369号、第4,824,591号および第5,004,558号明
細書で記載されたスルホンペルオキシ酸（スルホンペル
オキシカルボン酸）も、好ましく使用できる。

米国特許第4,686,063号明細書の例Ｉは、第８欄40行
目〜第９欄５行目のNAPSAと、第９欄15行目〜第９欄65
行目のNAPAAの合成の記載を含んでいる。アミドペルオ
キシ酸合成の最後に、反応は水で停止され、ロ過され、
一部過剰の硫酸（またはペルオキシ酸が作られた他の強
酸）を除去するために水で洗浄され、再びロ過される。

こうして得られたアミドペルオキシ酸湿潤ケークは、
引用することにより本明細書の開示の一部とされる1990
年３月20日付で発行されたSadlowskiらの米国特許第4,9
09,953号に従い、約3.5〜６、好ましくは約４〜５のpH
でリン酸緩衝液と接触させることができる。

貯蔵安定性または発熱コントロール用の他剤も、最終
製品中への配合前にアミドペルオキシ酸に添加できる。
例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とさ
れる1987年８月11日付で発行されたBurnsの米国特許第
4,686,063号明細書で開示された発熱コントロール剤、
ホウ酸は、約2:1過酸：ホウ酸比で（リン酸緩衝液で洗
浄された）アミドペルオキシ酸と混合てきる。リン酸緩
衝液洗浄アミドペルオキシ酸は、適量のジピコリン酸お
よびピロリン酸四ナトリウム、キレート化安定系と混合
してもよい。キレート化剤は、湿潤ケークとの接触前
に、場合によりリン酸緩衝液に含有させることができ
る。

湿潤ケークは約0.1〜約260ミクロン、好ましくは約10
〜約100ミクロン、最も好ましくは約30〜約60ミクロン
の平均粒径の粒子から構成されることが好ましい。小さ
な粒度のNAPAA結晶がここでは望ましい。引用すること
により本明細書の開示の一部とされる、1991年10月８日
付で発行されたGettyらの米国特許第5,055,218号明細書
参照。

このNAPAAロ過ケークは、好ましくはリン酸緩衝液で
２回洗浄される。２連続リン酸緩衝液洗浄でNAPAAに最
良の安定性を与えることがわかった。

約３〜約12、最も好ましくは５〜７の理論AvO（有効
酸素）を有する粒状（固体）有機ペルオキシ酸が好まし
い。

NAPAAがここでは使用上最も好ましい。ペルオキシア
ジピン酸のノニルアミド（“NAPAA"）に関するもう１つ
の名称は、６−（ノニルアミノ）−６−オキソペルオキ
シカプロン酸である。NAPAAの化学式は以下である： NAPAAの分子量は287.4である。

NAPAAを含有した洗剤組成物および漂白組成物は、布
帛の極めて有効で効率的な表面漂白を行う。しみおよび
／または汚れは布帛から除去される。これらの組成物は
布帛から黒ずんだ汚れを除去する上で特に有効である。

NAPAAの極性アミドまたは置換アミド部分は、非常に
低い蒸気圧を有し、ひいては臭気の小さな、優れた漂白
性能を有したペルオキシ酸を作る。アミド基の極性はペ
ルオキシ酸の蒸気圧の減少と融点の増加を起こすと考え
られる。NAPAAは漂白剤として直接使用できる。それは
洗濯適用上低い蒸気圧と良好な臭気特性を有する。

NAPAAは、例えば、初めにNAAA（アジピン酸のモノノ
ニアルミド）、硫酸および過酸化水素を反応させること
により製造できる。反応生成物は氷水の添加で冷却さ
れ、その後ロ過、蒸留水洗浄、最後に湿潤ケークを回収
するために吸引ロ過される。洗浄はロ液のpHが中性にな
るまで続けることができる。

NAPAA pH（水中10％固形分）は約4.2〜4.8であるこ
とも好ましい。意外にも、このpHはより熱的に安定な粒
子を作る。

（ｂ）漂白系−ブリーチ活性剤およびペルオキシゲン漂
白化合物 （ｉ）ブリーチ活性剤 ここで有用な漂白系のブリーチ活性剤は、好ましくは
下記構造を有する： 上記式中Ｒは約５〜約18の炭素原子を有するアルキル
基であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びる最
長の直鎖アルキル鎖は約６〜約10の炭素原子を有し、Ｌ
は脱離基であり、その共役酸は約４〜約13、好ましくは
約６〜約11、最も好ましくは約８〜約11の範囲内のpKa
を有する。

Ｌは本質的にいかなる適切な脱離基であってもよい。
脱離基とは、ブリーチ活性剤でペルヒドロキシドアニオ
ンによる求核攻撃の結果としてブリーチ活性剤から離れ
る基である。このペルヒドロライシス（perhydrolysi
s）反応では過カルボン酸を形成する。通常、その基が
適切な脱離基であれば、それは電子吸引効果を発揮する
にちがいない。これはペルヒドロキシドアニオンによる
求核攻撃を容易にする。

Ｌ基は反応が最適の時間枠（例えば、洗浄サイクル）
内で起きるほど十分に反応性でなければならない。しか
しながら、Ｌが反応性すぎると、この活性剤は安定化さ
せることが困難になる。これらの特徴は脱離基の共役酸
のpKaと通常パラレルであるが、この慣例の例外が知ら
れている。

好ましいブリーチ活性剤は下記一般式の場合である： 上記式中R¹は約６〜約12の炭素原子を有するアルキル
基であり、R²は１〜約６の炭素原子を有するアルキレン
であり、R⁵はＨあるいは約１〜約10の炭素原子を有する
アルキル、アリールまたはアルカリールであり、Ｌは からなる群より選択される。R⁶は約１〜約14の炭素原子
を有するアルキレンル、アリレンまたはアルカリレン基
であり、R³は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル鎖
であり、R⁴はＨまたはR³であり、ＹはＨまたは安定基で
ある。Ｙは好ましくは−SO₃ ^-M⁺、−COO^-M⁺、−SO₄ ^-M⁺、
（−N⁺R′_３）X^-およびＯ←Ｎ（Ｒ′_３）からなる群よ
り選択され、ここでＲ′は約１〜約４の炭素原子を有す
るアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活性剤に安定性を与
えるカチオンであり、Ｘはブリーチ活性剤に溶解性を与
えるアニオンである。好ましくは、Ｍはアルカリ金属、
アンモニウムまたは置換アンモニウムカチオンであり、
ナトリウムおよびカリウムが最も好ましく、Ｘはハライ
ド、ヒドロキシド、メチル硫酸および酢酸アニオンから
なる群より選択されるアニオンである。更に好ましく
は、Ｙは−SO₃ ^-M⁺および−COO^-M⁺である。溶解基を含ま
ない脱離基のあるブリーチ活性剤は、それらの溶解を助
けるためにブリーチ溶液によく分散させるべきであるこ
とに注意すべきである。好ましくは以下である： 上記式中R³は前記のとおりであり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺また
は−COO^-M⁺であり、Ｍは前記のとおりである。

特に好ましいブリーチ活性剤は、R¹が約６〜約12の炭
素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、R²が約２〜約６
の炭素原子を有する直鎖アルキレン鎖であり、R⁵がＨで
あり、Ｌが （上記式中R³は前記のとをりであり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺また
は−COO^-M⁺であり、Ｍは前記のとおりである）からなる
群より選択される場合である。

好ましいブリーチ活性剤は： であり、上記式中ＲはＨ、アルキル、アリールまたはア
ルカリールである。これは、引用することにより本明細
書の開示の一部とされるHodgeらの米国特許第4,966,723
号明細書で記載されている。

好ましいブリーチ活性剤は： または であり、上記式中R¹はＨまたは約１〜約６の炭素原子を
有するアルキル基であり、R²は約１〜約６の炭素原子を
有するアルキル基であり、Ｌは前記のとおりである。

更に、好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが一般式で定義
されたとおりであり、R¹がＨまたは約１〜約４の炭素原
子を有するアルキル基である、前記一般式の場合であ
る。

Ｌが一般式で定義されたとおりであり、R¹がＨである
前記一般式のブリーチ活性剤が更に一層好ましい。

更に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒは約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖
であり、Ｌが （上記式中Ｒ、R²、R³およびＹは前記のとおりである）
からなる群より選択される、前記一般式の場合である。

特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約12の炭
素原子を有するアルキル基であって、カルボニル炭素を
含めてそこから伸びるアルキル鎖の最長直鎖部分が約６
〜約10の炭素原子を有し、Ｌが （上記式中R²は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル
鎖であり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺または−COO^-M⁺であり、Ｍはア
ルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチ
オンである）からなる群より選択される、前記一般式の
場合である。

特に好ましいブリーチ活性剤は、Ｒが約５〜約９、好
ましくは約６〜約８の炭素原子を有する直鎖アルキル鎖
であり、Ｌが （上記式中R²は前記のとおりであり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺また
は−COO^-M⁺であり、Ｍは前記のとおりである）からなる
群より選択される、前記一般式の場合である。

最も好ましいブリーチ活性剤は下記式を有する： 上記式中Ｒは約５〜約９、好ましくは約６〜約８の炭
素原子を有する直鎖アルキル鎖であり、Ｍはナトリウム
またはカリウムである。

好ましくは、本ブリーチ活性剤はナトリウムノナノイ
ルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）またはナトリウ
ムベンゾイルオキシベンゼンスルホネート（BOBS）であ
る。

更に、本発明漂白組成物で使用上特に好ましいのは、
天然ゴム部分を有する機械で使用上特に安全である下記
ブリーチ活性剤である。これはこれらのアミド酸誘導ブ
リーチ活性剤のペルヒドロライシス反応により油状ジア
シルペルオキシド（DAP）種を生じず、むしろ不溶性結
晶固体DAPを形成する結果であると考えられる。これら
の固体物はコーティングフィルムを形成しないと考えら
れ、このため天然ゴム部分は長期間にわたりDAPに暴露
されない。これらの好ましいブリーチ活性剤は下記から
なる群より選択されるメンバーである： ａ）下記一般式のブリーチ活性剤： またはそれらの混合物。上記式中R¹は約１〜約14の炭
素原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール
基であり、R²は約１〜約14の炭素原子を有するアルキレ
ン、アリレンまたはアルカリレン基であり、R⁵はＨある
いは約１〜約10の炭素原子を有するアルキル、アリール
またはアルカリール基であり、Ｌは脱離基である； ｂ）下記一般式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性
剤： 上記式中R₁はＨ、アルキル、アルカリール、アリー
ル、アリールアルキルであり、R₂、R₃、R₄およびR₅は
Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒド
ロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、CO
OR₆（R₆はＨまたはアルキル基である）およびカルボニ
ル官能基から選択される同一または異なる置換基であ
る； ｃ）下記式のＮ−アシルカプロラクタムブリーチ活性
剤： R⁶はＨあるいは１〜12の炭素を有するアルキル、アリ
ール、アルコキシアリールまたはアルカリール基であ
る； ｄ）ａ）、ｂ）およびｃ）の混合物 タイプａ）の好ましいブリーチ活性剤は、R¹が約６〜
約12の炭素原子を有するアルキル基であり、R²が約１〜
約８の炭素原子を有し、R⁵がＨまたはメチルである場合
である。特に好ましいブリーチ活性剤は、R¹が約７〜約
10の炭素原子を有するアルキル基であり、R²が約４〜約
５の炭素原子を有する、前記一般式の場合である。

タイプｂ）の好ましいブリーチ活性剤は、R₂、R₃、R₄
およびR₅がＨであり、R₁がフェニル基である場合であ
る。

タイプｃ）の上記Ｎ−アシルカプロラクタムブリーチ
活性剤の好ましいアシル部分は式R⁶−CO−を有し、ここ
でR⁶はＨあるいは１〜12、好ましくは６〜12の炭素原子
を有するアルキル、アリール、アルコキシアリールまた
はアルカリール基である。高度に好ましい態様におい
て、R⁶はフェニル、ヘプチル、オクチル、ノニル、2,4,
4−トリメチルペンチル、デセニルおよびそれらの混合
からなる群より選択されるメンバーである。

−アミド誘導ブリーチ活性剤−本発明で用いられるタイ
プａ）のブリーチ活性剤は下記一般式のアミド置換化合
物： またはそれらの混合物であり、上記式中R¹、R²および
R⁵は前記のとおりであり、Ｌは本質的にいかなる適切な
脱離基であってもよい。好ましいブリーチ活性剤は、
R¹、R²およびR⁵がペルオキシ酸に関して定義されたとお
りであり、Ｌが およびそれらの混合からなる群より選択され、R¹が約１
〜約14の炭素原子を有するアルキル、アリールまたはア
ルカリール基であり、R³が１〜約８の炭素原子を有する
アルキル鎖であり、R⁴がＨまたはR³であり、ＹがＨまた
は安定基である、前記一般式の場合である。

