PL178045B1

PL178045B1 - Mutant proteazy do stosowania w detergentach, sekwencja DNA kodująca mutanta proteazy, sposób otrzymywania mutanta proteazy oraz kompozycja detergentowa

Info

Publication number: PL178045B1
Application number: PL93307132A
Authority: PL
Inventors: Leonardus J. S. M. Mulleners; Onno Misset; Der Laan Jan M. B. Van; Gastel Franciscus J. Van; Cornelis P. Broekhuizen; Erik J. Baas
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-19
Publication date: 2000-02-29
Also published as: EP0717778B1; ES2296285T3; FI950168A0; FI120500B; PT717778E; CA2139928A1; PL307132A1; AU682314B2; ATE376061T1; FI950168L; EP0717778A1; JPH07508887A; KR950702633A; AU4700693A; JP4028592B2; CA2139928C; WO1994002618A1

Abstract

1. Mutant proteazy do stosowania w detergentach, posiadajacy ulepszona zdolnosc pioraca i/lub ulepszona stabilnosc w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309, znam ienny tym, ze posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej: H 2N -A - Q - S-V -P- W - G -I- S- R - V -Q - A -P- A -A - H - N -R -G -L- T- G- S - G- V - K- V- A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T- Q - D - G - N - G -H -G -T -H -V -A -G - T - I- A -A -L -N -N -S -I -G - V -L -G -V -A -P -N -A - E - L -Y -A -V -K - V -L -G -A -S -G -S -G -S -V -S -S -I - A -Q -G -L -E -W -A -G -N -N -G - M -H -V -A- N- L- S- L- G-S -P- S- P-S -A- T- L-E -Q -A -V- N- S- A-T -S -R -G- V- L- V -V -A -A -S - G -N -S -G -A -G -S -I -S -Y -P -A -R -Y -A -N -A -M -A -V -G -A -T -D -Q - N- N- N -R -A-S-F -S-Q-Y -G-A-G -L-D -I-V-A -P-G- V-N-V -Q-S -T-Y-P -G-S- T -Y -A -S -L -N -G -T -S -M -A -T -P -H -V - A - G -A - A -A -L -V - K -Q -K -N -P -S -W -S - N -V -Q -I- R- N- H-L -K -N- T- A- T-S -L -G- S- T-N -L- Y- G- S-G -L- V-N -A -E -A- A -T -R- C O O H albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej: H2N - A - Q - S - V - P - W - G - I - S - R - V - Q - A - P - A - A - H - N - R - G - L - T - G - S - G - V-K -V- A-V -L -D- T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S- T -Q -D -G- N- G- H-G -T- H- V-A -G- T-I -A -A -L- N-N -S -I- G- V-L -G -V -A- P- S- A -E -L -Y -A -V -K -V -L -G -A -S -G -S -G -S -V - S - S - I- A -Q -G -L -E -W -A -G -N -N - G-M-H-V -A -N- L-S -L- G-S -P- S- P-S -A -T -L- E- Q-A -V -N- S- A- T-S -R -G- V- L -V -V -A -A -S - G -N -S -G -A -G -S -I -S -Y - P -A - R -Y - A- N- A- M- A- V- G- A- T - D - Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y -G- A- G-L -D -I -V- A- P- G-V -N- V- Q-S -T- Y- P-G - S- T -Y -A -S -L -N -G -T -S -M -A -T -P -H -V -A -G -A -A -A -L -V -K - Q -K -N -P -S -W - S -N- V- Q-I -R -N -H- L-K -N -T- A- T-S -L- G- S-T -N -L -Y -G- S- G-L -V -N -A- E- A-A-T-R-C O O H i rózni sie co najmniej jedna reszta aminokwasowa w wybranym miejscu, odpowiadajacym pozycjom 60, 87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,169,175,180,182,193,197, 198, 203, 211 i 216 w rzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309. PL PL PL

Description

Stosowanie dodatków enzymatycznych, zwłaszcza enzymów proteolitycznych, w kompozycjach detergentów dla ułatwienia usuwania zabrudzeń białkowych zostały obszernie udokumentowane. Patrz na przykład opublikowane europejskie zgłoszenia patentowe o numerach -Ρ-Α_0220921 i —-_Α-0232269, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 4 480 037 i ponowne wydanie numer 30 602 oraz artykuł „Production of Microbial -nzymes”, Microbial Technology, tom 1 (1979) 281-311, Academic Press.

