CN1137288A

CN1137288A - 含有蛋白酶的漂白组合物

Info

Publication number: CN1137288A
Application number: CN94194467A
Authority: CN
Inventors: M·E·布尔恩斯; C·K·格霍什; D·N·迪基乌利奥; E·E·盖蒂; A·D·威尔利; R·T·哈特什欧尔恩; P·F·布洛德三世; B·L·巴尔奈特; D·N·卢宾赫
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1996-12-04
Anticipated expiration: 2014-10-13
Also published as: WO1995010592A1; BR9407833A; DE69432954D1; CN1317560A; DE69432954T2; HU219852B; EP0723580B1; JP3776245B2; CN1177921C; JPH09503818A; AU1253695A; CA2173106C; US5677272A; CN1088102C; ATE245185T1; JPH11246896A; CZ105296A3; JP4404836B2; HUT76538A; TW305878B

Abstract

本发明提供一种含有蛋白酶的漂白粉组合物，这种蛋白酶是一种含有天然界未发现过的氨基酸序列的羰基水解酶变体，它是通过用不同的氨基酸来置换许多前体羰基水解酶中的氨基酸残基而衍生出来的；这里所说的在前体羰基水解酶中被置换的许多氨基酸残基相应于位置+76结合一个或多个下列残基：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274。这里的数字编号位置相应于来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中天然存在的枯草溶菌素中的位置或者相应于在其它羰基水解酶或枯草溶菌素(诸如迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)枯草溶菌素)中等价的氨基酸残基；组合物中还含有一种漂白剂。

Description

含有蛋白酶的漂白组合物

本申请书是1993年10月14日提出的U.S.Application SerialNO.08/136,626和1994年5月2日提出的U.S.Application SerialNO.08/237,938的部分继续申请，该两项申请在此引入作为参考。

发明领域

本发明涉及漂白组合物，特别是洗衣洗涤剂，以及使用一种或多种属于羧基水解酶变种的蛋白酶和由一种或多种漂白剂，特别是漂白活化剂组成的漂白体系的方法。

发明背景

长期以来就已习惯于使用各种形式的酶于洗衣用的洗涤剂中，用来帮助从织物上除去某些污渍。这些污渍典型地是和脂类及蛋白质污垢结合在一起的。但是这些酶已经证明对其它类型的污垢和污渍没有什么效果。

长期以来也知道过氧化物漂白剂对于从织物上除去污渍和/或污垢是有效的，不过这类漂白剂的效果与温度有关。当洗衣液的温度在60℃时，过氧化物漂白剂只是部分有效，当洗衣液温度低于60℃时，过氧化物漂白剂就变成相对无效了。结果，已经进行了大量工业研究来发展有效的漂白体系。

通过本发明，已经发现把新的属于羧基水解酶变种的蛋白酶与漂白剂、特别是漂白活化剂结合起来，提供了有效地除去污渍和/或清洗脏物的益处。因此本发明的一个目的是提供一种漂白组合物，特别是洗衣洗涤剂组合物。它具有改进的除去污渍和/或清洗脏物的益处和/或清洗织物的益处和/或改进的漂白性质。

由以下详尽的说明，本发明的这些目的和其它目的将变得很明显。

背景技术

1987年1月6日授予Burns等人的美国专利4,634,551中公开了酰胺基过氧酸漂白化合物和它们的前体，它被应用于本发明中。也可参看1989年8月1日授予Burns等人的美国专利4,852,989。1991年12月3日授予Lagerwaard等人的美国专利5,069,809中公开了结合使用NOBS漂白活化剂和脂酶Lipolase的方法。也可参看1989年11月15日颁发给Lagerwaard等人的欧洲专利341,947，其中讨论了脂酶与一些漂白体系的配伍问题。1985年10月8日授予Sanderson的美国专利4,545,784中公开了把活化剂吸附在过硼酸钠一水合物上的方法。

发明概要

本发明在此提供漂白组合物，它含有：

(a)有效量的蛋白酶，它是一种含有天然界未发现过的氨基酸序列的羰基水解酶的变种，是通过用不同的氨基酸置换前体羰基水解酶的许多氨基酸残基而衍生出来的，其中所说的在前体酶中置换的氨基酸残基相应于位置+76与一种或多种下列残基的组合：+99、+101、+103、+104、+107、+123、 +27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，这些数字标明的位置相应于天然存在的由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus Emyloliquefaciens)析离的枯草溶菌素中的位置，或者其它羰基水解酶或枯草溶菌素(诸如迟缓芽孢杆菌(Bacillus fentus)的枯草溶菌素)中等价的氨基酸残基的位置；

(b)一种漂白剂，它或者是一种有机过氧酸，或者是一种漂白活化剂和一种过氧化物的结合物，后者产生能和活化剂反应的过氧化氢，并在由这种组合物形成的漂白溶液中就地形成一种有机过氧酸；

(c)一种或多种能与蛋白酶以及漂白剂配伍的洗涤剂组合物材料。

本发明也包括一种清洗织物的方法，它包括把所说的织物，最好是在搅拌条件下，与含有所说的漂白组合物的水溶液接触。这种方法可以在低于大约60℃的温度下进行，不过当然在直到沸腾的洗衣温度下也是很有效的。这种洗衣水溶液最好是含有至少大约300ppm的通常的洗涤剂组分，以及至少大约25ppm的漂白活化剂和至少大约25ppm的漂白化合物。最好是，所说的水溶液中含有大约900ppm至大约20,000ppm的通常的洗涤剂组分以及大约100ppm至大约25,000ppm的所说的漂白化合物以及大约100ppm至大约2,500ppm所说的漂白活化剂。

在该方法中所用的通常的洗涤剂组分包含大约1％至大约99.8％、最好是大约5％至大约80％的洗涤用表面活性剂。供选择地，洗涤组合物中也可含有大约5％至大约80％的一种洗涤增效剂。其它可供选择的洗涤组分也包括本发明提供的完全配制好的洗涤/漂白组合物。

除非特别说明，所有的百分数、比率和比例都是按重量计算的。所有引证的文献在此引入作为参考。

附图简述

图1A～C描绘的是解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的DNA和氨基酸序列以及这一基因的部分限制性基因图谱Seq.ID No.6)。

图2描绘的是由解淀粉芽孢杆菌(BPN＇)和迟缓芽孢杆菌(野生型)析离的枯草溶菌素中保存的氨基酸残基。

图3A和3B描绘的是四种枯草溶菌素的氨基酸序列。最上一行代表由解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(有时也称为枯草溶菌素BPN＇)析离的枯草溶菌素(Seq.ID No.7)的氨基酸序列。第二行描绘由枯草杆菌析离的枯草溶菌素的氨基酸序列(Seq.IDNo.8)。第三行描绘由地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)析离的氨基酸序列(Seq.ID No.9)。第四行描绘了由迟缓芽孢杆菌析离的枯草溶菌素的氨基酸序列(在PCT WO 89/06276中也被称为枯草溶菌素309)(Seq.ID No.10)。符号*表明与枯草溶菌素BPN′比较不存在这一特定的氨基酸残基。

图4描绘了质粒GGA 274的构造。

图5描绘了GGT 274的构造，它是为可靠表达用于本申请的质粒的一个中间体。

图6A和图6B描绘了由迟缓芽孢杆菌析离的枯草溶菌素的DNA和氨基酸序列(Seq.ID No.11)。成熟的枯草溶菌素蛋白质是在相应于Ala的密码子GCG(334～336)处开始通过密码子编码的。

图7A和7B描绘了本发明经优选的实施方案中的DNA和氨基酸序列(N 76D/S103A/V104I)(Seq.ID No.12)。这图中的DNA已用在位置76的天冬氨酸、在位置103的丙氨酸和在位置104的异亮氨酸编码时所描述的方法进行修饰。成熟的枯草溶菌素变种蛋白质是在相应于Ala的密码子GCG(334～336)处开始通过密码子编码的。

图8描绘了载体pBCDAICAT的构造。

图9描绘了载体pUCCATFNA的构造。

发明详述

用于本发明的漂白组合物提供了有力的高效的织物清洗剂，它可从织物上除去污渍和/或污垢。漂白体系和蛋白酶相结合对于从织物上除去大多数类型的污垢、包括蛋白质和脂类污垢、脏物以及重污垢负载，尤其是来自亲核的和身体的污垢，是特别有效的。

下面将详尽描述这里使用的蛋白酶、漂白剂(包括过氧酸和漂白体系)以及清洗组合物材料，包括它们经优选的使用浓度。(1)漂白剂

这里的漂白组合物含有一种漂白剂，它的含量最好是组合物的大约0.5至大约20％(重量)。漂白剂可以是一种基本不溶的、最好是固体的有机过氧酸，也可以是一种由漂白活化剂和过氧漂白化合物组成的能够产生过氧化氢的漂白体系；或者二者的结合。存在于组合物中的过酸，或者通过活化剂和过氧化合物的结合而形成的过酸，其相应的羧酸最好具有大约3至大约6.5的亲水性亲油性平衡值(“H.L.B”)。这样，一种能用来鉴定可用于本发明中的经优选的过氧酸的方法，即“H.L.B标度”，如Davies，J.T在Proc.2nd Internat.Conqr.Surface Activity 1.426，Butterworths，London(1957)中所描述的那样，在此引入作为参考。这样一种H.L.B标度(亲水性亲油性平衡值)已被用在表面活性剂的研究中，作为一种关连表面活性剂在亲水相(与水相似)和亲油相(与油相似)之间分布的方法。以这种方式，H.L.B值可被用来指示在洗涤液中活性漂白物种的亲油(憎水)特性(即，过氧酸从洗涤液中分离出来并富集在污垢/织物界面的能力)。

在下面表A中陈列的是为一些选择出来的过氧酸计算的H.L.B值(是过氧酸对应的羧酸的值)。用来计算H.L.B值的方程式可表示为：

H.L.B.值＝亲水基团数的总和-憎水基团数的总和+7

亲水基团数的数值为[-C(O)OH和-N(H)C(O)-＝2.1]，憎水基团数的数值为[脂肪/芳香碳＝0.475，极性基团之间的脂肪碳为1/2，烃链上的脂肪碳的值取(0.475)/2]。作为参照，＞7的H.L.B值指示这种材料将优先溶于水中，而H.L.B.值＜7则表明增加的表面活性和憎水性。

表A

各种过氧酸提供的H.L.B.值活化剂/预先缩写过酸相应羧酸的形成的过氧酸 H.L.B.值四乙酰基乙二胺 TAED CH₃C(O)OOH 8.6二过氧十二碳烷 DPDDA HOO(O)C(CH₂)₁₀- 6.5二羧酸 -C(O)OOH过氧丁二酸的 NAPSA CH₃(CH₂)₈N(H)C(O)- 6.4壬基酰胺 -(CH₂)₂C(O)OOH苯甲酰氧苯磺酸盐 BOBS C₆H₅C(O)OOH 6.3过氧己二酸的 NAPAA CH₃(CH₂)₈N(H)C(O)- 6.0壬基酰胺 -(CH₂)₄C(O)OOH壬酰氧苯磺酸盐 NOBS CH₃(CH₂)₇C(O)OOH 5.3癸酰氧苯磺酸盐 DOBS CH₃(CH₂)₈C(O)OOH 4.8过月桂酸 PLA CH₃(CH₂)₁₀C(O)OOH 3.9

像前面已经提到那样，对应本发明过氧酸的经优选的H.L.B值的范围(指相应羧酸的值)(无论是直接加入的还是就地产生的)是在大约3.0至大约6.5的范围。在本发明中有用的过氧酸的更优选的H.L.B.值(无论是直接加入还是就地产生)范围为大约4.0至6.5(指相应的羧酸)。本发明的过氧酸最优选的H.L.B.值范围(指相应的羧酸)(无论是直接加入还是就地产生)为大约4.0至6.0。(a)过酸

本发明包括洗涤剂组合物，它含有有效量的蛋白酶以及一种漂白体系，后者含有至少大约0.1％，优选地是大约0.1％至大约50％(重量)的一种基本上不溶解的有机过氧酸。这里使用的过氧酸的含量为组合物的大约0.5至大约20％、更优选是大约1至大约10％，最优选是大约2至大约7％(重量)。

优选的有机过氧酸可选自4-壬胺基-4-氧代-过氧丁酸；6-(壬胺基)-6-氧代过氧己酸；1，12-二过氧十二碳烷二羧酸；庚基磺酰基过丙酸；癸基磺酰基过丙酸；庚基-、辛基-、壬基-、癸基-磺酰基过丁酸；以及它们的混合物。

在有机过氧酸中，酰胺基过氧酸(酰胺基取代的过氧羧酸)是优选的。适合于在此使用的酰胺基过氧酸包括1987年1月6日和1987年8月11日授予Burns等人的美国专利4,634,551和4,686,063中所描述的那些，二者在此引入作为参考。合适的酰胺基过氧酸具有下列结构式：

其中R¹是一个含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基(优选地是R¹是含有大约6至大约12个碳原子的烷基)，R²是一个含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基(优选地是R²是含有大约1至大约6个碳原子的亚烷基)，R⁵是H或一个含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基(优选地R⁵是H)。更优选地是，R¹是含有大约8至大约10个碳原子的烷基，R²是含有大约2至大约4个碳原子的亚烷基。

过氧富马酸盐在这里也是适用的，它已被描述于1989年8月1日授予Burns等人的美国专利4,852,989中，在此引入作为参考；还有各自在1988年7月19日、1989年4月25日以及1991年4月2日都是授予Dryoff等人的美国专利4,758,369、4,824,591和5,004,558中描述的砜过氧酸(砜过氧羧酸)，也都在此引入作为参考。

美国专利4,686,063的实例1中包含NAPSA合成的说明，在第8栏第40行至第9栏第5行；还有NAPAA的合成说明，在第9栏第15行至第9栏第65行。在酰胺基过氧酸合成的末尾，反应用水淬灭、过滤、用水洗以除去某些过量的硫酸(或者其它在制造过氧酸时用的强酸)，并且再次过滤。

这样得到的酰胺基过氧酸湿滤饼可用pH值在大约3.5至6之间、优选地是大约4和5之间的磷酸缓冲溶液，按照1990年3月20日授予Sadlowski等人的美国专利4,909,953所述的方法处理，在此引入作为参考。

在把酰胺基过氧酸并入最终产物之前，还可往其中加入其它的供贮存稳定或控制放热的试剂。例如，硼酸，它是1987年8月11日授予Burns的美国专利4,686,063公开的一种控制放热剂并已在此引入，可以大约2∶1的过酸∶硼酸的比率与酰胺基过氧酸混合(过氧酸已经在磷酸缓冲液中洗过)。洗涤酰胺基过氧酸的磷酸缓冲液也可以和适量的吡啶二羧酸及焦磷酸四钠盐，一种螯合稳定系统进行混合。可供选择地是在与湿滤饼接触之前就把螯合剂包括在磷酸缓冲液中。

湿滤饼最好是由平均颗粒直径为大约0.1至大约260微米、优选地是大约10至大约100微米、最优选地是大约30至大约60微米的颗粒所组成。这里希望得到的是具有小颗粒大小的NAPAA结晶。可参看1991年10月8日授予Getty等人的美国专利5,055,218，在此引入作为参考。

这里的NAPAA滤饼最好是在磷酸缓冲液中洗两次。已经发现经过两次相继的磷酸缓冲液洗涤的NAPAA具有最佳的稳定性。

具有理论Avo(可获得的氧)值在大约3至大约12之间、更优选地是5至7之间的颗粒状(固体)有机过氧酸是优选的。

这里使用的最优选的过氧酸是NAPAA。过氧己二酸的壬基酰胺(“NAPAA”)的另一个名称是6-(壬氨基)-6-氧代过氧己酸。NAPAA的化学式为：NAPAA的分子量为287.4。