好ましい溶解基−SO₃ ^-M⁺、−CO₂ ^-M⁺、−SO₄ ^-M⁺、−N⁺
（R³）₄X^-およびＯ←Ｎ（R³）_３、最も好ましくは−SO₃
^-M⁺および−CO₂ ^-M⁺であり、ここでR³は約１〜約４の炭
素原子を有するアルキル鎖であり、Ｍはブリーチ活性剤
に安定性を与えるカチオンであり、Ｘはブリーチ活性剤
に溶解性を与えるアニオンである。好ましくは、Ｍはア
ルカリ金属、アンモニウムまたは置換アンモニウムカチ
オンであり、ナトリウムおよびカリウムが最も好まし
く、Ｘはハライド、ヒドロキシド、メチル硫酸および酢
酸アニオンである。溶解基を含まない脱離基のあるブリ
ーチ活性剤は、それらの溶解を助けるためにブリーチ溶
液によく分散させるべきであることに注意すべきであ
る。

好ましいブリーチ活性剤は、Ｌが （上記式中R³は前記のとおりであり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺また
は−COO^-M⁺であり、Ｍは前記のとおりである）からなる
群より選択される、前記一般式の場合である。

タイプｂ）およびタイプｃ）の場合を含めてブリーチ
活性剤のもう１つの重要なクラスでは、環式環のカルボ
ニル炭素でペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃の
結果として、開環によりここで記載されたような有機ペ
ルオキシ酸を生じる。例えば、タイプｃ）活性剤の開環
反応では過酸化水素またはそのアニオンによりカプロラ
クタム環カルボニルで攻撃する。過酸化水素またはその
アニオンによるアシルカプロラクタムの攻撃が好ましく
は環外カルボニルで起きるため、開環の重要なフラクシ
ョンを得るには触媒を要するかもしれない。開環ブリー
チ活性剤のもう１つの例は、1990年10月30日付で発行さ
れたHodgeらの米国特許第4,966,723号明細書で開示され
たようなタイプｂ）活性剤でみられる。

−ベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤−Hodgeによ
り開示されたこのような活性剤化合物には、下記式を有
するベンゾオキサジンタイプ： と、下記タイプの置換ベンゾオキサジン： （上記式中R₁はＨ、アルキル、アルカリール、アリー
ル、アリールアルキルであり、R₂、R₃、R₄およびR₅は
Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒド
ロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、CO
OR₆（R₆はＨまたはアルキル基である）およびカルボニ
ル官能基から選択される同一または異なる置換基であ
る）を含めた活性剤がある。

ベンゾオキサジンタイプの好ましい活性剤は以下であ
る： 活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶
液のpHがペルヒドロライシス反応を促進するために約8.
5〜10.5、好ましくは9.5〜10.5である洗浄溶液で得られ
る。このようなpHは、本漂白系の任意成分である、緩衝
剤として普通知られる物質で得られる。

−Ｎ−アシルカプロラクタムブリーチ活性剤−本発明で
用いられるタイプｃ）のＮ−アシルカプロラクタムブリ
ーチ活性剤は下記式を有する： R⁶はＨあるいは１〜12の炭素を有するアルキル、アリ
ール、アルコキシアリールまたはアルカリール基であ
る。R⁶部分が少くとも約６、好ましくは６〜約12の炭素
原子を有するカプロラクタム活性剤は、前記のような求
核およびボディ汚れクリーンアップを示す疎水性漂白を
行う。R⁶が１〜約６の炭素原子を有するカプロラクタム
活性剤は、飲料しみを漂白する上で特に効果的である親
水性漂白種を供する。典型的には1:5〜5:1、好ましくは
1:1の重量比にある疎水性および親水性カプロラクタム
の混合物が、混合しみ除去効果のためにここで用いるこ
とができる。

高度に好ましいＮ−アシルカプロラクタムはベンゾイ
ルカプロラクタム、オクタノイルカプロラクタム、ノナ
ノイルカプロラクタム、3,5,5−トリメチルヘキサノイ
ルカプロラクタム、デカノイルカプロラクタム、ウンデ
セノイルカプロラクタムおよびそれらの混合物からなる
群より選択される。Ｎ−アシルカプロラクタムの製造方
法は当業界で周知である。

米国特許第4,545,784号明細書の開示とは逆に、ブリ
ーチ活性剤はペルオキシゲン漂白化合物に吸収されない
ことが好ましい。他の有機洗浄成分の存在下でそうする
ことは、安全性問題を引き起こすことがある。

タイプａ）、ｂ）またはｃ）のブリーチ活性剤は、漂
白系または洗剤組成物の少くとも0.1重量％、好ましく
は約0.1〜約50％、更に好ましくは約１〜約30％、最も
好ましくは約３〜約25％である。

ここで好ましいアミド誘導およびカプロラクタムブリ
ーチ活性剤は、典型的には1:5〜5:1、好ましくは約1:1
の範囲内にあるアミド誘導またはカプロラクタム活性
剤:TAEDの重量比で、TAEDのようなゴム安全性、酵素安
全性、親水性活性剤と併用することもできる。

通常漂白メカニズム、特に表面漂白メカニズムは、完
全には理解されていない。しかしながら、ブリーチ活性
剤はペルオキシゲンブリーチにより放出される過酸化水
素から生じるペルヒドロキシドアニオンによる求核攻撃
をうけて、ペルオキシカルボン酸を形成すると通常考え
られる。この反応はペルヒドロライシスと通常称され
る。

活性剤が用いられるとき、最良の表面漂白性能は、溶
液のpHがペルヒドロライシス反応を促進するために約8.
5〜10.5、好ましくは9.5〜10.5である洗浄溶液で得られ
る。このようなpHは、本漂白系の任意成分である、緩衝
剤として普通知られる物質で得られる。

（ii）ペルオキシゲン漂白化合物 ここで有用なペルオキシゲン漂白系は、水性液中で過
酸化水素を生成できるものである。これらの化合物は当
業界で周知であり、それには過酸化水素と、アルカリ金
属ペルオキシド、有機ペルオキシド漂白化合物、例えば
過酸化尿素、および無機過酸塩漂白化合物、例えば過ホ
ウ酸、過炭酸、過リン酸アルカリ金属などがある。２種
以上のこのような漂白化合物の混合物も所望であれば使
用できる。

好ましいペルオキシゲン漂白化合物には、一、三およ
び四水和物の形で市販されている過ホウ酸ナトリウム、
ピロリン酸ナトリウムペルオキシ水和物、尿素ペルオキ
シ水和物、過炭酸ナトリウムおよび過酸化ナトリウムが
ある。過ホウ酸ナトリウム四水和物、過ホウ酸ナトリウ
ム一水和物および過炭酸ナトリウムが特に好ましい。貯
蔵中非常に安定で、しかも漂白液に非常に速やかに溶解
することから、過炭酸塩が特に好ましい。このように速
やかな溶解はより高レベルの過カルボン酸を形成し、こ
うして表面漂白性能を高めると考えられる。

高度に好ましい過炭酸塩は非コート形でもまたはコー
トされた形でもよい。非コート過炭酸塩の平均粒度は約
400〜約1200ミクロン、最も好ましくは約400〜約600ミ
クロンの範囲内である。コートされた過炭酸塩が用いら
れるとき、好ましいコーティング物質にはカーボネー
ト、サルフェート、シリケート、ボロシリケートまたは
脂肪カルボン酸の混合物がある。

ペルオキシゲン漂白化合物は、漂白系または洗剤組成
物の少くとも0.1重量％、好ましくは約１〜約75％、更
に好ましくは約３〜約40％、最も好ましくは約３〜約25
％である。

漂白系中におけるブリーチ活性剤対ペルオキシゲン漂
白化合物の重量比は、典型的には約2:1〜1:5の範囲内で
ある、好ましい比率は約1:1〜約1:3の範囲内である。

ペルオキシゲン漂白化合物により生成される過酸化水
素対ブリーチ活性剤のモル比は約1.0以上、更に好まし
くは約1.5以上、最も好ましくは約2.0〜約10である。好
ましくは、本漂白組成物は約0.5〜約20、最も好ましく
は約１〜約10wt％のペルオキシゲン漂白化合物を含む。

本ブリーチ活性剤／漂白化合物系はそれ自体ブリーチ
として有用である。しかしながら、このような漂白系は
界面活性剤、ビルダーなどのような様々な洗浄助剤を含
むことができる組成物で特に有用である。

（２）プロテアーゼ酵素： 本発明には、変種アミノ酸配列が誘導されている前駆
カルボニルヒドロラーゼと比較して、異なるタンパク質
分解活性、安定性、基質特異性、pHプロフィルおよび／
または性能特徴を有した、非天然カルボニルヒドロラー
ゼ変種であるプロテアーゼ酵素を含む。前駆カルボニル
ヒドロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼでもまたは
組換えヒドロラーゼであってもよい。特に、このような
カルボニルヒドロラーゼ変種は天然でみられないアミノ
酸配列を有しており、異なるアミノ酸による前駆カルボ
ニルヒドロラーゼの「複数アミノ酸残基」の置換により
誘導されている。前駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋
76位と、下記残基：＋99、＋101、＋103、＋104、＋10
7、＋123、＋27、＋105、＋109、＋126、＋128、＋13
5、＋156、＋166、＋195、＋197、＋204、＋206、＋21
0、＋216、＋217、＋218、＋222、＋260、265および／
または＋274のうち１以上とに相当し、その番号位置はB
acillus amyloliquefaciensの天然ズブチリシンあるい
は他のカルボニルヒドラーゼまたはズブチリシン、例え
ばBacillus lentusズブチリシンの相当アミノ酸残基に
対応する。

本発明組成物において有用なプロテアーゼ酵素である
カルボニルヒドロラーゼ変種は、アミノ酸残基＋76位の
置換を１以上の追加の修飾と共に有する。好ましくは、
本発明で有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合せ:76/
99;76/101;76/103;76/104;76/107;76/123;76/99/101;76
/99/103;76/99/104;76/101/103;76/101/104;76/103/10
4;76/104/107;76/104/123;76/107/123;76/99/101/103;7
6/99/101/104;76/99/103/104;76/101/103/104;76/103/1
04/123;76/104/107/123;76/99/101/103/104;76/99/103/
104/123;76/99/101/103/104/123;76/103/104/128;76/10
3/104/260;76/103/104/265;76/103/104/197;76/103/104
/105;76/103/104/135;76/103/104/126;76/103/104/107;
76/103/104/210;76/103/104/126/265および／または76/
103/104/222でアミノ酸残基の置換、欠失または挿入を
有する。最も好ましくは、本発明で有用な変種酵素は残
基の下記組合せ:B.amyloliquefaciensズブチリシンの76
/99;76/104;76/99/104;76/103/104;76/104/107;76/101/
103/104;76/99/101/103/104および76/101/104でアミノ
酸残基の置換、欠失または挿入を有する。

このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシ
ン変種をコードする変種DNA配列は、天然または組換え
前駆酵素をコードする前駆DNA配列から誘導される。変
種DNA配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて7
6、99、101、103、104、107、123、27、105、109、12
6、128、135、156、166、195、197、204、206、210、21
6、217、218、222、260、265および／または274位ある
いはそのいずれかの組合せに相当する前記DNA配列によ
りコードされる１以上の特定アミノ酸残基の置換につい
てコードするように前駆DNA配列を修飾することにより
誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残
基は（すべてのズブチリシンで残基位置を特定する上で
常法になった）B.amyloliquefaciensに適用しうる番号
付けに従い特定されているが、本発明において有用な好
ましい前駆DNA配列は図６で示されたようなBacillus le
ntusのDNA配列である（Seq.ID No.11）。

これらの変種DNA配列は、１以上の追加の修飾と共に
アミノ酸残基76の挿入または置換をコードしている。好
ましくは、変種DNA配列は下記組合せ:76/99;76/101;76/
103;76/104;76/107;76/123;76/99/101;76/99/103;76/99
/104;76/101/103;76/101/104;76/103/104;76/104/107;7
6/104/123;76/107/123;76/99/101/103;76/99/101/104;7
6/99/103/104;76/101/103/104;76/103/104/123;76/104/
107/123;76/99/101/103/104;76/99/103/104/123;76/99/
101/103/104/123;76/103/104/128;76/103/104/260;76/1
03/104/265;76/103/104/197;76/103/104/105;76/103/10
4/135;76/103/104/126;76/103/104/107;76/103/104/21
0;76/103/104/126/265および／または76/103/104/222で
アミノ酸残基の置換または挿入についてコードしてい
る。最も好ましくは、変種DNA配列は残基の下記組合せ:
76/99;76/104;76/99/104;76/103/104;76/104/107;76/10
1/103/104;76/99/101/103/104および76/101/104の修飾
についてコードしている。これらの組換えDNA配列は、
一般的に前駆カルボニルヒドロラーゼDNA配列によりコ
ードされる酵素の同性能とは実質的に異なる少くとも１
つの性質と、新規アミノ酸配列を有する、カルボニルヒ
ドロラーゼ変種をコードしている。このような性質には
タンパク質分解活性、基質特異性、安定性、変化したpH
プロフィルおよび／または向上した性能特徴が含まれ
る。