Kompozycje detergentów, które stosuje się do mycia powierzchni twardych, czyszczenia sanitariatów·’, zmywania naczyń i prania, mogą mieć postać proszku, płynu lub pasty. Detergenty piorące dzieli się generalnie na dwa główne typy, płyny i proszki.

Enzymy proteolityczne trudno jest, ogólnie rzecz biorąc, łączyć z koMpozycjami detergentów; Muszą one być stabilne i aktywne podczas stosowania, na przykład w usuwaniu białkowych plam z tkanin podczas prania w temperaturach w zakresie od około 10°C do ponad 60°C. Ponadto, muszą one być stabilne w produktach detergentowych w ciągu długich okresów przechowywania. W konsekwencji, enzymy muszą być stabilne i działające w obecności czynników maskujących, środków powierzchniowo czynnych, wysokiej zasadowości, często czynników

178 045 wybielających oraz podwyższonej temperatury. Jako, że nie istnieją ani uniwersalne detergenty piorące, ani uniwersalne warunki prania (pH, temperatura, stężenie roztworu piorącego, twardość wody), które są stosowane na całym świecie, wymagania wobec enzymów mogą różnić się w zależności od typu detergentu, w którym się je stosuje, oraz warunków prania.

Komercjalnie ważną grupą proteaz są tak zwane proteazy mocno zasadowe, pochodzące z alkalofilowych Bacilli. Komercjalnie dostępny produkt proteazy mocno zasadowej MAXACAL® (Gistbrocades/IBIS) zawiera proteazę serynową„PB92”, pochodząca z Bacillus novo sp. PB92 (patrz ponowne wydanie numer 30 602 opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki). Jej sekwencję aminokwasowąujawniono w europejskich zgłoszeniach patentowych o numerach EP-A-0283075 i EP-A-0284126. Członkiem tej grupy jest również SAVINASE® (Novo-Nordisk). SAVINASE zawiera enzym „Subtilisin 309”, który pochodzi ze szczepu NCIB 10147 Bacillus (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 3 723 750). Jego sekwencję aminokwasową ujawniono w światowym opisie patentowym numer WO 89/06279, gdzie szczep określany jest jako Bacillus lentus. Ukazuje się, że sekwencje aminokwasowe tych dwóch proteaz różniąsię tylko w pozycji 85 (uwzględniając numerację reszt proteazy PB92, która odpowiada pozycji 87 w numeracji BPN), gdzie PB92 posiada asparaginę („N” w jednoliterowym kodzie aminokwasów), a „Subtilisin 309” serynę („S”).

Ponieważ proteaza PB92 jest aktywna w usuwaniu plam przy alkalicznych wartościach pH, powszechnie stosuje się ją jako dodatek do detergentów, wraz z takimi składnikami detergentów, jak środki powierzchniowo czynne, wypełniacze aktywne i czynniki utleniające. Te ostatnie czynniki najczęściej stosuje się w postaci proszku. Dodatek do detergentów może także obejmować inne enzymy, na przykład amylazy, celulazy i/lub lipazy, o ile są one kompatybilne z proteazą. Proteaza PB92 posiada wysoką skuteczność usuwania plam w porównaniu z innymi proteazami, takimi jak „klasyczne” subtylizyny, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Oznacza to, że potrzeba mniej proteazy PB92 do uzyskania tej samej zdolności piorącej. Wrażliwość na utlenianie jest istotną wadą proteazy PB92 i wszystkich innych znanych proteaz serynowych wykorzystywanych do stosowania w detergentach.