含有NAPAA的洗涤剂组合物和漂白组合物为纺织品提供了极为有力和有效的表面漂白作用。污渍和/或污垢被从纺织品上除去。这些组合物在由纺织品上除去脏物方面也是特别有效的。

NAPAA的极性酰胺或取代的酰胺部分导致这样的过氧酸，它具有很低的蒸气压因而具有很低的气味和很优良的漂白性能。相信是酰胺基的极性导致了过氧酸的蒸气压降低和熔点增高。

NAPAA可直接用作漂白剂。在用于洗涤衣物时，它具有降低了的蒸气压和良好的气味特性。

NAPAA可通过，例如，先使NAAA(己二酸的单壬基酰胺)、硫酸和过氧化氢进行反应。反应产物通过加入冰水淬灭后接着过滤、用蒸馏水洗涤，最后抽吸过滤以回收湿的滤饼。继续洗涤直到滤液的pH值为中性为止。

NAPAA pH值(10％的固体在水中)在大约4.2至4.8之间也是优选的。令人惊奇的是这一pH值导致对热更为稳定的颗粒。(b)漂白体系--漂白活化剂和过氧漂白化合物

(i)漂白活化剂

这里漂白体系中有用的漂白活化剂最好是具有以下结构：其中R是含有大约5至大约18个碳原子的烷基，其中由羰基碳原子延伸并包括这羰基碳原子的最长的线型烷基链含有大约6至大约10个碳原子，L是离去基团，它的共轭酸具有的pKa值范围在大约4至大约13之间，优选地是大约6至大约11之间，最优选地是大约8至大约11之间。

L基本上可以是任何一种合适的离去基团。离去基团是任何一个这样的基团，它通过过氢氧负离子对漂白活化剂的亲核进攻而从漂白活化剂中被置换出来。这一过氢氧根水解反应导致过羧酸的形成。一般，对于是合适的离去基团的一个基团，它必须发挥一种吸电子的效应。这一效应有助于过氢氧负离子的亲核进攻。

L基团对于在最佳时间构架内(例如，一次洗涤循环)所发生的反应，必须是有充分反应活性的。但是，L的反应性如果太强，则这种活化剂就难于使它稳定。这些特性一般地是和离去基团的共轭酸的pKa值平行的，虽然也已知有一些例外情形。

经优选的活化剂是那些具有下列通式的化合物：

其中R¹是含有大约6至大约12个碳原子的烷基，R²是含有1至大约6个碳原子的亚烷基，R⁵是H或含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，L可选自下列基团：

其中R⁶是含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基，R³是含有大约1至大约8个碳原子的烷基链，R⁴是H或R³，Y是H或一个加溶基。Y最好是选自-SO₃ ^-M⁺、-COO^-M⁺、-SO₄ ^-M⁺、(-N⁺R′₃)X^-和O←N(R′₃)，其中R′是含有大约1至大约4个碳原子的烷基链，M是一个阳离子，它给漂白活化剂提供溶解性，X是一个负离子，它也给漂白活化剂提供溶解性。最好是M是一种碱金属、铵或取代铵的阳离子，其中钠和钾是最优选的，X是选自卤化物、氢氧根、甲基硫酸根和醋酸根等负离子。更优选的是，Y是-SO₃ ^-M⁺和-COO^-M⁺。应该注意，带有不含加溶基团的离去基团的漂白活化剂应被很好地分散于漂白溶液中以便协助它们的溶解。优选的是：其中R³的定义与前相同，Y是-SO₃ ^-M⁺和-COO^-M⁺，其中M的定义与前相同。

特别优选的漂白活化剂是那些其中的R¹是含有大约6至大约12个碳原子的线型烷基链，R²是含有大约2至大约6个碳原子的线型亚烷基链，R⁵是H，并且L是选自：的化合物，其中R³的定义与前相同，Y是-SO₃ ^-M⁺或-COO^-M⁺，并且M的定义与前相同。

一种经优选的漂白活化剂是：

其中R是H、烷基、芳基或烷基芳基。这化合物已在Hodge等人的美国专利4,966,723中被描述过，在此引入作为参考。

经优选的漂白活化剂是：

其中R¹是H或含有大约1至大约6个碳原子的烷基，R²是含有大约1至大约6个碳原子的烷基，L的定义与前相同。

优选的漂白活化剂也可以是那些具有上述通式，其中L如通式中所定义的那样，R¹是H或是一个含有大约1至大约4个碳原子的烷基。

具有上述通式，其中L如通式中所定义的那样，并且R¹是H的化合物是甚至更为优选的漂白活化剂。

更优选的漂白活化剂是那些具有上述通式、其中R是一个含有大约5至大约9个碳原子的线型烷基链、最好是大约6至大约8个碳原子的线型烷基链，并且L是选自下列基团：

的化合物，其中R、R²、R³和Y的定义与前相同。

特别优选的漂白活化剂是那些具有上述通式、其中R是含有大约5至大约12个碳原子的烷基、其中由羰基的碳延伸并包括这羰基碳的烷基链的最长的线性部分含有大约6至大约10个碳原子，并且L是选自下列基团：

其中R²是一个含有大约1至大约8个碳原子的烷基链，并且Y是-SO₃ ^-M⁺或-COO^-M⁺，其中M是一种碱金属、铵或取代的铵阳离子。

特别优选的漂白活化剂是那些具有上述通式、其中R是含有大约5至大约9个碳原子、最好是含有大约6至大约8个碳原子的线型烷基链，并且L是选自下列基团：

的化合物，其中R²的定义与前相同并且Y是-SO₃ ^-M⁺或-COO^-M⁺，其中M的定义与前相同。

最优选的漂白活化剂具有通式：

其中R是含有大约5至大约9个碳原子、最好是大约6至大约8个碳原子的线型烷基链，并且M是钠或钾。

最好是，这里的漂白活化剂是壬酰基氧苯磺酸钠(NOBS)或苯甲酰氧苯磺酸钠(BOBS)。

用于本发明的进一步特别优选的漂白组合物是下面的漂白活化剂，它用于具有天然橡胶部件的机器是特别安全的。相信这是由于这些酰胺基酸衍生的漂白活化剂的过氢氧根水解反应不会产生油状二酰基过氧化物(DAP)物种，而是形成不溶性的结晶状固体DAP物种的结果。这些固体相信不会形成涂渍的膜从而使天然橡胶部件不会长时间暴露于DAP的侵蚀中。这些经优选的漂白活化剂是选自下列成员：

a)一种具有下列通式的漂白活化剂：

或它们的混合物，其中R¹是一个含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，R²是一个含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基，R⁵是H或一个含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，L是一个离去基团；

b)具有下列通式的苯并噁嗪型漂白活化剂：

其中R₁是H、烷基、烷基芳基、芳基、芳基烷基，并且其中R₂、R₃、R₄和R₅可以是相同或不同的取代基，各自选自H、卤素、烷基、烯基、芳基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、COOR₆(其中R₆是H或一个烷基)和羰基功能基；

c)具有下式的N-酰基己内酰胺漂白活化剂：其中R⁶是H或含有1至12个碳原子的烷基、芳基、烷氧基芳基或烷基芳基；

d)a)、b)和c)的混合物

经优选的类型a)的漂白活化剂是那些其中的R¹是含有大约6至大约12个碳原子的烷基，R²含有大约1至大约8个碳原子，并且R⁵是H或甲基的化合物，特别优选的漂白活化剂是那些上述通式中R¹是含有大约7至大约10个碳原子的烷基、R²含有大约4至大约5个碳原子的化合物。

经优选的类型b)的漂白活化剂是那些其中的R₂、R₃、R₄和R₅是H，并且R₁是苯基的化合物。

所说的类型c)的N-酰基己内酰胺漂白活化剂中优选的酰基部分具有化学式R⁶-CO-，其中R⁶是H或一个含有1至12个碳原子，最好是6至12个碳原子的烷基、芳基、烷氧基芳基或烷基芳基。在高度优选的实施方案中，R⁶是选自苯基、庚基、辛基、壬基、2，4，4-三甲基戊基、癸烯基以及它们的混合物。

酰胺基衍生的漂白活化剂--用于本发明的类型a)的漂白活化剂是具有下列通式的酰胺取代的化合物：

或它们的混合物，其中R¹、R²和R⁵的定义与前相同，L可以基本上是任意一种合适的离去基团。经优选的漂白活化剂是那些具有上述通式，其中R¹、R²和R⁵的定义与在过氧酸中的定义相同，L可选自下列基团：

以及它们的混合物，其中R¹是含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，R³是一个含有1至大约18个碳原子的烷基链，R⁴是H或R³，Y是H或一个加溶基团。

优选的加溶基团是-SO₃ ^-M⁺、-CO₂ ^-M⁺、-SO₄ ^-M⁺、-N⁺(R³)₄X^-和O←N(R³)₃，最优选的是-SO₃ ^-M⁺和-CO₂ ^-M⁺，其中R³是一个含有大约1至大约4个碳原子的烷基链，M是一个为漂白活化剂提供溶解性的阳离子，X是一个为漂白活化剂提供溶解性的阴离子。最好是，M是一种碱金属、铵或取代的铵阳离子，最优选的是钠和钾；X是卤化物、氢氧根、甲基硫酸根或醋酸根负离子。应该注意对于不含加溶基团的离去基团的漂白活化剂，应使其很好地分散于漂白溶液中以协助它们的溶解。

经优选的漂白活化剂是那些具有上述通式，并且L是选自下列基团：的化合物，其中R³的定义与前相同，并且Y是-SO₃ ^-M⁺或-CO₂ ^-M⁺，其中M的定义与前相同。

另一类重要的漂白活化剂，包括那些类型b)和类型c)的，可像在这里描述的那样，由于过氢氧根负离子对环上羰基碳的亲核进攻的结果，发生开环反应而提供有机过酸，例如，在类型c)的活化剂中这种开环反应涉及过氧化氢或它的负离子对己内酰胺环上羰基的进攻。因为酰基己内酰胺被过氧化氢或它的负离子的进攻优先发生在环外羰基上，因此为获得较多部分的开环产物可能需要一种催化剂。在类型b)活化剂中还可找到其它的开环漂白活化剂的实例，比如已在1990年10月30日授权的Hodge等人的美国专利4,966,723中所公开的那些。

苯并噁嗪类漂白活化剂--这类已被Hodge公开的活化剂化合物包括具有下式的苯并噁嗪类型化合物：

包括取代的苯并噁嗪类型：

其中R₁是H、烷基、烷基芳基、芳基、芳基烷基，并且其中R₂、R₃、R₄和R₅可以是相同或不同的取代基，各自可选自H、卤素、烷基、烯基、芳基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、COOR₆(其中R₆是H或烷基)和羰基官能基。

苯并噁嗪类型中经优选的一种活化剂是：

当使用这种活化剂时，为获得最佳表面漂白性能，洗涤溶液的pH值应在大约8.5和10.5之间，最好是在9.5至10.5之间，以便使过氢氧根水解反应容易进行。这样的pH值可用通常被称为缓冲剂的物质来获得，它是这里所用的漂白体系的可供选择的组分。

N-酰基-己内酰胺漂白活化剂--用于本发明的这种类型c)的N-酰基己内酰胺漂白活化剂具有下式：其中R⁶是H或含有1至12个碳原子的烷基、芳基、烷氧基芳基或烷基芳基。如上面已经提到的，R⁶部分含有至少大约6个、最好是6至大约12个碳原子的己内酰胺活化剂提供憎水的漂白作用，它提供亲核的和基底污垢的清洗作用。R⁶含有1至大约6个碳原子的己内酰胺活化剂提供亲水的漂白物种，它对于漂白饮料污渍是特别有效的。憎水性的和亲水性的己内酰胺类的混合物，其典型的重量比率为1∶5至5∶1，最好是1∶1，则可在此用来除去混合的污渍。

高度优选的N-酰基己内酰胺是选自苯甲酰基己内酰胺、辛酰基己内酰胺、壬酰基己内酰胺、3，5，5-三甲基己酰基己内酰胺、癸酰基己内酰胺、十一碳烯酰基己内酰胺以及它们的混合物。制备N-酰基己内酰胺的方法在专业内是众所周知的。

与美国专利4,545,784的说法相反，漂白活化剂最好是不要吸附在过氧漂白化合物上。因为这样做当存在其它有机洗涤组分时可能引起安全问题。

类型a)、b)或c)的漂白活化剂在漂白体系或洗涤剂组合物中的含量，按重量计应至少为0.1％，优选地是大约0.1％至大约50％，更优选地是大约1％至大约30％，最优选地是大约3％至大约25％。

这里使用的经优选的酰胺衍生的和己内酰胺漂白活化剂，也可以和橡胶安全剂、酶安全剂、亲水活化剂诸如TAED结合使用，酰胺衍生的或己内酰胺活化剂：TAED典型地重量比率在1∶5至5∶1的范围内，最好是大约1∶1。

一般而言，漂白机理，特别是表面漂白机理，还没有完全弄清楚。但是一般相信漂白活化剂遭受到过氢氧根负离子的亲核进攻，这负离子是过氧漂白涉及的过氧化氢所产生的，亲核进攻结果形成了过氧化羧酸。这一反应通常被称为过氢氧根水解。

当使用活化剂时，为获得最佳表面漂白性能，洗涤溶液的pH值应在大约8.5至10.5之间，最好是在9.5至10.5之间，以便使过氢氧根水解反应容易进行。这样的pH值可用通常被称为缓冲剂的物质来获得，它是这里所用的漂白体系的可供选择的组分。

(ii)过氧漂白化合物

这里使用的过氧漂白体系是那些在水溶液中能产生过氧化氢的化合物。这些化合物在本专业内是众所周知的，并且包括过氧化氢和碱金属过氧化物、有机过氧化物漂白化合物，诸如脲过氧化物、无机过氧盐漂白化合物，诸如碱金属过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐等。如果需要，也可以使用两种或多种这类漂白化合物的混合物。

优选的过氧漂白化合物包括过硼酸钠，市场上可买到的是它的一水、三水和四水合物的形式，焦磷酸钠过氧水合物、脲过氧水合物、过碳酸钠和过氧化钠，特别优选的是过硼酸钠四水合物、过硼酸钠一水合物和过碳酸钠。过碳酸钠是特别优选的，因为它在贮存过程中非常稳定，而且还能很快地溶解在漂白溶液中。相信这样迅速的溶解可导致形成高浓度的过羧酸，从而增强了表面漂白性能。

高度优选的过碳酸盐可以用它的未涂渍的或涂渍的形式。未涂渍的过碳酸盐的平均颗粒大小在大约400至大约1200微米范围内，最优选的是大约400至大约600微米范围内。如果使用涂渍过的过碳酸盐，则优选的涂渍材料包括碳酸盐和硫酸盐、硅酸盐、硼硅酸盐或脂肪羧酸的混合物。

过氧漂白化合物在漂白体系或洗涤剂组合物中的含量按重量计应至少为大约0.1％，优选地是大约1％至大约75％，更优选地是大约3％至大约40％，最优选地是大约3％至大约25％。

在漂白体系中漂白活化剂对过氧漂白化合物的重量比率典型地是在大约2∶1至1∶5的范围内，优选的比率范围为大约1∶1至大约1∶3。

由过氧漂白化合物产生的过氧化氢对漂白活化剂的摩尔比率应大于1.0，更优选地是大于大约1.5，最优选地是大约2.0至大约10。优选地是，这里的漂白组合物的含量为过氧漂白化合物的大约0.5至大约20％，更优选地是大约1至大约10％(重量)。