有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ酸残基
位置で19種天然Ｌ−アミノ酸のうちいずれかの置換を有
している。このような置換はいかなる前駆ズブチリシン
（原核、真核、哺乳動物など）でも行える。この出願全
般にわたり、共通１および３文字コードで様々なアミノ
酸について表している。このようなコードはDale,J.W.
（1989）,Molecular Genetics of Bacteria,John Wiley
＆ Sons,Ltd.,Appendix Bと同じである。

好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる
置換には、76位におけるＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、Ｐお
よびＮを含めた置換;99位におけるＤ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ
およびＳを含めた置換;101位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、
Ａ、Ｅ、ＳおよびＲを含めた置換;103位におけるＱ、
Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＡを含めた置
換;104位における全19種天然アミノ酸を含めた置換;107
位におけるＶ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、Ｓ、Ａ、
ＮおよびＩを含めた置換;123位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、
Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換;27位におけるＫ、
Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換;105位におけるＡ、
Ｄ、Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換;107位におけるＡ、
Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、ＳおよびＡを含めた置換;109
位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含めた置換;1
26位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換;128
位におけるＧ、ＬおよびＡを含めた置換;135位における
Ａ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを含めた置換;156位における
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換;166位におけ
る全19種天然アミノ酸を含めた置換;195位におけるＥを
含めた置換;197位におけるＥを含めた置換;204位におけ
るＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤを含めた置換;206位における
Ｌ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換;210位における
Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換;216位における
Ｖ、Ｅ、ＴおよびＫを含めた置換;217位における全19種
天然アミノ酸を含めた置換;218位におけるＳ、Ａ、Ｇ、
ＴおよびＶを含めた置換;222位における全19種天然アミ
ノ酸を含めた置換;260位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、
Ｃ、ＫおよびＤを含めた置換;265位におけるＮ、Ｇ、
Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、ＹおよびＨを含めた置換;274位におけ
るＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制限され
ない。このような各位置で置換される特に好ましいアミ
ノ酸は下記表Ｉで表示されている。特定のアミノ酸が表
Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も特定残基で置
き換わっていてよいことが理解されるべきである。

Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋76に相
当するアミノ酸残基において、B.lentusズブチリシンに
おいてインビトロ変異を有するこれらのプロテアーゼ酵
素は、前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例え
ば、修正された自己タンパク質分解安定性）を示すズブ
チリシン変種を生じる（表IVおよびVI参照）。しかも、
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンにおいて＋9
9、＋101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋10
5、＋109、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋19
5、＋197、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋21
8、＋222、＋260、＋265および／または＋274に相当す
る残基のインビトロ変異は、単独でまたは互いの組合せ
で、＋76変異と一緒になって、変化したタンパク質分解
活性、変化した熱安定性、変化したpHプロフィル、変化
した基質特異性および／または変化した性能特徴を示す
ズブチリシン変種を生じる。

カルボニルヒドロラーゼはＣ（Ｏ）−Ｘ結合（ここ
で、Ｘは酸素または窒素である）を有した化合物を加水
分解するプロテアーゼ酵素である。それらには天然カル
ボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラー
ゼがある。天然カルボニルヒドロラーゼには主としてヒ
ドロラーゼ、例えばズブチリシンまたはメタロプロテア
ーゼのようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒ
ドロラーゼとしてはα−アミノアシルペプチドヒドロラ
ーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノ
ヒドロラーゼ、セリンカルボキシルペフチダーゼ、メタ
ロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、
カルボキシプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼ
がある。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアー
ゼと、エンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。

“組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボ
ニルヒドロラーゼをコードするDNA配列がカルボニルヒ
ドロラーゼアミノ酸配列で１以上のアミノ酸の置換、挿
入または欠失についてコードする変異DNA配列を生じる
ように修飾されてなる、カルボニルヒドロラーゼに関す
る。適切な修飾法は本明細書、ならびに米国特許第4,76
0,025号（RE34,606）、米国特許第5,204,015号および米
国特許第5,185,258号明細書に開示されており、それら
の開示は引用することにより本明細書の開示の一部とさ
れる。

ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチ
ド結合を開裂するように通常作用する細菌または真菌カ
ルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる“ズブ
チリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリ
シンを意味する。天然ズブチリシンのシリーズは様々な
微生物種により産生されて、しばしば分泌されることが
知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列
は完全に相同的ではない。しかしながら、このシリーズ
のズブチリシンは同一または類似タイプのタンパク質分
解活性を示す。このセリンプロテアーゼは、それらとキ
モトリプシン関連クラスのセリンプロテアーゼとを区別
する触媒三残基（catalytic triad）を規定する共通ア
ミノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリ
シン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、
ヒスチジンおよびセリンからなる触媒三残基を有してい
る。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらア
ミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけ
て読取ると、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンであ
る。しかしながら、キモトリプシン関連プロテアーゼで
は、相対順序がヒスチジン−アスパラギン酸−セリンで
ある。このため、本ズブチリシンはズブチリシン関連プ
ロテアーゼの触媒三残基を有するセリンプロテアーゼを
関する。実施例には図３において特定されたズブチリシ
ンを示すが、本発明はそれに限定されない。

“組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコード
するDNA配列が天然ズブチリシンアミノ酸配列で１以上
のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコードする
変種（または変異）DNA配列を生じるように修飾された
ズブチリシンを意味する。このような修飾を生じて、本
明細書に開示されたものと組み合わせてもよい適切な方
法には、米国特許第4,760,025号（RE34,606）、米国特
許第5,204,015号および米国特許第5,185,258号明細書に
開示されものがある。

“非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらにつ
いてコードするDNAは、多くの原核および真核生物から
得られる。原核生物の適切な例には、E.coliまたはPseu
dmonasのようなグラム陰性生物と、MicrococcusまたはB
acillusのようなグラム陽性細菌がある。カルボニルヒ
ドロラーゼおよびそれらの遺伝子が得られる真核生物の
例には、Saccharomyces cerevisiaeのような酵母、Aspe
rgillus sp.のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例え
ばカルボニルヒドロラーゼキモシンついてコードする遺
伝子が得られるウシsp.がある。ズブチリシンの場合の
ように、カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリ
ーズのメンバー間で完全に相同的ではないアミノ酸配列
を有するが、それでもなお同一または類似タイプの生物
活性を示す、様々な関連種から得られる。このため、こ
こで用いられるような非ヒトカルボニルヒドロラーゼ
は、原核および真核源と直接または間接的に関連したカ
ルボニルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。

“カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニ
ルヒドロラーゼ”のアミノ酸配列から誘導されたアミノ
酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ（例えば
ズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブ
チリシン）および組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブ
チリシン）がある。カルボニルヒドロラーゼ変種のアミ
ノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置
換、欠失または挿入により、前駆ヒドラーゼアミノ酸配
列から“誘導”される。このような修飾は、前駆カルボ
ニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）の酵素自体の操作よ
りもむしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシ
ン）のアミノ酸配列についてコードする“前駆DNA配
列”に関するものである。前駆DNA配列のこのような操
作に適した方法にはここで開示された方法と、当業者に
公知の方法がある（例えば、EP O 328299、WO89/06279
とそこで既に参照された米国特許および出願参照）。

Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋76位
と、下記位置：＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋
123、＋27、＋105、＋109、126、＋128、＋135、＋15
6、＋166、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋21
6、＋217、＋218、＋222、＋260、＋265および／または
＋274のうち１以上とに相当する特定残基がここでは変
異のために特定されている。好ましくは、修飾される残
基は下記組合せ:76/99;76/101;76/103;76/104;76/107;7
6/123;76/99/101;76/99/103;76/99/104;76/101/103;76/
101/104;76/103/104;76/104/107;76/104/123;76/107/12
3;76/99/101/103;76/99/101/104;76/99/103/104;76/101
/103/104;76/103/104/123;76/104/107/123;76/99/101/1
03/104;76/99/103/104/123;76/99/101/103/104/123;76/
103/104/128;76/103/104/260;76/103/104/265;76/103/1
04/197;76/103/104/105;76/103/104/135;76/103/104/12
6;76/103/104/107;76/103/104/210;76/103/104/126/265
および／または76/103/104/222、最も好ましくは76/99;
76/104;76/99/104;76/103/104;76/104/107;76/101/103/
104;76/99/101/103/104および76/101/104から選択され
る。これらのアミノ配位置番号は、図１で表された成熟
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン配列に当ては
められた場合に関する。しかしながら、本発明において
有用なプロテアーゼ酵素はこの具体的ズブチリシンの変
異に制限されず、Bacillus amyloliquefaciensズブチリ
シンの具体的な特定残基に“相当”する位置でアミノ酸
残基を有する前駆カルボニルヒドロラーゼにもおよぶ。
好ましくは、前駆ズブチリシンはBacillus lentusズブ
チリシンであり、置換、欠失または挿入は上記場合に対
応するB.lentusの相当アミノ酸残基で行われる。

前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、
それが相同的である（即ち、一次または三次構造の位置
に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciensズブチ
リシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloli
quefaciensズブチリシンにおける特定残基またはその残
基の一部と類似している（即ち、化学的に化合、反応ま
たは相互作用する上で同一または類似した機能的能力を
有する）。

一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カル
ボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列はBacillus amyloli
quefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公知であ
るズブチリシンにおいて非変種であることが知られた一
連の残基と直接比較される。図２はamyloliquefaciens
ズブチリシンとB.lentusズブチリシンとの間における保
存残基について示している。保存残基を並べて、並びを
維持する（即ち、予定にない欠失および挿入による保存
残基の除去を避ける）ために必要な挿入および欠失を行
った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの一
次配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかにさ
れる。保存残基の並びは、好ましくはこのような残基の
100％を保存しているべきである。しかしながら、保存
残基の75％以上または50％もの少ない並びでも、相当残
基を明らかにする上で十分である。触媒三残基Asp32/Hi
s64/Ser221の保存は維持されているべきである。

例えば、図３において、Bacillus amyloliquefacien
s、Bacillus subtillis、Bacillus licheniformis（car
isbergensis）およびBacillus lentusのズブチリシンの
アミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を
与えるように並べられている。これら配列の比較では、
各配列に多くの保存残基が含まれていることを示してい
る。これらの保存残基は（BPN′およびB.lentus間）は
図２で特定されている。

このため、これらの保存残基は、Bacillus lentusの
ズブチリシン（1989年７月13日付で公開されたPCT公開N
o.WO89/06279）、ここで好ましいズブチリシン前駆酵
素、または好ましいBacillus lentusズブチリシンと高
度に相同的であるPB92として称されるズブチリシン（EP
Ｏ 328299）のような他のカルボニルヒドロラーゼ
で、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応す
る相当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。
これらズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、
保存残基の最大ホモロジーを生じるBacillus amyloliqu
efaciensズブチリシンの配列と共に、図3Aおよび3Bで並
べられている。みられるように、Bacillus amyloliquef
aciensズブチリシンと比較してBacillus lentusの配列
にいくつかの欠失がある。このため、例えば、他のズブ
チリシンにおいてBacillus amyloliquefaciensズブチリ
シンのVal165に相当するアミノ酸は、B.lentusおよびB.
licheniformisの場合にイソロイシンである。

このため、例えば、＋76位のアミノ酸はB.amylolique
faciensおよびB.lentusズブチリシン双方でアスパラギ
ン（Ｎ）である。しかしながら、本発明で有用な好まし
いズブチリシン変種において、Bacillus amyloliquefac
iensズブチリシンで＋76に相当するアミノ酸はアスパラ
ギン酸（Ｄ）で置換されている。ここで置換について特
定されたすべてのアミノ酸残基vs.このような各位置で
好ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示されてい
る。

相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆
カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでホモロジー
を調べることにより明らかにしてもよい。相当残基は、
前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliqu
efaciensズブチリシンの特定アミノ酸残基の２以上の主
鎖原子（ＮとＮ、CAとCA、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原
子座標が並べた後に0.13nm、好ましくは0.1nm以内であ
る場合として明らかにされる。ベストモデルがBacillus
amyloliquefaciensズブチリシンに対して問題のカルボ
ニルヒドロラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の
最大オーバーラップを与えるように配向および配置され
た後で、並びが実現される。ベストモデルは利用できる
最高解像能で実験回折データについて最低Ｒ因子を与え
る結晶学モデルである。

Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基
と機能的に類似した相当残基とは、それらがBacillus a
myloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限られかつ
属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒
作用を変更、修飾またはそれに寄与するようなコンホメ
ーションをとる前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸
として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原
子が相同位置を占めることに基づく一致性の基準を満た
さないが、残基の側鎖原子の少くとも２つの原子座標が
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原
子の0.13nm内に存在する程度まで類似した位置を占める
（三次構造がＸ線結晶学で得られた）前駆カルボニルヒ
ドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliquefaciens
ズブチリシンの三次元構造の座標はEPO公開No.0 251
446（米国特許出願第08/212,291号に相当する、その開
示は引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る）に示され、三次構造のレベルで相当残基を決めるた
めに上記のように使用できる。

