ES2287931T3 - Composiciones limpiadoras que contienen proteasa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES LIMPIADORAS QUE CONTIENEN LA ENZIMA PROTEASA QUE ES UNA VARIANTE DE LA CARBONIL HIDROLASA Y A UNA SECUENCIA AMINOACIDA QUE NO SE ENCUENTRA EN LA NATURALEZA, QUE SE DERIVA REEMPLAZANDO UNA PLURALIDAD DE RESIDUOS AMINOACIDOS DEL PRECURSOR DE LA CARBONIL HIDROLASA CON DISTINTOS AMINOACIDOS, EN LAS QUE DICHA PLURALIDAD DE RESIDUOS AMINOACIDOS REEMPLAZADOS EN LA ENZIMA PRECURSORA CORRESPONDEN A LAS POSICIONES +76 EN COMBINACION CON UNO O MAS DE LOS SIGUIENTES RESIDUOS: +99, +101,+103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265, Y/O +274, EN LAS QUE LAS POSICIONES NUMERADAS CORRESPONDEN A SUBTILISINA PRODUCIDA NATURALMENTE A PARTIR DEL BACILO AMILOLIQUEFACIENS O A RESIDUOS AMINOACIDOS EQUIVALENTES EN OTRAS CARBONIL HIDROLASAS O SUBTILISINAS (COMO LA SUBTILISINA DEL BACILO LENTUS).
Description
Composiciones limpiadoras que contienen
proteasa.
Esta solicitud es una solicitud de continuación
en parte de la solicitud US-08/136.797, presentada
el 4 de octubre de 1993, y la solicitud
US-08/237.938, presentada el 2 de mayo de 1994,
ambas incorporadas íntegramente como referencia en la presente
memoria.
La presente invención se refiere a una variedad
de composiciones limpiadoras que comprenden enzimas proteasa
novedosas que son variantes de la carbonil hidrolasa.
Las enzimas constituyen la clase más numerosa de
proteínas naturales. Cada clase de enzima generalmente cataliza
(acelera una reacción sin ser consumida) una clase diferente de
reacción química. Una clase de enzimas conocidas como proteasas son
conocidas por su capacidad de hidrolizar (romper un compuesto en dos
o más compuestos más simples absorbiendo las partes H y OH de una
molécula de agua en cada parte del enlace químico escindido) otras
proteínas. Se ha aprovechado esta capacidad de hidrolizar proteínas
incorporando proteasas naturales y proteasas manipuladas mediante
ingeniería de proteínas como un aditivo para preparaciones
detergentes para el lavado de ropa. Muchas de las manchas que se
producen en las prendas de vestir son proteináceas y las proteasas
de amplia especificidad pueden mejorar básicamente la eliminación de
dichas manchas.
Desgraciadamente, el nivel de eficacia de estas
proteínas en su entorno bacteriano natural frecuentemente no es
igual en el entorno de lavado relativamente artificial.
Específicamente, las características de las proteasas, tales como
estabilidad térmica, estabilidad frente al pH, estabilidad oxidativa
y especificidad por el sustrato no están necesariamente optimizadas
para su uso fuera del entorno natural de la enzima.
La secuencia de aminoácidos de la enzima
proteasa determina las características de la proteasa. Un cambio en
la secuencia de aminoácidos de la proteasa puede alterar las
propiedades de la enzima en diversos grados, o incluso puede
inactivar la enzima, dependiendo de la ubicación, naturaleza y/o
magnitud del cambio en la secuencia de aminoácidos. Se han adoptado
diversos enfoques para alterar la secuencia de aminoácidos de la
proteasa en un intento de mejorar sus propiedades, con el fin de
aumentar la eficacia de la proteasa para usos de limpieza tales
como en el entorno de lavado. Estos métodos incluyen la alteración
de la secuencia de aminoácidos para mejorar la estabilidad térmica
y mejorar la estabilidad frente a la oxidación en condiciones
bastante diversas.
A pesar de los diversos métodos descritos en la
técnica, sigue existiendo la necesidad de nuevas variantes de
proteasas eficaces útiles para la limpieza de una diversidad de
superficies. Es por tanto un objeto de la presente invención
proporcionar composiciones limpiadoras que contienen enzimas
proteasa que son variantes de la carbonil hidrolasa que tienen
actividad proteolítica mejorada, especificidad de sustrato,
estabilidad y/o características de rendimiento mejoradas. Estos y
otros objetos resultarán más fácilmente comprensibles a partir de
la siguiente descripción
detallada.
detallada.
La presente invención se refiere a composiciones
limpiadoras que comprenden:
- (a)
- una cantidad eficaz de enzima proteasa que es una variante de la carbonil hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora, y en donde la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S101R; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/ V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/ I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/ S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/ S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/ V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/ S265N y N76D/S103A/V104I/M222A y mezclas de las mismas; en donde las posiciones numeradas corresponden a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens o a residuos aminoácido equivalentes en otras carbonil hidrolasas o subtilisinas (tales como subtilisina de Bacillus lentus); y
- (b)
- uno o más materiales de composiciones limpiadoras compatibles con la enzima proteasa.
La presente invención se refiere también a
métodos para limpiar artículos que precisan limpieza poniendo dicho
artículo en contacto con una enzima proteasa que es una variante de
la carbonil hidrolasa como se describe en la presente memoria. La
invención abarca por tanto un método para limpiar tejidos que
comprende poner en contacto, preferiblemente con agitación, dichos
tejidos con una solución acuosa que contiene dicha enzima proteasa.
El método se puede llevar a cabo a temperaturas por debajo de
aproximadamente 60ºC pero, por supuesto, es bastante eficaz a
temperaturas de lavado de ropa hasta la ebullición. La presente
invención también se refiere a un método para limpiar platos
poniendo un plato que precisa limpieza en contacto con una enzima
proteasa como se describe en la presente memoria. Los métodos de la
presente invención también incluyen métodos de aseo personal,
comprendiendo dichos métodos poner la parte del cuerpo del ser
humano o animal inferior que precisa limpieza en contacto con una
enzima proteasa como se describe en la presente memoria.
Las Fig. 1 A-C representan la
secuencia de ADN y de aminoácidos para la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens y un mapa de restricción parcial de este gen
(SEC. n.º 6).
La Fig. 2 representa los residuos de aminoácidos
conservados entre subtilisinas de Bacillus amyloliquefaciens
(BPN') y Bacillus lentus (cepa natural).
Las Figuras 3A y 3B representan la secuencia de
aminoácidos para cuatro subtilisinas. La línea superior representa
la secuencia de aminoácidos de la subtilisina a partir de la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (a veces referida
también como subtilisina BPN') (SEC. n.º 7). La segunda línea
representa la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de
Bacillus subtilis (SEC. n.º 8). La tercera línea representa
la secuencia de aminoácidos de la subtilisina de B.
licheniformis (SEC. n.º 9). La cuarta línea representa la
secuencia de aminoácidos de la subtilisina de Bacillus
lentus (también referida como subtilisina 309 en la patente PCT
WO89/06276) (SEC. n.º 10). El símbolo * indica la ausencia de
residuos de aminoácidos específicos en comparación con la
subtilisina BPN'.
La Fig. 4 representa la construcción de plásmido
GGA274.
La Fig. 5 representa la construcción de GGT274
que es un producto intermedio para ciertos plásmidos de expresión
usados en esta solicitud.
Las Fig. 6A y 6B representan la secuencia de ADN
y aminoácidos de la subtilisina de Bacillus lentus (SEC. n.º
11). La proteína de subtilisina madura está codificada por los
codones que empiezan en el codón GCG (334-336) que
corresponde a Ala.
Las Fig. 7A y 7B representan la secuencia de ADN
y de aminoácidos de una realización preferida de la invención
(N76D/S103A/V104I) (SEC. n.º 12). El ADN en esta figura se ha
modificado por los métodos descritos para codificar aspartato en la
posición 76, alanina en la posición 103 e isoleucina en la posición
104. La proteína de la variante de la subtilisina madura está
codificada por los codones que empiezan en el codón GCG
(334-336) que corresponde a Ala.
La Fig. 8 representa la construcción del vector
pBCDAICAT.
La Fig. 9 representa la construcción del vector
pUCCATFNA.
La Fig. 10 muestra la estabilidad de una enzima
mutante preferida comparada con la cepa natural, en una formulación
de detergente líquido.
Esta invención incluye enzimas proteasa que son
variantes de la carbonil hidrolasa no naturales que tienen una
actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de substrato,
perfil de pH y/o característica de rendimiento diferentes en
comparación con la carbonil hidrolasa precursora a partir de la que
se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. La carbonil
hidrolasa precursora puede ser una carbonil hidrolasa natural o una
hidrolasa recombinante. Específicamente, dichas variantes de la
carbonil hidrolasa tienen una secuencia de aminoácidos que no se
encuentra en la naturaleza que se deriva por sustitución de una
pluralidad de residuos de aminoácidos de una carbonil hidrolasa
precursora con diferentes aminoácidos. La pluralidad de residuos de
aminoácidos de la enzima precursora corresponde a la posición +76
junto con uno o más de los siguientes residuos +103, +104, donde la
posición numerada corresponde a la subtilisina natural de
Bacillus amyloliquefaciens o a residuos de aminoácidos
equivalentes en otras carbonil hidrolasas o subtilisinas, tales como
subtilisina de Bacillus lentus.
Las variantes de la carbonil hidrolasa que son
enzimas proteasa útiles en las composiciones de la presente
invención comprenden la sustitución del residuo de aminoácido +76
junto con una o más modificaciones adicionales. Las enzimas
proteasa variantes útiles para la presente invención comprenden la
sustitución, deleción o inserción de residuos de aminoácido en las
siguientes combinaciones: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104;
76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123;
76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104; 76/101/103/104;
76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104;
76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128;
76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105;
76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/
107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 y/o 76/103/104/222. Preferiblemente las enzimas variantes útiles para la presente invención comprenden la sustitución, deleción o inserción de un residuo de aminoácido en las siguientes combinaciones de residuos: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104 de subtilisina de B. amyloliquefaciens.
107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 y/o 76/103/104/222. Preferiblemente las enzimas variantes útiles para la presente invención comprenden la sustitución, deleción o inserción de un residuo de aminoácido en las siguientes combinaciones de residuos: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104 de subtilisina de B. amyloliquefaciens.
Las secuencias de ADN variantes que codifican
dichas variantes de carbonil hidrolasa o subtilisina se derivan de
una secuencia de ADN precursora que codifica una enzima precursora
natural o recombinante. Las secuencias de ADN variantes se derivan
modificando la secuencia de ADN precursora para codificar la
sustitución de uno o más residuos de aminoácidos específicos
codificados por la secuencia de ADN precursora correspondiente a
las posiciones 76, 99, 101, 103, 104, donde la variante debe estar
al menos sustituida en la posición 76 y 103 ó 104, 107, 123, 27,
105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216,
217, 218, 222, 260, 265 y/o 274, en Bacillus
amyloliquefaciens o en cualquier combinación de las mismas.
Aunque los residuos de aminoácidos identificados para la
modificación en la presente invención se identifican según la
numeración aplicable a B. amyloliquefaciens (que se ha
convertido en el método convencional para identificar posiciones de
residuos en todas las subtilisinas), la secuencia de ADN precursora
preferida útil para la presente invención es la secuencia de ADN de
Bacillus lentus que se muestra en la Fig. 6
(SEC. n.º 11).
(SEC. n.º 11).
Estas secuencias de ADN variantes codifican la
inserción o sustitución del residuo de aminoácido 76 junto con una
o más modificaciones adicionales. Las secuencias de ADN variantes
codifican la sustitución o inserción de residuos de aminoácidos en
las siguientes combinaciones: 76/103; 76/104; 76/99/103; 76/99/104;
76/101/103; 76/101/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/104/123;
76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104; 76/99/103/104;
76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123; 76/99/101/103/104;
76/99/103/104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128;
76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/105;
76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/
107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 y/o 76/103/104/222. Preferiblemente las secuencias de ADN variantes se codifican para modificar las siguientes combinaciones de residuos: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104. Estas secuencias de ADN recombinantes codifican variantes de la carbonil hidrolasa que tienen una secuencia de aminoácidos novedosa y, en general, al menos una propiedad que es prácticamente diferente de la misma propiedad de la enzima codificada por la secuencia de ADN de la carbonil hidrolasa precursora. Dichas propiedades incluyen actividad proteolítica, especificidad de sustrato, estabilidad, perfil de pH alterado y/o características de rendimiento mejoradas.
107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265 y/o 76/103/104/222. Preferiblemente las secuencias de ADN variantes se codifican para modificar las siguientes combinaciones de residuos: 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104. Estas secuencias de ADN recombinantes codifican variantes de la carbonil hidrolasa que tienen una secuencia de aminoácidos novedosa y, en general, al menos una propiedad que es prácticamente diferente de la misma propiedad de la enzima codificada por la secuencia de ADN de la carbonil hidrolasa precursora. Dichas propiedades incluyen actividad proteolítica, especificidad de sustrato, estabilidad, perfil de pH alterado y/o características de rendimiento mejoradas.