在这里漂白活化剂/漂白化合物体系本身被用作漂白剂。但是，这类漂白体系在含有各种洗涤辅剂诸如表面活性剂、增效剂等的组合物中使用时特别有用。(2)蛋白酶

本发明包括蛋白酶，它是天然界不存在的羰基水解酶变种，它和它的氨基酸序列与由之衍生的前体羰基水解酶相比，具有不同的解蛋白活度、稳定性、底物特异性、pH性能和/或品质特性。前体羰基水解酶可以是一种天然界存在的羰基水解酶或重组体水解酶。具体地说，这类羰基水解酶变种具有在天然界未发现过的氨基酸序列，它是用不同的氨基酸来置换前体羰基水解酶中的许多氨基酸残基而衍生出来的。这许多前体酶中的氨基酸残基相应于位置+76以及一种或多种下列残基的位置：+99、+101、+103、+104、+107、+123、 +27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，这里数字标示的位置相应于天然界存在的由解淀粉芽孢杆菌析离的枯草溶菌素中的位置或其它羰基水解酶或枯草溶菌素，诸如迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素中等价的氨基酸残基的位置。

用于本发明组合物中的羰基水解酶变种是一种蛋白酶，它包括置换+76位置的氨基酸残基并结合一种或多种别的修饰。最好是用于本发明的变种蛋白酶包括置换、删除或插入下列组合的氨基酸残基：76/99；6/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.最优选地是用于本发明的变种酶包括置换、删除或插入下列氨基酸残基的组合，即解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。

编码这类羰基水解酶或枯草溶菌素变种的变种DNA序列是由编码天然存在的或重组体前体酶的前体DNA序列所衍生的。这种变种DNA序列是通过修饰前体DNA序列来编码置换一种或多种特定的、被前体DNA序列编码的相应于解淀粉芽孢杆菌中下列位置的氨基酸残基或它们的组合而衍生出来的：76、99、101、103、104、107、123、27、105、109、126、128、135、156、166、195、197、204、206、210、216、217、218、222、260、265和/或274。虽然这里为修饰而鉴定的氨基酸残基是按照可应用于解淀粉芽孢杆菌(它已成为在所有枯草溶菌素中惯常使用的鉴定残基位置的方法)中的数码标志，但用于本发明的经优选的前体DNA序列是如图6所示的迟缓芽孢杆菌的DNA序列(Seq.ID No.11)。

这些变种DNA序列编码插入或取代氨基酸残基76并结合一种或多种另外的修饰。最好是变种DNA序列编码取代或插入下列组合的氨基酸残基：76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.最优选地是变种DNA序列编码修饰下列残基的组合：76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。这些重组体DNA序列编码具有新的氨基酸序列的羰基水解酶变种，并且一般至少有一种性质是和被前体羰基水解酶DNA序列编码的酶的同一性质有实质上的不同。这类性质包括解蛋白活度、底物专一性、稳定性、变化了的pH特性和/或增进的品质特性等。

这里有用的蛋白酶包括在指明的氨基酸残基位置上用天然存在的19种L-氨基酸中的任何一种进行置换的产物。这样的置换可以在任何前体枯草溶菌素(原核生物的、真核生物的、哺乳动物的等)中进行。贯穿整个本申请书都是用通常的一个和三个字母代号来表示各个氨基酸的。这样的代号已在Dale，J.W(1989)所著的“Molecular Genetics of Bacteria”(细菌的分子遗传学)一书的附录B中认定，John Wiley & Sons，Ltd.出版。

最好是，在每个认定的氨基酸残基位置上进行的置换包括但不仅限于：在位置76的置换包括D、H、E、G、F、K、P和N；在位置99的置换包括D、T、N、Q、G和S；在位置101的置换包括G、D、K、L、A、E、S和R；在位置103的置换包括Q、T、D、E、Y、K、G、R、S和A；在位置104的置换包括所有19种天然界存在的氨基酸；在位置107的置换包括V、L、M、Y、G、E、F、T、S、A、N和I；在位置123的置换包括N、T、I、G、A、C和S；在位置27的置换包括K、N、C、V和T；在位置105的置换包括A、D、G、R和N；在位置107的置换包括A、L、V、Y、G、F、T、S和A；在位置109的置换包括S、K、R、A、N和D；在位置126的置换包括A、F、I、V和G；在位置128的置换包括G、L和A；在位置135的置换包括A、F、I、S和V；在位置156的置换包括D、E、A、G、Q和K；在位置166的置换包括所有天然界存在的19种氨基酸；在位置195的置换包括E；在位置197的置换包括E；在位置204的置换包括A、G、C、S和D；在位置206的置换包括L、Y、N、D和E；在位置210的置换包括L、I、S、C和F；在位置216的置换包括V、E、T和K；在位置217的置换包括所有天然界存在的19种氨基酸；在位置218的置换包括S、A、G、T和V；在位置222的置换包括所有天然界存在的19种氨基酸；在位置260的置换包括P、N、G、A、S、C、K和D；在位置265的置换包括N、G、A、S、C、K、Y和H；在位置274的置换包括A和S。在每个这样的位置上被置换的特别优选的氨基酸被列出在下面的表1中。在表1中虽然指明了具体的氨基酸，但应该理解在认定的残基位置上任何一种氨基酸都可被置换。

表I氨基酸被置换/插入的残基经优选的氨基酸+76 D，H+99 D，T，N，G+101 R，G，D，K，L，A，E+103 A，Q，T，D，E，Y，K，G，R+104 I，Y，S，L，A，T，G，F，M，W，D，V，N+107 V，L，Y，G，F，T，S，A，N+123 S，T，I+27 K+105 A，D+109 S，K，R+126 A，I，V，F+128 G，L+135 I，A，S+156 E，D，Q+166 D，G，E，K，N，A，F，I，V，L+195 E+197 E+204 A，G，C+206 L+210 I，S，C+216 V+217 H，I，Y，C，A，G，F，S，N，E，K+218 S+222 A，Q，S，C，I，K+260 P，A，S，N，G+265 N，A，G，S+274 A，S

这些包含在迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素+76氨基酸残基位置上进行过活体外变更的蛋白酶产生出枯草溶菌素变种，它呈现出超过其前体枯草溶菌素的稳定性(例如，经改进的自解蛋白稳定性)(参见表IV和表VI)。

同样，在等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的残基位置上进行活体外的变更，无论单独地或相互结合并与+76位置的变更作任意组合，都会产生枯草溶菌素变种，它们呈现改变了的解蛋白活度、改变了的热稳定性、改变了的pH特性、改变了的底物专一性和/或改变了的品质特性。

羰基水解酶是能水解含有键的化合物的蛋白酶，式中的X是氧或氮。它们包括天然界存在的羰基水解酶以及羰基水解酶的重组体。天然界存在的羰基水解酶主要包括水解酶，例如肽水解酶诸如枯草溶菌素或金属蛋白酶。肽水解酶包括α-氨基酰基肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰基氨基水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、硫羟蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶。丝氨酸、金属、硫羟和羧酸蛋白酶以及内型和外型蛋白酶都被包括在内。

“重组体羰基水解酶”是指这样的羰基水解酶，其中编码天然存在的羰基水解酶的DNA序列被修饰以产生一种突变种DNA序列，它编码时在羰基水解酶氨基酸序列中进行置换、插入或删去一种或多种氨基酸。合适的修饰方法已在这里被公开，也已在美国专利4,760,025(RE 34,606)、美国专利5,204,015以及美国专利5,185,258中被公开，这些专利的公开内容在此引入作为参考。

枯草溶菌素是细菌或霉菌的羰基水解酶，它一般地作用是断裂蛋白质或多肽的肽键。像这里使用的那样，“枯草溶菌素”意指天然界存在的枯草溶菌素或一种重组体枯草溶菌素。已知有各种微生物物种能产生和常常分泌出一系列的天然存在的枯草溶菌素。这一系列中的成员的氨基酸序列不完全是同源的。但是，在这一系列中的枯草溶菌素呈现出相同或相似的解蛋白活度。这类丝氨酸蛋白酶共享有一种定义催化三单元组的共同的氨基酸序列，以此把它们与糜蛋白酶相关类别的丝氨酸蛋白酶相区别。枯草溶菌素和糜蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶二者都有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三单元组。在枯草溶菌素相关的蛋白酶中，这些氨基酸的相对次序，从氨基端读到羧基端是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。但是在糜蛋白酶相关的蛋白酶中，这种相对次序是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。这样，这里的枯草溶菌素是指一种具有枯草溶菌素相关的蛋白酶的催化三单元组的丝氨酸蛋白酶。实例包括但不限于这里的图3中所认定的那些枯草溶菌素。

“重组体枯草溶菌素”是指这样一种枯草溶菌素，其中编码这种枯草溶菌素的DNA系列被修饰以产生一种变种(或突变种)DNA系列，它编码时在天然存在的枯草溶菌素氨基酸序列中置换、删去或插入一种或多种氨基酸。产生这类修饰的合适的方法，并且它也可以和这里所公开的方法结合，已被包括在美国专利4,760,025(RE 34,606)、美国专利5,204,015和美国专利5,185,258的公开内容中。

“非人类羰基水解酶”以及对它们编码的DNA，可以由多种原核生物的和真核生物的生物体中得到。原核生物的生物体的合适的实例包括格兰氏阴性生物体诸如大肠杆菌(E.Coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)以及格兰氏阳性细菌诸如微球菌属(Micrococcus)或杆菌。真核生物的生物体，从中可以得到羰基水解酶和它们的基因，其实例包括酵母诸如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、霉菌诸如麴菌(Aspergillus sp.)，以及非人类哺乳动物来源诸如，例如，牛类(bovine sp.)，从中可得到编码羰基水解酶凝乳酶的基因。像用枯草溶菌素那样，从各种有关的物种中可得到一系列的羰基水解酶，这些物种在它们系列的成员之间含有的氨基酸序列不完全是同源的，但却无论如何呈现出相同或相似类型的生物活性。例如，这里使用的非人类的羰基水解酶具有一种功能定义，是专指直接或间接地与原核生物或真核生物源缔合的羰基水解酶。

一种“羰基水解酶变种”具有从“前体羰基水解酶”的氨基酸序列衍生的氨基酸序列。前体羰基水解酶(诸如一种枯草溶菌素)包括天然存在的羰基水解酶(枯草溶菌素)和重组体羰基水解酶(枯草溶菌素)。羰基水解酶变种的氨基酸序列是由前体水解酶的氨基酸序列通过置换、删去或插入一种或多种前体氨基酸序列中的氨基酸而“衍生”出来的。这样的修饰是对前体羰基水解酶(枯草溶菌素)的氨基酸序列编码的“前体DNA序列”进行的，而不是修改前体羰基水解酶(枯草溶菌素)的酶本身。这类修改前体DNA序列的合适的方法包括这里公开的方法以及本领域的技术人员熟知的方法(参看，例如，EPO 328299、WO 89/06279以及这作为参考的美国专利和申请书)。这里作为变更，认定了相应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的位置+76与一种或多种下列位置组合的具体残基：+99，+101，+103，+104，+107，+123，+27，+105，+109，+126，+128，+135，+156，+166，+195，+197，+204，+206，+210，+216，+217，+218，+222，+260，+265 and/or+274最好是修饰的残基是选自下列组合：76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222；最优选的组合是76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104；和76/101/104。这些氨基酸位置数码是指那些在图1中提供的指定给成熟的解淀粉芽孢杆菌的枯草溶菌素的序列。但用于本发明的蛋白酶并不仅限于这一特定的枯草溶菌素的变体，而是扩展为在“等价”于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中特别认定的残基位置上含有氨基酸残基的前体羰基水解酶。最好是，前体枯草溶菌素是迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素，并且在迟缓芽孢杆菌中相应于上面列出的等价的氨基酸残基位置上进行置换、删去或插入。

前体羰基水解酶的一个残基(氨基酸)等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的一个残基，如果它对于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中那个具体的残基或残基的部分是同系的(即在一级或三级结构中有位置的对应性)或类似的(即具有相同或相似的对于结合、反应或化学相互作用等的功能能力)。

为确立对一级结构的同系性，前体羰基水解酶的氨基酸序列被直接与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的一级序列以及特别是一系列已知是枯草溶菌素中不变更的残基进行比较，这些不变更的残基的序列是已知的。这里的图2显示了解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素和迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素之间保存的残基。在校准保存的残基并允许进行必要的插入和删去以维持顺序之后(即避免保存的残基经由任意的删去和插入而消除)，即定义了等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的一级序列中特定的氨基酸残基。保存的残基的校准最好应保存100％的这类残基。但是大于75％或甚至少至50％的保存残基的校准也适宜于定义等价残基。应坚持保存催化三单元组Asp32/His64/Ser221。

例如，在图3中校准了来自解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素的氨基酸序列，以提供氨基酸序列之间最大量的同系现象。比较这些序列显示在每种序列中都含有一些保存的残基。这些保存的残基(如BPN′和迟缓芽孢杆菌之间)已在图2中被认定。

这样，这些保存的残基即可被用来定义在别的羰基水解酶诸如来自迟缓芽孢杆菌(1989年7月13日发布的PCT Publication No.WO 89/06279)的枯草溶菌素中相应的等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的氨基酸残基，这里经优选的枯草溶菌素前体酶，或称作pB92(EP O 328299)的枯草溶菌素，是和优选的迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素高度同系的。这些枯草溶菌素中有一些的氨基酸序列在图3A和3B中与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的序列校准，以产生保存的残基的最大同系现象。像能看到的那样，与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素比较，迟缓芽孢杆菌的序列中有一些删去。这样，例如，对于在解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的Val 165等价氨基酸，在别的枯草溶菌素如迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的就是异亮氨酸了。

这样，例如，解淀粉芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌两种枯草溶菌素+76号氨基酸位置上的是天冬酰胺(N)。但是在用于本发明的经优选的枯草溶菌素变种中，等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中+76号位置的氨基酸则被天冬氨酸置换。为说明的目的，所有这里为置换认定的氨基酸残基与为每个这类位置进行经优选的置换的比较被列于表II中。

表II

+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123杆菌 N D S Q Y I N(野生型)迟缓芽孢杆菌 N S S S V I N(野生型)最优选的置换 D D R A I/Y V S

等价残基也可以在三级结构的水平上通过为其三级结构已被X射线晶体衍射法测定的前体羰基水解酶测定同系物来定义。等价残基被定义为那些经校准后前体羰基水解酶和解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子(在N上的N、CA上的CA、C上的C和O上的O)的原子坐标已在0.13纳米之内、最好是在0.1纳米之内的残基。在最好的模型被定向、并且定位给出研究中的羰基水解酶与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠后，校准即告完成。最好的模型是在可获得的最高分辨率时实验衍射数据给出最低R因子的晶体模型。

其功能类似于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的特定残基的等价残基，被定义为前体羰基水解酶的那些氨基酸，它可采取这样一种构象，使它们或者能改变、修饰或起作用于蛋白质的结构，底物结合，或者以一定的方式催化并归因于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的一种特定的残基。进一步，它们是前体羰基水解酶(其三级结构已被X射线晶体衍射法测定)的那些残基，它占据一个类似的位置到这种程度，使得虽然给定的残基可能并不满足基于占据同系的位置时等价性的标准，但至少有两个残基的侧链原子的原子坐标是位于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素相应的侧链原子的0.13纳米以内。解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的三维结构的坐标已陈列于EPOPublication No.0251446中(等价于美国专利申请SN08/212,291，它的公开内容在此引入作为参考)，并可用来作为上述略图，用来在三级结构的水平上测定等价残基。