Pierwotnie, komercjalnie dostępne proteazy alkaliczne, takie jak MAXACAL®, opracowano do stosowania w detergentach w podwyższonych temperaturach w zakresie 40-60°C. Jednakże obecnie, z powodu wzrastającego nacisku na ekonomiczność, występuje ciągła tendencja do przechodzenia na niższe temperatury. W konsekwencji, niższa zdolność piorąca w obniżonych temperaturach, np. 15-25°C, jest istotnąwadą dostępnych w handlu proteaz alkalicznych.

Istnieje kilka dróg otrzymywania nowych enzymów do zamierzonego stosowania, które są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Modyfikacja istniejących enzymów przez inżynierię białkowąjest prawdopodobnie obecnie najbardziej popularną i skuteczną metodą.

Najbardziej specyficzną drogą otrzymywania zmodyfikowanych enzymów jest ukierunkowana mutageneza, umożliwiające specyficzne podstawianie jednego lub więcej aminokwasów innym, pożądanym, aminokwasem. Europejskie zgłoszenie patentowe numer EP-A-0130756 podaje przykład stosowania tej techniki do tworzenia zmutowanych genów proteaz, dzięki ekspresji których można otrzymywać zmodyfikowane enzymy proteolityczne. Bardzo skuteczną metodąjest ukierunkowana mutageneza kierowana oligonukleotydami, która umożliwia wprowadzanie wielu różnych mutacji w specyficznej części sekwencji DNA przez użycie pojedynczego preparatu syntetycznego oligonukleotydu.

Wyczerpujące podsumowanie różnych kompozycji detergentów i enzymów, ich postaci fizycznych, warunków, które enzymy mają spełniać dla optymalnego działania, problemów i ograniczeń stosowania obecnie dostępnych enzymów w enzymatycznych kompozycjach detergentów, przygotowywania i przeszukiwania zmutowanych proteaz itp., zawarte jest w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP-A-0328229, włączonym do niniejszego opisu poprzez odnośnik literaturowy.

Światowy opis patentowy numer WO 89/06279 zastrzega między innymi mutanty proteazy „Subtilisin 309”, w których przedstawiono jedną lub więcej reszt w następujących pozycjach (uwzględniając oryginalną numerację reszt BPN): 6, 9, 11-12, 19, 25, 36-38, 53-59, 67, 71, 89,

178 045

104,111,115,120,121-122,124, 131 140,153-166,168,169-170,172, 175,180,182,186,

187, 191, 194, 195, 199, 218, 219, 222, 226, 234-238, 241,260-262, 265, 268 lub 275. Liczba przykładów opisujących mutanty, które rzeczywiście przygotowano i testowano, ograniczona jest w tym opisie tylko do ośmiu, obejmujących nie więcej niż cztery pozycje. Tymi mutantami są: S153A, G195D, G195E, N218S, [G195E,M222A], [G195E,M222-], M222A i M222-.

Europejskie zgłoszenie patentowe numer EP-A-0328229 ujawnia i zastrzega między innymi zmutowane proteazy, które posiadając-o najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92 i różnią się co najmniej jedną resztą aminokwasową w wybranych miejscach odpowiadających 32, 33, 48-54, 58-62, 94-107, 116-118, 123-134, 150, 152-156, 158-1 (i 11164,166,169,175-186,197,198 i 203-216,235,243 i 259 rzeczonej proteazy serynowej PB92, i posiadające ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do rzeczonej proteazy serynowej PB92. W zgłoszeniu tym podaje sięprzykłady 69 mutantów, obejmujących 17 pozycji.

Europejskie zgłoszenie patentowe numer EP 0405 901 A1 ujawnia i zastrzega zmutowane subtylizyny wywodzące się między innymi od „Subtilisin 309” lub proteazy PB92, które różnią się co najmniej jedną resztą aminokwasową w następujących pozycjach: 1-4, 6,9,10,12,14,15, 17-22, 24, 25,27,36-38,40, 41,43-46,49-62,75-79, 87, 89,91,94,98-101,103-109,112,113, 115-118,120,126, 128-131,133,134,136,137,140,141,143-146,155,156,158-167,170-173, 181-186, 188, 189, 191, 192, 194, 195, 197, 204, 206, 209-218, 235-245, 247-249, 251-257, 259-263, 269, 271,272,275,97, dzięki czemu posiadają zmieniony ładunek cząsteczkowy co polepsza ich zdolność piorącą. W zgłoszeniu tym podaje się przykłady 68 mutantów, obejmujących 34 pozycje.