Las enzimas proteasa útiles en la presente
invención abarcan la sustitución de cualquiera de los diecinueve
L-aminoácidos naturales en las posiciones designadas
de residuo de aminoácido. Tales sustituciones pueden hacerse en
cualquier subtilisina precursora (procariota, eucariota, de
mamífero, etc.). En esta solicitud se hace referencia a varios
aminoácidos por medio de códigos comunes de una y de tres letras.
Tales códigos se identifican en Dale, M.W. (1989), Molecular
Genetics of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Apéndice
B.
Preferiblemente, la sustitución que se ha de
realizar en cada una de las posiciones de residuo de aminoácido
identificadas incluye, aunque no de forma limitativa: sustituciones
en la posición 76 que incluyen D, H, E, G, F, K, P y N;
sustituciones en la posición 99 que incluyen D, T, N, Q, G y S;
sustituciones en la posición 101 que incluyen G, D, K, L, A, E, S y
R; sustituciones en la posición 103 que incluyen Q, T, D, E, Y, K,
G, R, S y A; sustituciones en la posición 104 que incluyen los
diecinueve aminoácidos naturales; sustituciones en la posición 107
que incluyen V, L, M, Y, G, E, F, T, S, A, N e I; sustituciones en
la posición 123 que incluyen N, T, I, G, A, C y S; sustituciones en
la posición 27 que incluyen K, N, C, V y T; sustituciones en la
posición 105 que incluyen A, D, G, R y N; sustituciones en la
posición 107 que incluyen A, L, V, Y, G, F, T, S y A; sustituciones
en la posición 109 que incluyen S, K, R, A, N y D; sustituciones en
la posición 126 que incluyen A, F, I, V y G; sustituciones en la
posición 128 que incluyen G, L y A; sustituciones en la posición
135 que incluyen A, F, I, S y V; sustituciones en la posición 156
que incluyen D, E, A, G, Q y K; sustituciones en la posición 166
que incluyen los diecinueve aminoácidos naturales; sustituciones en
la posición 195 que incluyen E; sustituciones en la posición 197
que incluyen E; sustituciones en la posición 204 que incluyen A, G,
C, S y D; sustituciones en la posición 206 que incluyen L, Y, N, D y
E; sustituciones en la posición 210 que incluyen L, I, S, C y F;
sustituciones en la posición 216 que incluyen V, E, T y K;
sustituciones en la posición 217 que incluyen los diecinueve
aminoácidos naturales; sustituciones en la posición 218 que
incluyen S, A, G, T y V; sustituciones en la posición 222 que
incluyen los diecinueve aminoácidos naturales; sustituciones en la
posición 260 que incluyen P, N, G, A, S, C, K y D; sustituciones en
la posición 265 que incluyen N, G, A, S, C, K, Y y H; y
sustituciones en la posición 274 que incluyen A y S. El (los)
aminoácido(s) específicamente preferido(s) que
se
ha(n) de sustituir en cada una de dichas posiciones se designa(n) a continuación en la Tabla I. Aunque en la Tabla I se muestran aminoácidos específicos, se debe entender que se puede sustituir cualquier aminoácido en los residuos identificados.
ha(n) de sustituir en cada una de dichas posiciones se designa(n) a continuación en la Tabla I. Aunque en la Tabla I se muestran aminoácidos específicos, se debe entender que se puede sustituir cualquier aminoácido en los residuos identificados.
\vskip1.000000\baselineskip
| Aminoácido | Aminoácido preferido que se |
| Residuo | ha de sustituir/insertar |
| +76 | D,H |
| +99 | D,T,N,G |
| +101 | R,G,D,K,L,A,E |
| +103 | A,Q,T,D,E,Y,K,G,R |
| +104 | I,Y,S,L,A,T,G,F,M,W,D,V,N |
| +107 | V,L,Y,G,F,T,S,A,N |
| +123 | S,T,I |
| +27 | K |
| +105 | A,D |
| +109 | S,K,R |
| +126 | A,I,V,F |
| +128 | G,L |
| +135 | I,A,S |
| +156 | E,D,Q |
| +166 | D,G,E,K,N,A,F,I,V,L |
| +195 | E |
| +197 | E |
| +204 | A,G,C |
| +206 | L |
| +210 | I,S,C |
| +216 | V |
| +217 | H,I,Y,C,A,G,F,S,N,E,K |
| +218 | S |
| +222 | A,Q,S,C,I,K |
| +260 | P,A,S,N,G |
| +265 | N,A,G,S |
| +274 | A,S |
Estas enzimas proteasa que contienen mutaciones
in vitro en la subtilisina de B. lentus en un residuo
de aminoácido equivalente a +76 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens producen variantes de subtilisina que
presentan estabilidad alterada (p. ej., estabilidad autoproteolítica
modificada) con respecto a subtilisinas precursoras. (Véanse las
Tablas IV y VI).
Además, la mutación in vitro en residuos
equivalentes a +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109,
+126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216,
+217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 en la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens, por sí solos o en combinación
entre sí y en cualquier combinación con mutaciones de +76, producen
variantes de subtilisina que presentan actividad proteolítica
alterada, estabilidad térmica alterada, perfil de pH alterado,
especificidad de sustrato alterada y/o características de
rendimiento alteradas.
Las carbonil hidrolasas son enzimas proteasa que
hidrolizan compuestos que contienen enlaces
\delm{O}{\delm{\dpara}{C --
X}}
en donde X es oxígeno o nitrógeno.
Incluyen carbonil hidrolasas naturales y carbonil hidrolasas
recombinantes. Las carbonil hidrolasas naturales principalmente
incluyen hidrolasas, p. ej., péptido hidrolasas tales como
subtilisinas o metaloproteasas. Las péptido hidrolasas incluyen
\alpha-aminoacilpéptido hidrolasa, peptidil
aminoácido hidrolasa, acilamino hidrolasa, serina carboxipeptidasa,
metalocarboxipeptidasa, tiol proteinasa, carboxilproteinasa y
metaloproteinasa. Se incluye serina proteasas, metalo proteasas,
tiol proteasas y proteasas ácidas, así como endoproteasas y
exoproteasas.
La expresión "carbonil hidrolasa
recombinante" se refiere a una carbonil hidrolasa en donde la
secuencia de ADN que codifica la carbonil hidrolasa natural se
modifica para producir una secuencia de ADN mutante que codifica la
sustitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos en la
secuencia de aminoácido de la carbonil hidrolasa. Métodos de
modificación adecuados se describen en la presente memoria y en las
patentes US-4.760.025 (RE 34.606),
US-5.204.015 y US-5.185.258, cuyas
descripciones se incorporan como referencia en la presente
memoria.
Las subtilisinas son carbonil hidrolasas
bacterianas o fúngicas que generalmente actúan para escindir enlaces
péptido de proteínas o péptidos. En la presente memoria, el término
"subtilisina" se refiere a una subtilisina natural o una
subtilisina recombinante. Se sabe que una serie de subtilisinas
naturales es producida y a menudo secretada por diversas especies
microbianas. Las secuencias de aminoácido de los miembros de esta
serie no son totalmente homólogas. No obstante, las subtilisinas de
esta serie presentan el mismo tipo de actividad proteolítica o un
tipo similar. Esta clase de serina proteasas comparte una secuencia
de aminoácidos común que define una triada catalítica que las
distingue de la clase de serina proteasas relacionadas con la
quimotripsina. Las subtilisinas y las serina proteasas relacionadas
con quimotripsina tienen una triada catalítica que comprende
aspartato, histidina y serina. En las proteasas relacionadas con
subtilisina el orden relativo de estos aminoácidos, leyendo desde
el extremo amino al carboxi, es
aspartato-histidina-serina. En las
proteasas relacionadas con quimotripsina el orden relativo, sin
embargo, es
histidina-aspartato-serina. Por
tanto, la subtilisina en la presente memoria se refiere a una
serina proteasa que tiene la triada catalítica de las proteasas
relacionadas con subtilisina. Los ejemplos incluyen, aunque no de
forma limitativa, las subtilisinas identificadas en la Fig. 3 en la
presente memoria.
La expresión "subtilisina recombinante" se
refiere a una subtilisina en la que la secuencia de ADN que codifica
la subtilisina se modifica para producir una secuencia de ADN
variante (o mutante) que codifica la sustitución, deleción o
inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de
la subtilisina natural. Métodos adecuados para producir dicha
modificación y que se pueden combinar con los descritos en la
presente memoria incluyen los descritos en las patentes
US-4.760.025 (RE 34.606),
US-5.204.015 y US-5.185.258.
Las "carbonil hidrolasas no humanas" y los
ADN que las codifican se pueden obtener a partir de organismos
procarióticos y eucarióticos. Ejemplos adecuados de organismos
procarióticos incluyen organismos gram negativos tales como E.
coli o Pseudomonas y bacterias gram positivas tales como
Micrococcus o Bacillus. Ejemplos de organismos
eucarióticos a partir de los cuales se puede obtener carbonil
hidrolasa y sus genes incluyen levaduras tales como
Saccharomyces cerevisiae, hongos tales como
Aspergillus sp. y fuentes de mamíferos no humanos tales
como, por ejemplo, especies bovinas a partir de las que se
puede obtener el gen que codifica la quimosina de carbonil
hidrolasa. Como ocurre con las subtilisinas, se puede obtener una
serie de carbonil hidrolasas a partir de diversas especies
relacionadas que tienen secuencias de aminoácidos que no son
totalmente homólogas entre los miembros de dicha serie pero que, no
obstante, presentan el mismo tipo de actividad biológica o un tipo
similar. Por tanto, la carbonil hidrolasa no humana en la presente
memoria tiene una definición funcional que se refiere a carbonil
hidrolasas que están asociadas, directa o indirectamente, con
fuentes procarióticas y eucarióticas.
Una "variante de carbonil hidrolasa" tiene
una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de
aminoácidos de una "carbonil hidrolasa precursora". Las
carbonil hidrolasas precursoras (tales como una subtilisina)
incluyen carbonil hidrolasas (subtilisina) naturales y carbonil
hidrolasas (subtilisina) recombinantes. La secuencia de aminoácidos
de la variante de la carbonil hidrolasa se "deriva" de la
secuencia de aminoácidos de la hidrolasa precursora mediante
sustitución, deleción o inserción de uno o más aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos precursora. Dicha modificación es de la
"secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de
aminoácidos de la carbonil hidrolasa (subtilisina) precursora más
que la manipulación de la enzima carbonil hidrolasa (subtilisina)
precursora per se. Métodos adecuados para dicha manipulación
de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos descritos en
la presente memoria, así como métodos conocidos por los expertos en
la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes EP 0 328299,
WO89/06279 y las patentes y solicitudes US ya referenciadas en la
presente memoria).
En la presente memoria se identifican residuos
específicos correspondientes a la posición +76 junto con una o más
de las siguientes posiciones +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27,
+105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206,
+210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 de la subtilisina
de Bacillus amyloliquefaciens para la mutación. Los residuos
modificados se seleccionan de las siguientes combinaciones: 76/103;
76/104; 76/99/103; 76/99/104; 76/101/103; 76/101/104; 76/103/104;
76/104/107; 76/104/123; 76/107/123; 76/99/101/103; 76/99/101/104;
76/99/103/104; 76/101/103/104; 76/103/104/123; 76/104/107/123;
76/99/101/103/104; 76/99/103/
104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/
105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265; y/o 76/103/104/222; y con máxima preferencia son 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104. Estos números de posición de aminoácidos se refieren a los asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. Las enzimas proteasa útiles en la presente invención, sin embargo, no se limitan a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extienden a carbonil hidrolasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son "equivalentes" a los residuos identificados en particular en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Preferiblemente, la subtilisina precursora es subtilisina de Bacillus lentus y las sustituciones, deleciones o inserciones se realizan en el residuo de aminoácido equivalente en B. lentus que corresponde a los listados anteriormente.
104/123; 76/99/101/103/104/123; 76/103/104/128; 76/103/104/260; 76/103/104/265; 76/103/104/197; 76/103/104/
105; 76/103/104/135; 76/103/104/126; 76/103/104/107; 76/103/104/210; 76/103/104/126/265; y/o 76/103/104/222; y con máxima preferencia son 76/104; 76/99/104; 76/103/104; 76/104/107; 76/101/103/104; 76/99/101/103/104 y 76/101/104. Estos números de posición de aminoácidos se refieren a los asignados a la secuencia de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens madura presentada en la Fig. 1. Las enzimas proteasa útiles en la presente invención, sin embargo, no se limitan a la mutación de esta subtilisina particular sino que se extienden a carbonil hidrolasas precursoras que contienen residuos de aminoácidos en posiciones que son "equivalentes" a los residuos identificados en particular en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Preferiblemente, la subtilisina precursora es subtilisina de Bacillus lentus y las sustituciones, deleciones o inserciones se realizan en el residuo de aminoácido equivalente en B. lentus que corresponde a los listados anteriormente.