置換、挿入または欠失について特定された残基の一部
は保存残基であるが、その他はそうでない。保存されて
いない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然でみ
られるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を生
じる置換に限定される。保存残基の場合、このような置
換は天然配列で起こらないはずである。本発明で有用な
カルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニルヒドロラ
ーゼ変種の成熟形とこのようなヒドロラーゼ変種のプロ
およびプレプロ形がある。プレプロ形は、これがカルボ
ニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟を促進す
ることから、好ましい構造である。

“プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒド
ロラーゼの“成熟”形を出現させる、カルボニルヒドロ
ラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ酸配列
に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産
物として天然でみられ、翻訳後プロセッシングがないと
このまま発現される。カルボニルヒドロラーゼ変種、特
にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacill
us amyloliquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であ
るが、他のズブチリシンプロ配列も用いてよい。例で
は、Bacillus lentus（ATCC 21536）のズブチリシンの
推定プロ配列が用いられる。

“シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニ
ルヒドロラーゼのＮ末端部分、あるいはヒドロラーゼの
成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラーゼの
Ｎ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグ
ナル配列のこの定義は機能的なもので、天然条件下でズ
ブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の
実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カ
ルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分によりコードされる
すべてのアミノ酸配列を含めた意味である。本発明で有
用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニル
ヒドロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を
利用する。例で用いられる好ましいシグナル配列は、Ba
cillus lentus（ATCC 21536）ズブチリシンのシグナル
配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズ
ブチリシンからのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基
を含んでなる。

カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒ
ドロラーゼのアミノ末端に作動的に結合されたプロ配列
と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された“プ
レ”またな“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼ
の成熟形からなる。

“発現ベクター”とは、適切な宿主でDNAの発現を行
える適切な制御配列に作動的に結合されたDNA配列を含
むDNA組立体に関する。このような制御配列には、転写
を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オ
ペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位につい
てコードする配列と、転写および翻訳の終結を制御する
配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒
子または単純な可能ゲノムインサートである。適切な宿
主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムから独立
して複製および機能するか、あるいは一部の場合にはゲ
ノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、“プ
ラスミド”および“ベクター”は時々互換的に用いられ
るが、プラスミドが現在最も常用される形のベクターで
ある。しかしながら、相当する機能を発揮して、当業界
で知られるかまたは知られるようになった、このような
他の形の発現ベクターもここに含まれる。

本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵
素的に活性なエンドプロテアーゼ分泌できないようにす
るために、好ましくは米国特許第4,760,025号（RE34,60
6）で開示された方法により操作された原核または真核
宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい宿
主細胞は、酵素的に活性な天然プロテアーゼおよびアル
カリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBacillus株BG
2036である。株BG2036の作成は米国特許第5,264,366号
明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現さ
せる上で他の宿主細胞には、Bacillus subtilis 1168
（米国特許第4,760,025号（RE34,606）および米国特許
第5,264,366号明細書でも記載されており、それらの開
示は引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る）とB.licheniformis、B.lentusなどのようないずれ
か適切なBacillus株がある。

宿主細胞は組換えDNA技術を用いて作成されたベクタ
ーで形質転換またはトランスフェクトされる。このよう
な形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒドロラーゼ
変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラ
ーゼ変種を発現するベクターを複製することができる。
カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよびプレプロ形を
コードするベクターの場合、このような変種は発現され
ると、典型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に分泌さ
れる。

“作動的に結合された”とは、２つのDNA領域間の関
係について表すとき、それらが互いに機能的に関連して
いることを単純に意味する。例えば、プレ配列は、それ
がシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の
分泌に関与し、おそらくシグナル配列を開裂させるなら
ば、ペプチドに作動的に結合されている。プロモーター
はそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動
的に結合されており、リボソーム結合部位はそれが翻訳
を行えるように配置されているならばコード配列に作動
的に結合されている。

天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子
は、当業者に知られる一般的方法に従い得られる。その
方法では通常関心あるヒドロラーゼの領域をコードする
推定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼ
を発現する生物からゲノムライブラリーを作り、プロー
ブとのハイブリッド形成により目的とする遺伝子につい
てライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハ
イブリッド形成クローンの酵素地図が作成され、配列決
定される。例で用いられるB.lentus遺伝子は米国特許第
5,185,258号明細書の例１で記載されたようにクローニ
ングされ、その開示は引用することにより本明細書の開
示の一部とされる。例で用いられるBPN′遺伝子はRE34,
606明細書の例１で記載されたようにクローニングさ
れ、その開示は引用することにより本明細書の開示の一
部とされる。

次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細
胞を形質転換してヒドロラーゼを発現させるために用い
られる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数プラス
ミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミ
ド複製に必要な周知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に
結合されたプロモーター（それが宿主により認識、即ち
転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターと
して供給される）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ
遺伝子の内在ターミネーター領域により供給される（あ
る真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写さ
れたmRNAの安定性にとり必要な）転写終結およびポリア
デニル化領域と、望ましくは抗生物質含有培地中の増殖
でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行える抗生
物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという
意味で、宿主複製される。高コピー数プラスミドは宿主
用の複製起点も含み、それにより染色体制限なしに細胞
質で多数のプラスミドを生成させることができる。しか
しながら、ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲノ
ム中に組込むことも範囲内とされる。これは、特に相同
的組換えを受けやすい原核および真核生物で容易化され
る。

本例で用いられる遺伝子は天然B.lentus遺伝子および
天然B.amyloliquefaciens遺伝子である。一方、天然ま
たは変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）
をコードする合成遺伝子も作成してよい。このようなア
プローチで、前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）のDNA
および／またはアミノ酸配列が決定される。その後多数
の重複合成一本鎖DNA断片が合成され、ハイブリッド形
成および結合により前駆ヒドロラーゼをコードする合成
DNAを生じる。合成遺伝子作成例は米国特許第5,204,015
号明細書の例３で示され、その開示は引用することによ
り本明細書の開示の一部とされる。

天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子が
クローニングされると、いくつかの修飾が天然前駆カル
ボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用を高め
るために行われる。このような修飾には、米国特許第4,
760,025号（RE34,606）およびEPO公開第０ 251 446号
明細書で開示されたような組換えカルボニルヒドロラー
ゼの産生と、ここで記載されたカルボニルヒドロラーゼ
変種の産生がある。

下記カセット変異誘発法も本発明において有用なカル
ボニルヒドロラーゼ変種の作成および同定を容易にする
ために用いられるが、部位特異的変異誘発を含めた他の
方法も用いてよい。最初に、ヒドロラーゼをコードする
天然遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定され
る。次いで配列がコードされた酵素で１以上のアミノ酸
の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる
箇所について操作される。この箇所に隣接する配列は、
発現されたときに様々な変異体をコードするオリゴヌク
レオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換するた
めの制限部位の存在について評価される。このような制
限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を容易に
するためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位である。
しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複してい
ない好都合な制限部位はいずれも用いうるが、但し制限
切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で再アセンブリ
ーできねばならない。制限部位が選択された箇所から好
都合な距離内の位置（10〜15ヌクレオチド）に存在しな
いならば、このような部位は読取枠だけでなくコードさ
れたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺伝子でヌ
クレオチドを置換させることにより作成される。その配
列を変えて望ましい配列にするための遺伝子の変異は、
通常知られる方法に従いM13プライマー伸長により行わ
れる。適切な隣接領域を配置して、２つの好都合な制限
部位配列にするために必要な変化を評価する作業は、遺
伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素地図および多数
の異なる制限酵素によりルーチン化される。好都合な隣
接制限部位が利用しうるならば、上記方法は部位を含ま
ない隣接領域だけと併用される必要があることに注意せ
よ。

天然DNAまたは合成DNAがクローニングされると、変異
される位置に隣接した制限部位は同族制限酵素で切断さ
れ、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカセットがその
遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌク
レオチドが同様の制限部位を有するように合成でき、合
成リンカーが制限部位を作成する上で不要であるため、
この方法により簡易化される。

ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素mg
当たりのペプチド結合の加水分解速度として規定され
る。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定するた
めに存在する（K.M.Kalisz,“Microbial Proteinases",
Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,
A.Fiechter ed.,1988）。修正タンパク質分解活性に加
えてまたは代えて、本発明の変種酵素はK_m、K_cat、K_cat
/K_m比および／または修正基質特異性および／または修
正pH活性プロフィルのような他の修正された性質を有し
ていてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用途のよう
な加水分解プロセスで存在することが予想される特定基
質用に作ることができる。

１つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して
変化したタンパク質分解活性を有する変種カルボニルヒ
ドロラーゼを得ることであり、そうすればこのような活
性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率
的に作用するように酵素を使用できるようになるからで
ある。前駆体と比較して変化した熱安定性および／また
は変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。
好ましくは、変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブ
チリシンである。Bacillus amyloliquefaciensズブチリ
シンの＋76、＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋12
3、＋27、＋105、＋109、＋126、＋128、＋135、＋15
6、＋166、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋21
6、＋217、＋218、＋222、＋260、＋265および／または
＋274あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基
においてズブチリシンタイプカルボニルヒドロラーゼで
このような結果を得るために有用な特定のアミノ酸が例
で示されている。一部の場合には、低いタンパク質分解
活性が望ましい。逆に、一部の場合には、前駆体よりも
変種酵素のタンパク質分解活性を増加させることが望ま
れる。加えて、アルカリまたは熱安定性であろうと、変
種の安定性の増加または減少（変更）が望まれる。
K_cat、K_mまたはK_cat/K_mの増加または減少は、これらの
動力学的パラメーターを決定するために用いられる基質
に特異的である。

しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋76
位に相当する残基は酵素の全体的安定性および／または
タンパク質分解活性を調節する上で重要なことがわかっ
た。このため、例で示されたように、相当する＋76位に
おけるBacillus lentusズブチリシンのアスパラギン
（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定性および／また
は高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋99、＋
101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋105、＋10
9、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋195、＋19
7、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋218、＋22
2、＋260、＋265および／または＋274のうち１以上の修
飾と共に、好ましいプロテアーゼ酵素でアスパラギン酸
（Ｄ）により置換することができる。

本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で
示されている。これらには置換残基の下記特定組合せ:N
76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/
V1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76
D/S101R/S103A/V104Iがある。これらの置換は好ましく
はBacillus lentus（組換えまたは天然型）ズブチリシ
ンで行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシン
で行ってもよい。

このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基
づくと、Bacillus amyloliquefaciensの＋76、＋99、＋
101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋105、＋10
9、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋195、＋19
7、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋218、＋22
2、＋260、＋265および／または＋274位に相当するカル
ボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残
基が、これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／
または安定性と、このような変種酵素のクリーニングま
たは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。

以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造
例により示されている。

プロテアーゼ製造例 B.subtilisでGG36遺伝子発現用の作成 B.lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのク
ローニングおよび作成は、米国特許第5,185,258号明細
書で記載された場合と本質的に同様に行う。プラスミド
GGA274（図４に記載）で図５で示されたように下記の方
法で更に修飾される。GGA274プラスミドの作成時に導入
されたPst I部位は、下記配列:5′GAAGCTGCAＡCTCGTTAA
A3′（Seq.ID No.1）を有するオリゴヌクレオチドで、
下記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により除去さ
れる。下線“A"残基は制限酵素Pst Iの認識配列を除い
て、274位でアラニンからトレオニンに対応アミノ酸残
基を変える。274位のトレオニンはクローン化B.lentus
ズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生型残基であ
る。ズブチリシンをコードするDNAセグメントは、EcoR
IおよびBamH I切断でプラスミドGGA274またはその誘導
体（図５で示されたGGT274）から切り出される。DNA断
片は、変異誘発のために、MP19のようなバクテリオファ
ージM13ベースベクター中に逆サブクローニングされ
る。変異誘発後、EcoR IおよびHind III切断、その後ク
ローニングが、変異ズブチリシンタンパク質の発現およ
び回収のために、GGA274のような発現プラスミド中に変
異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行われる。

オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et a
l.（1983）,Methods Enzymol.,100:468−500で記載され
たように行われる。例として、配列５′GCTGCTＣTAＧAC
AATTCG3′（Seq.ID No.2）の合成オリゴヌクレオチドが
76位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラ
ギン酸（Ｄ）、即ちN76Dに変えるために用いられる。下
線“G"および“C"残基は野生型遺伝子配列からの変化を
表す。CAは＋75位でロイシンを保ち、Xbal制限酵素のXb
al認識部位（TCTAGA）を導入するようにアミノ酸配列を
変化させ、一方ＧACの変化は＋76のアスパラギンをアス
パラギン酸に変化させる。