有一些为置换、插入或删去而认定的残基是保存的残基，而另外一些则不是。在残基不属于保存残基的情况下，一种或多种氨基酸的置换仅限于这样的置换，即它产生的变种具有与在天然界中发现的不相对应的氨基酸序列。在是保存残基的情况下，这样的置换不应导致一种天然存在的序列。用于本发明的羰基水解酶变种包括羰基水解酶变种的成熟的形式，也包括这类水解酶变种的原型或预原型。预原型是优选的构造，因为它能使羰基水解酶变种的表达、分泌和熟化变得容易。

“原序列”是指连接在羰基水解酶成熟形式的N端部分的氨基酸序列，当除去它时导致出现羰基水解酶的“成熟”形式。许多在天然界发现的蛋白酶是转移酶原的产物，并且在不存在后转移过程时即以这种形式被表达。为生产羰基水解酶变种，具体地说枯草溶菌素变种的一种经优选的原序列是解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的推定的原序列，虽然其它枯草溶菌素的原序列也可被使用。在实例中，是使用从迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)中得到的枯草溶菌素的推定的原序列。

一种“讯号序列”或“预序列”是指连接在羰基水解酶的N-端部分或原水解酶的N-端部分的任何氨基酸序列，它可能参与水解酶的成熟形式或原型的分泌。讯号序列的这种定义是功能性的，意谓包括所有那些被枯草溶菌素基因的N-端部分或别的在自然条件下参与使枯草溶菌素或别的羰基水解酶奏效的可分泌的羰基水解酶编码的氨基酸序列。用于本发明的蛋白酶利用这样的序列如这里叙述的那样来影响羰基水解酶变种的分泌。在实例中使用的一种经优选的讯号序列包括熔合到从迟缓芽孢杆菌得到的枯草溶菌素(ATCC 21536)讯号序列的其余部分中的解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素讯号序列的头七个氨基酸残基。

一种“预原型”的羰基水解酶变种是由可用来连接在水解酶氨基末端的具有原序列的水解酶的成熟形式以及一种可用来连接在原序列的氨基末端的“预”或“讯号”序列所组成的。

“表达载体”是指含有一个可用来连接在合适的控制序列上的DNA序列的DNA构造，这控制序列能在一种合适的宿主中影响所说的DNA的表达。这样的控制序列包括一种影响转录的始发基因、一种供选择的操纵序列用来控制这类转录、一种用来编码合适的mRNA核蛋白体连接位置的序列和控制转录和转译的终止的序列。这种载体可以是一种质粒、一种噬菌体粒子或简单地就是一种潜在的基因插入物。一旦转移进适当的宿主中，这种载体就可复制并独立地行使宿主基因的功能，或者在某些情况下可以联合到基因本身中去。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时被交替使用，因为质粒是目前最常使用的载体形式。但是，这里也包括这类表达载体的其它形式，它起着等价的功能并在本专业中是已知的或将成为已知的。

用于本发明的“宿主细胞”一般是原核生物或真核生物宿主，它们最好是用在美国专利4,760,025(RE 34,606)中公开的方法处理过，以使它们不能分泌酶活性的内切蛋白酶。一种经优选的为表达枯草溶菌素的宿主细胞是杆菌菌株BG 2036，它缺乏酶活性的中性蛋白酶和碱性蛋白酶(枯草溶菌素)。菌株BG 2036的构造以被美国专利5,264,366详尽描述过。别的为表达枯草溶菌素的宿主细胞包括枯草杆菌I168(也已在美国专利4,760,025(RE34,606)和美国专利5,264,366中被描述过，它的公开内容在此引入作为参考)，以及任何合适的杆菌菌株诸如地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌等。

宿主细胞可用重组体DNA技术构成的载体来进行转化或转染。这类转化的宿主细胞既能复制编码羰基水解酶的载体，也能表达所需的羰基水解酶变种。在编码羰基水解酶变种的预型或预原型的情况下，这类变种当被表达时即典型地被从宿主细胞分泌到宿主细胞介质中去。

在描述两种DNA区域之间关系时所用的术语“可用来连接的”简单地意指它们在功能方面是彼此相关的。例如，一种预序列可用来连接到一种多肽上，如果它的功能是作为讯号序列，参与最可能涉及讯号序列断裂的蛋白质的成熟形式的分泌。一种始发基因可用来连接到编码序列上，如果它控制序列的转录；一种核蛋白体连接位置可用来连接到编码序列上，如果它这样定位可允许进行转译。

编码天然界存在的前体羰基水解酶的基因可以按照本领域的技术人员众所周知的一般方法来得到。这种方法一般包括合成具有编码感兴趣的水解酶区域的推定序列的标记探头、由表达这种水解酶的生物体中制备基因库，并通过杂交到探头上从库中筛选出感兴趣的基因。阳性杂交克隆然后被绘图并序列化。用于实例中的迟缓芽孢杆菌基因可按美国专利5,185,258的实例1中所描述的方法克隆化，它的公开内容在此引入作为参考。用于实例中的BPN基因可按RE 34,606中实例1中所描述的方法克隆化，它的公开内容在此引入作为参考。

克隆化的羰基水解酶然后被用来转化宿主细胞以用来表达水解酶。水解酶基因然后被连接进高拷贝数质粒中。这种质粒在宿主中在下述意义上复制，即它含有众所周知的为质粒复制所必需的要素：一种可连接到研究中的基因上的始发基因(它可以基因本身的同系始发基因来提供，如果它被宿主识别，即被转录的话)、一个转录终止和多聚腺苷酸化区域(是为稳定由来自某些真核生物宿主细胞中的水解酶基因的宿主转录的MRNA所必需的)、它是外源的或者可被水解酶基因的内源终止区域提供，合乎需要的是，一种选择基因诸如一种耐受抗菌素的基因，它通过在含有抗菌素的介质中生长使被质粒感染的宿主细胞得以连续培养维持。高拷贝数的质粒也含有一种为宿主的复制来源，通过它能使大量质粒得以在细胞质中产生而没有染色体的限制。但是，在本发明的范围内也包括把水解酶基因联合多次拷贝到宿主基因组中去。这可通过用对同系重组特别敏感的原核生物和真核生物的生物体而变得容易。

用于本发明实例中的基因是天然的迟缓芽孢杆菌基因和天然的解淀粉芽孢杆菌基因。另外，一种合成的编码天然存在的或突变体的前体羰基水解酶(枯草溶菌素)的基因也可被产生。在这样一种方法中，前体水解酶(枯草溶菌素)的DNA和/或氨基酸序列被测定。此后多次、重叠的合成单股DNA片段即被合成出来，它经杂交和连接作用而产生一种编码前体水解酶的合成DNA。合成基因构造的一个实例被发表于美国专利5,204,015的实例3中，它的公开内容在此引入作为参考。

一旦天然界存在的或合成的前体羰基水解酶基因被克隆化，即可进行一些修饰来增强超出合成天然界存在的前体羰基水解酶范围以外的应用。这类修饰包括生产重组体羰基水解酶，如美国专利4,760,025(RE 34,606)和EPO Publication No.0251446所公开的内容以及这里描述的生产羰基水解酶变种。

下列盒式突变方法可用来使得用于本发明的羰基水解酶变种的构造和鉴定变得容易，虽然也可使用其它包括位置定向诱变的方法。首先，天然存在的编码这种水解酶的基因被获得并进行全部或部分地序列化。然后，序列在想要进行变更(删去、插入或置换)已编码的酶中一种或多种氨基酸的一点上被校验。评估位于这一点侧面的序列，看是否存在用一个低聚核苷酸池置换一个短的基因片段的限制性位点，该低聚核苷酸池当被表达后将编码各种突变体。这样的限制性位点最好是在水解酶基因中的独一无二的位置，以使基因片段的置换变得容易。但是，任何在水解酶基因中的不是过分冗长的方便的限制性位点都可以使用，只要是通过限制消化产生的基因碎片能被重新装配在适当的序列中。如果在选择的位点的方便距离内(10至15个核苷酸)不存在限制性位点，可在基因中以这样的方式通过置换核苷酸来产生这样的位点，即在最终的构造中既没有读码的改变，也没有编码氨基酸的改变。为改变它的序列以适合所需要的序列进行的基因改变可按照一般已知的方法通过M13引物延伸来完成。确定合适的侧面区域位置以及评估得出两个方便的限制性位点序列所需要的变更的工作，可通过遗传密码的过剩、基因的限制酶略图以及大量不同的限制酶而成为例行的常规工作。注意如果能获得方便的位于限制性位点侧面的位点，则上述方法只需要用来与不含一个位点的侧面区域相连接。

一旦天然存在的DNA或合成的DNA被克隆化，位于要被变更的位置侧面的限制性位点即用关连限制酶消化，许多末端端基互补的低聚核苷酸盒带即被连接到基因中。诱变作用通过这种方法而被简化，因为所有的低聚核苷酸都可这样来合成使具有同样的限制性位点，并且不必用合成的连接来造成这种限制性位点。

如这里使用的，解蛋白活度被定义为每毫克活性酶中肽键的水解速率。已存在许多众所周知的实验程序可用来测量解蛋白活度(参见K.M.Kalisz“Microbial Proteinase”，Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988)(“微生物蛋白酶，高等生物化学工程/生物技术”，A.Fiechter出版，1988)。除了解蛋白活度以外，或者作为一种替代物来修饰解蛋白活度，本发明的变种酶还可以有其它的经修饰的特性诸如Km、Kcat、Kcat/Km比率和/或经修饰的底物专一性和/或经修饰的pH活性特性。这些酶可以为预期存在的特定的底物而进行剪裁，例如，为诸如洗衣用的水解过程中的底物。

一个目标是保证得到一种与前体羰基水解酶比较具有改变了的解蛋白活度的变种羰基水解酶，因为这种活度的增加(数值增大)能更有效地使酶作用于目标底物上。同样感兴趣的是与前体比较，具有改变了的热稳定性和/或改变了的底物专一性的变种酶。最好是被变更的羰基水解酶是一种枯草溶菌素。在枯草溶菌素类型的羰基水解酶中用来得到这样的结果的具体氨基酸位置，等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，或者它们的任意组合，这些氨基酸在实例中提供。在一些场合中，可能需要较低的解蛋白活度。相反，在另一些场合中则可能需要变种酶的解蛋白活度比它的前体更高。另外，还可能期望增加或降低(改变)变种的无论是对碱还是对热的稳定性。在Kcat、Km或Kcat/Km值方面的增加或降低对于用来测定这些动力学参数的底物是专一性的。

同样，已经测定，在枯草溶菌素中等价于+76位置并结合一些其它位置的修饰，对于调制酶的整体稳定性和/或解蛋白活度是重要的。例如，像在实例中说明的那样，在经优选的蛋白酶中，在迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的等价于+76的位置上天冬酰胺(N)可用天冬氨酸(D)置换，并结合修饰一种或多种下列氨基酸残基：+99、 +101、+103、+104、+107、+123、+27、 +105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，以便在得到的变种酶中产生增进了的稳定性和/或增进的活性。

用于本发明的最优选的蛋白酶已在实例中被陈述。这些包括以下特定的置换残基的组合：N76D/S99D；N76D/V104I；N76D/S99D/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V以及N76D/S101R/S103A/V104I。这些置换最好是在迟缓芽孢杆菌(重组体或天然的)枯草溶菌素中进行，虽然置换也可以在任何一种杆菌的枯草溶菌素中进行。

基于用这种和其它变种枯草溶菌素得到的结果，可明显看出解淀粉芽孢杆菌羰基水解酶中等价于位置+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274上的残基对于这些酶的解蛋白活度、品质和/或稳定性以及这类变种酶的清洗或洗涤品质是重要的。

下面通过实例来提供来提供用于本发明组合物中的蛋白酶的制造方法。

蛋白酶制造实例

为枯草杆菌中GG36基因表达的构造

克隆化和为来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素基因表达的构造，基本上和美国专利5,185,258中描述的相同。质粒GGA274(描述于这里的图4中)进一步用如图5所示的方式进行修饰。在构造GGA274质粒过程中引入的Pstl位点通过下面将会描述的低聚核苷酸定向诱变的方法，用一种含有下列序列：5′GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3′(Seq.ID No.1)的低聚核苷酸除去。下面画有一横线的“A”残基消除限制酶Pstl的认别序列，并在位置274上把相应的氨基酸从丙氨酸改变成苏氨酸。在位置274上的苏氨酸是原来发现在克隆化的迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素基因中的野生型残基。编码枯草溶菌素的DNA片段被EcoRI和BamHI消化产物从质粒GGA274或它的衍生物(GGT274被表示在图5中)上切除。这DNA碎片再被半克隆化回到用作诱变的基于噬菌体M13的载体，诸如MP19中。诱变之后，EcoRI和HindIII消化产物，在克隆化之后，即履行工作移动变更过的枯草溶菌素基因回到表达质粒诸如GGA274中，以便表达和回收变更过的枯草溶菌素蛋白质。

低聚核苷酸定向的诱变

低聚核苷酸定向诱变是按Zoller，M.等人在(1983)MethodsEnzymol.，100：468～500中描述的方法来进行的。作为一个实例，一种合成的具有5′GCTGCTCTAGACAATTCG 3′(Seq.IDNo.2)序列的低聚核苷酸被用来改变位置76的氨基酸残基，使它从天冬酰胺(N)变为天冬氨酸(D)，或N76D。下方画横线的“G”和“C”残基指示由野生型基因序列发生的变化。CA使亮氨酸保留在位置+75上并改变这种氨基酸序列来引入一个xbal限制酶(TCTAGA)的xbal识别位点，同时在GAC处的改变把在+76位置上的天冬酰胺变成天冬氨酸。

为了在位置99、101、103和104处进行诱变，可依照所需变更的结合来使用不同的低聚核苷酸。例如，具有序列为5′GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3′(Seq.ID No.3)的一种低聚核苷酸被用来同时在一个单一的枯草溶菌素分子中进行下列改变：S99D；S101R；S103A和V104I。相似地，一种序列为5′TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3′(Seq.IDNo.4)的低聚核苷酸和一种序列为5′CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3′(Seq.ID No.5)的低聚核苷酸被分别用来产生I107V和N123S。同样，画横线的残基指示由野生型序列发生的变化，它可产生所期望的或者是氨基酸序列的变化、或者是限制酶识别序列的变化。

枯草溶菌素变种的解蛋白活度

按照前述低聚核苷酸定向诱变的方法，制造了列在表III上的变种。每一种这样的枯草溶菌素变种的解蛋白活度也列在表III上。用P.Bonneau等人(1991)在J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，No.3，P1030所述的方法测量合成的多肽底物丁二酰基-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰对硝基苯胺水解的动力学参数Kcat、Km和Kcat/Km。简而言之，把枯草溶菌素储备溶液的小的等分溶液，加到含有溶解在pH值为8.6的0.1M Tris-HCl缓冲液中的底物的1厘米小池中，并恒温在25℃。反应进程用分光光度法跟踪，即监测在410纳米处反应产物对硝基苯胺的吸光度。通过一种非线性回归算法使每种反应的反应速率和产物浓度符合Michaelis-Menten方程，来得到动力学参数。