Un residuo (aminoácido) de una carbonil
hidrolasa precursora es equivalente a un residuo de subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens si es bien homólogo (es decir, que
corresponde en posición en estructura bien primaria o terciaria) o
análogo a un residuo o porción específicos de ese residuo en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (es decir, que
tiene la misma o similar capacidad funcional para combinarse,
reaccionar o interactuar químicamente).
Para establecer homología con la estructura
primaria, se compara directamente la secuencia de aminoácidos de
una carbonil hidrolasa precursora, con la secuencia primaria de la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens y especialmente
con una serie de residuos que se sabe que son invariantes en
subtilisinas cuya secuencia se conoce. La Fig. 2 en la presente
memoria muestra los residuos conservados como entre subtilisina de
amyloliquefaciens y subtilisina de B. lentus. Después
de alinear los residuos conservados, permitiendo las inserciones y
deleciones necesarias para mantener la alineación (es decir,
evitando la eliminación de residuos conservados a través de
deleción e inserción arbitrarias), se definen los residuos
equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria de
la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. La alineación
de residuos conservados preferiblemente debería conservar el 100%
de tales residuos. Sin embargo, también es adecuada la alineación
de más del 75%, o de hasta el 50%, de los residuos conservados para
definir residuos equivalentes. Se debería mantener la conservación
de la triada catalítica, Asp32/His64/Ser221.
Por ejemplo, en la Fig. 3 se alinea la secuencia
de aminoácidos de la subtilisina a partir de Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis (carlsbergensis) y Bacillus lentus,
para proporcionar la máxima cantidad de homología entre secuencias
de aminoácidos. Una comparación de estas secuencias muestra que hay
un número de residuos conservados contenidos en cada secuencia.
Estos residuos conservados (como entre BPN' y B. lentus) se
identifican en la Fig. 2.
Estos residuos conservados, por tanto, se pueden
usar para definir los correspondientes residuos de aminoácidos
equivalentes de la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens
en otras carbonil hidrolasas tales como la subtilisina de
Bacillus lentus (publicación de patente PCT núm. W089/06279
publicada el 13 de julio de 1989), la enzima precursora de la
subtilisina preferida en la presente invención o la subtilisina
referida como PB92 (patente EP O 328 299), que es altamente
homóloga a la subtilisina de Bacillus lentus preferida. Las
secuencias de aminoácidos de varias de estas subtilisinas se alinean
entre las Fig. 3A y 3B con la secuencia de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens para producir la máxima homología
de residuos conservados. Como se puede ver, hay una serie de
deleciones en la secuencia de Bacillus lentus en comparación
con la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Por lo
tanto, por ejemplo, el aminoácido equivalente para Val165 en la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens en las demás
subtilisinas es isoleucina para B. lentus y B.
licheniformis.
Por lo tanto, por ejemplo, el aminoácido en la
posición +76 es asparagina (N) en las subtilisinas tanto de B.
amyloliquefaciens como de B. lentus. En la variante de la
subtilisina preferida útil en la invención, sin embargo, el
aminoácido equivalente a +76 en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se sustituye con aspartato (D). En la Tabla
II y con fines ilustrativos se proporciona una comparación de todos
los residuos de aminoácidos identificados en la presente memoria
para sustitución frente a la sustitución preferida para cada una de
tales posiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
También se pueden definir residuos equivalentes
determinando la homología al nivel de estructura terciaria para una
carbonil hidrolasa precursora cuya estructura terciaria se ha
determinado por cristalografía de rayos X. Se definen residuos
equivalentes como aquellos para los que las coordinadas atómicas de
dos o más de los átomos de la cadena principal de un residuo de
aminoácidos particular de la carbonil hidrolasa precursora y la
subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N en N, CA en CA,
C en C y O en O) están dentro de 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm
después de la alineación. La alineación se consigue una vez que se
ha orientado y colocado el mejor modelo para dar el solapamiento
máximo de las coordinadas atómicas de átomos de proteínas que no
sean hidrógeno de la carbonil hidrolasa en cuestión a la subtilisina
de Bacillus amyloliquefaciens. El mejor modelo es el modelo
cristalográfico que da el factor R más bajo para datos de difracción
experimentales a la resolución más alta disponible.
Se definen residuos equivalentes que son
funcionalmente análogos a un residuo específico de la subtilisina
de Bacillus amyloliquefaciens, como los aminoácidos de las
carbonil hidrolasas precursoras que pueden adoptar una conformación
tal que bien alteren, modifiquen o contribuyan a la estructura de la
proteína, unión de sustratos o catálisis de una forma definida y
atribuida a un residuo específico de la subtilisina Bacillus
amyloliquefaciens. Además, son los residuos de la carbonil
hidrolasa precursora (para la que se ha obtenido una estructura
terciaria por cristalografía de rayos X) que ocupan una posición
análoga hasta el punto de que, aunque los átomos de la cadena
principal del residuo dado puede que no satisfagan los criterios de
equivalencia sobre la base de ocupar una posición homóloga, las
coordinadas atómicas de al menos dos de los átomos de la cadena
lateral del residuo se encuentran con 0,13 nm de los
correspondientes átomos de la cadena lateral de la subtilisina de
Bacillus amyloliquefaciens. Las coordinadas de la estructura
tridimensional de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens se exponen en la publicación EPO 0 251 446
(equivalente a la solicitud de patente US-SN
08/212.291, cuya descripción se incorpora como referencia en la
presente memoria) y se pueden usar como se ha indicado
anteriormente para determinar residuos equivalentes en el nivel de
estructura terciaria.
Algunos de los residuos identificados por
sustitución, inserción o deleción son residuos conservados mientras
otros no lo son. En el caso de residuos que no se conservan, la
sustitución de uno o más aminoácidos está limitada a sustituciones
que producen una variante que tiene una secuencia de aminoácidos que
no corresponde a una encontrada en la naturaleza. En el caso de
residuos conservados, tales sustituciones no deberían dar como
resultado una secuencia natural. Las variantes de la carbonil
hidrolasa útiles en la presente invención incluyen las formas
maduras de las variantes de la carbonil hidrolasa, así como las
proformas y preproformas de tales variantes de la hidrolasa. Las
preproformas son la construcción preferida puesto que esto facilita
la expresión, secreción y maduración de las variantes de la carbonil
hidrolasa.
"Prosecuencia" se refiere a una secuencia
de aminoácidos ligada a la parte N-terminal de la
forma madura de una carbonil hidrolasa que cuando se elimina da
como resultado la aparición de la forma "madura" de la carbonil
hidrolasa. Muchas enzimas proteolíticas se encuentran en la
naturaleza como proenzimas producto de la traducción y, en ausencia
de procedimientos postraduccionales, se expresan de este modo. Una
prosecuencia preferida para producir variantes de la carbonil
hidrolasa, específicamente variantes de la subtilisina, es la
supuesta prosecuencia de la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens, aunque se pueden utilizar otras prosecuencias
de la subtilisina. En los Ejemplos, se usa la supuesta prosecuencia
a partir de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC
21536).
Una "secuencia señal" o "presecuencia"
se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos ligada a la parte
N-terminal de una carbonil hidrolasa o a la parte
N-terminal de una prohidrolasa que puede participar
en la secreción de formas maduras o proformas de la hidrolasa. Esta
definición de secuencia señal es una definición funcional que
pretende incluir todas las secuencias de aminoácidos codificadas por
la parte N-terminal del gen de la subtilisina u
otras carbonil hidrolasas que se pueden secretar que participan en
la realización de la secreción de la subtilisina u otras carbonil
hidrolasas en condiciones naturales. Las enzimas proteasa útiles
para la presente invención utilizan tales secuencias para efectuar
la secreción de las variantes de la carbonil hidrolasa como se
describe en la presente memoria. Una secuencia señal preferida usada
en los Ejemplos comprende los primeros siete residuos de
aminoácidos de la secuencia señal a partir de la subtilisina de
Bacillus subtilis fusionados al resto de la secuencia señal
de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536).
Una forma "prepro" de una variante de la
carbonil hidrolasa consiste en la forma madura de la hidrolasa que
tiene una prosecuencia de forma operable unida al terminal amino de
la hidrolasa y una secuencia "pre" o "señal" de forma
operable unida al terminal amino de la prosecuencia.
"Vector de expresión" se refiere a una
construcción de ADN que contiene una secuencia de ADN que está de
forma operable unida a una secuencia de control adecuada capaz de
efectuar la expresión de dicho ADN en un huésped adecuado. Tales
secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la
transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar tal
transcripción, una secuencia que codifica puntos de unión de
ribosomas mRNA adecuados y secuencias que controlan la terminación
de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un
plásmido, una partícula de fago o simplemente una inserción
genómica potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el
vector se puede replicar y funcionar independientemente del genoma
huésped o puede, en algunos casos, integrarse en el genoma mismo.
En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector"
se usan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma más
comúnmente usada de vector actualmente. Sin embargo, en la presente
memoria se incluyen tales otras formas de vectores de expresión que
sirven funciones equivalentes y que son, o llegan a ser, conocidas
en la técnica.
Las "células huésped" usadas en la presente
invención normalmente son huéspedes procarióticos o eucarióticos
que preferiblemente se han manipulado por los métodos descritos en
la patente US-4.760.025 (RE 34.606) para hacerlos
incapaces de secretar endoproteasa enzimáticamente activa. Una
célula huésped preferida para expresar subtilisina es la cepa de
Bacillus BG2036 que es deficiente en proteasa neutra y
proteasa alcalina (subtilisina) enzimáticamente activas. La
construcción de la cepa BG2036 se describe con detalle en la patente
US-5.264.366. Otras células huésped para expresar
subtilisina incluyen Bacillus subtilis I168 (también se
describe en la patente US-4.760.025 [RE 34,606] y
la patente US-5.264.366, cuya descripción se
incorpora como referencia en la presente memoria), así como
cualquier cepa de Bacillus adecuada tal como B.
licheniformis, B. lentus, etc.
Las células huésped se transforman o transfectan
con vectores construidos usando técnicas de ADN recombinante. Tales
células huésped transformadas son capaces bien de replicar vectores
codificando las variantes de la carbonil hidrolasa o de expresar la
variante de la carbonil hidrolasa deseada. En el caso de vectores
que codifican la preforma o preproforma de la variante de la
carbonil hidrolasa, tales variantes, cuando se expresan, se
secretan de forma típica a partir de la célula huésped en el medio
de la célula huésped.
"Unida de forma operable", cuando se
describe la relación entre dos regiones de ADN, simplemente quiere
decir que están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo,
una presecuencia se une de forma operable a un péptido si funciona
como una secuencia señal, participando en la secreción de la forma
madura de la proteína lo más probablemente implicando segmentación
de la secuencia señal. Un promotor está de forma operable unido a
una secuencia codificante si controla la transcripción de la
secuencia; un punto de unión de ribosomas se une de forma operable
a una secuencia codificante si se coloca de forma que se permita la
traducción.
Se pueden obtener los genes que codifican la
carbonil hidrolasa precursora natural de acuerdo con los métodos
generales conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos
normalmente comprenden sintetizar sondas marcadas que tienen
supuestas secuencias que codifican regiones de la hidrolasa de
interés, preparar bibliotecas genómicas a partir de organismos que
expresan la hidrolasa e investigar las bibliotecas para el gen de
interés por hibridación de las sondas. Después se mapean y se
forman secuencias de los clones híbridados positivamente. El gen de
B. lentus usando en los Ejemplos se clona como se describe en
el Ejemplo 1 de la patente US-5.185.258, cuya
descripción se incorpora en la presente memoria. El gen de BPN'
usado en los Ejemplos se clona como se describe en el Ejemplo 1 en
RE 34.606, cuya descripción se incorpora en la presente memoria.
Después se usa la carbonil hidrolasa clonada
para transformar una célula huésped para expresar la hidrolasa. El
gen de la hidrolasa se liga después a un plásmido de número de
copias alto. Este plásmido se replica en huéspedes en el sentido de
que contiene los elementos bien conocidos necesarios para la
replicación de plásmidos: un promotor de forma operable unido al
gen en cuestión (que se puede suministrar como el propio promotor
homólogo del gen si se reconoce, es decir, se transcribe, por el
huésped), una terminación de transcripción y región de
poliadenilación (necesaria para la estabilidad del MRNA transcrito
por el huésped a partir del gen de la hidrolasa en ciertas células
huésped eucarióticas) que es exógena o se suministra por la región
terminadora endógena del gen de la hidrolasa y, deseablemente, un
gen de selección tal como un gen resistente a los antibióticos que
permite mantenimiento biológico continuo de células huésped
infectadas de plásmidos por crecimiento en medio que contiene
antibiótico. Los plásmidos de número de copias alto también
contienen un origen de replicación para el huésped, permitiendo de
ese modo que se generen grandes números de plásmidos en el
citoplasma sin limitaciones cromosómicas. Sin embargo, está dentro
del alcance de la presente invención integrar múltiples copias del
gen de la hidrolasa en el genoma huésped. Esto se facilita mediante
organismos procarióticos y eucarióticos que son especialmente
susceptibles a la recombinación homóloga.