99、101、103および104位の変異誘発には、異なるオ
リゴヌクレオチドが望ましい変異の組合せに応じて使用
できる。例えば、配列５′GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCG
ＣCATCAGCTCGATT3′（Seq.ID No.3）のオリゴヌクレオ
チドが単一ズブチリシン分子で下記変化:S99D、S101R、
S103AおよびV104Iを同時に行うために用いられる。同様
に、配列５′TCAGGTTCGGTCTCGAGＣＧTTGCCCAAGGATTG3′
（Seq.ID No.4）および５′CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG3′
（Seq.ID No.5）のオリゴヌクレオチドがI107VおよびN1
23Sを各々作るために利用される。同じく、下線残基は
アミノ酸配列または制限酵素認識配列で望ましい変化を
生じさせる野生型配列からの変化を表す。

ズブチリシン変種のタンパク質分解活性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従
い、表IIIで掲載された変種が作られる。これらズブチ
リシン変種の各々のタンパク質分解活性は表IIIで示さ
れている。動力学的パラメーターk_cat、K_mおよびk_cat/K
_mは、P.Bonneau et al.（1991）J.Am.Chem.Soc.,Vol.11
3,No.3,p.1030に記載された方法を用いて、合成ペプチ
ド基質サクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−P
he−ｐ−ニトロアニリドの加水分解に関して測定され
る。簡単にいえば、少量のズブチリシン変種ストック溶
液がpH8.6の0.1M Tris−HCl緩衝液に溶解された基質を
含む1cmキュベットに加えられ、25℃で恒温される。反
応の進行は410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸
光度をモニターすることにより分光測定で追跡される。
動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴリズムを用
いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis
−Menten式に当てはめることにより得られる。

表IIIに掲載された結果は、試験されたズブチリシン
変種のすべてがタンパク質分解活性を留めていることを
示している。更に、データの詳しい分析では、タンパク
質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで76、99、10
1、103、104、107および123位に相当するアミノ酸残基
において置換の様々な組合せによりBacillus lentusズ
ブチリシンで有意に変わっていることを示している。

ズブチリシン変種の熱安定性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスに
より作られた本発明のBacillus lentusズブチリシンお
よび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示されて
いる。50mM CaCl₂含有または非含有0.1Mグリシン、0.01
％Tween−80pH10.0中の精製酵素15μg/mlを小さな管中
に入れ、10℃で５分間、10〜60℃で１分間および60℃で
20分間インキュベートする。次いで管を氷上に10分間お
く。管からの一部は、25℃に恒温された0.1M tris−HCl
緩衝液pH8.6に溶解された1.2mMの合成ペプチド基質サク
シニル−Ｌ−Ala−Ｌ−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−Phe−ｐ−ニ
トロアニリドを含有する1cmキュベットへの添加によ
り、酵素活性について調べる。初期の直線的反応速度
は、時間の関数として410nmで反応生成物ｐ−ニトロア
ニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追
跡する。データは加熱前に対する活性％として表示され
る。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（26例中2
4）が50mM CaCl₂添加試験条件下でBacillus lentusズブ
チリシンに匹敵する熱安定性を発揮することを示してい
る。50mM CaCl₂非添加試験条件下でも、大多数の変種
（26例中19）がBacillus lentusズブチリシンよりも有
意に安定である。更に、変種N76D/S99D、N76D/V104I、N
76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107
V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iは5
0mM CaCl₂非添加試験条件下で単一置換変種N76Dよりも
有意に安定である。

ファージミドから作られた一本鎖DNA鋳型によるオリゴ
ヌクレオチド特異的変異誘発 A.B.lentus変種の作成 変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変
異誘発で前記された場合と本質的に同様である。一本鎖
DNA鋳型はファージミド法で作る。一本鎖DNA鋳型作成用
のファージミドベクターを作成するために、我々はベク
ターpBCDAICATを最初に作成した。ベクター作成のフロ
ーチャートは図８で示されている。初めに、pC194プラ
スミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bacteriol.1
50:8−15,1982）のCAT遺伝子をコードするC1a I−C1a I
切断をpUC19（New England BioLabs,Beverly,MA）のポ
リリンカー領域のAcc I部位中にクローニングしてプラ
スミドpUCCHLを作り、GG36DAIコードDNAの５′末端から
のEcoR I−Dra I 0.6KB断片をpBSKSプラスミド（Strat
agene,Inc.,San Diego,CA）のEcoR IおよびEcoR V部位
中にクローニングしてpBC2SK5を作る。プラスミドpBC2S
K5の単一EcoR I部位をEcoR I切断により除去し、その後
T4DNAポリメラーゼ触媒で補充し、再結合させて、EcoR
I部位を有しないプラスミドpBC2SK−5Rを作る。pBCSK−
5R中にクローニングされたEcoR I−Dra I断片をPst I−
Hind III断片として単離し、pUCCHLのPst I−Hind III
部位（pUC19のポリリンカーの一部）中にクローニング
してプラスミドpUCCHL5Rを作る。GG36DAI遺伝子のコー
ド配列をEcoR I−BamH I切断として切出し、pUCCHL5Rの
EcoR I−BamH I部位中にクローニングしてpUCCATを作
る。次いでpUCCATの大きなEcoR I−Hind III断片をBS2K
S＋のEcoR IおよびHind III部位中にクローニングして
プラスミドpBCDAICATを作る。

一本鎖DNAを作るために、pBCDAICATを含むE.coliをRe
ssel.M.,Kidd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45:333−338,19
86に記載されたプロトコールに従いファージR408（Stra
tagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。一
本鎖DNA鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異
的変異誘発で前記されたような標準変異誘発方法を実施
する。ある変異体の作成は説明目的で以下に詳述されて
いる。

B.lentus（GG36）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成で
は、GG36 N76D/S103A/V104IについてコードするEcoR I
−BamH I DNA断片をpUCCATの作成（図８参照）に用い
て、プラスミドpBCDAICATを作る。一本鎖DNA鋳型を前記
プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プラ
イマー xC1al ５′TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACＴ TCG ATG GCT 3′
（Seq.ID No.13） を用いて、L217Hを作る。前記のように、下線残基は行
われたヌクレオチド変化を表し、xC1a Iは存在するC1a
I部位が変異誘発後に除去されたことを示す。変異誘発
プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
で記載されたとおりである。変異誘発後、プラスミドDN
Aを初めにC1a I部位の除去についてスクリーニングし、
C1a I部位を欠いたクローンをDNA配列分析に付して、21
7位アミノ酸残基でＬからＨに変化したDNA配列について
確認する。

B.BPN′変種の作成およびB.subtilisでのそれらの発現 B.amyloliquefaciens（BPN′）N76D/Q103A/Y104I/Y21
7Lの作成を２つの連続工程のほかは同様の方式で行う。
N76Dを最初にBPN′Y217L中に導入してBPN′N76D/Y217L
を作り、第二の変異誘発を行ってBPN′N76D/Y217LをBP
N′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発
用の一本鎖DNA鋳型を作るために、BPN′Y217Lズブチリ
シンについてコードするEcoR I−BamH I断片（Wells,
J.,et al.,PNAS,84,5167,1087で記載されたY217Lプラス
ミドから誘導される）を用いて、プラスミドpUCCATFNA
を作る（図９参照）。BPN′Y217Lを含むpUCCATFNAプラ
スミドを用いて、pBCFNACATプラスミドを作成する（図
９）。一本鎖DNAを前記のように作る。BPN′N76D/Y217L
を作るために、下記配列のオリゴヌクレオチドプライマ
ー Xbal ５′C ACA GTT GCG GCT CTＡ ＧAT AAC TCA ATC GGT
G 3′（Seq.ID No.15） を用いて、変化N76Dを作る。次いで一本鎖DNAをBPN′N7
6D/Y217L保有pBCFNACATプラスミド（N76D変異誘発後のp
BCFNACATプラスミド）から作り、下記配列のもう１つの
オリゴヌクレオチド xPvull ５′GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGＴ TGG ATC ATT
3′（Seq.ID No.15） で変異誘発させて、BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217を得
る。クローニング、一本鎖DNA作成、変異誘発および変
異体のスクリーニングに関係するすべての工程は前記の
ように実施する。BPN′遺伝子およびその変種の発現
は、RE34,606に記載されたようなBacillus subtilisの
プロテアーゼ欠失株中に直接プラスミドDNA（異なる変
種のBPN′遺伝子を含むpBCFNACAT）を組込むことにより
行う。

多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どお
りに作る。動力学的データおよび安定性データはこのよ
うな変種について作る。動力学的データは前記方法を用
いて作り、表Ｖで示されている。安定性データはここで
詳述されたように作成した。結果は表VIで示されてい
る。

熱安定性アッセイ操作 精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G−25か
らなるカラムに酵素を適用し、同緩衝液を用いてカラム
から酵素を溶出させることにより、0.1MグリシンpH10.
0、0.01％Tween−80中に緩衝液交換する。

60℃に恒温された0.1Mグリシン、0.01％Tween−80pH1
0.0を含有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、15
μg/mlの最終酵素濃度にする。

一部を様々な時間に60℃インキュベートから取出し、
25℃に恒温された0.1M tris−HCl緩衝液pH8.6に溶解さ
れた1.2mMの合成ペプチド基質サクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ
−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−Phe−Ｐ−ニトロアニリドを含有
する1cmキュベットへの添加により、酵素活性について
直ちに調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数と
して410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸光度を
モニターすることにより分光測定で追跡する。

50％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、
60℃でインキュベート時間の関数として反応速度の一次
プロットから決める。

データは同一条件下でBacillus lentusズブチリシン
（GG36）について決められた半減期の％として表VIに掲
載されている。

（３）クリーニング組成物物質： 本発明のクリーニング組成物は、前記漂白剤およびプ
ロテアーゼ酵素に加えて、プロテアーゼ酵素と適合する
１種以上のクリーニング組成物物質も含んでいる。ここ
で用いられる“クリーニング組成物物質”という用語
は、望まれるクリーニング組成物の具体的タイプおよび
製品の形（例えば、液体、顆粒、スプレー組成物）につ
いて選択されるあらゆる液体、固体または気体物質を意
味し、しかもその物質は組成物で用いられるプロテアー
ゼ酵素と適合している。クリーニング組成物物質の具体
的選択は、クリーニングされる表面、物品または布帛と
使用中（例えば、洗浄洗剤使用中）のクリーニング条件
にとり組成物の望ましい形について考慮することにより
容易に行われる。ここで用いられる“適合する”という
用語は、プロテアーゼが通常の使用状況中に望んでいる
ほど有効でなくなる程度までにはクリーニング組成物物
質がプロテアーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させ
ないことを意味する。具体的なクリーニング組成物物質
は以下で詳細に例示されている。

１種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク
質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で
有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング
組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆
粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；
形態上制限されない（例えば、顆粒、液体及び固形処
方）、布帛クリーニングするための洗剤組成物；皿洗い
組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない
（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方）口内洗浄
組成物；形態上制限されない（例えば、液体、錠剤）義
歯クリーニング組成物がある。ここで記載される“プロ
テアーゼ酵素の有効量”とは、特定のクリーニング組成
物で必要な酵素活性を出すために必要な前記プロテアー
ゼ酵素の量に関する。このような有効量は当業者により
容易に確認でき、用いられる具体的酵素変種、クリーニ
ング適用例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体
または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物が必要かどう
かなどのような多くのファクターに基づいている。

好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約0.0001
〜約10％、更に好ましくは0.001〜約１％、更に一層好
ましくは約0.001〜約0.1％の１種以上のプロテアーゼ酵
素を含んでいる。しかも好ましくは、プロテアーゼ酵素
は、酵素対ブリーチ比（E/B比）としてここでは称され
る、約1:1〜約20:1の範囲内で組成物100g当たりの活性
プロテアーゼmg対洗浄液中ペルオキシ酸からの理論有効
O₂（“AvO₂"）ppmの比率を示すために十分な量で組成物
中に存在する。プロテアーゼ酵素が用いられた数例の様
々なクリーニング組成物が以下で更に詳細に記載されて
いる。ここで用いられるすべての部、パーセンテージ及
び比率は、他で指摘されないかぎり重量による。

（ｉ）任意の洗浄酵素 本組成物および方法は、特定のプロテアーゼ酵素に加
えて、すべての種類の洗浄酵素と有効である。本発明で
有用な任意の洗浄酵素も、例えばタンパク質ベース、炭
水化物ベースまたはトリグリセリドベース汚れの除去を
含めた様々な布帛洗濯目的と、遊離染料移動の防止のた
めに含有させてよい。配合される酵素には他のプロテア
ーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびペルオ
キシダーゼとそれらの混合物がある。他のタイプの酵素
も含んでよい。それらは植物、動物、細菌、真菌および
酵母起源のようにいかなる適切な起源であってもよい。
しかしながら、それらの選択はpH活性および／または最
良安定性、熱安定性、活性洗剤、ビルダーなどに対する
安定性のようないくつかのファクターにより支配され
る。この点において、細菌アミラーゼおよびプロテアー
ゼと真菌セルラーゼのような細菌または真菌酵素が好ま
しい。