表III

测量迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素和变种的

动力学参数Kcat、Km和Kcat/Km蛋白酶^# 酶变种 Kcat(s^-1) K_M(M) K_cat/K_M

(s^-1M^-1)- B.Ientus Subtilisin 170 0.00078 2.18×10⁵- N76D 219 0.0008 2.74×10⁵1 N76D/S99D 88 0.00061 1.44×10⁵2 N76D/S101R 371 0.0013 2.85×10⁵3 N76D/S103A 400 0.0014 2.86×10⁵4 N76D/V104I 459 0.0011 4.17×10⁵5 N76D/I107V 219 0.0011 1.99×10⁵6 N76D/N123S 115 0.0018 6.40×10⁴7 N76D/S99D/S101R 146 0.00038 3.84×10⁵8 N76D/S99D/S103A 157 0.0012 1.31×10⁵9 N76D/S99D/V104I 247 0.00097 2.55×10⁵10 N76D/S101R/S103A 405 0.00069 5.90×10⁵11 N76D/S101R/V104I 540 0.00049 1.10×10⁶12 N76D/S103A/V104I 832 0.0016 5.20×10⁵13 N76D/V104I/I107V 497 0.00045 1.10×10⁶14 N76D/V104Y/I107V 330 0.00017 1.90×10⁶15 N76D/V104I/N123S 251 0.0026 9.65×10⁴16 N76D/I107V/N123S 147 0.0035 4.20×10⁴17 N76D/S99D/S101R/S103A 242 0.00074 3.27×10⁵18 N76D/S99D/S101R/V104I 403 0.00072 5.60×10⁵19 N76D/S99D/S103A/V104I 420 0.0016 2.62×10⁵20 N76D/S101R/S103A/V104I 731 0.00065 1.12×10⁶21 N76D/S103A/V104I/N123S 321 0.0026 1.23×10⁵22 N76D/V104I/I107V/N123S 231 0.003 7.70×10⁴23 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0.00098 6.37×10⁵24 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0.0043 4.51×10⁴25 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 311 0.0023 1.35×10⁵

表III的结果说明，所有试验的枯草溶菌素变种保持着解蛋白活度。进一步，对数据的详尽分析表明，通过在等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的76、99、101、103、104、107和123这些氨基酸残基位置上进行各种置换的组合，可以有意义地改变迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的解蛋白活度。

枯草溶菌素的热稳定性

通过上述低聚核苷酸定向诱变方法制得的本发明的迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素及其变种的观测到的热稳定性的比较被显示在表IV中。把纯化过的酶在0.1M甘氨酸0.01％Tween-80pH10.0缓冲液中的浓度为15微克/毫升的溶液，加有或不加50mM CaCl₂，等分到小试管中并在10℃保温5分钟，10°至60℃保温超过1分钟，在60℃保温20分钟。然后把试管放在冰上10分钟。把试管中的等分溶液加到含有1.2mM的合成多肽底物丁二酰-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺溶解在0.1Mtris-HCl的pH值为8.6的缓冲液中所形成的溶液并恒温在25℃的1厘米小池中，以试验酶的活性。最初的线性反应速率是用分光光度法通过监测反应产物对硝基苯胺在410纳米处的吸光度作为时间的函数来跟踪的。提供的数据为加热前的百分数活度。列于表IV的结果指出在加入50mM CaCl₂的试验条件下许多变种(26个当中的24个)呈现出和迟缓芽孢杆菌差不多的热稳定性。在没有加50mM CaCl₂的试验条件下有许多变种(26个当中的19个)其稳定性明显地要比迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的更好。进一步，在没有加50mM CaCl₂的试验条件下，变种N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I比单一置换的变种N76D要明显地更稳定。

表IV

测量迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素及其变种的热稳定性

pH值10，60℃，加入或不加入50mM CaCl₂

初始活性的保留值％酶 -CaCl₂ +CaCl₂迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素 2 96N76D 34 97N76D/S99D 49 98N76D/S101R 0 82N76D/S103A 26 92N76D/V104I 58 98N76D/I107V 32 96N76D/N123S 0 97N76D/S99D/S101R 30 100N76D/S99D/S103A 36 100N76D/S99D/V104I 48 97N76D/S101R/S103A 26 100N76D/S101R/V104I 38 100N76D/S103A/V104I 58 100N76D/V104I/I107V 60 97N76D/V104Y/I107V 48 74N76D/V104I/N123S 0 98N76D/I107V/N123S 16 100N76D/S99D/S101R/S103A 38 100N76D/S99D/S101R/V104I 33 100N76D/S99D/S103A/V104I 38 98N76D/S101R/S103A/V104I 40 99N76D/S103A/V104I/N123S 1 98N76D/V104I/I107V/N123S 3 99N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 36 99N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 2 95N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 0 100

用由质粒噬菌体产生的单股DNA

模板进行低核苷酸定向诱变A.迟缓芽孢杆菌变种的构造

诱变的实验程序基本上和前面在低聚核苷酸定向诱变中所描述的相同。为构造产生这种单股DNA模板的质粒噬菌体载体，我们首先构造载体pBCDAICAT。载体构造的流程图被概括于图8中。首先，来自pC194质粒的编码CAT基因的Clal至Clal碎片(参见Horinouchi，S.和Weisblum，B.，J.Bacteril.，150：8～15，1982)被克隆化进行pUC19的多链接区域的Accl位点上(NewEngland BioLabs，Beverly，MA)以制造质粒pUCCHL，并且由GG36DAI编码DNA 5′端的EcoRI-Dral 0.6 KB碎片被克隆化进入pBSKS质粒(stratagens.Inc.，San diego，CA)的EcoRI和EcoRV位点，以制造pBC2SK5。质粒pBC2SK5的单一EcoRI位点通过EcoRI消化而消除，接着被填充到被T4催化的DNA聚合酶中，并重新连接以产生没有EcoRI位点的质粒pBC2SK-5R。被克隆化进入pBCSK-5R中的EcoRI-Dral碎片以Pstl-HindIII碎片的形式被析离并克隆化到pUCCHL(pUC19多链区的一部分)的Pstl-HindIII位点以产生质粒pUCCHL 5R。GG36DAI的编码序列被切除成为EcoRI-BamHI碎片并克隆化到pUCCHL 5R的EcoRI-BamHI位点上以制造pUCCAT。然后把pUCCAT的大的EcoRI-HindIII碎片克隆化到BS2KS+的EcoRI和HindIII位点上以产生质粒pBCDAIVCAT。

为产生单股DNA，含有pBCDAICAT的E.Coli用噬菌体R408(可由stratagene，San Diego，CA购得)感染，这可按照Russel.M.，Kidd，S，和Kelley，M.R.在GENE 45：333～338，1986中所叙述的实验程序来进行。一旦获得单股DNA模板，即可实施前面在低聚核苷酸定向诱变中叙述过的标准的诱变方法。一些突变体的构造为说明的目的详述如下：

为构造迟缓芽孢杆菌(GG36)N76D/S103A/V104I/L217H，可将编码GG36 N76D/S103A/V104I的EcoRI-BamHIDNA碎片用于构造pUCCAT(参见图8)以产生质粒pBCDAICAT，在按上述实验程序制得单股DNA模板后，即可用具有下列序列^* *** **x Clal

5′TAT GCC AGG CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3′(Seq.IDNo.13)的诱变引物来制造L217H。像前面那样，下边画有横线的残基是指明已进行的核苷酸变化，xclal是指存在的clal位点在诱变后已被消除。诱变的实验程序已在前面低聚核苷酸定向诱变中描述过。诱变以后，质粒DNA首先被筛选出消除了Clal位点的，并且那些失去Clal位点的克隆被拿去进行DNA序列分析以证实在第217号氨基酸残基位置上实施了把L变为H的DNA序列。B.BPN′变种的构造以及它们在枯草杆菌中的表达

解淀粉芽孢杆菌(BPN′)N76D/Q103A/Y104I/Y217L的构造除两个连续步骤以外是以相似的方式来进行的。先把N76D引入BPN′Y217L以制造BPN′N76D/Y217L，第二次诱变把BPN′N76D/Y217L转化成BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。为产生第一次诱变所需的单股DNA模板，可用编码BPN′Y217L枯草溶菌素的EcoRI-BamHI碎片(是由Y217L质粒衍生的，已被描述于Wells，J.等人在PNAS，84，5167，1087发表的论文中)来构造质粒pUCCATFNA(参见图9)。含有BPN′Y217L的pUCCATFNA质粒被用来构造pBCFNACAT质粒(图9)。像前面叙述的那样就产生单股DNA。为产生BPN′N76D/Y217L，可用一种具有以下序列的低聚核苷酸引物：^*******Xbal

5′C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3′(Seq.ID No.14)来产生改变N76D。然后由含有BPN′N76D/Y217L的pBCFNACAT质粒来制备单股DNA(N76D诱变后的pBCFNACAT质粒)并用另一种具有以下序列的低聚核苷酸：^******x Pvull

5′GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3′(Seq.ID No.15)诱变而得到BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。涉及的克隆化、单股DNA制备、诱变以及突变体的筛选所有这些步骤都如上面叙述过的方法来进行。BPN′基因以及它的变种的表达可通过直接把质粒DNA(含有不同变种BPN′基因的pBCFNACAT)连接到枯草杆菌的缺乏蛋白酶的菌株中来完成，如RE 34,606中所描述的那样。

像每个这些蛋白酶制造实例所教授的那样，已制造了许多变种。为这些变种测定了动力学数据和稳定性数据。动力学数据是按前面描述过的方法产生的并被提供于表V中。稳定性数据的产生将在此详述，结果列于表VI中。

热稳定性试验程序

纯化过的酶被缓冲液交换到0.1M甘氨酸·pH10.0、含有0.01％Tween-80的缓冲液中，这可通过把酶加到含有用这种缓冲液平衡过的Sephadex G-25的层析柱上，并用同样的缓冲液把酶从柱上洗脱下来而实施。

往含有0.1M甘氨酸、0.01％Tween，pH为10.0并恒温在60℃的缓冲液的试管中，加入经缓冲液交换过的酶，使最终酶的浓度为15微克/毫升。

在不同时间从60℃的恒温液中取出等分的试样并立即试验酶的活性，即把它加入一个1厘米的小池中，其中含有1.2mM合成肽底物丁二酰基-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰对硝基苯胺的溶解在pH值为8.6并恒温在25℃的0.1M tris-HCl缓冲溶液中而形成的溶液。最初的线性反应速率可通过监测反应产物对硝基苯胺在410纳米处的吸光度作为时间的函数来进行分光光度法跟踪。

半衰期，即50％的酶失活所需时间的长度，是通过在60℃恒温溶液的反应速率作为时间函数的一级图形而测出的。

在表VI中提供的数据是按在相同条件下测定迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素(GG36)半衰期的百分数来表示的。

表V酶 kcat KM kcat/KM

(s^-1) (mM) (s^-1M^-1)迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素 170 0.78 2.20E+05N76D/S103G/V104I^* 380 1.4 2.70E+05N76D/S103A/V104F 730 0.33 2.20E+06N76D/S103A/V104N 790 2.8 2.80E+05N76D/S103A/V104S 170 0.83 2.00E+05N76D/S103A/V104T 370 1.9 2.00E+05N76D/S103A/V104W 880 0.31 2.80E+06N76D/S103A/V104Y 690 0.5 1.40E+06K27R/N76D/V104Y/N123S 500 1.2 4.20E+05N76D/S101G/S103A/V104I^* 620 1.3 4.80E+05N76D/S103A/V104I/S105A^* 550 1.3 4.20E+05N76D/S103A/V104I/S105D^* 440 1.7 2.60E+05N76D/S103A/V104T/I107A^* 120 5.7 2.10E+04N76D/S103A/V104T/I107L^* 310 3.2 9.70E+04N76D/S103A/V104I/L126A 90 2.2 4.10E+04N76D/S103A/V104I/L126F 180 1.9 9.50E+04N76D/S103A/V104I/L126I 100 2.4 4.20E+04N76D/S103A/V104I/L126V 64 3.2 2.00E+04N76D/S103A/V104I/S128G^* 560 1.7 3.30E+05N76D/S103A/V104I/S128L^* 430 3.8 1.10E+05N76D/S103A/V104I/L135A 140 0.76 1.80E+05N76D/S103A/V104I/L135F 390 0.69 5.70E+05N76D/S103A/V104I/L135I 110 0.73 1.50E+05N76D/S103A/V104I/L135V 140 0.86 1.60E+05N76D/S103A/V104I/S156E^* 170 2.6 6.50E+04N76D/S103A/V104I/S166D^* 160 3.5 4.60E+04N76D/S103A/V104I/D197E 510 1.4 3.60E+05N76D/S103A/V104I/N204A^* 530 1.1 4.80E+05N76D/S103A/V104I/N204G^* 580 1.4 4.10E+05N76D/S103A/V104I/N204C^* 370 1.3 2.90E+05N76D/S103A/V104I/P210I^* 500 1.2 4.20E+05N76D/S103A/V104I/L217H^* 80 0.63 1.30E+0SN76D/S103A/V104I/M222A 70 3.1 2.30E+04N76D/S103A/V104I/M222S 80 3.1 2.60E+04N76D/S103A/V104I/T260P 660 1.5 4.40E+05N76D/S103A/V104I/S265N 590 1.3 4.50E+05K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 220 1.4 1.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 430 1.1 3.90E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 400 1.1 3.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 440 1.2 3.70E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 440 1.2 3.70E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 760 0.98 7.80E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 410 1.2 3.40E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 390 1 3.90E+05N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 170 2.1 8.10E+04N76D/S103A/V104I/S156E/S166D^* 40 6.3 6.40E+03K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 410 0.98 4.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 540 0.66 8.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 770 0.79 9.80E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 610 0.99 6.20E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 580 0.78 7.40E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 660 1 6.60E+05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 590 0.89 6.60E+05K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T 520 1 5.20E+05274AK27F/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N 460 0.65 7.10E+05218S解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(BPN′) 50 0.14 3.60E+05BPN′-N76D/Y217L^* 380 0.46 8.30E+05^*带星号的这些突变体是用由噬菌体质粒产生的单股DNA模板进行低聚核苷酸定向诱变而制出的；所有其它不带星号的则是按前面所叙述的低聚核苷酸定向诱变方法制出的。

表VI酶热稳定性

(天然酶半衰期的％)迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素 100N76D 590N76D/S99D 840N76D/S103A 390N76D/V104I 660N76D/I107V 710N76D/N123S 70N76D/S99D/S101R 610N76D/S99D/S103A 590N76D/S99D/V104I 910N76D/S101F/S103A 930N76D/S101R/V104I 500N76D/S103A/V104I 460N76D/S103G/V104I^* 370N76D/S103A/V104F 480N76D/S103A/V104N 230N76D/S103A/V104S 230N76D/S103A/V104T 370N76D/S103A/V104W 280N76D/S103A/V104Y 400N76D/V104I/I107V 940N76D/V104Y/I107V 820N76D/V104I/N123S 80N76D/I107V/N123S 150K27R/N76D/V104Y/N123S 100N76D/S99D/S101R/S103A 570N760/S99D/S101R/V104I 1000N76D/S99D/S103A/V104I 680N76D/S101G/S103A/V104I^* 390N76D/S101F/S103A/V104I 470N76D/S103A/V104I/S105A^* 360N76D/S103A/V104I/S105D^* 370N76D/S103A/V104T/I107A^* 270N76D/S103A/V104T/I107L^* 230N76D/S103A/V104I/N123S 110N76D/V104I/I107V/N123S 220N76D/S103A/V104I/L126A 270N76D/S103A/V104I/L126F 950N76D/S103A/V104I/L126I 410N76D/S103A/V104I/L126V 320N76D/S103A/V104I/S128G^* 640N76D/S103A/V104I/S128L^* 760N76D/S103A/V104I/L135A 230N76D/S103A/V104I/L135F 200N76D/S103A/V104I/L135I 510N76D/S103A/V104I/L135V 500N76D/S103A/V104I/S156E^* 120N76D/S103A/V104I/S166D^* 590N76D/S103A/V104I/D197E 460N76D/S103A/V104I/N204A^* 230N76D/S103A/V104I/N204G^* 240N76D/S103A/V104I/N204C^* 500N76D/S103A/V104I/P210I^* 1370N76D/S103A/V104I/L217H^* 60N76D/S103A/V104I/M222A 520N76D/S103A/V104I/M222S 490N76D/S103A/V104I/T260P 490N76D/S103A/V104I/S265N 360K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 40K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 590N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110N76D/S103A/V104/VL126F/S265N 810N76D/S103A/V104/VS156E/S166D^* 220K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 90K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 250K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 460K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 1400K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 310K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 180N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 90K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274 230K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N21 240解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(BPM′) 100BPN′-N76D/Y217L^* 420^*带星号的这些突变体是用由噬菌体质粒产生的单股DNA模板进行低聚核苷酸定向诱变而制出的；所有其它不带星号的则是按前面所叙述的低聚核苷酸定向诱变方法制出的.(3)清洗组合物材料