Los genes usados en los presentes ejemplos son
un gen de B. lentus natural y un gen de B.
amyloliquefaciens natural. De forma alternativa, se puede
producir un gen sintético que codifique una carbonil hidrolasa
(subtilisina) precursora natural o mutante. En tal enfoque, se
determina la secuencia de ADN y/o aminoácidos de la hidrolasa
(subtilisina) precursora. Se sintetizan después de eso fragmentos de
ADN monocatenario sintéticos superpuestos, que en la hibricación y
ligadura producen un ADN sintético que codifica la hidrolasa
precursora. Un ejemplo de construcción de genes sintéticos se
expone en el Ejemplo 3 de la patente US-5.204.015,
cuya descripción se incorpora como referencia en la presente
memoria.
Una vez que se ha clonado el gen de la carbonil
hidrolasa precursora natural o sintético, se emprende una serie de
modificaciones para exaltar el uso del gen más allá de la síntesis
de la carbonil hidrolasa precursora natural. Tales modificaciones
incluyen la producción de carbonil hidrolasas recombinantes como se
describe en la patente US-4.760.025 (RE 34.606) y
la publicación EPO 0 251 446 y la producción de variantes de la
carbonil hidrolasa descritas en la presente memoria.
Se puede usar el siguiente método de mutagénesis
de casete para facilitar la construcción e identificación de las
variantes de la carbonil hidrolasa útiles en la presente invención,
aunque se pueden usar otros métodos incluyendo mutagénesis dirigida
al sitio. En primer lugar, se obtiene el gen natural que codifica la
hidrolasa y se ordena secuencialmente en todo o en parte. Después
la secuencia se escanea para un punto en el que se desea hacer una
mutación (deleción, inserción o sustitución) de uno o más
aminoácidos en la enzima codificada. Se evalúan las secuencias que
flanquean este punto por la presencia de sitios de restricción por
sustitución de un segmento corto del gen con un conjunto de
oligonucleótidos que cuando se expresa codificará diversos
mutantes. Tales sitios de restricción son sitios preferiblemente
únicos dentro del gen de la hidrolasa de forma que se facilite la
sustitución del segmento génico. Sin embargo, se puede usar
cualquier sitio de restricción oportuno que no sea demasiado
superfluo en el gen de la hidrolasa, siempre que los fragmentos
génicos generados por maduración de restricción se puedan volver a
reunir en la secuencia conveniente. Si no están presentes sitios de
restricción en posiciones dentro de una distancia oportuna a partir
del punto seleccionado (de 10 a 15 nucleótidos), tales sitios se
generan sustituyendo nucleótidos en el gen de tal modo que no cambie
la base de lectura ni los aminoácidos codificados en la
construcción final. La mutación del gen para cambiar su secuencia
para conformarlo a la secuencia deseada se lleva a cabo por
extensión de matriz M13 de acuerdo con los métodos normalmente
conocidos. La tarea de localizar regiones de flanqueo adecuadas y
evaluar los cambios necesarios para llegar a dos secuencias de
sitios de restricción convenientes se hace rutina por la
redundancia del código genético, un mapa enzimático de restricción
del gen y el gran número de enzimas de restricción diferentes.
Obsérvese que si está disponible un sitio de restricción de flanqueo
oportuno, el método anterior deberá ser usado sólo junto con la
región de flanqueo que no contiene un sitio.
Una vez que se clona el ADN natural o el ADN
sintético, los sitios de restricción que flanquean las posiciones
que se tienen que mutar, se maduran con las enzimas de restricción
de origen similar y se liga una pluralidad de casetes de
oligonucleótidos complementariamente terminales de extremo al gen.
La mutagénesis se simplifica por este método debido a que todos los
oligonucleótidos se pueden sintetizar de forma que tengan los mismos
sitios de restricción y no se requieren conectores sintéticos para
crear los sitios de restricción.
En la presente memoria, la actividad
proteolítica se define como la relación de hidrólisis de enlaces
peptídicos por miligramo de enzima activa. Existen muchos
procedimientos bien conocidos para medir la actividad proteolítica
(K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988).
Además de, o como alternativa para modificar la actividad
proteolítica, las enzimas variantes de la presente invención pueden
tener otras propiedades modificadas tales como K_{m}, K_{cat},
relación K_{cat}/K_{m} y/o especificidad de sustrato modificada
y/o perfil de actividad de pH modificado. Estas enzimas se pueden
adaptar para el sustrato particular que se prevé que esté presente,
por ejemplo, para procedimientos hidrolíticos tales como usos de
lavado de ropa.
Un objetivo puede ser asegurar una carbonil
hidrolasa variante que tenga actividad proteolítica modificada en
comparación con la carbonil hidrolasa precursora, puesto que
aumentar tal actividad (numéricamente mayor) permite el uso de la
enzima para que actúe más eficazmente sobre un sustrato objeto de
estudio. También son de interés enzimas variantes que tienen
estabilidad térmica modificada y/o especificidad de sustrato
modificada en comparación con el precursor. Preferiblemente la
carbonil hidrolasa que se ha de mutar es una subtilisina. En los
Ejemplos se presentan aminoácidos específicos útiles para obtener
tales resultados en carbonil hidrolasas de tipo subtilisina en
residuos equivalentes a +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27,
+105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206,
+210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 o cualquier
combinación de los mismos en la subtilisina de Bacillus
amyloliquefaciens. En algunos casos, puede ser deseable menor
actividad proteolítica. A la inversa, en algunos casos puede ser
deseable aumentar la actividad proteolítica de la enzima variante
frente a su precursor. De forma adicional, pueden ser deseable
aumentos o disminuciones (alteración) de la estabilidad del
variante, estabilidad bien alcalina o térmica. Los aumentos o
disminuciones en K_{cat}, K_{m} o K_{cat}/K_{m} son
específicos para el sustrato usado para determinar estos parámetros
cinéticos.
También, se ha determinado que los residuos
equivalentes a +76 junto con una serie de otras modificaciones en
la subtilisina son importantes en la modulación de la estabilidad
y/o actividad proteolítica total de la enzima. Por lo tanto, como
se expone en los Ejemplos, se puede sustituir la asparagina (N) en
la subtilisina de Bacillus lentus en posiciones equivalentes
+76 con aspartato (D) en las enzimas proteasa preferidas junto con
la modificación de uno o más de los residuos de aminoácidos
siguientes +103, +104 para producir mejor estabilidad y/o mejor
actividad de la enzima mutante resultante.
Las enzimas proteasa más preferidas útiles en
esta invención se exponen en los Ejemplos. Estos incluyen las
siguientes combinaciones específicas de residuos sustituidos:
N76D/V104I; N76D/S99D/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V;
N76D/V104Y/I107V y N76D/S101R/S103A/V104I. Estas sustituciones se
realizan en la subtilisina de Bacillus lentus (de tipo
recombinante o natural), aunque las sustituciones se pueden realizar
en cualquier subtilisina de Bacillus.
Sobre la base de los resultados obtenidos con
esta y otras subtilisinas variantes, es evidente que los residuos
en las carbonil hidrolasas (preferiblemente subtilisina)
equivalentes a posiciones +76, +99, +101, +103, +104, +107, +123,
+27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204,
+206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 y/o +274 en
Bacillus amyloliquefaciens son importantes para la actividad
proteolítica, el rendimiento y/o la estabilidad de estas enzimas y
la capacidad de limpieza o lavado de tales enzimas variantes.
Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo para
fabricar enzimas proteasa útiles en las composiciones de la
presente invención.
La clonación y la construcción para la expresión
del gen de la subtilisina de B. lentus se lleva a cabo
prácticamente al igual que se describió en la patente
US-5.185.258. El plásmido GGA274 (descrito en la
Fig. 4 en la presente memoria) se modifica además de la siguiente
forma, como se muestra en la Fig. 5. El sitio PstI que se introduce
durante la construcción del plásmido GGA274 se retira por la
mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos descrita a
continuación, con un oligonucleótido que tiene la siguiente
secuencia: 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' (SEC. n.º 1). El
residuo "A" subrayado elimina la secuencia de reconocimiento de
la enzima PstI de restricción y cambia el correspondiente residuo
de aminoácidos de alanina a treonina en la posición 274. La
treonina en la posición 274 es el residuo de cepa natural que se
encuentra originalmente en las secuencias génicas de la subtilisina
de B. lentus clonadas. El segmento de ADN que codifica la
subtilisina se toma por escisión del plásmido GGA274 o sus derivados
(GGT274 mostrado en la Fig. 5) por maduración de EcoRI y BamHI. El
fragmento de ADN se subclona de nuevo a vectores a base de
Bacteriofago M13, tal como MP19, para la mutagénesis. Después de la
mutagénesis, se lleva a cabo la maduración de EcoRI y HindIII,
seguida por la clonación, para devolver el gen de la subtilisina
mutado a un plásmido de expresión como GGA274 para la expresión y
la recuperación de proteínas de la subtilisina mutadas.
La mutagénesis dirigida a oligonucleótidos se
lleva a cabo como se describe en Zoller, M. y col. (1983),
Methods Enzymol., 100:468-500. Como
ejemplo, se usa un oligonucleótido sintético de la secuencia 5'
GCTGCTCTAGA
CAATTCG 3' (SEC. n.º 2) para cambiar el residuo de aminoácidos en la posición 76 de asparagina (N) a ácido aspártico (D), o N76D. Los residuos "G" y "C" subrayados indican cambios de la secuencia génica de cepa natural. El CA mantiene la leucina en la posición +75 y cambia la secuencia de aminoácidos para introducir un sitio de reconocimiento de XbaI de la enzima de restricción Xbal (TCTAGA), al tiempo que el cambio en GAC cambia asparagina en +76 a aspartato.
CAATTCG 3' (SEC. n.º 2) para cambiar el residuo de aminoácidos en la posición 76 de asparagina (N) a ácido aspártico (D), o N76D. Los residuos "G" y "C" subrayados indican cambios de la secuencia génica de cepa natural. El CA mantiene la leucina en la posición +75 y cambia la secuencia de aminoácidos para introducir un sitio de reconocimiento de XbaI de la enzima de restricción Xbal (TCTAGA), al tiempo que el cambio en GAC cambia asparagina en +76 a aspartato.
Para la mutagénesis en las posiciones 99, 101,
103 y 104, se pueden usar diferentes oligonucleótidos dependiendo
de la combinación de mutaciones deseada. Por ejemplo, se usa un
oligonucleótido de la secuencia 5' GTATTAGGGGC
GGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (SEC. n.º 3) para hacer simultáneamente los siguientes cambios: S99D; S101R; S103A y V104I en una única molécula de subtilisina. De forma similar, se utilizan los oligonucleótidos de la secuencia 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (SEC. n.º 4) y 5' CACGTTGCTAGCTT
GAGTTTAG 3' (SEC. n.º 5) para generar I107V y N123S, respectivamente. De nuevo, los residuos subrayados indican cambios a partir de secuencias de cepa natural que producen cambios deseados bien en secuencias de aminoácidos o secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción.
GGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (SEC. n.º 3) para hacer simultáneamente los siguientes cambios: S99D; S101R; S103A y V104I en una única molécula de subtilisina. De forma similar, se utilizan los oligonucleótidos de la secuencia 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3' (SEC. n.º 4) y 5' CACGTTGCTAGCTT
GAGTTTAG 3' (SEC. n.º 5) para generar I107V y N123S, respectivamente. De nuevo, los residuos subrayados indican cambios a partir de secuencias de cepa natural que producen cambios deseados bien en secuencias de aminoácidos o secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción.
Siguiendo los métodos de mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos anteriores, se preparan las variantes enumeradas
en la Tabla III. La actividad proteolítica de cada una de estas
variantes de la subtilisina se muestra en la Tabla III. Los
parámetros cinéticos k_{cat}, K_{M} y k_{cat}/K_{M} se miden
por hidrólisis del sustrato de péptidos sintético
succinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida
usando el método descrito en P. Bonneau y col. (1991) J. Am.
Chem. Soc., vol. 113, n.º 3, pág. 1.030. En pocas palabras, se
añade una pequeña alícuota de solución madre de variante de la
subtilisina a una cubeta de 1 cm que contiene sustrato disuelto en
tampón Tris-HCL 0,1 M, pH 8,6 y termostatizado a
25ºC. El desarrollo de la reacción se sigue espectrofotométricamente
controlando la absorbancia del producto de reacción
p-nitroanilina a 410 nm. Se obtienen parámetros
cinéticos usando un algoritmo de regresión no lineal para ajustar
la velocidad de la reacción y la concentración de producto para
cada reacción a la ecuación de Michaelis-
Menten.