Pomimo postępu, który dokonał się w kilku ostatnich latach, istnieje ciągłe zainteresowanie opracowywaniem nowych enzymów proteolitycznych o ulepszonych właściwościach, które czyniąje bardziej atrakcyjnymi pod względem stosowania w detergentach. Właściwości te mogą obejmować, ale nie ograniczają się do lepszej zdolności piorącej, polepszonej zdolności usuwania plam w niskiej temperaturze prania, ulepszonej stabilności podczas przechowywania lub ulepszonej stabilności podczas stosowania.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest mutant proteazy do stosowania w detergentach, posiadający ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309, charakteryzujący się tym, że posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

H2NτAIQ-S-V-Ρ-WI--I-S-RτVIQ-A-Ρ-A-AIHIN-Rτ--LτT-GτS-G-VI

K-VτAτV-L-D-TI--I-S-T-H-P-D-L-NII-R-G-G-A-S~F-V-Ρ-G-E-Ρ-SτTI

Q-D---]N-G-H-G-T-H-V-A-G-TτI-A-A-L-N-N-S-I-G-VIL-G-V-A-Ρ-NIAI

EIL-YτA-V-K-V-L---A-S---S---S-V-S-S-IAA-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-GM-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-Ρ-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-TIS-R-G-V-LI

V-V-A-A-S---N-SIG-A-G-S-I-SγγpPAA-RγYAA-NAA-M-A-V---AIT-D-QI

N-N-N-R-A-S-FIS-Q-Y-G-A-G-L-D-IIV-A-ΡτG-V-N-V-Q-S-T-Y-Ρ---ST-Y-A-SIL-NτG-T-S-MτA-TIΡ-H-VIA-GτA-A-A-L-V-K-Q-K-N-Ρ-S-W-SI

N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-TIA-T-SτL--IS-T-N-L-Y---S---L-V-N-AIE-AI

A-T-^R-I^C^OH

178 045 albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej :

h₂n-a-q-s-v-p-w-g-i-s-r-v-q-a-p-a-a-h-n-r-g-l-t-g-s-gV-K-V-A-V-L-D---G---S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-ST-Q-D-G-N-G-H-G-TtH-V-AaGgT-I-AaAaLlN-N--sI-G-V-L-G-V-A-P-SA-E-L-V-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G~S-V-S-S-IAA-Q-G-L-E-W-A-G-N-NG-M-H-V-Aa_N-L--sL-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-QlA-V-N-S-A-T-S-R-G-VLlV-V-A-A- S - G-N- S -G-A- G- S -1 - S - Y- P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V- G-A- T - Dq_—_N-n-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-GS-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A---V-K-Q-K-—-P-S-WS-n-v-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-GlS-G-L-V-N-A-EA-A-T-R-COOH i różni się co najmniej jednąresztąaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128,130, 133, 134, 154, 156,158, 159, 160,

164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 wrzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309. ’

Korzystnie, mutant proteazy według wynalazku, charakteryzuje się tym, ze różni się od proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,V203W], [S99G,M216S], [S99T], [V102A], [V102A,M216S], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V1021,G116V,S 126V,P 127M], [V102I,S130G], [V102-], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XyZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [v102N,R164Y], [—102—.— 198G], [V102N,N 197T,N 198G], [V102N,N198G,V203W], [V102N,V203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [-102P], [V102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [G116V,S126L,P127N,S128V,A156E], [G116V,S126L,P127N,S128V,V203W], [G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D], [G11 6V,S 126L,P 127Q,S 128A,M2 16S], [G11 6V,S 12 6N,P 127S,S128A], [G 11 6V,S 126N,P 127S,S 128A,M2 16Q], [G116V,S126N,P127S,S128A,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126V,P127E,S128K,S160D], [G116V,S 126V,P127M,S 160D], [G116V,S 126V,P 127M,N 198G], [G116V,S 126V,P 127M,Y203 W], [G116V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P127A,S128G,S160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,V203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134-], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212-], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198-], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,V203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203-], [Y203E],

178 045

[Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203TiS182N], [Y203V], [Y203V,V193A]i [Y203W], [Y203W,M216S], [-211—], [L211X^N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211—,M216S] i [N212—].