本发明的清洗组合物除前面叙述的漂白剂和蛋白酶以外，也包括一种或多种可以和蛋白酶配伍的清洗组合物材料。术语“清洗组合物材料”，像这里使用的，意指任何选自特定类型所需的清洗组合物以及产物形式(例如液体、颗粒、喷雾组合物)的液体、固体或气体材料，这些材料也可以和用于组合物中的蛋白酶配伍。清洗组合物材料的具体选择可通过考虑被清洗的表面、物件或织物以及所需的在使用过程的清洗条件下组合物的形式(例如通过洗涤剂使用)而容易地做出决定。术语“可配伍的”，像这里使用的，是指清洗组合物材料不致降低蛋白酶的解蛋白活度到这种程度，以致在正常使用的情形下不再像期望那样有效。具体的清洗组合物材料将在后面举例详尽说明。

有效量的一种或多种上述蛋白酶被包括在组合物中，用来清洗许多需要除去蛋白质污渍的表面。这样的清洗组合物包括为清洗硬表面的形式不限(例如，液体或颗粒状)的洗涤剂组合物；为清洗织物的形式不限(例如，颗粒状、液体和棒状配方)的洗涤剂组合物；洗碟用组合物(形式不限)；口腔洗涤组合物，形式不限(例如，牙粉，牙膏和漱口剂配方)；以及假牙清洗组合物，形式不限(例如，液体、片状)。像这里所用的，“有效量的蛋白酶”是指为必须达到的酶活性在具体的清洗组合物中所需的前面叙述的蛋白酶的量。这样的有效量能容易地为本领域的技术人员所确定，并且它基于许多因素，诸如使用的特定的酶的变种、清洗施用情况、清洗组合物的具体组分，以及所需的组合物是液体还是干的(例如颗粒或条状)等等。

优选地是本发明的清洗组合物中含有由大约0.0001％至大约10％的一种或多种蛋白酶，更优选地是含有大约0.001％至大约1％、还更优选地是含有大约0.001％至大约0.1％。同样优选地是存在于组合物中的蛋白酶的量，可充分提供每100克组合物中所含活性蛋白酶的毫克数对理论上可从洗涤液中的过氧酸得到的O₂(“AvO₂”)的比率值、这里称为酶对漂白剂之比(E/B比)，在大约1∶1至大约20∶1的范围内。下面将进一步详尽讨论可应用蛋白酶的各种清洗组合物的一些实例。除非特别说明，所有的份数、百分数和比率在这里都是基于重量计算的。(i)供选择的洗涤剂酶

除了指定的蛋白酶以外，这里的组合物和方法在用所有样式的洗涤剂酶时也是有效的。用于本发明的供选择的洗涤剂酶被包括在种类繁多的织物洗涤目的中，包括除去基于蛋白质的、基于碳水化合物的或基于三酸甘油酯的污渍，例如，还包括防止短效染料的转移。被并入的酶包括其他蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶、过氧化物酶以及它们的混合物。也可以包括其它类型的酶。它们可来自任何合适的来源，诸如植物、动物、细菌、霉菌和酵母源等。但是，它们的选择被一些因素所控制，诸如pH活性和/或稳定性最优值、热稳定性、对活性洗涤、增效剂等的稳定性等。在这方面细菌或霉菌的酶是优选的，诸如细菌淀粉酶和蛋白酶以及霉菌纤维素酶等。

通常并入的酶的浓度为按重量计每克洗涤组合物中应能充分提供大约50毫克、更典型地是大约0.01毫克至大约10毫克的活性酶。换言之，用于本发明中的有效量的供选择的酶，按洗涤组合物的重量计算其含量为至少大约0.001％，优选地是大约0.001％至大约5％，更优选地是大约0.001％至大约1％，最优选地是大约0.01％至大约1％。

供选择的蛋白酶的合适的实例有从枯草杆菌和地衣芽孢杆菌的特定菌株中得来的枯草溶菌素。其它合适的蛋白酶有从枯草杆菌和地衣芽孢杆菌中得到的一种经修饰的细菌丝氨酸蛋白酶，它在整个8～12pH范围内都具有最大的活性，被NOVO Industries开发并在注册商标名称ESPERASE下出售。这种酶和类似的酶的制备已被描述于NOVO的英国专利说明书No.1,243,784中。其它可买到的解蛋白酶有NOVO Industries A/S(丹麦)的商品名为ALCALASE和SAVINASE、及Bio-Synthetics，Inc.(荷兰)的商品名为MAXATASE的酶。还有的其它蛋白酶包括蛋白酶A(参看1985年1月9日发布的欧洲专利申请130,756)以及蛋白酶B(参看1987年4月28日提出申请的欧洲专利申请Serial No.87303761.8以及1985年1月9日发布的Bott等人的欧洲专利申请130,756)，和在这里被称为“蛋白酶C”的酶，它是从杆菌得到的碱性丝氨酸蛋白酶的三重变种，其中位置104的酪氨酸被缬氨酸所置换，位置123的丝氨酸被天冬氨酸置换、位置274的丙氨酸被苏氨酸置换。蛋白酶C被描述于1991年5月16日发布的EP90915958.4中，相应于WO 91/06637，它在此引入作为参考。经遗传学修饰的变种，特别是蛋白酶C的变种，也包括在这里。

淀粉酶包括，例如，英国专利说明书No.1,296,839(NOVO)中描述的α-淀粉酶，International Bio-Synthetics，Inc.的RAPIDASE以及NOVO Industries的TERMAMYL等。

用于本发明的纤维素酶包括细菌或霉菌的纤维素酶。最好是，它们所具有的pH最佳值在5和9.5之间。合适的纤维素酶已在1984年3月6日授权的Barbesgoard等人的美国专利4,435,307中被公开、其中公开了由Humicola insolens和Humicola菌株DSM1800中产生的霉菌纤维素酶或属于气单胞菌属的产生纤维素酶212的霉菌，以及从一种海洋软体动物(Dolabella Auricula Solander)的肝胰腺中提取出来的纤维素酶。合适的纤维素酶也被公开于GB-A-2.075.028；GB-A-2.095.275和DE-OS-2.247.832中。

为洗涤剂用的合适的脂酶包括那些假单胞菌属的微生物、诸如在英国专利1,372,034中被公开的施氏假单胞菌stutzeri ATCC19.154所产生的脂酶。也可参看1978年2月24日对公共检验公开的日本专利申请53-20487中的脂酶。这种脂酶可从日本Nagoya的Amano药物公司买到，其商品名称为脂酶P“Amano”，此后就称它为“Amano P”。其它可买到的脂酶包括Amano-CES、日本Tagata的Toyo Jozo公司的脂酶exChromobacter Viscosum，例如Chromobacter Viscosum Var.lipolyticum NRRLB 3673，美国Biochemical Corp.和荷兰DisoynthCo.生产的Chromobacter Viscosum脂酶以及脂酶ex Pseudomonasgladioli。由Humicola lanuqinosa衍生、并作为主体在AspergillusOryzae中表达的酶LIPOLASE可从Novo公司买到(也可参见E.P.专利341,947)，是这里使用的优选的脂酶。

过氧化物酶是和氧源结合使用的，例如和过碳酸盐、过硼酸盐、过硫酸盐、过氧化氢等结合使用。它们被用于溶液漂白，即在洗涤操作过程中防止染料或颜料从一种底物转移到洗涤溶液中的其它底物上去。过氧化物酶在本领域内是已知的，并且包括，例如，辣根过氧化酶、木质素酶、以及卤代过氧化酶诸如氯和溴代过氧化酶。含有过氧化酶的洗涤剂组合物已在，例如，授权给NovoIndustries A/S的O-Kirk于1989年10月19日发布的PCT国际专利申请WO 89/099813中被公开。

范围广泛的酶材料以及把它们并入合成的洗涤剂颗粒中去的方法已在1971年1月5日授权给McCarty等人的美国专利3,553,139中被公开。酶被进一步公开于1978年7月18日授权的Place等人的美国专利4,101,457和1985年3月26日授权的Hughes的美国专利4,507,219两项专利中。用于液体洗涤剂配方的酶材料以及把它们并入这类配方中去的方法已在1981年4月14日授权的Hora等人的美国专利4,261,868中被公开。用于洗涤剂中的酶可用各种技术使之稳定化。酶稳定化技术已被公开并示例于1981年4月14日授权给Hora等人的美国专利4,261,868、1971年8月17日授权给Gedge等人的美国专利3,600,319以及Venegas1986年10月29日发布的欧洲专利申请公开No.0199405，公开No.86200586.5中。酶稳定化系统也已被描述于，例如，美国专利4,261,868、3,600,319以及3,519,570中。(ii)酶稳定剂

这里使用的酶可通过在做成的组合物中存在有给酶提供钙离子的水溶性的钙离子源而被稳定化。存在各种其它本领域中已公开的稳定剂，特别是硼酸盐类，可提供进一步的稳定性：参看上文所引证的Severson的美国专利4,537,706。典型的洗涤剂，特别是液体的，在每立升做成的组合物中将含有大约1至大约30、优选地是大约2至大约20、更优选地是大约5至大约15、最优选地是大约8至大约12毫摩尔钙离子。依赖于所存在的酶的数量和它对钙离子的响应，可以稍有变化。钙离子的浓度应该这样来选择，即对于酶来说，在钙与增效剂、脂肪酸等络合之后，在组合物中总还会有某种最低浓度的钙离子可以得到。任何水溶性的钙盐都能用作钙离子源，包括、但不仅限于、氯化钙、硫酸钙、苹果酸钙、氢氧化钙、甲酸钙和醋酸钙。小量钙离子，一般为大约0.05至大约0.4每升毫摩尔，也常常存在于组合物中，这是由于酶浆和配制用的水中的钙离子。在固体洗涤剂组合物中，配方可包括充分量的一种水溶性钙离子源来为洗衣液提供这样数量的钙离子。作为代替，天然硬水中的钙离子可能就足够了。

这里的组合物也可供选择地，但是优选地，含有各种其它的稳定剂，包括硅酸盐涂料、特别是硼酸盐类型的稳定剂。典型地，这类稳定剂在组合物中使用的浓度，基于在组合物中硼酸的重量或别的能形成硼酸的硼酸盐化合物的重量(换算成硼酸)来计算为大约0.25％至大约10％、优选地是0.5％至大约5％、更优选地是大约0.75％至大约3％。最好是用硼酸，虽然其它化合物诸如氧化硼、硼砂、以及其它碱金属硼酸盐(例如，原硼酸钠、偏硼酸钠、焦硼酸钠和五硼酸钠)也是合适的。取代的硼酸(例如，苯基硼酸、丁烷硼酸和对溴苯基硼酸)也可被用来代替硼酸。(iii)洗涤表面活性剂

在由本发明提供的完整配制好的洗涤剂组合物中所包括的洗涤表面活性剂的量，依赖于具体使用的表面活性剂和所期望的效果，可从大约1％至大约99.8％。最好是，洗涤表面活性剂的含量基于洗涤剂组分的重量计为大约5％至大约80％。

洗涤表面活性剂可以是非离子的、阴离子的、两性的、两性离子的或阳离子的。也可使用这些表面活性剂的混合物。经优选的洗涤剂组合物中含有阴离子洗涤表面活性剂或阴离子表面活性剂与别的表面活性剂、特别是非离子表面活性剂的混合物。

这里使用的表面活性剂的非限制性的实例包括通常的C₁₁～C₁₈烷基苯磺酸盐以及一级、二级和任意的烷基硫酸盐、C₁₀～C₁₈烷基烷氧基硫酸盐、C₁₀～C₁₈烷基聚糖苷和它们相应的硫酸化的聚糖苷、C₁₂～C₁₈α-磺酸化的脂肪酸酯、C₁₂～C₁₈烷基和烷基酚烷氧化物(特别是乙氧化物和混合的乙氧/丙氧化物)、C₁₂～C₁₈三甲铵乙内酯和磺基三甲铵乙内酯(“sultaines”)、C₁₀～C₁₈胺氧化物、C₈～C₂₄肌氨酸盐(特别是油酰基肌氨酸盐)等。其它通常有用的表面活性剂已被列举在标准的教科书中。

在这里特别有用的一类具体的附加的非离子性表面活性剂包括具有下式的多羟基脂肪酸酰胺：其中R¹是H、C₁～C₈烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或它们的混合物，优选地是C₁～C₄烷基，更优选地是C₁或C₂烷基，最优选地是C₁烷基(即甲基)；R²是C₅～C₃₂烃基部分，优选地是直链C₇～C₁₉烷基或烯基，更优选地是直链C₉～C₁₇烷基或烯基，最优选地是直链C₁₁～C₁₉烷基或烯基，或它们的混合物；Z是一个含有线型烃基链的多羟基烃基部分，在它的链上直接连接着至少两个羟基(在甘油醛的情况下)或至少3个羟基(在其它还原糖的情况下)，或是它的一种烷氧化(最好是乙氧化或丙氧化)的衍生物。Z最好是在还原胺化反应中由还原糖衍生；更优选地是Z是一个糖醇基。合适的还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖和木糖，以及甘油醛。作为原料，也可以用高右旋糖玉米糖浆、高果糖玉米糖浆以及高麦芽糖玉米糖浆来代替上面列举的那些糖。这些玉米糖浆将产生混合的糖组分在基团Z中。应当理解这里决不想排除其它合适的原料。Z最好是选自-CH₂-(CHOH)_n-CH₂OH、-CH(CH₂OH)-(CHOH)_n-1-CH₂OH、-CH₂-(CHOH)₂(CHOR＇)(CHOH)-CH₂OH，其中n是1至5的一个整数，包括1和5，R′是H或一个环状的单糖或多糖以及它们的烷氧化的衍生物。更优选地是这样的糖醇基，其中的n值为4，特别是-CH₂-(CHOH)₄CH₂OH。

在式(1)中，R¹可以是，例如，N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-异丙基、N-丁基、N-异丁基、N-2-羟基乙基、或N-2-羟基丙基。为最高度地起泡沫，R¹最好是甲基或羟基烷基。如果希望降低起泡沫能力，R¹最好是C₂～C₈烷基，特别是正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、己基和2-乙基己基。

R²-CO-N＜可以是，例如椰子脂(酸)酰胺、硬脂酰胺、油酰胺、月桂酰胺、肉豆蔻酰胺、癸酰胺、软脂酰胺、牛脂酰胺等。

另一类非离子型的在本发明中特别有用的表面活性剂是环氧乙烷与一个憎水部分的缩合产物，它提供一种表面活性剂。其亲水-亲油平衡值(HLB)在5至17、优选地是6至14、更优选地是7至12的范围内。憎水(亲油)部分在性质上可以是脂肪或芳香的，并且与任何特定的憎水基团缩合的聚氧乙烯基的长度可被容易地调节以产生一种水溶性的化合物，它在亲水和憎水之间具有所期望的平衡程度。

这种类型的特别优选的非离子型表面活性剂是每摩尔醇含有3～8摩尔环氧乙烷的C₉～C₁₅一级醇乙氧化物、特别是每摩尔醇含有6～8摩尔环氧乙烷的C₁₄～C₁₅一级醇乙氧化物、每摩尔醇含有3～5摩尔环氧乙烷的C₁₂～C₁₅一级醇乙氧化物，以及它们的混合物。(iv)洗涤增效剂