酵素は、洗剤組成物1g当たり重量で約50mg以内、更に
典型的には約0.01〜約10mgの活性酵素を供給するために
十分なレベルで通常配合される。換言すれば、本発明で
用いられる任意酵素の有効量は、典型的には洗剤組成物
の少くとも約0.001重量％、好ましくは約0.001〜約５
％、更に好ましくは約0.001〜約１％、最も好ましくは
約0.01〜約１％である。

任意プロテアーゼの適切な例は、B.subtilisおよびB.
licheniformsの特定株から得られるズブチリシンであ
る。もう１つの適切なプロテアーゼは、８〜12のpH範囲
で最大活性を有するBacillus subtilisまたはBacillus
licheniformisから得られ、Novo Industries A/Sから登
録商品名ESPERASEとして開発および販売されている、修
正された細菌セリンプロテアーゼ酵素である。この酵素
および類似酵素の製品はNovoの英国特許明細書第1,243,
784号明細書で記載されている。市販されている他のタ
ンパク質分解酵素には、Novo Industries A/S（デンマ
ーク）から商品名ALCALASEおよびSAVINASEとして、Inte
rnational Bio−Synthetics,Inc.（オランダ）からMAXA
TASEとして販売されるものがある。更に他のプロテアー
ゼには、プロテアーゼＡ（1985年１月９日付で公開され
た欧州特許出願第130,756号明細書参照）およびプロテ
アーゼＢ（1987年４月28日付で出願された欧州特許出願
第87303761.8号および1985年１月９日付で公開されたBo
ttらの欧州特許出願第130,756号明細書参照）と、123位
でチロシンがバリンに置き換わり、123位でセリンがア
スパラギンに置き換わり、274位でアラニンがトレオニ
ンに置き換わったBacillusからのアルカリセリンプロテ
アーゼのトリプル変種である、ここでは“プロテアーゼ
C"と称されるものがある。プロテアーゼＣは、引用する
ことにより本明細書の開示の一部とされる、1991年５月
16日付で公開されたWO91/06637に対応するEP第9091595
8.4号明細書で記載されている。特にプロテアーゼＣの
遺伝子的に修正された変種もここに含まれる。

アミラーゼには、例えば英国特許明細書第1,296,839
号（Novo）明細書で記載されたα−アミラーゼ、Intern
ational Bio−Synthetics,Inc.のRAPIDASEおよびNovo I
ndustriesのTERMAMYLがある。

本発明で使用しうるセルラーゼには細菌または真菌双
方のセルラーゼを含む。好ましくは、それらは５〜9.5
の至適pHを有する。適切なセルラーゼは1984年３月６日
付で発行されたBarbesgoardらの米国特許第4,435,307号
明細書で開示しており、そこではHumicola insolensお
よびHumicola株DSM1800またはAeromonas属に属するセル
ラーゼ212産生真菌から産生される真菌セルラーゼと、
海洋軟体動物（Dolabella Auricula Solander）の肝膵
から抽出されるセルラーゼについて開示している。適切
なセルラーゼはGB−Ａ−2,075,028、GB−Ａ−2,095,275
およびDE−OS−2,247,832でも開示されている。

洗剤用に適したリパーゼ酵素には、英国特許第1,372,
034号明細書で開示されたPseudomonas stutzeriATCC19.
154のようなPseudomonas属の微生物により産生されるも
のがある。更に1978年２月24日付で公開された日本特許
出願第53−20487号のリパーゼ参照。このリパーゼは商
品名Lipase P‘Amano'として日本、名古屋のAmano Phar
maceutical Co.Ltd.から市販され、以下‘Amano−P'と
称される。他の市販リパーゼにはAmano−CES、リパーゼ
ex Chromobacter viscosum、例えば日本、田方の東洋醸
造社から市販されるChromobacter viscosum var.lipoly
ticum NRRLB 3673;USAのU.S.Biochemical Corp.および
オランダのDisoynth Co.からのChromobacter viscosum
リパーゼ；リパーゼ ex Pseudomonas gladioliがあ
る。真菌Humicola lanuginosaに由来し、宿主としてAsp
ergillus oryzaeで発現され、Novoから市販されるLIPOL
ASE酵素（更にE.P.特許第341,947号明細書参照）がここ
で使用上好ましいリパーゼである。

ペルオキシダーゼ酵素は酸素源、例えばペルカーボネ
ート、ペルボレート、ペルサルフェート、過酸化水素な
どと組合せて用いられる。それらは“溶液漂白”に、即
ち洗浄操作中に物品から落ちた染料または顔料が洗浄溶
液中で他の物品に移動することを防ぐために用いられ
る。ペルオキシダーゼ酵素は当業界で公知であり、それ
には例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、リグニナーゼ
とクロロおよびブロモペルオキシダーゼのようなハロペ
ルオキシダーゼがある。ペルオキシダーゼ含有洗剤組成
物は、例えばO.Kirkにより1989年10月19日付で公開され
て、Novo Industries A/Sに譲渡された、PCT国際出願WO
第89/099813号明細書で開示されている。

様々な酵素物質と顆粒合成洗剤中へのそれらの配合手
段も1971年１月５日付で発行されたMcCartyらの米国特
許第3,553,139号明細書で開示されている。酵素は1978
年７月18日付で発行されたPlaceらの米国特許第4,101,4
57号および1985年３月26日付で発行されたHughesの米国
特許第4,507,219号双方の明細書でも更に開示されてい
る。液体洗剤処方で有用な酵素物質とこのような処方中
へのそれらの配合は、1981年４月14日付で発行されたHo
raらの米国特許第4,261,868号明細書で開示されてい
る。洗剤で有用な酵素は様々な技術で安定化させること
ができる。酵素安定化技術は、1981年４月14日付で発行
されたHornらの米国特許第4,261,868号、1971年８月17
日付で発行されたGedgeらの米国特許第3,600,319号およ
び1986年10月29日付で公開されたVenegasの欧州特許出
願公開第0199405号、出願第86200586.5号明細書で開示
および例示されている。酵素安定化系も、例えば米国特
許第4,261,868号、第3,600,319号および3,519,570号明
細書で記載されている。

（ii）酵素安定剤 ここで用いられる酵素は、酵素にカルシウムイオンを
供給する最終組成物中の水溶性カルシウムイオン源の存
在により安定化させることができる。追加安定は様々な
他の業界開示安定剤、特にボレート種の存在により得ら
れる：前記Seversonの米国特許第4,537,706号明細書参
照。典型的洗剤、特に液体は最終組成物１リットル当た
り約１〜約30、好ましくは約２〜約20、更に好ましくは
約５〜約15、最も好ましくは約８〜約12ミリモルのカル
シウムイオンを含む。これは存在する酵素の量とカルシ
ウムイオンに対するその応答に応じてやや変動しうる。
カルシウムイオンのレベルは、組成物中でビルダー、脂
肪酸などとの錯体形成後に酵素にとり有用な最少レベル
で常に存在するように選択されるべきである。限定され
ないが、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、リンゴ酸カ
ルシウム、水酸化カルシウム、ギ酸カルシウムおよび酢
酸カルシウムを含めたあらゆる水溶性カルシウム塩がカ
ルシウムイオン源として使用できる。通常0.05〜約0.4
ミリモル／リットルの少量のカルシウムイオンも、酵素
スラリーおよび処方水中のカルシウムのために組成物中
にしばしば存在している。固形洗剤組成物でも、処方物
は洗濯液中でこのような量を供給するために十分な量の
水溶性カルシウムイオン源を含有していてよい。代わり
に、天然水硬度でも十分である。

本組成物は場合により、但し好ましくは、シリケート
コーティングを含めた様々な追加安定剤、特にボレート
タイプ安定剤を含有してもよい。典型的には、このよう
な安定剤は（ホウ酸に基づき計算して）ホウ酸または組
成物中でホウ酸を形成できる他のボレート化合物につい
て組成物中約0.25〜約10重量％、好ましくは約0.5〜約
５％、更に好ましくは約0.75〜約３％のレベルで用いら
れる。ホウ酸が好ましいが、酸化ホウ素、ボラックスお
よび他のアルカリ金属ボレート（例えば、オルト、メタ
およびピロホウ酸ナトリウムと五ホウ酸ナトリウム）の
ような他の化合物も適切である。置換ホウ酸（例えば、
フェニルボロニン酸、ブタンボロニン酸およびｐ−ブロ
モフェニルボロニン酸）もホウ酸の代わりに使用でき
る。

（iii）洗浄界面活性剤 本発明で提供されるフル処方洗剤組成物中に含有され
る洗浄界面活性剤の量は、用いられる具体的界面活性剤
と望まれる効果に応じて、約１〜約99.8％である。好ま
しくは、洗浄界面活性剤は洗剤成分の約５〜約80重量％
である。

洗浄界面活性剤にはノニオン系、アニオン系、両性、
双極性、カチオン系がある。これら界面活性剤の混合物
も使用できる。好ましい洗剤組成物は、アニオン系界面
活性剤、またはアニオン系界面活性剤と他の界面活性
剤、特にノニオン系界面活性剤との混合物を含む。

ここで有用な界面活性剤の非制限例には慣用的なC₁₁
−C₁₈アルキルベンゼンスルホネート、一級、二級およ
びランダムアルキルサルフェート、C₁₀−C₁₈アルキルア
ルコキシサルフェート、C₁₀−C₁₈アルキルポリグリコシ
ドおよびそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、
C₁₂−C₁₈α−スルホン化脂肪酸エステル、C₁₂−C₁₈アル
キルおよびアルキルフェノールアルコキシレート（特
に、エトキシレートおよび混合エトキシ／プロポキ
シ）、C₁₂−C₁₈ベタインおよびスルホベタイン（“スル
タイン”）、C₁₀−C₁₈アミンオキシド、C₈−C₂₄サルコ
シネート（特に、オレオイルサルコシネート）などがあ
る。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲
載されている。

ここで特に有用な補助ノニオン系界面活性剤の１つの
具体的なクラスには下記式のポリヒドロキシ脂肪酸アミ
ドがある： 上記式中、R¹はＨ、C₁−C₈ヒドロカルビル、２−ヒド
ロキシエチル、２−ヒドロキシプロピルまたはそれらの
混合物、好ましくはC₁−C₄アルキル、更に好ましくはC₁
またはC₂アルキル、最も好ましくはC₁アルキル（即ちメ
チル）であり、R²はC₅−C₃₂ヒドロカルビル部分、好ま
しくは直鎖C₇−C₁₉アルキルまたはアルケニル、更に好
ましくは直鎖C₉−C₁₇アルキルまたはアルケニル、最も
好ましくは直鎖C₁₁−C₁₉アルキルまたはアルケニル、あ
るいはそれらの混合物であり、Ｚは直鎖ヒドロカルビル
鎖とその鎖に直接結合された少くとも２つ（グリセルア
ルデヒドの場合）または少くとも３つ（他の還元糖の場
合）のヒドロキシルあるいはそのアルコキシル化（好ま
しくはエトキシル化またはプロポキシル化）誘導体とを
有するポリヒドロキシヒドロカルビル部分である。Ｚは
好ましくは還元アミノ化反応で還元糖から誘導され、更
に好ましくはＺはグリシチル部分である。適切な還元糖
にはグリコール、フルクトース、マルトース、ラクトー
ス、ガラクトース、マンノースおよびキシロースとグリ
セルアルデヒドがある。原料として、高デキストロース
コーンシロップ、高フルクトースコーンシロップおよび
高マルトースコーンシロップと上記個別の糖が利用でき
る。これらのコーンシロップはＺについて糖成分の混合
物を与えることがある。他の適切な原料を決して排除す
るつもりはないことが理解されるべきである。Ｚは好ま
しくは−CH₂−（CHOH）_ｎ−CH₂OH、−CH（CH₂OH）−（C
HOH）_n-1−CH₂OH、−CH₂−（CHOH）_２（CHOR′）（CHO
H）−CH₂OHからなる群より選択され、ここでｎは１〜５
の整数であり、Ｒ′はＨまたは環状単糖または多糖およ
びそのアルコキシル化誘導体である。ｎが４であるグリ
シチル、特に−CH₂−（CHOH）_４−CH₂OHが最も好まし
い。

式（Ｉ）において、R¹は例えばＮ−メチル、Ｎ−エチ
ル、Ｎ−プロピル、Ｎ−イソプロピル、Ｎ−ブチル、Ｎ
−イソブチル、Ｎ−２−ヒドロキシエチルまたはＮ−２
−ヒドロキシプロピルである。最高起泡性のためには、
R¹は好ましくはメチルまたはヒドロキシアルキルであ
る。低い起泡性が望まれるならば、R¹は好ましくはC₂−
C₈アルキル、特にｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブ
チル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルおよび２−エチ
ルヘキシルである。

R²−CO−Ｎ＜には、例えばコカミド、ステアラミド、
オレアミド、ラウラミド、ミリストアミド、カプリカア
ミド、パルミトアミド、タロウアミドなどがある。

本発明で特に有用なノニオン系界面活性剤のもう１つ
のクラスは、５〜17、好ましくは６〜14、更に好ましく
は７〜12の範囲内の平均親水性−親油性バランス（HL
B）を有する界面活性剤を与えるような疎水性部分との
エチレンオキシドの縮合物である。疎水性（親油性）部
分は性質上脂肪族でもまたは芳香族でもよく、いずれか
特定の疎水基と縮合されるポリオキシエチレン基の長さ
は、親水性および疎水性要素間で望ましいバランス度を
有する水溶性化合物を生じるように容易に調整すること
ができる。