Menten.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los resultados enumerados en la Tabla III
indican que todas las variantes de la subtilisina ensayadas retienen
actividad proteolítica. Además, el análisis detallado de los datos
revela que la actividad proteolítica se modifica significativamente
para la subtilisina de Bacillus lentus por las diversas
combinaciones de sustituciones en residuos de aminoácidos
equivalentes a las posiciones 76, 99, 101, 103, 104, 107 y 123 en
Bacillus amyloliquefaciens.
Una comparación de la estabilidad térmica
observada para la subtilisina de Bacillus lentus y las
variantes de la presente invención preparadas por el procedimiento
de mutagénesis dirigida a oligonucleótidos anterior se muestra en
la Tabla IV. Se toman alícuotas de enzima purificada, 15 \mug/ml
en glicina 0,1 M, Tween-80 al 0,01% a pH 10,0, con
o sin CaCl_{2} 50 mM, en tubos pequeños y se incuban a 10ºC
durante 5 minutos, 10ºC a 60ºC durante 1 minuto y 60ºC durante 20
minutos. Los tubos se colocan después sobre hielo durante 10
minutos. Se ensaya la actividad enzimática en alícuotas a partir de
los tubos mediante adición a cubetas de 1 cm que contengan 1,2 mM
del sustrato de péptidos sintético
succinil-L-ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida
disueltas en tampón de tris-HCL 0,1 M, pH 8,6,
termostatizado a 25ºC. La velocidad de reacción lineal inicial se
sigue espectrofotométricamente por control de la absorbancia de la
p-nitroanilina del producto de reacción a 410 nm
como función del tiempo. Los datos se presentan como porcentaje de
la actividad previa al calentamiento. Los resultados enumerados en
la Tabla IV indican que una gran mayoría de las variantes presenta
estabilidad térmica comparable a la subtilisina de Bacillus
lentus (24 de cada 26) en las condiciones de ensayo con
CaCl_{2} 50 mM añadido. En las condiciones de ensayo sin
CaCl_{2} 50 mM añadido, una gran mayoría de las variantes (19 de
cada 26) es significativamente más estable que la subtilisina de
Bacillus lentus. Además, las variantes N76D/S99D,
N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V,
N76D/V104Y/I107V y N76D/S101R/S103A/V104I son significativamente
más estables que la única variante N76D de sustitución en las
condiciones de ensayo sin CaCl_{2} 50 mM añadido.
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El protocolo de la mutagénesis es prácticamente
el mismo que se describió anteriormente en Mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos. La cadena de ADN molde monocatenario se genera por
el método fagémido. Para construir el vector fagémido para generar
la cadena de ADN molde monocatenario primero construimos el vector
pBCDAICAT. El organigrama de la construcción de vectores se explica
en líneas generales en la Figura 8. Primero, el fragmento
C1aI a C1aI que codifica el gen CAT a partir de
plásmido pC194 (Horinouchi, S., y Weisblum, B., J.
Bacteriol., 150:8-15, 1982) se clona con
el sitio AccI de la región poliligadora de pUC19 (New England
BioLabs, Beverly, MA) para preparar plásmido pUCCHL y se clona el
fragmento EcoRI-DraI 0,6 KB a partir del
extremo 5' del GG36DAI que codifica ADN en los sitios EcoRI y
EcoRV del plásmido pBSKS (Stratagene, Inc., San Diego, CA)
para preparar pBC2SK5. El único sitio EcoRI del plásmido
pBC2SK5 se elimina por digestión de EcoRI, seguida por la
adición catalizada por ADN polimerasa T4 y religadura para generar
el plásmido pBC2SK-5R que no tiene sitio
EcoRI. El fragmento EcoRI-DraI que se
clona en pBCSK-5R se aísla como fragmento
PstI-HindIII y se clona en el sitio
PstI-HindIII del pUCCHL (parte del
poliligador de pUC19) para generar plásmido pUCCHL5R. La secuencia
codificada del gen GG36DAI se escinde como fragmento
EcoRI-BamHI y se clona en los sitios
EcoRI-BamHI de pUCCHL5R para preparar pUCCAT.
El fragmento EcoRI-HindIII grande de pUCCAT
se clona después en los sitios EcoRI y HindIII de
BS2KS+ para generar el plásmido pBCDAICAT.
Para generar ADN monocatenario, se infecta
pBCDAICAT que contiene E. coli con fago R408 (obtenido de
Stratagene, San Diego, CA) siguiendo el protocolo descrito en
Russel, M., Kidd, S. and Kelley, M.R., GENE
45:333-338, 1986. Una vez que la cadena de
ADN molde monocatenaria está disponible, se llevan a cabo métodos de
mutagénesis habituales como se describió anteriormente en
Mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La construcción de ciertos
mutantes se detalla a continuación con fines ilustrativos.
Para la construcción de N76D/S103A/V104I/L217H
(GG36) B. lentus se usa un fragmento de ADN
EcoRI-BamHI que codifica N76D/S103A/V104I
GG36 en la construcción de pUCCAT (véase la Fig. 8) para generar el
plásmido pBCDAICAT. Una vez que se prepara la cadena de ADN molde
monocatenario siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se usa
una matriz de mutagénesis con la secuencia siguiente
* *** ** x ClaI
| 5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3' | (SEC. n.º 13) |
para preparar el L217H. Como
anteriormente, los residuos subrayados indican los cambios que se
hacen en el nucleótido y el x C1aI indica que el sitio
C1aI existente se elimina después de la mutagénesis. El
protocolo de mutagénesis es como se describió anteriormente en
Mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Después de la mutagénesis,
en el ADN del plásmido se investiga primero la eliminación del sitio
C1aI y esos clones que pierden el sitio C1aI se
someten a análisis de secuencia de ADN para verificar la secuencia
de ADN que hizo el cambio L a H en el residuo de aminoácido
217.
La construcción de N76D/Q103A/Y104I/Y217L (BPN')
de B. amyloliquefaciens se hace de un modo similar excepto
en dos etapas consecutivas. Se introduce primero N76D en Y217L BPN'
para preparar N76D/Y217L BPN' y se hace una segunda mutagénesis
para convertir N76D/Y217L BPN' en N76D/Q103A/Y104I/Y217L BPN'. Para
generar la cadena de ADN molde monocatenario para la primera
mutagénesis, se usa un fragmento de
EcoRI-BamHI que codifica la subtilisina
Y217L BPN' (procedente del plásmido Y217L descrito en Wells, J., y
col., PNAS, 84, 5167, 1087) para construir un plásmido
pUCCATFNA (véase la Fig. 9). El plásmido pUCCATFNA que contiene
Y217L BPN' se usa para construir el plásmido pBCFNACAT (Fig. 9). Se
genera ADN monocatenario como se describió anteriormente. Para
generar N76D/Y217L BPN', se usa una matriz de oligonucleótidos con
la secuencia
* *** ** XbaI
| 5' C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3' | (SEC. n.º 14) |
para generar el cambio N76D. Se prepara después
DNA monocatenario a partir del plásmido pBCFNACAT que contiene el
N76D/Y217L BPN' (el plásmido pBCFNACAT después de la mutagénesis de
N76D) y mutageneizado con otro oligonucleótido con la secuencia
* *** ** x PvuII
| 5' GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3' | (SEC. n.º 15) |
para obtener N76D/Q103A/Y104I/Y217L
BPN'. Todas las etapas implicadas en la clonación, la preparación de
ADN monocatenario, la mutagénesis y la investigación de mutantes,
se llevan a cabo como se describió anteriormente. La expresión del
gen BPN' y sus variantes se consigue integrando el ADN del plásmido
(pBCFNACAT que contiene los diferentes genes BPN' de las variantes)
directamente en una cepa deficiente en proteasa de Bacillus
subtilis como se describe en RE
34.606.
Se preparan numerosas variantes según las
explicaciones de estos Ejemplos de fabricación de porteases. Se
generan datos cinéticos y datos de estabilidad para tales variantes.
Los datos cinéticos se generan usando los métodos descritos
anteriormente y se proporcionan en la Tabla V. Los datos de
estabilidad se generan como se detalla en la presente memoria. Los
resultados se muestran en la Tabla VI.
La enzima purificada se recupera en tampón en
glicina 0,1 M, pH 10,0, Tween-80 al 0,01% aplicando
la enzima a una columna que consiste en Sephadex
G-25 equilibrada con este tampón y eluyendo la
enzima de la columna usando el mismo tampón.
A un tubo que contiene glicina 0,1 M,
Tween-80 al 0,01% a pH 10,0 termostatizado a 60ºC,
se le añade la enzima recuperada en tampón para dar una
concentración final de enzima de 15 \mug/ml.
Se extraen alícuotas a partir de la incubación a
60ºC a diversos tiempos y se ensaya inmediatamente la actividad
enzimática por adición a una cubeta de 1 cm que contiene 1,2 mM del
sustrato de péptidos sintético
succinil-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilida
disuelto en tampón de tris-HCL 0,1 M, pH 8,6,
termostatizado a 25ºC. La velocidad de reacción lineal inicial se
sigue espectrofotométricamente controlando la absorbancia de la
p-nitroanilina del producto de reacción a 410 nm
como función del tiempo.
La semivida, que es la extensión de tiempo
requerida para 50% de inactivación enzimática, se determina a partir
de la gráfica de la velocidad de reacción de primer orden como
función del tiempo de incubación a 60ºC.
Los datos se presentan en la Tabla VI como
porcentaje de la semivida determinada para la subtilisina (GG36) de
Bacillus lentus en idénticas condiciones.
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siguiente)
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Las composiciones limpiadoras de la presente
invención también comprenden, además de la enzima proteasa descrita
anteriormente, uno o más materiales de composiciones limpiadoras
compatibles con la enzima proteasa. La expresión "materiales de
composiciones limpiadoras", en la presente memoria, quiere decir
cualquier material líquido, sólido o gaseoso seleccionado para el
tipo particular de composición limpiadora deseada y la forma del
producto (p. ej., líquido, en gránulos, composición para
pulverizar), cuyos materiales también son compatibles con la enzima
proteasa usada en la composición. La selección específica de los
materiales de las composiciones limpiadoras se prepara fácilmente
considerando la superficie, artículo o tejido que se ha de limpiar y
la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza
durante su uso (p. ej., uso de detergente para añadir durante el
lavado). El término "compatible", en la presente memoria,
quiere decir que los materiales de las composiciones limpiadoras no
reducen la actividad proteolítica de la enzima proteasa en tal
extensión que la proteasa no sea eficaz como se desea durante
situaciones de uso normal. Los materiales de las composiciones
limpiadoras específicos se ilustran con detalle a continuación.
Se incluye una cantidad eficaz de una o más
enzimas proteasa descritas anteriormente en composiciones útiles
para limpiar una variedad de superficies que necesitan eliminación
de manchas proteináceas. Tales composiciones limpiadoras incluyen
composiciones detergentes para limpiar superficies duras, sin
límites de forma (p. ej., líquida y granulada); composiciones
detergentes para limpiar tejidos, sin límites de forma (p. ej.,
formulaciones granuladas, líquidas y en pastillas); composiciones
de lavado de vajillas (sin límites de forma); composiciones de
limpieza oral, sin límites de forma (p. ej., formulaciones de
dentífricos, pasta de dientes y colutorios), y composiciones
limpiadoras de dentaduras postizas, sin límite de formas (p. ej.,
líquida, en comprimidos). En la presente memoria, "cantidad
eficaz de enzima proteasa" se refiere a la cantidad de enzima
proteasa descrita anteriormente necesaria para conseguir la
actividad enzimática necesaria en la composición limpiadora
específica. Dichas cantidades eficaces serán fácilmente
determinadas por un experto en la técnica y dependen de muchos
factores, tales como la variante enzimática utilizada, la aplicación
de limpieza, la composición específica de la composición limpiadora
y si se requiere una composición líquida o seca (p. ej., granulada,
en pastilla) y similares.
Preferiblemente las composiciones limpiadoras de
la presente invención comprenden de aproximadamente
0,0001% a aproximadamente 10% de una o más enzimas proteasas, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,1%. Diversos ejemplos de diversas composiciones limpiadoras en las que se pueden emplear las enzimas proteasa se discuten con más detalle a continuación. Todas las partes, porcentajes y relaciones utilizados en la presente memoria son en peso, salvo que se indique lo contrario.
0,0001% a aproximadamente 10% de una o más enzimas proteasas, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, más preferiblemente aún de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,1%. Diversos ejemplos de diversas composiciones limpiadoras en las que se pueden emplear las enzimas proteasa se discuten con más detalle a continuación. Todas las partes, porcentajes y relaciones utilizados en la presente memoria son en peso, salvo que se indique lo contrario.
En la presente memoria, la expresión
"composiciones limpiadoras para no tejidos" incluye
composiciones limpiadoras para superficies duras, composiciones
para lavado de vajillas, composiciones limpiadoras orales,
composiciones limpiadoras para dentaduras postizas y composiciones
limpiadoras de aseo personal.