Równie korzystnie, mutant proteazy PB92 według wynalazku, charakteryzuje się tym, że posiada mutacj ę aminokwasu 102 i co najmniej j ednego innego aminokwasu, przy czym korzystniej wybrano go z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198—].

Kolejnym aspektem niniejszego wynalazkujest sekwencja DN— kodująca mutanta proteazp, posiadającego ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy aerpnnwej Subtilisin 309 charakteryzująca się tym, że kodowany przez nią mutant proteazy posiada cn najmniej 70% homologii dn sekwencji aminnkwaso^ej proteazy serpnnw_<ej PB92, o sekwencji eminokwasnwej:

H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-VK-y-A-Y-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-—-S-F-V-P-G-E-P-S-TQ-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-p-N-AE-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-GM-H-V-A-N-I-IsL-G-S-P-S-P-S-—-T-:--—-Qi—-V-N-S-—-T-S-R-G-V-Lv-v-—-—-S-G-N-S-G-—-G-S-IsS-YpI-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-—-T---Qi

N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-—-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-ST-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-SN-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-—-A—-T-RcCOOH albo do sekwencji αminokwesowej prottazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej :

H2N-—-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-—-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-GV-K-V-A-V-LlD-T-G-IiS-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-ST-Q---G-N-G-H-G-TtH-V-A-G-TtIiA-A-L-N-N---I-G-V-L-G-V-A-P-Sa-—-l-y-—-v-k-v-l-g-a-s-g-s-g-s-v-s-s-i-a-q-g-l—e-w-a-g-n-ng-m-h-v-a-n-l-Ssl-g-s-p-s-p-s-—-t-l-—-q-—-v-n-s-a-t-s-r-g-vL-V-v-—-—-S-G-N-S-G-—-G-S-I-S-YpP-A-R-Y-A-N-A-M-—-V-G-—-T-DQ-N-N-N-R-—-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L---I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-GS-T-Y-—-S-L-N-G-T-S-M-—-T-P-H-V-A-G-A-A-—-L-V-K-Q-K-N-P-S-WS-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-—-—A-A-T-R-COOH

178 045 i różni się co najmniej j ednąresztąaminokwasowąw wybranym miej scu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160,

164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 wproteazie serynowej PB92 lub proteazie serynowej Subtilisin 309.

Korzystnie, sekwencja DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że kodowany przez nią mutant proteazy różni się od proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [ V 102 A], [V 1 02 A,M2 1 6 S], [V102E], [V102G], [V102H], [ V 102I ], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZjestjakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164Y], [V102N,N198G], [-102N,N197T,N198G], [V102N,N198G,Y203W], [YW2N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [Y102P], [V102P,M216S], [V102Q], [Y102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [-102T], [V102Y], [G116V,S126L,P127N,S128V,A156E], [G116Y,S126L,P127N,S 128V,Y203W], [G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D], [G116-,S126L,P127Q,S128A,M216S], [G11 6V,S 12 6N,P 127S,S 128A], [G116V,S126N,P127S,S128A,M216Q], [G116V,S126N,P127S,S128A,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M21 6S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116—S 126V,P127E,S 128K,S 160D], [G116-S126-P127M.S160D], [G116-,S126V,P127M,N198G], [G116V,S126V,P127M,Y203W], [G116V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P127A,S128G,S160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [-197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198C], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203C], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,n212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E].

Równie korzystnie, sekwencja DNA według wynalazku, charakteryzuje się tym, ze kodowany przez nią mutant proteazy PB92 posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu, przy czym korzystniej kodowany przez nią mutant został wybrany z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198G].