このタイプの特に好ましいノニオン系界面活性剤は、
アルコール１モル当たり３〜８モルのエチレンオキシド
を含むC₉−C₁₅一級アルコールエトキシレート、特にア
ルコール１モル当たり６〜８モルのエチレンオキシドを
含むC₁₄−C₁₅一級アルコール、アルコール１モル当たり
３〜５モルのエチレンオキシドを含むC₁₂−C₁₅一級アル
コールとそれらの混合物である。

（iv）洗浄ビルダー 本発明で用いられる任意洗剤成分には、ミネラル硬度
のコントロールを助ける無機および／または有機洗浄ビ
ルダーがある。用いられるならば、これらのビルダーは
洗剤組成物の約５〜約80重量％である。

無機洗浄ビルダーにはポリホスフェート（トリポリホ
スフェート、ピロホスフェートおよびガラス質ポリマー
メタホスフェートで例示される）、ホスホネート、フィ
チン酸、シリケート、カーボネート（ビカーボネートお
よびセスキカーボネートを含む）、サルフェートおよび
アルミノシリケートのアルカリ金属、アンモニウムおよ
びアルカノールアンモニウム塩があるが、それらに限定
されない。しかしながら、非ホスフェートビルダーも一
部の場所で要求される。

シリケートビルダーの例はアルカリ金属シリケート、
特に1.6:1〜3.2:1範囲のSiO₂:Na₂O比を有するものと、1
987年５月12日付でH.P.Rieckに発行された米国特許第4,
664,839号明細書で記載された、商標名“SKS"としてHoe
chstから市販される積層ナトリウムシリケートのような
積層シリケートであり、“SKS−6"が特に好ましい積層
シリケートビルダーである。

カーボネートビルダー、特に10m²/g以上の表面積を有
する微細炭酸カルシウムが、顆粒組成物で使用できる好
ましいビルダーである。このようなアルカリ金属カーボ
ネート洗剤の密度は、好ましくは４％以下の水分で450
〜850g/の範囲内である。

カーボネートビルダーの例は、1973年11月15日付で公
開されたドイツ特許出願第2,321,001号明細書で開示さ
れるようなアルカリ土類およびアルカリ金属カーボネー
トである。

アルミノシリケートビルダーは本発明で特に有用であ
る。好ましいアルミノシリケートは下記式を有するゼオ
ライトビルダーである： Na_z〔（Alo₂）_ｚ（SiO₂）_ｙ〕・xH₂O 上記式中ｚおよびｙは少くとも６の整数であり、ｚ対
ｙのモル比は1.0〜約0.5の範囲であり、ｘは約15〜約26
4の整数である。

有用なアルミノシリケートイオン交換物質は市販され
ている。これらのアルミノシリケートは構造上結晶でも
または非晶質でもよく、天然アルミノシリケートでもま
たは合成してもよい。アルミノシリケートイオン交換物
質の製造方法は、1976年10月12日付で発行されたKrumme
lらの米国特許第3,985,669号および1986年８月12日付で
発行されたCorkillらの米国特許第4,605,509号明細書で
開示されている。ここで有用な好ましい合成結晶アルミ
ノシリケートイオン交換物心はゼオライトＡ、ゼオライ
トＰ（Ｂ）（EPO384,070で開示されたものを含む）およ
びゼオライトＸという名称で市販されている。好ましく
は、アルミノシリケートは直径約0.1〜10ミクロンの粒
度を有する。

本発明の目的に適した有機洗浄ビルダーには様々なポ
リカルボキシレート化合物、例えば1964年４月７日付で
発行されたBergの米国特許第3,128,287号および1972年
１月18日付で発行されたLambertiらの米国特許第3,635,
830号明細書で開示されたようなオキシジサクシネート
を含めたエーテルポリカルボキシレートがあるが、それ
らに限定されない。更に1987年５月５日付でBushらに発
行された米国特許第4,663,071号の“TMS/TDS"ビルダー
参照。適切なエーテルポリカルボキシレートには、米国
特許第3,923,679号、第3,835,163号、第4,158,635号、
第4,120,874号および第4,102,903号で記載されたものの
ような環式化合物、特に脂環式化合物も含む。

他の有用な洗浄ビルダーにはエーテルヒドロキシポリ
カルボキシレート、無水マレイン酸とエチレンまたはビ
ニルメチルエーテルとのコポリマー、1,3,5−トリヒド
ロキシベンゼン−2,4,6−トリスルホン酸、カルボキシ
メチルオキシコハク酸と、エチレンジアミン四酢酸およ
びニトリロ三酢酸のようなポリ酢酸の様々なアルカリ金
属、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩と、メリッ
ト酸、コハク酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、
ベンゼン−1,3,5−トリカルボン酸、カルボキシメチル
オキシコハク酸およびそれらの可溶性塩のようなポリカ
ルボキシレートがある。

シトレートビルダー、例えばクエン酸およびその可溶
性塩（特にナトリウム塩）は、特にゼオライトおよび／
または積層シリケートビルダーと組合せて、顆粒組成物
でも使用できる、好ましいポリカルボキシレートであ
る。

本発明の洗剤組成物では、1986年１月28日付で発行さ
れたBushの米国特許第4,566,984号明細書で開示された
3,3−ジカルボキシ−４−オキサ−1,6−ヘキサンジオエ
ート類と関連化合物も適している。

リンベースビルダーが使用できる状況下、特に手洗い
操作で用いられる固形物の処方において、周知トリポリ
リン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウムおよびオルト
リン酸ナトリウムのような様々なアルカリ金属ホスフェ
ートが使用できる。エタン−１−ヒドロキシ−1,1−ジ
ホスホネートおよび他の公知ホスホネートのようなホス
ホネートビルダー（例えば、米国特許第3,159,581号、
3,213,030号、第3,422,021号、第3,400,148号および第
3,422,137号明細書参照）も使用できる。

（ｖ）任意の洗浄助剤 好ましい態様として、ここで用いられる慣用的洗剤成
分は洗浄界面活性剤および洗浄ビルダーのような典型的
洗剤組成物成分から選択することができる。場合によ
り、洗剤成分にはクリーニング性能、クリーニングされ
る物品の処理を助けるかまたは高めるために、あるいは
洗剤組成物の美観を変えるために、１種以上の他の洗浄
助剤または他の物質を含有することができる。洗剤組成
物の通常の洗剤助剤には、引用することにより本明細書
の開示の一部とされるBaskervilleらの米国特許第3,93
6,537号明細書で示された成分がある。本発明で用いら
れる洗剤組成物に使用上慣用的な業界確立レベル（通常
洗剤成分の０〜約20％、好ましくは約0.5〜約10％）で
含有させることができるこのような助剤には、カラース
ペクル（color speckle）、起泡増強剤、起泡抑制剤、
曇り防止および／または腐食防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ
放出剤、色素、フィラー、光学増白剤、殺菌剤、アルカ
リ性源、ヒドロトロピー剤、酸化防止剤、香料、溶媒、
溶解剤、土汚れ除去／再沈着防止剤、ポリマー分散剤、
加工助剤、布帛柔軟化成分（例えば、スメクタイト
土）、色素移動阻止剤（例えば、ポリビニルピロリド
ン）、静電気抑制剤などがある。

ブリーチ系は場合により、但し好ましくはブリーチを
分解する傾向がある重金属イオンを除去することでブリ
ーチ安定性を高めるだけでなく、茶汚れなどのようなポ
リフェノール系汚れの除去にも役立つキレート化剤も含
む。MonsantからDEQUESTとして市販されるアミノホスホ
ネート、ヒトリロトリアセテート、ヒドロキシエチルエ
チレンジアミントリアセテートなどを含めた様々なキレ
ート化剤がこのような使用にとり知られている。好まし
い生分解性無リンキレート化剤にはエチレンジアミンジ
サクシネート（“EDDS"、HartmanおよびPerkinsの米国
特許第4,704,233号明細書参照）、エチレンジアミン−
N,N′−ジグルタメート（EDDG）および２−ヒドロキシ
プロピレンジアミン−N,N′−ジサクシネート（HPDDS）
化合物がある。このようなキレート化剤は、それらのア
ルカリまたはアルカリ土類金属塩として、典型的には本
組成物の約0.1〜約10％のレベルで使用できる。

本発明組成物は、顆粒洗剤または洗濯固形物で典型的
にみられるような慣用的洗濯洗剤組成物として特に有用
である。1965年４月13日付で発行されたOkenfussの米国
特許第3,178,370号明細書は、固形洗濯洗剤としてそれ
らの製造方法について記載している。1980年９月23日付
で発行されたAndersonのフィリピン特許第13,778号明細
書は、合成洗剤洗濯固形物について記載している。様々
な押出し方法による固形洗濯洗剤の製造方法が当業界で
周知である。

下記例は本発明を更に説明するために示されており、
それを制限すると解釈されるべきでない。

例１ 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ C₁₂直鎖アルキルベンゼンスルホネート 22 ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして） 30 炭酸ナトリウム 14 ケイ酸ナトリウム ３ プロテアーゼ12 0.3 過炭酸ナトリウム ５ エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（EDDS） 0.4 硫酸ナトリウム 5.5 ノナノイルカプロラクタム ５ フィラー^＊および水 残部100％まで^＊ CaCO₃、タルク、土、シリケートなどのような好まし
い物質から選択できる 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラ
ッチャー（crutcher）混合物を調製し、スプレードライ
し、他の成分はそれらが表示された成分を示されたレベ
ルで含有するように混合する。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例２ 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ アニオン系アルキルサルフェート ７ ノニオン系界面活性剤 ５ ゼオライト（0.1〜10ミクロン） 10 クエン酸三ナトリウム ２ SKS−６シリケートビルダー 10 アクリレートマレエートポリマー ４ ノナノイルカプロラクタム ５ 過炭酸ナトリウム^＊ 15 炭酸ナトリウム ５ エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（EDDS） 0.4 起泡抑制剤 ２ プロテアーゼ12 0.3 リパーゼ 0.3 汚れ放出剤 0.2 微量成分、フィラー^＊＊および水 残部100％まで^＊ 400〜1200ミクロンの平均粒度^＊＊ CaCO₃、タルク、土、シリケートなどのような好ま
しい物質から選択できる 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラ
ッチャー混合物を調製し、スプレードライし、他の成分
はそれらが表示された成分を示されたレベルで含有する
ように混合する。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例３ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、
但し15％のベンゾイルカプロラクタム、ノナノイルカプ
ロラクタムおよび（６−ノナンアミドカプロイル）オキ
シベンゼンスルホネートの1:1:1混合物がノナノイルカ
プロラクタムに置き代わり、過炭素ナトリウムの量は30
％である。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例４ 洗剤組成物を例１の場合と同一の操作で製造するが、
但し20％のベンゾイルカプロラクタムおよび（６−ノナ
ンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの1:
1混合物がノナノイルカプロラクタムに置き代わり、過
炭酸ナトリウムの量は20％であり、ホスフェートの量は
０％である。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例５ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、
但し相当量のベンゾオキサジンタイプ活性剤をノナノイ
ルカプロラクタムの代わりに用いる。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例６ 洗剤組成物を例２の場合と同一の操作で製造するが、
但し10％のベンゾオキサジンタイプ活性剤およびテトラ
アセチルエチレンジアミンの1:1混合物がノナノイルカ
プロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの量は25
％である。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例７ 手洗い汚れ布帛用に適した洗濯固形物を標準押出しプ
ロセスにより製造し、以下を含有させる。成分 重量％ C₁₂直鎖アルキルベンゼンスルホネート 30 ホスフェート（トリポリリン酸ナトリウムとして） ７ 炭酸ナトリウム 25 ピロリン酸ナトリウム ７ ココナツモノエタノールアミド ２ ゼオライト（0.1〜10ミクロン） ５ カルボキシメチルセルロース 0.2 ポリアクリレート（m.w.1400） 0.2 （６−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホ
ネート ５ 過炭酸ナトリウム ５ 増白剤、香料 0.2 プロテアーゼ12 0.3^＊＊ リパーゼ 0.3 CaSO₄ １ MgSO₄ １ 水 ４ フィラー^＊ 残部100％まで^＊ CaCO₃、タルク、土、シリケートなどのような好まし
い物質から選択できる、^＊＊ 組成物ｇ当たりの活性酵素mgを表示している、 洗剤洗濯固形物を当業界で常用される慣用的石鹸また
は固形洗剤製造装置で処理する。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例８ 洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、
但し相当量のベンゾイルカプロラクタムを（６−ノナン
アミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの代わ
りに用いる。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例９ 洗剤組成物を例７の場合と同一の操作で製造するが、
但し相当量のノナノイルカプロラクタムを（６−ノナン
アミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネートの代わ
りに用いる。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例10 下記成分を含んだ顆粒洗剤組成物を製造する。成分 重量％ アニオン系アルキルサルフェート ７ ノニオン系界面活性剤 ５ ゼオライト（0.1〜10ミクロン） 10 クエン酸三ナトリウム ２ SKS−６シリケートビルダー 10 アクリレートマレエートポリマー ４ ノナノイルカプロラクタム ５ 過炭酸ナトリウム^＊ 15 炭酸ナトリウム ５ エチレンジアミンジサクシネートキレート化剤（EDDS） 0.4 起泡抑制剤 ２ プロテアーゼ12 0.5 汚れ放出剤 0.2 微量成分、フィラー^＊＊および水 残部100％まで^＊ 400〜1200ミクロンの平均粒度^＊＊ CaCO₃、タルク、土、シリケートなどのような好ま
しい物質から選択できる 洗剤組成物の熱およびアルカリ安定性成分の水性クラ
ッチャー混合物を調製し、スプレードライし、他の成分
はそれらが表示された成分を示されたレベルで含有する
ように混合する。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例11 洗剤組成物を例10の場合と同一の操作で製造するが、
但し相当量のベンゾイルカプロラクタムをノナノイルカ
プロラクタムの代わりに用いる。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例12 洗剤組成物を例10の場合と同一の操作で製造するが、
但し15重量％の（６−ノナンアミドカプロイル）オキシ
ベンゼンスルホネートがノナノイルカプロラクタムに置
き代わり、過炭酸ナトリウムの量は30％である。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例13 洗剤組成物を例10の場合と同一の操作で製造するが、
但し15重量％のベンゾオキサジンタイプ活性剤がノナノ
イルカプロラクタムに置き代わり、過炭酸ナトリウムの
量は30％である。