Las enzimas proteasa se pueden usar en cualquier
composición detergente donde se desee alta formación de jabonaduras
y/o buena eliminación de sustrato insoluble. Así, las enzimas
proteasa se pueden usar con diversos ingredientes convencionales
para proporcionar limpiadores de superficies duras, composiciones de
lavado de vajillas, composiciones de lavado de tejidos y similares
totalmente formulados. Dichas composiciones pueden estar en la forma
de líquidos, gránulos, pastillas y similares. Dichas composiciones
se pueden formular como detergentes "concentrados" modernos
que contienen hasta 30%-60% en peso de tensioactivos.
Las composiciones limpiadoras de la presente
invención pueden opcionalmente, y preferiblemente, contener diversos
tensioactivos aniónicos, no iónicos, de ion híbrido, etc. Dichos
tensioactivos están de forma típica presentes a niveles de
aproximadamente 0,1% a aproximadamente 60%, preferiblemente de
aproximadamente 1% a aproximadamente 35%, de las composiciones.
Ejemplos no limitativos de tensioactivos útiles
en la presente invención incluyen los alquilbencenosulfonatos
C_{11}-C_{18} convencionales y alquilsulfatos
primarios y aleatorios, los alquil C_{10}-C_{18}
sulfatos (2,3) secundarios de fórmula
CH_{3}(CH_{2})x(CHOSO_{3})^{-}M^{+})CH_{3}
y
CH_{3}(CH_{2})y(CHOSO_{3}^{-}M^{+})
CH_{2}CH_{3} en donde x e (y+1) son números enteros de al menos
aproximadamente 7, preferiblemente al menos aproximadamente 9, y M
es un catión hidrosoluble, especialmente sodio, los
alquilalcoxisulfatos C_{10}-C_{18}
(especialmente los etoxisulfatos EO 1-7), los
alquilalcoxicarboxilatos C_{10}-C_{18}
(especialmente los etoxicarboxilatos EO 1-7), los
alquilpoliglicósidos C_{10}-C_{18} y sus
correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos
grasos alfasulfonados C_{12}-C_{18}, alcoxilatos
de alquilo y de alquilfenoles C_{12}-C_{18}
(especialmente etoxilatos y etoxi/propoxi mezclados), betaínas y
sulfobetaínas C_{12}-C_{18} ("sultaínas"),
óxidos de amina C_{10}-C_{18}, sarcosinatos
C_{8}-C_{24} (especialmente oleoilsarcosinato)
y similares. Los alquil alcoxi sulfatos (AES) y los alquil alcoxi
carboxilatos (AEC) son los preferidos en la presente invención.
(También se prefiere el uso de dichos tensioactivos junto con los
tensioactivos de tipo óxido de amina, betaína o sultaína
anteriormente mencionados, dependiendo del deseo del formulador).
Otros tensioactivos convencionales útiles se describen en los textos
estándar. Tensioactivos especialmente útiles incluyen las
N-metilglucamidas C_{10}-C_{18}
descritas en la patente US-5.194.639, concedida a
Connor y col. el 16 de marzo de 1993 e incorporada como referencia
en la presente memoria.
La clase de tensioactivos no iónicos que son
condensados de óxido de etileno con un resto hidrófobo resulta
especialmente útil para proporcionar un tensioactivo que tiene un
balance hidrófilo-lipófilo (HLB) promedio en el
intervalo de 5 a 17, preferiblemente de 6 a 14, más preferiblemente
de 7 a 12. El resto hidrófobo (lipófilo) puede ser de tipo
alifático o aromático y la longitud del grupo polioxietileno que es
condensado con cualquier grupo hidrófobo particular puede ser
fácilmente ajustada para obtener un compuesto hidrosoluble que tenga
el deseado grado de resto entre el elemento hidrófilo y el elemento
hidrófobo. Especialmente preferidos son los etoxilatos de alcoholes
primarios C_{9}-C_{15} (o etoxi/propoxi
mezclados) que contienen 3-8 moles de óxido de
etileno por mol de alcohol, particularmente los alcoholes primarios
C_{14}-C_{15} que contienen 6-8
moles de óxido de etileno por mol de alcohol, los alcoholes
primarios C_{12}-C_{15} que contienen
3-5 moles de óxido de etileno por mol de alcohol y
mezclas de los mismos.
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En las composiciones de la presente invención se
puede incluir una amplia variedad de otros ingrediente útiles en
las composiciones limpiadoras detergentes, incluyendo otros
ingredientes activos, vehículos, hidrótropos, mejoradores del
proceso, tintes o pigmento, disolventes para formulaciones líquidas,
etc. Si se desea un aumento adicional de la formación de
jabonaduras, se pueden incorporar a las composiciones reforzadores
de formación de las jabonaduras, como las alcohol
C_{10}-C_{16} amidas, de forma típica a niveles
de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%. Las monoetanolamidas y
dietanolamidas C_{10}-C_{14} ilustran una clase
típica de dichos reforzadores de formación de las jabonaduras.
También resulta ventajoso el uso de dichos reforzadores de
formación de espuma con tensioactivos adyuvantes de alta espuma
tales como los óxidos de amina, las betaínas y las sultaínas. Si se
desea, se pueden añadir sales de magnesio solubles, tales como
MgCl_{2}, MgSO_{4} y similares a niveles, de forma típica, de
aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, para proporcionar
jabonaduras adicionales.
Las composiciones detergentes líquidas de la
presente invención pueden contener agua y otros disolventes como
vehículos. Resultan adecuados los alcoholes primarios o secundarios
de bajo peso molecular como, por ejemplo, el metanol, el etanol, el
propanol o el isopropanol. Los alcoholes monohídricos son preferidos
para disolver los tensioactivos, aunque también se pueden usar
polioles tales como los que contienen de aproximadamente 2 a
aproximadamente 6 átomos de carbono y de aproximadamente 2 a
aproximadamente 6 grupos hidroxi (p. ej.,
1,3-propanodiol, etilenglicol, glicerina y
1,2-propanodiol). Las composiciones pueden contener
de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, de forma típica de
aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, de dichos vehículos.
Las composiciones detergentes de la presente
invención estarán preferiblemente formuladas de modo que durante el
uso en operaciones de limpieza acuosa el agua de lavado tendrá un pH
entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 11,0. Los productos
terminados están, por lo tanto, formulados de forma típica en este
intervalo. Las técnicas para el control del pH en los niveles de
uso recomendados incluyen el uso de tampones, álcalis, ácidos, etc.
y son bien conocidas por los expertos en la técnica.
A la hora de formular las composiciones
limpiadoras para superficies duras y las composiciones limpiadoras
para tejidos de la presente invención, el formulador podría desear
emplear diversos aditivos reforzantes de la detergencia a niveles
de aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, en peso. Los aditivos
reforzantes de la detergencia típicos incluyen las zeolitas de
1-10 micrómetros, policarboxilatos tales como los
citratos y oxidisuccinatos, silicatos laminares, fosfatos, y
similares. Otros aditivos reforzantes de la detergencia
convencionales figuran en los formularios convencionales.
Igualmente, el formulador puede desear utilizar
diversas enzimas adicionales, tales como celulasas, lipasas,
amilasas, peroxidasas y proteasas en dichas composiciones, de forma
típica a niveles de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, en
peso. En la técnica de los detergentes para lavado de ropa son bien
conocidas diversas enzimas detersivas y para el cuidado de
tejidos.
En dichas composiciones se pueden utilizar
diversos compuestos blanqueadores, tales como percarbonatos,
perboratos y similares, de forma típica a niveles de
aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, en peso. Si se desea,
dichas composiciones pueden contener también activadores del
blanqueador, tales como tetraacetil etilendiamina,
nonaoiloxibenceno sulfonato y similares, los cuales son también
conocidos en la técnica. Los niveles de uso oscilan de forma típica
de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, en peso.
En tales composiciones se pueden utilizar
diversos agentes para liberar la suciedad, especialmente del tipo
oligoéster aniónico, diversos agentes quelantes, especialmente los
aminofosfonatos y etilendiamindisuccinatos, diversos agentes para
eliminar suciedad de arcilla, especialmente tetraetilenpentamina
etoxilada, diversos agentes dispersantes, especialmente
poliacrilatos y poliasparatatos, diversos abrillantadores,
especialmente abrillantadores aniónicos, diversos agentes
inhibidores de la transferencia de colorantes, tales como
polivinilpirrolidona, diversos supresores de las jabonaduras,
especialmente silicona y alcoholes secundarios, diversos suavizantes
de tejidos, especialmente arcilla tipo esmectita y polímeros
floculantes de tipo arcilla (p. ej., poli(oxi etileno)) y
similares, a niveles en el intervalo de aproximadamente 1% a
aproximadamente 35% en peso. Los formularios convencionales y las
patentes publicadas contienen múltiples descripciones detalladas de
estos materiales convencionales.
En las composiciones limpiadoras de la presente
invención también se pueden utilizar estabilizantes enzimáticos.
Dichos estabilizantes enzimáticos incluyen propilenglicol
(preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%),
formiato sódico (preferiblemente de aproximadamente 0,1% a
aproximadamente 1%) y formiato cálcico (preferiblemente de
aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%).
En la presente memoria, la expresión
"composición limpiadora para superficies duras" se refiere a
composiciones detergentes líquidas y granuladas para limpiar
superficies duras como suelos, paredes, baldosas de cuartos de baño
y similares. Las composiciones limpiadoras para superficies duras de
la presente invención comprenden una cantidad eficaz de una o más
enzimas de tipo proteasa, preferiblemente de aproximadamente 0,0001%
a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente
0,001% a aproximadamente 5%, más preferiblemente aún de
aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, en peso de enzima
activa de tipo proteasa de la composición. Además de comprender una
o más enzimas de tipo proteasa, dichas composiciones limpiadoras
para superficies duras comprenden de forma típica un tensioactivo y
un aditivo reforzante de la detergencia secuestrante hidrosoluble.
Sin embargo, en determinados productos especializados, tales como
limpiadores de ventanas en pulverizador, los tensioactivos a veces
no son utilizados ya que éstos pueden dejar un residuo de película o
vetas en la superficie del cristal.
El componente tensioactivo, cuando está
presente, puede comprender una cantidad tan pequeña como 0,1% de las
composiciones de la presente invención, aunque de forma típica las
composiciones contendrán de aproximadamente 0,25% a aproximadamente
10%, más preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%,
de tensioactivo.
De forma típica las composiciones contendrán de
aproximadamente 0,5% a aproximadamente 50% de un aditivo reforzante
de la detergencia, preferiblemente de aproximadamente 1% a
aproximadamente 10%. Preferiblemente el pH debería estar en el
intervalo de aproximadamente 8 a 12. En caso de que sea necesario un
ajuste, se pueden usar reguladores del pH convencionales, tales
como hidróxido sódico, carbonato sódico o ácido clorhídrico.
Los disolventes se pueden incluir en las
composiciones. Los disolventes útiles incluyen, aunque no de forma
limitativa, éteres de glicol tales como dietilenglicol monohexil
éter, éter monobutílico de dietilenglicol, éter monobutílico de
etilenglicol, etilenglicol monohexil éter, éter monobutílico de
propilenglicol, éter monobutílico de dipropilenglicol y dioles,
tales como
2,2,4-trimetil-1,3-pentanodiol
y
2-etil-1,3-hexanodiol.
Cuando se usan, dichos disolventes están presentes de forma típica
a niveles de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%,
preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 11%.
Además, en las presentes composiciones se pueden
usar disolventes muy volátiles como isopropanol o etanol para
facilitar una evaporación más rápida de la composición en las
superficies si estas no se aclaran después de la aplicación de la
composición "pura" sobre la superficie. Cuando se usan, los
disolventes volátiles están presentes de forma típica a niveles de
aproximadamente 2% a aproximadamente 12% en las composiciones.
La realización de composición limpiadora para
superficies duras de la presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos no limitativos. (En los siguientes ejemplos, la
"Proteasa n.º" de los ejemplos se refiere a la variante útil
en las composiciones de la presente invención que tiene el número
dado en la Tabla III anteriormente).
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Ejemplos
1-6
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En los Ejemplos 1-4, las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares.
En los Ejemplos 5 y 6, cualquier combinación de
las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas en
las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa n.º
12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente similares.
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Ejemplos
7-12
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El pH del producto es aproximadamente 7.
En los Ejemplos 7-10, las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares.
En los Ejemplos 11 y 12, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, en otras, se sustituyen por Proteasa n.º
12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
composiciones para lavado de vajillas comprenden una o más enzimas
proteasa. En la presente memoria, "composición para lavado de
vajillas" se refiere a todas las formas de composiciones para
limpiar platos incluyendo de forma no exclusiva, formas granuladas y
líquidas. La realización de la composición para lavado de vajillas
de la presente invención está ilustrada por los ejemplos que se
presentan a continuación.
\newpage
Ejemplos
13-18
El pH del producto se ajusta a 7.
En los Ejemplos 13-16, las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares.