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania mutanta proteazy, posiadającego ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309 charakteryzujący się tym, że hoduje się szczepy mikroorganizmu gospodarza stransformowanego wektorem ekspresyjnym, zawierającym sekwencję DNA kodującą mutanta proteazy i odzyskuje się mutanta proteazy, przy czym sekwencja DNA kodująca mutanta proteazy, charakteryzuje się tym, że posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-VK-V-AV-LlD-TtG-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-QD-G-NG-H-G-TtH-V-AaG-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-LY-A-—<-V-L-G-A-S-G-S-G-S---S-S-IaA-Q-G-L-EwWaA-G-N-N-G-M-H--14

178 045 _-n-ls-l-g-s-p-s-p-s-a-t-l-EqQ-a-v-n-s-a-t-s-r-g-v-l-v-v-a-_S-GLNS-G-A-G-S-I-Svγpp_ARRvY-A-N_A-M-A-V---_-T-D-QLNLN-N-R-_SLFLSQ-Y-GLA-G-L-D-I-V-A-PLG-V-N-VLQ-SLT-Y-P-GLSLT-Y-ALSLLLNL g-t-sm-a-t-p-h-v-a-g-a-a-_-l-v-k-q-k-n-p-s-w-s-n-v-q-i-r-n-hL-K-NT-A-T-SLL-G-S-T-N-LvY-G-S-GLLvV-N_A-L_A_AτTRR-COOH albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-_-q-s-v-p-—---i-s-r-v-q-_-p-_-_-h-n-r---l-t---s-—V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-ST-Q-D-G-N-G-H-G-TτH-VvA__G-TτI-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-SL

A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-AqQ-G-L-E-W-A-G-N-NG-M-H-VvA_N-LLSsLLG-Lsp-S-P-S-A-T-L-E-QLA-V-N-S-A-T-S-R-G-VL-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-·S-Y-P-ARR-Y-A-N-A-M-ALV-G-_-TLDL

Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-_-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-GL

SLTLY-A-S-L-N-G-T-S-M-ALT-P-H-V-A-G-ALA-A-LLV-K-QLKLN-P-S-WL

S-N-V-Q-I-R-N-HLL-K-N-TLA-T-S-L-GLS-T-N-L-Y-GLS-G-L-V-N-_-EL

A-A-T-RcCOOH i różni się co najmniej jednąreszląaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 13^^ 154, 156, 158, 159, 160,

164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 w rzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309.

Korzystnie, sposób według wynalazku, charakteryzuje się tym, że kodowany przez sekwencję DN_ mutant proteazy różni się od proteazy serynowej PB92 lub rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [ V 102 _], [V 102_,M2 16 S ], [V102E], [V102G], [V102H], [ V 102I], [V102I,G116V,S 126V,P 127M], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [v 102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZjestjakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164Y], [V102N,N198G], [Y102N,N197T,N198G], [V102N,N198G,Y203W], [V102N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [V102P], [V102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [G116V,S126L,P127N,S128V,_156E], [G116V,S126L,P 127N,S 128V,Y203W], [G116V,S126L,P127Q,S128_,S160D], [G116V,S126L,P127Q,S128_,M216S], [G11 6V,S 126N,P 127S,S 128_], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216Q], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S 126VP127E,S 128K,S 160D], [G116V,S 126V,P 127M,S 160D], [G116V,S126VP127M,N198G], [G116V,S 126V,P 127M,Y203W], [Gn6V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X,

178 045 gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P127A,S128G,S160D] [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164-], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180-], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198C], [N198D], [7198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203C], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiemL, a Zjestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E].

Równie korzystnie, sposób według wynalazku, charakteryzuje się tym, że kodowany przez sekwencj ę DNA mutant proteazy posiada mutacj ę aminokwasu 102 i co naj mniej j ednego innego aminokwasu, przy czym korzystniej kodowany przez sekwencję DNA mutant proteazy został wybrany z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102—,—198G].