用于本发明的供选择的洗涤剂组分含有无机和/或有机的洗涤增效剂以协助无机物硬度控制。如果使用，这些增效剂的含量为洗涤剂组合物的大约5％至大约80％(重量)。

无机洗涤增效剂包括，但不限制于，碱金属、铵和烷醇铵的聚磷酸盐(例如三聚磷酸盐、焦磷酸盐和玻璃状的聚合偏磷酸盐)、膦酸盐、肌醇六磷酸、硅酸盐、碳酸盐(包括碳酸氢盐和倍半碳酸盐)、硫酸盐和铝硅酸盐。但是，在某些场所也需要非磷酸盐增效剂。

硅酸盐增效剂的实例有碱金属硅酸盐，特别是那些SiO₂∶Na₂O比率在1.6∶1至3.2∶1范围内的以及层状的硅酸盐，诸如在1987年5月12日授权给H.P.Rieck的美国专利4,664,839中所描述的层状硅酸钠，它的商品名称为“SKS”，可从Hoechst买到。SKS-6是一种特别优选的层状硅酸盐增效剂。

碳酸盐增效剂，特别是表面积大于10M²/g的经细磨的碳酸钙、是可用于颗粒状组合物中的优选的增效剂。这种碱金属碳酸盐构成的洗涤剂的密度可在450～850克/立升范围内，湿气含量最好是低于4％。

碳酸盐增效剂的实例有碱土金属和碱金属碳酸盐，诸如1973年11月15日发布的德国专利申请No.2,321,001中所公开的那些。

铝硅酸盐增效剂在本发明中是特别有用的。经优选的铝硅酸盐有沸石类增效剂，它具有下式：Na_z[(AlO₂)_z(SiO₂)_y]^·xH₂O其中z和y为至少是6的整数，z对y的摩尔比率在1.0至大约0.5的范围内，x是大约15至大约264之间的一个整数。

有用的铝硅酸盐离子交换材料可从市场买到。这些铝硅酸盐在结构上可以是结晶状的或无定形的，并且可以是自然界存在的或人工合成衍生的。生产铝硅酸盐离子交换材料的方法已在1976年10月12日授予Krummel等人的美国专利3,985,669和1986年8月12日授予Corkill等人的美国专利4,605,509中被公开。在这里有用的经优选的合成结晶状铝硅酸盐离子交换材料可以Zeolite A、Zeolite P(B)(包括在EPO 384,070中公开的那些)和Zeolite X这些名称牌号从市场上买到。最好是，铝硅酸盐具有0.1～10微米直径的颗粒大小。

适用于本发明目的的有机洗涤增效剂包括、但不仅限于，许多聚羧酸盐化合物，诸如醚聚羧酸盐，包括氧联二丁二酸盐，如1964年4月7日授予Berg的美国专利3,128,287、1972年1月18日授予Lamberti等人的美国专利3,635,830中公开的那些。也可参看1987年5月5日授予Bush等人的美国专利4,663,071中的“TMS/TDS”增效剂。合适的醚聚羧酸盐也包括环状的化合物，特别是脂环化合物，诸如那些在美国专利3,923,679、3,835,163、4,158,635、4,120,874和4,102,903中描述的化合物。

其它有用的洗涤增效剂包括醚羟基聚羧酸盐、马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸、以及羧甲基-氧联丁二酸、多乙酸诸如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，和多羧酸盐诸如苯六甲酸、丁二酸、氧联丁二酸、聚马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧甲基氧联丁二酸以及它们的可溶性的盐。

柠檬酸盐增效剂，例如柠檬酸和它的可溶性盐(特别是钠盐)，是也能用于颗粒组合物中的优选的多羧酸盐增效剂，特别是和沸石和/或层状硅酸盐增效剂结合使用时。

也适用于本发明洗涤剂组合物的还有3，3-二羧基-4-氧杂-1，6-己烷二羧酸盐和有关的化合物，它们被公开于1986年1月28日授予Bush的美国专利4,566,984中。

在可以使用基于磷的增效剂的情况下，特别是为手洗衣操作用的条棒型配方中，可使用各种碱金属磷酸盐诸如众所周知的三聚磷酸钠、焦磷酸钠和正磷酸钠。磷酸盐增效剂诸如乙烷-1-羟基-1，1-二膦酸盐以及别的已知的膦酸盐(参看，例如，美国专利3,159,581；3,213,030；3,422,021；3,400,148和3,422,137)也可以被使用。(v)供选择的洗涤添加剂

作为经优选的实施方案，这里应用的通常的洗涤剂组分可以选自典型的洗涤剂组合物组分诸如洗涤表面活性剂和洗涤增效剂。供选择地，洗涤剂组分可包括一种或多种别的洗涤添加剂或别的帮助或增强洗涤性能、处理被清洗的底物或修饰洗涤剂组合物的审美外观的材料。通常的洗涤剂组合物的洗涤添加剂包括Baskerville等人的美国专利No.3,936,537所阐明的那些组分，在此引入作为参考。这类能被包括在用于本发明的洗涤剂组合物中的添加剂，以它们通常在本领域确立的使用浓度(一般为洗涤剂组分的0％至大约20％，最好是大约0.5％至大约10％)使用，包括颜色点缀剂、发泡剂、抑泡剂、防锈剂和/或防腐蚀剂、污垢悬浮剂、污垢释出剂、染料、填充剂、荧光增自剂、杀菌剂、碱性源、水溶助长剂、抗氧剂、香料、溶剂、加溶剂、除尘土污渍/抗污垢再沉积剂、聚合分散剂、操作助剂、织物软化组分(例如绿土)、染料转移抑制剂(例如，聚乙烯基吡咯烷酮)、静电控制剂等。

漂白系统供选择地，但优选地，也应含有一种螯合剂，它不仅能通过清除会分解漂白剂的重金属离子而增进漂白剂的稳定性，也能有助于除去多元酚污渍诸如茶汁污渍等。各种螯合剂，包括可从Monsanto公司买到的商品名称为DEQUEST的氨基膦酸盐。次氮三乙酸盐、羟乙基-乙二胺三乙酸盐等，已知可供这类用途。经优选的生物可降解的非磷螯合剂包括乙二胺二丁二酸盐(“EDDS”；参见Hartman和Perkins的美国专利4,704,233)、乙二胺-N，N′-二谷氨酸盐(EDDG)和2-羟基亚丙基二胺-N，N′-二丁二酸盐(HPDDS)等化合物。这类螯合剂可以它们的碱金属盐或碱土金属盐的形式来使用，典型的浓度为大约本组合物的0.1％至大约10％。

本发明组合物作为通常的洗衣洗涤剂组合物诸如那些典型地常见的颗粒洗涤剂或洗衣皂条是特别有用的。1965年4月13日授予Okenfuss的美国专利3,178,370中描述了洗衣洗涤剂条和制造它们的方法。1980年9月23日授予Anderson的菲律宾专利13,778中描述了合成洗涤剂洗衣皂条。用各种挤压方法来制造洗衣洗涤剂皂条的方法在本领域内是众所周知的。

下面给出的实例进一步说明了本发明，但并不想用来限制本发明。

实例1制备了一种颗粒状洗涤剂组合物，它含有以下组分：

组分重量％C₁₂线型烷基苯磺酸盐 22磷酸盐(如三聚磷酸钠) 30碳酸钠 14硅酸钠 3蛋白酶12 0.3过碳酸钠 5乙二胺二丁二酸盐螯合剂(EDDS) 0.4硫酸钠 5.5壬酰基己内酰胺 5填充剂^*和水平衡到100％

^*注：可选自一些方便可得的材料诸如CaCO₃、滑石、粘土、硅酸盐等。

洗涤剂组合物中的对热和碱稳定的组分的水溶液调和混合物制好之后经喷雾干燥，再与别的组分混合在一起，以使它们含有表中所列出的那种浓度的组分。

在这个实例中蛋白酶1～11号和13～25号列举在表III中，包括别的用于本发明的其它蛋白酶被描述于表V和表VI中，当用它们代替12号蛋白酶时得到基本上类似的结果。在本实例中也曾用表III、V和VI中所列的用于本发明的以及其它的蛋白酶的组合物来代替12号蛋白酶，结果也基本是类似的。

实例2

制备了一种颗粒状洗涤剂组合物，它含有以下组分：

组分重量％

阴离子性烷基硫酸盐 7

非离子性表面活性剂 5

沸石(0.1～10微米) 10

柠檬酸三钠 2

SKS-6硅酸盐增效剂 10

丙烯酸酯马来酸酯共聚物 4

壬酰基己内酰胺 5

过碳酸钠^* 15

碳酸钠 5

乙二胺二丁二酸盐螯合剂(EDDS) 0.4

抑泡剂 2

蛋白酶12 0.3

脂酶 0.3

污垢释出剂 0.2

次要组分、填充剂^**和水平衡到100％

^*注：其平均颗粒大小应为400至1200微米。

^**注：可选自方便易得的材料，诸如CaCO₃、滑石、粘土、硅酸盐等。

洗涤剂组合物中对热和碱稳定的组分的水溶液调和混合物，制好之后经喷雾干燥，再与别的组分混合在一起，使它们含有表中的组分以及所示的浓度。

在这个实例中曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和13～25号以及表V和表VI中描述的、用于本发明的其它蛋白酶来代替12号蛋白酶，得到基本上类似的结果；在本实例中也曾结合使用数种表III、V和VI中所列的、用于本发明的以及其它的蛋白酶来代替12号蛋白酶，也得到基本上类似的结果。

实例3

按与实例2相同的方法制备洗涤剂组合物，只是用15％的苯甲酰己内酰胺、壬酰基己内酰胺和(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐的1∶1∶1的混合物来代替壬酰基己内酰胺，并且过碳酸钠的用量为30％。

在这个实例中曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和13～25号以及表V和表VI中描述的、用于本发明的其它蛋白酶来代替12号蛋白酶，得到基本上类似的结果；在本实例中也曾任意地结合使用数种表III、V和VI中所列的、用于本发明的以及其它的蛋白酶来代替12号蛋白酶，也得到基本上类似的结果。

实例4

按与实例1相同的方法制备洗涤剂组合物，只是用20％的苯甲酰己内酰胺和(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐的1∶1的混合物来代替壬酰基己内酰胺，并且过碳酸钠的用量为20％，而磷酸盐的用量为0％。

实例5

按与实例2相同的方法制备洗涤剂组合物，唯一例外是用等价量的苯并噁嗪型活化剂来代替壬酰基己内酰胺。

实例6

按与实例2相同的方法制备洗涤剂组合物，只是用10％苯并噁嗪型活化剂和四乙酰基乙二胺的1∶1的混合物来代替壬酰基己内酰胺，并且过碳酸钠的用量为25％。

实例7

用标准的挤压工艺制备了适合于手洗污垢织物的洗衣皂条，它含有以下组分：

组分重量％

C₁₂线型烷基苯磺酸盐 30

磷酸盐(如三聚磷酸钠) 7

碳酸钠 25

焦磷酸钠 7

椰油单乙醇酰胺 2

沸石A(0.1～10微米) 5

羧甲基纤维素 0.2

聚丙烯酸酯(分子量1400) 0.2

(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐 5

过碳酸钠 5

增白剂，香料 0.2

蛋白酶12 0.3^**

脂酶 0.3

CaSO₄ 1

MgSO₄ 1

水 4

填料^* 平衡至100％

^*注：可选自方便的材料诸如CaCO₃、滑石、粘土、硅酸盐等。

^**注：是指每克组合物中活性酶的毫克数。

这种洗衣皂条是在本专业中一般使用的通常的肥皂或洗涤剂皂条制造设备中被加工的。

实例8

按与实例7相同的方法制备洗涤剂组合物，唯一例外是用等价量的苯甲酰己内酰胺来代替(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐。

实例9

按与实例7相同的方法制备洗涤剂组合物，唯一的例外是用等价量的壬酰基己内酰胺来代替(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐。

实例10

制备了一种颗粒状的洗涤剂组合物，它含有以下组分：

组分重量％

阴离子性烷基硫酸盐 7

非离子性表面活性剂 5

沸石(0.1～10微米) 10

柠檬酸三钠 2

SKS-6硅酸盐增效剂 10

丙烯酸酯马来酸酯共聚物 4

壬酰基己内酰胺 5

过碳酸钠^* 15

碳酸钠 5

乙二胺二丁二酸盐螯合剂(EDDS) 0.4

抑泡剂 2

蛋白酶12 0.5

污垢释出剂 0.2

次要组分、填料^**和水平衡到100％

^*注：其平均颗粒大小为400至1200微米。

^**注：可选自方便的材料，诸如CaCO₃、滑石、粘土、硅酸盐等。

洗涤剂组合物中的对热和碱稳定的组分的水溶液调和混合物制好之后经喷雾干燥，再与别的组分混合在一起，以使它们含有表中的组分以及所示的浓度。

实例11

按与实例10相同的方法制备洗涤剂组合物，唯一的例外是用等价量的苯甲酰己内酰胺来代替壬酰基己内酰胺。

实例12

用与实例10相同的方法制备洗涤剂组合物，只是用15％(重量)的(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐来代替壬酰基己内酰胺，并且过碳酸钠的量为30％。

实例13

用与实例10相同的方法制备洗涤剂组合物，只是用15％(重量)的一种苯并噁嗪类活化剂来代替壬酰基己内酰胺，并且过碳酸钠的用量为30％。

实例14

洗涤性能试验

各种在本发明中的组合物的洗涤性能，是通过测量除去EMPA 116(血/奶/炭黑在棉花上)在小块布样(Testfabrics，Inc.，Middlesex，NJ07030)上的污点的能力来评价的。

把6块EMPA 116布样剪成3×4-1/2英寸大小并把边剪成锯齿形，放入含有1000毫升硬度为15gpg(其Ca⁺⁺∶Mg⁺⁺为3∶1重量∶重量)的水、7克洗涤剂以及适量酶的7243S Terg-O-Tometer型振荡式涤垢仪(United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，NJ出品)的每个罐中。洗涤剂基剂是德国Krefeld的wfk-Testgewebe GmbH，Adlerstrasse 42，Postfach 130762，D-47759的WFKl洗涤剂：

组分在最终配方中所占的％

沸石A 25％

硫酸钠 25％

苏打灰 10％

线型烷基苯磺酸盐 8.8％

醇乙氧化物(7～8 EO) 4.5％

钠肥皂 3％

硅酸钠 3％

再往这基剂中加入以下添加剂：

组分在最终配方中所占的％

过硼酸钠一水合物 13％

共聚物(Sokalan CP5) 4％

TAED(Mykon ATC Green) 3％

酶 0.5％

增白剂(Tinopal AMS-GX) 0.2％

过硼酸钠一水合物是从Degussa Corporation，Ridgefield-Park，NJ 07660得到的。Sokalan CP5是从BASF Corporation，Parsippany，NJ 07054得到的。Mykon ATC Green(TAED，即四乙酰基乙二胺)是从英国Warkwick International，Limited，Mostyn，Holywell，Clwyd CH8 9HE得到的。Tinopal AMS GX是从Ciba-GeigyCorporation，Greensboro，NC 27419得到的。

把六块EMPA 116布样在60℃，在带有酶的洗涤剂中洗涤30分钟，然后每次用1000毫升水漂洗两次，每次5分钟。加入酶，为制作标准曲线可使最终浓度为0.05至1ppm，为通常的分析则只需0.25ppm。布样经干燥和挤压后在CR-200型(MinoltaCorporation，Ramsey，NJ 07446出品)Minolta色度计的L^*a^*b^*标度上用L值测量布样的反射度。性能指标是以迟缓芽孢杆菌(GG36)蛋白酶性能的百分数来报告的，它是用迟缓芽孢杆菌(GG36)蛋白酶的量除以为达到同样除污性能所需提供的各种蛋白酶的量所得数值×100计算出来的。数据被列于表VII中。

表VII酶洗涤性能迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素 100N76D 310N76D/S103A 230N76D/V104I 130N76D/V107V 160N76D/S99D/S101R 370N76D/S99D/S103A 290N76D/S101R/S103A 130N76D/S101R/V104I 300N76D/S103A/V104I 320N76D/S103G/V104I 160N76D/S103A/V104F 210N76D/S103A/V104N 110N76D/S103A/V104T 170N76D/V104I/I107V 210N76D/S99D/S101R/S103A 220N76D/S99D/S101R/V104I 140N76D/S101G/S103A/V104I 170N76D/S101R/S103A/V104I 150N76D/S103A/V104I/S105A 170N76D/S103A/V104T/I107A 120N76D/S103A/V104T/I107L 110N76D/S103A/V104I/L126F 110N76D/S103A/V104I/S128G 280N76D/S103A/V104I/L135I 160N76D/S103A/V104I/L135V 160N76D/S103A/V104I/D197E 170N76D/S103A/V104I/N204A 160N76D/S103A/V104I/N204G 150N76D/S103A/V104I/P210I 470N76D/S103A/V104I/M222A 100N76D/S103A/V104I/T260P 280N76D/S103A/V104I/S265N 190

序列表(1)一般讯息：(i)申请人：Ghosh，Chanchal K.