En los Ejemplos 17 y 18, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa
n.º 12 y Proteasa n.º 4 con resultados prácticamente similares.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
En los Ejemplos 19 A-C las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 19 A-C, cualquier
combinación de las proteasas útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
composiciones limpiadoras de tejidos comprenden una o más enzimas
proteasa. En la presente memoria, "composición limpiadora de
tejidos" se refiere a todas las formas de composiciones
detergentes para limpiar tejidos, incluyendo de forma no excluyente,
formas granuladas, líquidas y en pastilla.
Las composiciones limpiadoras de tejidos
granuladas de la presente invención contienen una cantidad eficaz
de una o más enzimas proteasa, preferiblemente de aproximadamente
0,001% a aproximadamente 10%, más preferiblemente de
aproximadamente 0,005% a aproximadamente 5%, más preferiblemente de
aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, en peso de enzima
proteasa activa de la composición. Además de una o más enzimas
proteasa, las composiciones limpiadoras de tejidos granuladas
comprenden de forma típica al menos un tensioactivo, uno o más
aditivos reforzantes de la detergencia y, en algunos casos, un
agente blanqueante.
La realización de composición limpiadora de
tejidos granulada de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
Ejemplos
20-23
En los Ejemplos 20-21 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares.
En los Ejemplos 22 y 23, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa
n.º 12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente similares.
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Ejemplos
24-27
En los Ejemplos 24 y 25 las Proteasas n.º
1-11 y 13-25 indicadas en la Tabla
III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales útiles en
la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyen
por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente similares.
En los Ejemplos 26 y 27, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa
n.º 12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente
similares.
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Ejemplos 28 y
29
\newpage
Ejemplos 30 y
31
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En cada uno de los Ejemplos
28-34 en la presente memoria las Proteasas n.º
1-11 y 13-25 indicadas en la Tabla
III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales útiles en la
presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyen
por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente similares. También
en los Ejemplos 28-34, cualquier combinación de las
proteasas útiles en la presente invención indicadas en las Tablas
III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa n.º 12 con
resultados prácticamente similares.
Las composiciones limpiadoras de tejidos
líquidas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de
una o más enzimas proteasas, preferiblemente de aproximadamente
0,0001% a aproximadamente 10%, más preferiblemente de
aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1% y con máxima preferencia
de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,1%, en peso de enzima
proteasa activa de la composición. Dichas composiciones limpiadoras
de tejidos líquidas comprenden además de forma típica un
tensioactivo aniónico, un ácido graso, un aditivo reforzante de la
detergencia hidrosoluble y agua.
La realización de la composición limpiadora de
tejidos líquida de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
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Ejemplos
35-39
\vskip1.000000\baselineskip
En los Ejemplos 35-37 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares.
En los Ejemplos 38 y 39, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa
n.º 12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente
similares.
\newpage
Ejemplos
40-41
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\vskip1.000000\baselineskip
En cada uno de los Ejemplos 40 y 41 en la
presente memoria las Proteasas n.º 1-11 y
13-25 indicadas en la Tabla III, que incluyen entre
otras las proteasas adicionales útiles en la presente invención
descritas en las Tablas V y VI, se sustituyen por Proteasa n.º 12,
con resultados prácticamente similares. También en los Ejemplos 40
y 41, cualquier combinación de las proteasas útiles en la presente
invención indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se
sustituyen por Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente
similares.
Las composiciones limpiadoras de tejidos en
pastilla de la presente invención adecuadas para lavar a mano
tejidos manchados contienen una cantidad eficaz de una o más enzimas
proteasa, preferiblemente de aproximadamente 0,001% a
aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0,01% a
aproximadamente 1%, en peso de la composición.
La realización de la composición limpiadora de
tejidos en pastilla de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
\newpage
Ejemplos
42-45
En los Ejemplos 42 y 43 las Proteasas n.º
1-11 y 13-25 indicadas en la Tabla
III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales útiles en
la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se sustituyen
por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente similares.
En los Ejemplos 44 y 45, cualquier combinación
de las enzimas proteasa útiles en la presente invención indicadas
en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por Proteasa
n.º 12 y Proteasa n.º 4, con resultados prácticamente
similares.
Además de las composiciones limpiadoras para
superficies duras, para lavado de vajillas y para tejidos tratadas
anteriormente, se pueden incorporar una o más enzimas proteasa en
otras composiciones limpiadoras donde se desea hidrólisis de un
sustrato insoluble. Dichas composiciones limpiadoras adicionales
incluyen, aunque no de forma limitativa, composiciones limpiadoras
orales, composiciones limpiadoras de dentaduras postizas y
composiciones limpiadoras para lentillas de contacto.
En otra realización de la presente invención, se
incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una o más
enzimas proteasa en composiciones útiles para eliminar manchas
proteináceas de dientes o dentaduras postizas. En la presente
memoria, la expresión "composiciones limpiadoras orales" se
refiere a dentífricos, pastas de dientes, geles dentales, polvos
dentales, colutorios, pulverizadores bucales, geles bucales, gomas
de mascar, pastillas, bolsitas, comprimidos, biogeles, pastas
profilácticas, soluciones para tratamiento dental y similares.
Preferiblemente, las composiciones limpiadoras orales de la presente
invención comprenden de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente
20% de una o más enzimas proteasa, más preferiblemente de
aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10%, más preferiblemente
aún de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, en peso de la
composición, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En la
presente memoria, "farmacéuticamente aceptable" significa que
los fármacos, medicamentos o ingredientes inertes que describe el
término son adecuados para usar en contacto con los tejidos de
seres humanos y animales inferiores sin provocar una inadecuada
toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta
alérgica y similares, y con una relación ventaja/riesgo
razonable.
De forma típica, los componentes vehículo para
la limpieza oral farmacéuticamente aceptables de los componentes
limpiadores orales de las composiciones limpiadoras orales
comprenderán generalmente de aproximadamente 50% a aproximadamente
99,99%, preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente
99,99%, más preferiblemente de aproximadamente 65% a
aproximadamente 99%, en peso de la composición.
Los componentes vehículo farmacéuticamente
aceptables y los componentes opcionales que se pueden incluir en
las composiciones limpiadoras orales de la presente invención son
bien conocidos por los expertos en la técnica. Una amplia variedad
de tipos de composición, componentes vehículo y componentes
opcionales útiles en las composiciones limpiadoras orales se
describen en las patentes US-5.096.700, concedida a
Seibel el 17 de marzo de 1992; US-5.028.414,
concedida a Sampathkumar el 2 de julio de 1991, y
US-5.028.415, concedida a Benedict, Bush y Sunberg
el 2 de julio de 1991; todas ellas incorporadas como referencia en
la presente memoria.
La realización de composición limpiadora oral de
la presente invención está ilustrada por los siguientes
ejemplos.
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Ejemplos
46-49
En los Ejemplos 46-49 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 46-49, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V, VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
\newpage
Ejemplos
50-53
En los Ejemplos 50-53 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 50-53, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
Ejemplos
54-57
En los Ejemplos 54-57 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 54-57, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
Ejemplos
58-61
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En los Ejemplos 58-61 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 58-61, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
composiciones limpiadoras de dentaduras postizas para limpiar
dentaduras postizas fuera de la cavidad oral comprenden una o más
enzimas proteasa. Tales composiciones limpiadoras de dentaduras
postizas comprenden una cantidad eficaz de una o más enzimas
proteasa, preferiblemente de aproximadamente 0,0001% a
aproximadamente 50% de una o más enzimas proteasa, más
preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 35%,
más preferiblemente aún de aproximadamente 0,01% a aproximadamente
20%, en peso de la composición, y un vehículo de limpieza de
dentaduras postizas. En la técnica se conocen diversos formatos de
composición limpiadora de dentaduras postizas tales como pastillas
efervescentes y similares (véase, por ejemplo, la patente
US-5.055.305, Young, incorporada como referencia en
la presente memoria), que son generalmente adecuados para la
incorporación de una o más enzimas proteasa para eliminar manchas
proteináceas de las dentaduras postizas.
La realización de composiciones limpiadoras de
dentaduras postizas de la presente invención se ilustra en los
siguientes ejemplos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplos
62-65
En los Ejemplos 62-65 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 62-65, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
composiciones para aseo personal para limpiar la piel (en forma de
líquido o pastilla) comprenden una o más de las enzimas proteasa.
Tales composiciones de forma típica comprenden de aproximadamente
0,001% a aproximadamente 5% de enzima proteasa, preferiblemente de
aproximadamente 0,005% a aproximadamente 2% y con máxima
preferencia de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,8%, en peso
de la composición. Las composiciones para aseo personal preferidas
en las que se pueden incluir enzimas proteasa como se describe en
la presente memoria se muestran en las solicitudes de patente
US-SN 08/121.623 y US-SN
08/121.624, ambas presentadas por Visscher y col. el 14 de
septiembre de 1993, cuya descripción se incorpora como referencia
en su totalidad en la presente memoria. Tales composiciones se
ilustran en los siguientes ejemplos.
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En los Ejemplos 66-67 las
Proteasas n.º 1-11 y 13-25 indicadas
en la Tabla III, que incluyen entre otras las proteasas adicionales
útiles en la presente invención descritas en las Tablas V y VI, se
sustituyen por Proteasa n.º 12, con resultados prácticamente
similares. También en los Ejemplos 66-67, cualquier
combinación de las enzimas proteasa útiles en la presente invención
indicadas en las Tablas III, V y VI, entre otras, se sustituyen por
Proteasa n.º 12 con resultados prácticamente similares.
Se evalúa la capacidad de lavado de las
variantes útiles en las composiciones de la presente invención
midiendo la eliminación de manchas de muestras de tejido
(sangre/leche/negro de carbono sobre algodón) EMPA 116 (Testfabrics,
Inc., Middlesex, NJ 07030).
Se colocan seis muestras de tejido EMPA 116,
cortadas a 7,3 x 11,4 cm (3 x 4-1/2 pulgadas) con
bordes picados, en cada marmita de un
Terg-O-Tometer Modelo 7243S (United
States Testing Co., Inc., Hoboken, NJ) que contiene 1.000 ml de
agua, 3,9 g/l (15 gpg) de dureza (Ca^{++}:Mg^{++}::3:1::w:w), 7
g de detergente y enzima como sea apropiado. El detergente base es
detergente WFK1 de wfk - Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42,
Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Alemania:
A este detergente base se hacen las siguientes
adiciones:
Se obtiene perborato de sodio monohidratado de
Degussa Corporation, Ridgefield-Park, NJ 07660. Se
obtiene Sokalan CP5 de BASF Corporation, Parsippany, NJ 07054. Se
obtiene Mykon ATC Green (TAED, tetraacetiletilendiamina) de Warwick
International, Limited, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8 9HE, Inglaterra.
Se obtiene Tinopal AMS GX de Ciba-Geigy
Corporation, Greensboro, NC 27419.
Se lavan seis muestras de tejido EMPA 116 en
detergente con enzima durante 30 minutos a 60ºC y con posterioridad
se aclaran dos veces durante 5 minutos cada vez en 1.000 ml de agua.
Se añaden enzimas a concentraciones finales de 0,05 a 1 ppm para
curvas estándar, y 0,25 ppm para análisis de rutina. Se secan y
prensan las muestras y se mide la reflectancia de las muestras
usando el valor L de la escala L*a*b* de un cromámetro Minolta,
Modelo CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ
07446). La capacidad se refiere como porcentaje de la capacidad de
la proteasa (GG36) de B. lentus y se calcula dividiendo la
cantidad de proteasa (GG36) de B. lentus entre la cantidad
de proteasa variante que se requiere para proporcionar la misma
capacidad de eliminación de manchas X 100. Los datos se muestran en
la Tabla VII.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza una comparación de la estabilidad de
la proteasa frente a la inactivación en una formulación de
detergente líquido para la subtilisina Bacillus lentus y su
enzima variante N76D/S103A/V104I según el procedimiento descrito en
líneas generales en la presente memoria. La formulación de
detergente para el estudio es un frasco adquirido comercialmente de
detergente líquido para lavado de ropa Tide Ultra hecho en los
EE.UU. por The Procter & Gamble Company. Para inactivar la
proteasa in-situ es necesario someter la
formulación de detergente a tratamiento de calor. Esto se lleva a
cabo incubando el detergente a 96ºC durante un periodo de 4,5
horas. A continuación, se añaden las preparaciones concentradas de
la subtilisina de B. lentus y la variante N76D/S103A/V104I,
en el intervalo de 20 gramos/litro de enzima, al detergente Tide
Ultra tratado con calor a temperatura ambiente hasta conseguir una
concentración final de 0,3 gramos/litro de enzima en la formulación
de detergente. Después, el detergente tratado con calor con proteasa
añadida se incuba en un baño de agua termostatizada a 50ºC. Se
extraen alícuotas de los tubos de incubación a intervalos de tiempo
de 0, 24, 46, 76 y 112 horas y se ensaya su actividad enzimática
mediante adición a una cubeta de 1 cm que contiene 1,2 mM del
sustrato de péptidos sintético
suc-Ala-Ala-Pro-phe-p-nitroanilida
disuelto en tampón de tris-HCL 0,1M, pH 8,6 y
termostatizado a 25ºC. La velocidad de reacción lineal inicial se
sigue espectrofotométricamente controlando la absorbancia de la
p-nitroanilina del producto de reacción a 410 nm
como función del tiempo. Como muestra la Fig. 10, se observa que la
variante N76D/S103A/V104I tiene una estabilidad significativamente
mayor hacia la inactivación que la enzima B. lentus nativa.