この例において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ＃
１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載された
本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同様
の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、この
例において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本発
明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。

例14 洗浄性能試験 本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、EMPA116
（コットン上に血液／ミルク／カーボンブラック）衣切
れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030）から汚れ
の除去を調べることにより評価する。

ギザギザ端のある３×４−1/2インチに切断された６
枚のEMPA116布切れを、水1000ml、硬度15gpg（Ca⁺⁺:Mg
⁺⁺3:1w:w）、洗剤7gおよび適宜に酵素を含有したモデル
7243S Terg−Ｏ−Tometer（United States Testing C
o.,Inc.,Hoboken,NJ）の各ポットに入れる。洗剤ベース
はwfk−Testgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13
07 62,D−47759 Krefeld,GermanyのWFK1洗剤である： 成分 最終処方の％ ゼオライトＡ 25％ 硫酸ナトリウム 25％ ソーダ灰 10％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネートン 8.8％ アルコールエトキシレート（７−8EO） 4.5％ ナトリウム石鹸 ３％ ケイ酸ナトリウム（SiO₂:Na₂O 3:3:1） ３％ このベース洗剤に下記添加を行う： 成分 最終処方の％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物 13％ コポリマー（Sokalan CP5） ４％ TAED（Mykon ATC Green） ３％ 酵素 0.5％ 増白剤（Tinopal AMS−GX） 0.2％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,
Ridgefield−Park,NJ 07660から得る。Sokalan CP5はBA
SF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。Mykon
ATC Green（TAED,テトラアセチルエチレンジアミン）は
Warwick International,Limited,Mostyn,Holywell,Clwy
d CH8 9HE,Englandから得る。Tinopal AMS GXはCiba−G
eigy Corporation,Greensboro,NC 27419から得る。

６枚のEMPA116布切れを60℃で30分間酵素入り洗剤で
洗浄し、その後各回毎に水1000mlで５分間にわたり２回
すすぎ洗いする。酵素を標準曲線では0.05〜1ppm、ルー
チン分析では0.25ppmの最終濃度で加える。布切れを乾
燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Met
er,Model CR−200（Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07
446）のＬ^＊ａ^＊ｂ^＊スケールでＬ値を用いて測定す
る。性能はB.Lentus（GG36）プロテアーゼの性能の％と
して報告し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変
種プロテアーゼの量でB.Lentus（GG36）プロテアーゼの
量を割り100を掛けることにより計算する。データは表V
IIで示される。 表VII 酵素 洗浄性能 B.Lentusズブチリシン 100 N76D 310 N76D/S103A 230 N76D/V104I 130 N76D/I107V 160 N76D/S99D/S101R 370 N76D/S99D/S103A 290 N76D/S101R/S103A 130 N76D/S101R/V104I 300 N76D/S103A/V104I 320 N76D/S103G/V104I 160 N76D/S103A/V104F 210 N76D/S103A/V104N 110 N76D/S103A/V104T 170 N76D/V104I/I107V 210 N76D/S99D/S101R/S103A 220 N76D/S99D/S101R/V104I 140 N76D/S101G/S103A/V104I 170 N76D/S101R/S103A/V104I 150 N76D/S103A/V104I/S105A 170 N76D/S103A/V104T/I107A 120 N76D/S103A/V104T/I107L 110 N76D/S103A/V104I/L126F 110 N76D/S103A/V104I/L128G 280 N76D/S103A/V104I/L135V 160 N76D/S103A/V104I/D197E 160 N76D/S103A/V104I/N204A 170 N76D/S103A/V104I/N204G 160 N76D/S103A/V104I/N204C 150 N76D/S103A/V104I/P210I 470 N76D/S103A/V104I/M222A 100 N76D/S103A/V104I/T260P 280 N76D/S103A/V104I/S265N 190

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｄ０６Ｌ 3/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ディジュリオ，デイビッド ニール アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、アップルシード、ドライブ、8769 (72)発明者 ゲティー，エドワード ユージン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、ローン、レイン、8940 (72)発明者 ウイリー，アラン デイビッド アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、セレスティアル、ストリート、1971 (72)発明者 ハーツホーン，リチャード チモシー イギリス国ニューキャッスル、アポン、 ザ、タイン、キングストン、パーク、ハ ーシャム、クローズ（番地なし) (72)発明者 ブロウド，フィリップ フレデリック ザ．サード アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、スクワイレルスネスト、レイン、 5780 (72)発明者 バーネット，ボビー リー アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、エルクウッド、ドライブ、12175 (72)発明者 ラビン，ドン ネルトン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、シード、ロード、8224 (56)参考文献 特表 平４−500385（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−505976（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500384（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502957（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C11D 3/386,3/395

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）前駆カルボニルヒドロラーゼから誘
   導された、有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、このプ
   ロテアーゼ酵素はN76D/S103A/V104Iズプチリシン変種で
   ある）、 （ｂ）有機ペルオキシ酸であるか、または組成物から形
   成される漂白溶液中その場で活性剤と反応して有機ペル
   オキシ酸を形成しうる過酸化水素を生じることができる
   ペルオキシゲン化合物とブリーチ活性剤との組合せであ
   る漂白剤、 および （ｃ）１種以上のクリーニング組成物物質 を含んでなることを特徴とする、漂白組成物。
2. 【請求項２】前記漂白剤が、 （ｉ）下記式の有機ペルオキシ酸： （上記式中R¹は約１〜約14の炭素原子を有するアルキ
   ル、アリールまたはアルカリール基であり、R²は約１〜
   約14の炭素原子を有するアルキレン、アリレンまたはア
   ルカリレン基であり、R⁵はＨあるいは約１〜約10の炭素
   原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基
   である）および （ii）組成物から形成される漂白溶液中その場で活性剤
   と反応して有機ペルオキシ酸を形成しうる過酸化水素を
   生じることができるペルオキシゲン化合物とブリーチ活
   性剤との組合せ（上記ブリーチ活性剤は下記一般式を有
   する： 上記式中Ｒは約５〜約18の炭素原子を有するアルキル基
   であって、カルボニル炭素を含めてそこから伸びる最長
   の直鎖アルキル鎖は約６〜約10の炭素原子を有し、Ｌは
   脱離基であり、その共役酸は約４〜約13の範囲内のpHを
   有する）からなる郡より選択されたものである、請求項
   １に記載の漂白剤組成物。
3. 【請求項３】（ａ）BaciHus lentusズブチリシンから誘
   導されるN76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であるプロ
   テアーゼ酵素約0.0001〜約10％ （ｂ）水性液中で過酸化水素を生じることができる少く
   とも約0.1重量％のペルオキシゲン漂白化合物と少くと
   も0.1重量％の１種以上のブリーチ活性剤からなる漂白
   系約0.5〜約20％〔上記ブリーチ活性剤が ｉ）下記一般式のブリーチ活性剤： またはそれらの混合物（上記式中R¹は約１〜約14の炭素
   原子を有するアルキル、アリールまたはアルカリール基
   であり、R²は約１〜約14の炭素原子を有するアルキレ
   ン、アリレンまたはアルカリレン基であり、R⁵はＨある
   いは約１〜約10の炭素原子を有するアルキル、アリール
   またはアルカリール基であり、Ｌは脱離基である） ii）下記式のベンゾオキサジンタイプブリーチ活性剤： （上記式中R₁はＨ、アルキル、アルカリール、アリー
   ル、アリールアルキルであり、R₂、R₃、R₄およびR₅は
   Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アリール、ヒド
   ロキシル、アルコキシル、アミノ、アルキルアミノ、−
   COOR₆（R₆はＨまたはアルキル基である）およびカルボ
   ニル官能基から選択される同一または異なる置換基であ
   る） iii）下記式のＮ−アシルカプロラクタムブリーチ活性
   剤： （R⁶はＨあるいは１〜12の炭素を有するアルキル、アリ
   ール、アルコキシアリールまたはアルカリール基であ
   る）と、 iv）ｉ）、ii）およびiii）の混合物と、 からなる群より選択されるものである〕と、 （ｃ）少くとも約５％の界面活性剤と、 （ｄ）少くとも約５％のビルダーと、そして （ｅ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、
   土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟
   剤、起泡増強剤、酵素安定剤、色素、香料およびそれら
   の混合物からなる群より選択される、１種以上のクリー
   ニング組成物物質と を含んでなる布帛クリーニング組成物。
4. 【請求項４】界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネー
   ト、一級アルキルサルフェート、二級アルキルサルフェ
   ート、アルキルアルコキシサルフェート、アルキルアル
   コキシカルボキシレート、アルキルポリグリコシドおよ
   びそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、α−ス
   ルホネート化脂肪酸エステル、アルキルおよびアルキル
   フェノールアルコキシレート、ベタインおよびスルホベ
   タイン、アミンオキシド、Ｎ−メチルグルカミド、ノニ
   オン系一級アルコールエトキシレート、ノニオン系一級
   アルコール混合エトキシ／プロポキシとそれらの混合物
   からなる群より選択され、更にビルダーがゼオライト、
   ポリカルボキシレート、積層シリケート、ホスフェート
   およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求
   項３に記載の布帛クリーニング組成物。
5. 【請求項５】上記布帛クリーニング組成物の少くとも約
   0,001重量％で、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパー
   ゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合
   物からなる郡より選択される少くとも１種の酵素を更に
   含んでなる、請求項４に記載の組成物。
6. 【請求項６】ブリーチ活性剤がベンゾイルカプロラクタ
   ム、ノナノイルカプロラクタム、（６−ノナンアミドカ
   プロイル）オキシベンゼンスルホネートおよびそれらの
   混合物からなる郡より選択される、請求項３に記載の組
   成物。
7. 【請求項７】ペルオキシゲン漂白化合物が過ホウ酸ナト
   リウム−水和物、過ホウ酸ナトリウム四水和物、ピロリ
   ン酸ナトリウムペルオキシ水和物、尿素ペルオキシ水和
   物、過炭酸ナトリウム、過酸化ナトリウムおよびそれら
   の混合物からなる郡より選択される、請求項３に記載の
   組成物。
8. 【請求項８】過酸化水素封ブリーチ活性剤のモル比が約
   1.0以上である、請求項７に記載の組成物。
9. 【請求項９】R¹が約６〜約12の炭素原子を有するアルキ
   ル基であり、R²が約１〜約８の炭素原子を有し、R⁵がＨ
   またはメチルである、請求項３に記載の組成物。
10. 【請求項１０】R¹が約７〜約10の炭素原子を有するアル
    キル基であり、R²が約４〜約５の炭素原子を有し、Ｌが （上記式中R³は約１〜約８の炭素原子を有するアルキル
    鎖であり、Ｙは−SO₃ ^-M⁺または−CO₂ ^-M⁺であり、ここで
    Ｍはナトリウムまたはカリウムである）からなる郡より
    選択される、請求項３に記載の組成物。
11. 【請求項１１】ベンゾイルカプロラクタム、オタタノイ
    ルカプロラクタム、ノナノイルカプロラクタム、3,5,5
    −トリメチルヘキサノイルカプロラクタム、デカノイル
    カプロラクタム、ウンデセノイルカプロラクタムおよび
    それらの混合物からなる郡より選択されるＮ−アシルカ
    プロラクタムを含んでなる、請求項３に記載の組成物。