Burns，Michael E.

DiGiulio，David N.

Getty，Edward E.

Hartshorn，Richard T.

Willey，Alan D.

Brode，Philip F.，III

Barnett，Bobby L.

Rubingh，Donn N.(ii)发明名称：含有蛋白酶的漂白组合物(iii)序列数：15(iv)通信地址：

(A)地址：The Procter & Gamble Company

(B)街道：11810 East River Road

(C)城市：Cincinnati

(D)州：OH

(E)国家：美国

(F)邮政编码：45253-8707(v)可从下列计算机读出：

(A)介质形式：硬盘

(B)计算机：IBM PC兼容的

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patentin Release#1.0，文本#1.25。

(vi)现行申请时期：

(A)申请号：

(B)申请日期：1994.10.13

(C)分类：

(viii)代理人/代理处讯息：

(A)姓名：Zerby，Kim William

(B)登记号：32，323

(C)参考/摘要：5041R

(ix)电话电传讯息：

(A)电话：(513)627-2885

(B)电传：(513)627-0318(2)SEQ ID NO：1的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

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GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 19(2)SEQ ID NO：2的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

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(ii)分子类型：DNA(genomic)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GCTGCTCTAG ACAATTCG 18(2)SEQ ID NO：3的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：39碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

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(ii)分子类型：DNA(genomic)

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(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG 33(2)SEQ ID NO：5的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：22碱基对

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(C)股：单股

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(ii)分子类型：DNA(genomic)

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(A)长度：1497碱基对

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(i)序列特性：

(A)长度：275氨基酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

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195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

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275(2)SEQ ID NO：8的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：275氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala

35 40 45Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His

50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser

130 135 140Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly145 150 155 160Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala

165 170 175Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala

180 185 190Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr

210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr225 230 235 240Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr

245 250 255Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270Ala Ala Gln

275(2)SEQ ID NO：9的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：274氨基酸

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20 25 30Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala

35 40 45Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn

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130 135 140Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser145 150 155 160Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly

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195 200 205Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

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(A)长度：269氨基酸

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130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

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210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265(2)SEQ ID NO：11的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：1140碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

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(i)序列特性： (A)长度：1140碱基对(B)类型：核酸(C)股：单股(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(genomic)(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140(2)SEQ ID NO：13的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：DNA(genomic)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT 30(2)SEQ ID NO：14的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：DNA(genomic)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T 31(2)SEQ ID NO：15的讯息：

(i)序列特性：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：DNA(genomic)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT 33

Claims

1.一种漂白组合物，它含有：

(a)有效剂量的蛋白酶，它是一种含有天然界未发现过的氨基酸序列的羰基水解酶的变体，是用不同的氨基酸在所说的前体羰基水解酶中等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的+76的位置，以及一个或多个下列氨基酸残基的位置上置换许多氨基酸残基而衍生出来的；这些位置等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的+99、+101、+103、+104、+107、+123、 +27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274；

(b)一种漂白剂，它或者是一种有机过氧酸，或者是一种漂白活化剂和一种能产生过氧化氢的过氧化物的结合物，后者能和活化剂反应并在由这种组合物形成的漂白溶液中就地形成一种有机过氧酸；

2.权利要求1的漂白组合物，其中的洗涤剂组合物材料是选自表面活性剂、溶剂、缓冲剂、酶、污垢释出剂、除污土剂、分散剂、增白剂、抑泡剂、织物软化剂、泡沫促进剂、酶稳定剂、增效剂、染料、香料以及它们的混合物。

3.权利要求2的漂白组合物，它被做成含有至少一种表面活性剂的用作织物洗涤组合物的形式。

4.权利要求3的漂白组合物，它含有至少大约5％的表面活性剂，后者可选自烷基苯磺酸盐、一级烷基硫酸酯、二级烷基硫酸酯、烷基烷氧基硫酸酯、烷基烷氧基羧酸酯、烷基多糖苷和它们相应的硫酸化的多糖苷、α-磺化的脂肪酸酯、烷基和烷基酚烷氧化物、三甲胺乙内酯和磺化的三甲胺乙内酯、胺氧化物、N-甲基葡糖酰胺、非离子性的一级醇乙氧化物、非离子性的一级醇混合的乙氧/丙氧化物以及它们的混合物。

5.权利要求4的漂白组合物，它进一步含有至少大约5％的增效剂，后者可选自沸石、聚羧酸盐、层状硅酸盐、磷酸盐以及它们的混合物。

6.权利要求4的漂白组合物，它被做成含有至少大约30％表面活性剂的浓缩颗粒状织物洗涤组合物的形式。

7.权利要求1的漂白组合物，其中的洗涤组合物材料含有至少一种酶，它可选自纤维素酶、脂酶、淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶以及它们的混合物。

8.权利要求1的漂白组合物，它被做成含有至少一种溶剂和至少一种表面活性剂的用作液体织物洗涤组合物的形式。

9.权利要求8的漂白组合物，它含有水和至少5％的表面活性剂。

10.权利要求1的漂白组合物，其中的洗涤组合物材料含有至少一种织物软化剂。

11.权利要求1的洗涤组合物，其中作为蛋白酶前体的羰基水解酶是一种枯草溶菌素，并且蛋白酶是一种枯草溶菌素变种，它在等价于以下所列出的位置上进行了一系列置换：76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/126，76/103/104/135，76/103/104/197，76/103/104/222，76/103/104/260，76/103/104/265，76/103/104/126/265，27/76/104/123/274，27/76/104/109/123/274，27/76/104/123/218/274，27/76/104/123，27/76/104/107/123，27/76/104/109/123，27/76/104/109/123/218/274，27/76/104/123/197，27/76/104/123/204，27/76/104/123/206，27/76/104/123/216，27/76/104/123/218，27/76/104/123/260，27/76/104/123/195/197，27/76/104/123/195/218，27/76/104/123/197/218，27/76/104/123/204/218，27/76/104/123/206/218，27/76/104/123/218/260，27/76/104/123/195/197/218，76/103/104/217，76/103/104/156，76/103/104/166，76/103/104/105，76/101/103/104，76/103/104/128，76/103/104/210，76/103/104/107，76/103/104/204，76/217，76/103/104/156/166和76/103/104/128.

12.权利要求1中的洗涤组合物，其中的蛋白酶是选自以下所列的枯草溶菌素的变种：76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222.

13.一种织物洗涤组合物，它含有：

(a)有效剂量的蛋白酶，它是一种含有天然界未发现过的氨基酸序列的羰基水解酶的变种，是由一种枯草溶菌素前体羰基水解酶衍生而来的，并且其中蛋白酶是选自以下所列的枯草溶菌素的变

种：N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V1041/S105A；N76D/S1D3A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N，和N76D/S103A/V104I/M222A

以及它们的混合物；

(b)大约0.5％至大约20％的选自下面列出的漂白剂：

(i)一种具有下式的有机过氧酸：

其中R¹是一个含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，R²是一个含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基，R⁵是H或一个含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，

(ii)一种漂白活化剂和一种能产生过氧化氢的过氧化物的结合物，后者能和活化剂反应并在由这种组合物形成的漂白溶液中就地形成一种有机过氧酸，其中所说的漂白活化剂具有下列通式：其中R是一个含有大约5个至大约18个碳原子的烷基，其中由羰基碳原子延伸并包括这羰基碳原子的最长的线型烷基链含有大约6至大约10个碳原子；L是一个离去基团，它的共轭酸的pKa值在大约4至大约13的范围内；

(c)一种或多种能与蛋白酶以及漂白剂配伍的洗涤组合物材料，按组合物的重量计算，漂白剂含有至少大约5％的表面活性剂和至少大约5％的增效剂。

14.权利要求13的织物洗涤组合物，它进一步含有选自下列物质的洗涤组合物材料：溶剂、缓冲剂、酶、污垢释出剂、除污土剂、分散剂、增白剂、抑泡剂、织物软化剂、泡沫促进剂、酶稳定剂、染料、香料以及它们的混合物。

15.权利要求13的织物洗涤组合物，它进一步含有至少一种酶，后者可选自纤维素酶、脂酶、淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶以及它们的混合物。

16.权利要求13的织物洗涤组合物，它被做成液体的、颗粒状的或条状的形式。

17.权利要求13的织物洗涤组合物，其中的蛋白酶是一种枯草溶菌素变种，可选自：N76D/S99D，N76D/V104I，N76D/S99D/V104I，N76D/S103A/V104I，N76D/V104I/I107V，N76D/V104Y/I107V，N76D/S101R/S103A/V104I，N76D/S99D/S101R/S103A/V104I，N76D/S101R/V104I，以及它们的混合物。

18.权利要求13的织物洗涤组合物，其中的蛋白酶是选自N76D/V104I、N76D/S103A/V104I的一种杆菌枯草溶菌素变种以及它们的混合物。

19.权利要求13的织物洗涤组合物，它含有一种漂白剂，其中包含至少大约0.1％(重量)的能在水溶液中产生过氧化氢的过氧漂白化合物以及至少大约0.1％(重量)的一种或多种漂白活化剂，其中所说的漂白活化剂是选自下列物质：

a)一种具有下列通式的漂白活化剂：

或它们的混合物，其中R¹是一个含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，R²是一个含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基，R⁵是氢或一个含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，L是一个离去基团，

b)一种具有下式的苯并噁嗪型漂白活化剂：

其中R₁是H、烷基、烷基芳基、芳基、芳基烷基，并且其中R₂、R₃、R₄和R₅可以是相同或不同的取代基，可选自H、卤素、烷基、烯基、芳基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、-COOR₆，其中R₆是H或一个烷基和羰基官能基，

c)一种具有下式的N-酰基己内酰胺型漂白活化剂：其中R⁶是H或-个含有1至12个碳原子的烷基、芳基、烷氧基芳基或烷基芳基，

d)a)、b)和c)组合的混合物。

20.权利要求13的织物洗涤组合物，其中有机过氧酸漂白剂中相应的羧酸的亲水-亲油平衡值在大约3至大约6.5的范围内。

21.权利要求20的织物洗涤组合物，其中每100克组合物中蛋白酶的毫克数对有机过酸理论上可获得的O₂的ppm的比率是在大约1∶1至大约20∶1的范围内。

22.一种织物洗涤组合物，它包含：

(a)大约0.0001％至大约10％的蛋白酶，它是由迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素衍生的一种N76D/S103A/V104I的枯草溶菌素变种；

(b)大约0.5％至大约20％的漂白系统，它含有至少大约0.1％(重量)的在水溶液中能产生过氧化氢的过氧漂白化合物以及至少0.1％(重量)的一种或多种漂白活化剂，其中所说的漂白活化剂是选自下列物质：

i)一种具有下列通式的漂白活化剂：

或它们的混合物，其中R¹是一个含有大约1至大约14个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，R²是一个含有大约1至大约14个碳原子的亚烷基、亚芳基或亚烷基芳基，R⁵是H或一个含有大约1至大约10个碳原子的烷基、芳基或烷基芳基，L是一个离去基团，

ii)一种具有下列通式的苯并噁嗪型漂白活化剂：

iii)一种具有下式的N-酰基己内酰胺型的漂白活化剂：

其中R₆是H或一个含有1至12个碳原子的烷基、芳基、烷氧基芳基或烷基芳基，

iv)i)、ii)和iii)的混合物。

(c)至少大约5％的表面活性剂；

(d)至少大约5％的增效剂；和

(e)任选地还可含有一种或多种能和蛋白酶及漂白体系配伍的洗涤组合物材料，它可选自溶剂、缓冲剂、酶、污垢释出剂、除污土剂、分散剂、增白剂、抑泡剂、织物软化剂、泡沫促进剂、酶稳定剂、染料、香料以及它们的混合物。

23.权利要求22的织物洗涤组合物，其中的表面活性剂是选自烷基苯磺酸盐、一级烷基硫酸酯、二级烷基硫酸酯、烷基烷氧基硫酸酯、烷基烷氧基羧酸酯、烷基多糖苷和它们相应的硫酸化的多糖苷、α-磺化的脂肪酸酯、烷基和烷基酚烷氧化物、三甲胺乙内酯和磺化的三甲胺乙内酯、胺氧化物、N-甲基葡糖酰胺、非离子性的一级醇乙氧化物、非离子性的一级醇混合的乙氧/丙氧化物以及它们的混合物；其中进一步含有的增效剂可选自沸石、聚羧酸酯、层状硅酸盐、磷酸盐以及它们的混合物。

24.权利要求23的组合物，它进一步含有至少大约0.001％的按所说洗涤组合物重量计算的至少一种酶，它可选自蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶、过氧化物酶以及它们的混合物。

25.一种权利要求22的组合物，其中所说的漂白活化剂是选自苯甲酰基己内酰胺、壬酰基己内酰胺、(6-壬酰胺基己酰基)氧苯磺酸盐以及它们的混合物。

26.一种权利要求22的组合物，其中的过氧漂白化合物是选自过硼酸钠一水合物、过硼酸钠四水合物、焦磷酸钠过氧水合物、尿素过氧水合物、过碳酸钠、过氧化钠以及它们的混合物。

27.一种权利要求26的组合物，其中过氧化氢对漂白活化剂的摩尔比大于约1.0。

28.一种权利要求22的组合物，其中R¹是一个含有大约6至大约12个碳原子的烷基，R²含有大约1至大约8个碳原子，R⁵是H或甲基。

29.一种权利要求22的组合物，其中R¹是一个含有大约7至大约10个碳原子的烷基，R²含有大约4至大约5个碳原子，并且其中的L是选自下列基团：

其中R³是一个含有大约1至大约8个碳原子的烷基链，Y是-SO₃ ^-M⁺或-CO₂ ^-M⁺，其中M是钠或钾。

30.一种权利要求22的组合物，它含有一种N-酰基己内酰胺，后者可选自苯甲酰基己内酰胺、辛酰基己内酰胺、壬酰基己内酰胺、3，5，5-三甲基己酰基己内酰胺、癸酰基己内酰胺、十一碳烯酰基己内酰胺以及它们的混合物。

31.一种洗涤织物的方法，所说的方法包括把需要洗涤的织物与一种含有效量的权利要求1的组合物的洗涤溶液接触。

32.一种洗涤织物的方法，所说的方法包括把需要洗涤的织物与一种含有效量的权利要求22的组合物的洗涤溶液接触。