Las semividas estimadas para la inactivación en la formulación de
detergente Tide Ultra para ambas enzimas, bajo las condiciones de
ensayo especificadas, son de 45 horas para la subtilisina de
B. lentus y 125 horas para la variante
N76D/S103A/V104I.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Baeck, Andre (NMN)
\hskip3,9cm Ghosh, Chanchal K.
\hskip3,9cm Graycar, Thomas P.
\hskip3,9cm Bott, Richard R.
\hskip3,9cm Wilson, Lori J.
\hskip3,9cm Brode, Philip F., III
\hskip3,9cm Barnett, Bobby L.
\hskip3,9cm Rubingh, Donn N.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones limpiadoras que contienen proteasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: The Procter & Gamble Company
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 11810 East River Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cincinnati
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: OH
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 45253-8707
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn liberación n.º 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 13 de octubre de 1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN ABOGADO/ AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Zerby, Kim William
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.323
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO REFERENCIA/ CERTIFICADO: 5040R
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (513) 627-2885
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (513) 627-0318
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGCTGCAA CTCGTTAAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGCTCTAG ACAATTCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.497 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 275 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 275 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 274 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. n.º 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA CATENARIO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. n.º 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT
\hfill33
Claims (33)
1. Una composición limpiadora que comprende:
- (a)
- una cantidad eficaz de enzima proteasa que es una variante de la carbonil hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora y en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de:
- N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/ S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/ I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/S101R/ S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/ V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/ V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/S103A/ V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N y N76D/S103A/V104I/M222A y mezclas de las mismas; donde la posición numerada corresponde a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens; y
- (b)
- uno o más materiales de composiciones limpiadoras compatibles con la enzima proteasa.
2. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 1, en donde los materiales de composiciones
limpiadoras se seleccionan del grupo que consiste en tensioactivos,
disolventes, tampones, enzimas, agentes para liberar la suciedad,
agentes para eliminar suciedad de arcilla, agentes dispersantes,
abrillantadores, supresores de las jabonaduras, suavizantes de
tejidos, reforzadores de formación de las jabonaduras,
estabilizadores de enzimas, aditivos reforzantes de la detergencia,
agentes blanqueantes, tintes, perfumes y mezclas de los mismos.
3. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 1, en donde los materiales de composiciones
limpiadoras comprenden al menos aproximadamente 1% de tensioactivo
en peso de la composición, comprendiendo dicho tensioactivo
materiales seleccionados del grupo que consiste en
alquilbencenosulfonatos, alquilsulfatos primarios, alquilsulfatos
secundarios, alquilalcoxisulfatos, alquilalcoxicarboxilatos,
alquilpoliglicósidos y sus correspondientes poliglicósidos
sulfatados, ésteres de ácidos grasos alfasulfonatados, alcoxilatos
de alquilo y de alquilfenoles, betaínas y sulfobetaínas, óxidos de
amina, N-metilglucamidas, etoxilatos de alcoholes
primarios no iónicos, mezcla etoxi/propoxi de alcoholes primarios
no iónicos y mezclas de los mismos.
4. La composición limpiadora según la
reivindicación 3, que además comprende al menos aproximadamente 5%
de aditivo reforzante de la detergencia seleccionado del grupo que
consiste en zeolitas, policarboxilatos, silicatos laminares,
fosfatos y mezclas de los mismos.
5. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 1, en donde los materiales de composiciones
limpiadoras comprenden al menos un agente blanqueante.
6. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 5, en donde el agente blanqueante se selecciona del
grupo que consiste en percarbonatos, perboratos y mezclas de los
mismos y, de forma opcional, comprendiendo además al menos un
activador del blanqueador.
7. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 1, en donde los materiales de composiciones
limpiadoras comprenden al menos una enzima seleccionada del grupo
que consiste en celulasas, lipasas, amilasas, proteasas,
peroxidasas y mezclas de las mismas.
8. Las composiciones limpiadoras según la
reivindicación 1, en donde los materiales de composiciones
limpiadoras comprenden al menos un suavizante de tejidos.
9. La composición limpiadora según la
reivindicación 1, que además comprende materiales de composiciones
limpiadoras seleccionados del grupo que consiste en disolventes,
tampones, enzimas, agentes para liberar la suciedad, agentes para
eliminar suciedad de arcilla, agentes dispersantes, abrillantadores,
supresores de las jabonaduras, suavizantes de tejidos, reforzadores
de formación de las jabonaduras, estabilizadores de enzimas, agentes
blanqueantes, tintes, perfumes y mezclas de los mismos.
10. La composición limpiadora según la
reivindicación 1, que además comprende al menos un agente
blanqueante.
11. La composición limpiadora según la
reivindicación 1, que además comprende al menos una enzima
seleccionada del grupo que consiste en celulasas, lipasas,
amilasas, proteasas, peroxidasas y mezclas de las mismas.
12. La composición limpiadora de tejidos según
la reivindicación 1, que está en forma de líquido, gránulos o
pastilla.
\newpage
13. La composición limpiadora según la
reivindicación 1, en la que la enzima proteasa es una variante de
subtilisina seleccionada de N76D/V104I, N76D/S99D/V104I,
N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/I107V,
N76D/S101R/S103A/V104I, N76D/S99D/S101R/S103A/V104I,
N76D/S101R/V104I y mezclas de las mismas.
14. La composición limpiadora de tejidos según
la reivindicación 1, en la que la enzima proteasa es una variante
de la subtilisina de Bacillus seleccionada de N76D/V104I,
N76D/S103A/V104I y mezclas de las mismas.
15. Una composición limpiadora de tejidos que
comprende:
- (a)
- de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 10% de enzima proteasa que es una variante de la subtilisina N76D/S103A/V104I derivada de la subtilisina de Bacillus lentus;
- (b)
- al menos aproximadamente 5% de tensioactivo;
- (c)
- al menos aproximadamente 5% de aditivo reforzante de la detergencia; y
- (d)
- de forma opcional, uno o más materiales de composiciones limpiadoras compatibles con la enzima proteasa seleccionados del grupo que consiste en disolventes, tampones, enzimas, agentes para liberar la suciedad, agentes para eliminar suciedad de arcilla, agentes dispersantes, abrillantadores, supresores de las jabonaduras, suavizantes de tejidos, reforzadores de formación de las jabonaduras, estabilizadores de enzimas, agentes blanqueantes, tintes, perfumes y mezclas de los mismos.
16. La composición limpiadora de tejidos según
la reivindicación 15, en la que el tensioactivo se selecciona del
grupo que consiste en alquilbencenosulfonatos, alquilsulfatos
primarios, alquilsulfatos secundarios, alquilalcoxisulfatos,
alquilalcoxicarboxilatos, alquilpoliglicósidos y sus
correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos
grasos alfa-sulfonatados, alcoxilatos de alquilo y
de alquilfenoles, betaínas y sulfobetaínas, óxidos de amina,
N-metilglucamidas, etoxilatos de alcoholes primarios
no iónicos, mezcla etoxi/propoxi de alcoholes primarios no iónicos
y mezclas de los mismos; y en la que además el aditivo reforzante de
la detergencia se selecciona del grupo que consiste en zeolitas,
policarboxilatos, silicatos laminares, fosfatos y mezclas de los
mismos.
17. La composición limpiadora de tejidos según
la reivindicación 16, que además comprende uno o más materiales de
composiciones limpiadoras seleccionados del grupo que consiste en
agentes blanqueantes, suavizantes de tejidos y enzimas.
18. La composición limpiadora de tejidos según
la reivindicación 15, que está en forma de una composición
limpiadora de tejidos granulada concentrada que comprende al menos
30% de tensioactivo.
19. Una composición de lavado de vajillas que
comprende:
- (a)
- de 0,0001% a 10% de enzima proteasa que es una variante de la carbonil hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora de subtilisina y en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/ N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I; N76D/ S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/ S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/ S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/ D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L126F; N76D/ S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N, donde la posición numerada corresponde a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens; y N76D/S103A/V104I/M222A y mezclas de las mismas;
- (b)
- de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 10% de tensioactivo; y
- (c)
- de forma opcional, uno o más materiales de composiciones limpiadoras compatibles con la enzima proteasa seleccionados del grupo que consiste en disolventes, tampones, enzimas, agentes dispersantes, supresores de las jabonaduras, estabilizadores de enzimas, agentes blanqueantes, tintes, perfumes y mezclas de los mismos.
20. La composición para lavado de vajillas según
la reivindicación 19, en la que la enzima proteasa es una variante
de la subtilisina N76D/S103A/V104I derivada de subtilisina de
Bacillus lentus.
21. Una composición de aseo personal que
comprende:
- (a)
- de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 5% en peso de enzima proteasa que es una variante de la carbonil hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora y en la que la enzima proteasa es una variante de la subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V; N76D/V104Y/ I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/ S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S; N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/ V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/ V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N, y N76D/S103A/V104I/ M222A; y mezclas de las mismas; donde la posición numerada corresponde a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens; y
- (b)
- de 0,01% a 95% en peso de un sistema tensioactivo; y
- (c)
- de forma opcional, de 0,05% a 50% de un estabilizador de enzimas.
22. La composición de la reivindicación 20, en
la que la enzima proteasa está a un nivel de aproximadamente 0,001%
a aproximadamente 2% en peso.
23. La composición de la reivindicación 20, en
la que la enzima proteasa está a un nivel de aproximadamente 0,01%
a aproximadamente 0,8% en peso.
24. La composición de la reivindicación 20, en
la que el sistema tensioactivo comprende un tensioactivo
seleccionado del grupo que consiste en carboxilatos aniónicos,
óxidos de amina, alquilglucósidos, glucosamidas, alquilsulfatos,
alquiléter sulfatos, acil isetionatos, alquil sulfosuccinatos,
ésteres de alquilfosfato, ésteres de fosfato etoxilado, alquil
gliceril éter sulfonatos o mezclas de los mismos.
25. La composición de la reivindicación 20, en
la que el sistema tensioactivo comprende un tensioactivo
seleccionado del grupo que consiste en jabones, acilglutamatos,
alquilsarcosinatos, óxidos de lauramina, óxidos de cocamina, óxidos
de cocamidopropilamina, decilglucósidos, laurilsulfatos,
laurethsulfatos, acil C_{12}-C_{18} isetionatos
o mezclas de los mismos.
26. La composición de la reivindicación 25, en
la que el tensioactivo es jabón a un nivel de al menos 2% en peso
de la composición.
27. La composición de la reivindicación 26, en
la que el jabón está a un nivel de al menos 10% en peso de la
composición.
28. La composición de la reivindicación 27, en
la que el jabón está a un nivel de al menos 25% en peso de la
composición.
29. La composición de la reivindicación 25, en
la que la relación entre jabón y enzima proteasa es de 2.000:1 a
8:1.
30. La composición de la reivindicación 29, en
la que la relación entre jabón y enzima proteasa es de 400:1 a
40:1.
31. La composición de la reivindicación 25, en
la que la enzima proteasa es una variante de la carbonil hidrolasa
que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la
naturaleza, que se deriva de una carbonil hidrolasa precursora de
subtilisina y en la que la enzima proteasa es una variante de la
subtilisina de Bacillus lentus seleccionada de N76D/S103A;
N76D/V104I; N76D/S99D/S103A; N76D/S99D/V104I; N76D/S101R/S103A;
N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/V104I/I107V;
N76D/V104Y/I107V; N76D/V104I/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A;
N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I;
N76D/S101R/S103A/V104I; N76D/S103A/V104I/N123S;
N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/
S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/
S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/
V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N y N76D/S103A/V104I/M222A; donde la posición numerada corresponde a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens; y mezclas de las mismas.
N76D/V104I/I107V/N123S; N76D/S99D/S101R/S103A/V104I; N76D/S99D/S103A/V104I/N123S; N76D/S99D/
S101R/S103A/V104I/N123S; N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/T260P; N76D/S103A/V104I/
S265N; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/
V104I/L126F; N76D/S103A/V104T/L107T; N76D/S103A/V104I/L126F/S265N y N76D/S103A/V104I/M222A; donde la posición numerada corresponde a subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens; y mezclas de las mismas.
32. Un método para limpiar tejidos,
comprendiendo dicho método poner en contacto un tejido que precisa
limpieza con una enzima proteasa que es una variante de subtilisina
N76D/S103A/V104I derivada de la subtilisina de Bacillus
lentus.
33. Un método para limpiar platos, comprendiendo
dicho método poner en contacto un plato que precisa limpieza con
una enzima proteasa que es una variante de subtilisina
N76D/S103A/V104I derivada de la subtilisina de Bacillus
lentus.
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