Kolejnym aspektem wynalazku jest kompozycja detergentowa, zawierająca stosowane do produkcji środków piorących detergenty, wypełniacze i enzymatyczny dodatek do detergentów, który posiada ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309, charakteryzująca się tym, że jako enzymatyczny dodatek do detergentów zawiera jednego lub więcej mutanta proteazy, który posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-V-P---G-I-S-R-V-Q-AgP-AgA-HgN-R-G-L-T-G-S-G-VK-v_a-v-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T—-—-G-N-G-H“G-TtH-V_A-G-TtI-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-Ae-l-y-a-v-k-v-l-g-a-s-g-s-g-s-v-s-s-g-a-<i-g-l-g-w-a-g-n-n-gM-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-C-AgV-N-S-AgT-S-R-G-V-Lv-v-a-a- s-g-n-s-g-a-g-s-i-^yi- p-a- r-y-a-n-a-m-a- v-g-a-t - D-QN-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-IgV-A-PgG-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-ST-y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-TgP-H-VgAgGgAgAgA-LgVgK-QgK-n-PiS^--Si

N—V—Q—I—R—N-H-L-K-N-T—A—T—S—L—G-S—T—N—L—Y—G—S -g-l-v-n-a-e-aa-t-r-cooh albo sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-V-P-W-g-i-s-r-V-Q-A-P-AgA-H-N-R-g-l-t-g-s-gV-K-V-A-V_LiD-GtG-I-S-T-H-P-D-L-N-I-—-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-ST-Q-D-G-N-G-H-G-GtH-V_A-G-TtI-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-SA-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-GlL-E-W-A-G-N-N16 178 045

--MIH-V-A-N-L-S-L-G-S-Ρ-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-VI

L-VIVIAIAτS-G-N-S-G-A--IS-IsIγγpTAA-TγγAA-NAA-M-A-V--IAIT-DI

Q-N-N-N-R-A-S-F-S-QIY---A---L-D-I-VIA-Ρ-G-VIN-V-Q-S-TIY-Ρ-GI

SITτY-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-QτK-N-Ρ-S-WI

SIN-V-Q-I-R-N-H-L-KτN-TτA-TτS-L---S-T-N-L-Y-G-S---L-V-N-A-EI

A-A-T-R-COOH i różni się co najmniej jednąresztąaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158,159,160, 1'6ⁱ4,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 w rzeczonej proteazie serynowej PB921ub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309, i zawiera, jeśli jest to pożądane, jeden lub więcej enzymów wybranych z grupy, składającej się z amylaz, celulaz i lipaz.

Korzystnie, kompozycja detergentowa według wynalazku, charakteryzuje się tym, że mutant proteazy różni się od rzeczonej proteazy serynowej PB92 lub rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99-,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99-,M216S], [S99T], [V 102 A], [V 102 A,M2 16S], [V102E], [Y102G], [V102H], [V102I], [V102I,-116V,S126V,P127M], [V102I,-116V,S126V,P127M], [V102I,S130-], [V102L], [V102L,-116V,S126V,P127M], [V102L,S130-], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [—102M], [—102N], [-102N,XYZ, gdzie XYZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164Y], [V102N,N198-], [V102N,N197T,N198-], [V102N,N198-,Y203W], [— 102N,Y203 W], [V102N,L211E], [—102N,M216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [—102Ρ], [V102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [-116V,S126L,P127N,S128V,A156E], [-116V,S126L,P127N,S128V,Y203W], [-116V,S126L,P127Q,S128A,S160D], [G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S], [-116V,S 12 6N,P 127S,S 128 A], [—116V,S 126N,P 127S,S 128A,M216Q], [-116V,S126N,P127S,S128A,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [-116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126V,P127E,S128K,S160D], [-116V,S 126V,P 127M,S 160D], [G116V,S 126—,Ρ 127M,N 198G], [-116V,S126V,P127M,Y203W], [-116V,S126V,P127M,Y203-], [M117L], [S126F'Ρ127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem Ρ], [S126M,P 127A,S 128-,S 160D], [S126M,P127A,S128-,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130-,Y203W], [L1331], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134-], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [—197N], [V197T], [V197T,M216S], [—197W], [M198-], [N198D], [N198E], [N198G], [N198-,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203-], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E].

Równie korzystnie, kompozycja detergentowa według wynalazku, charakteryzuje się tym, ze mutant proteazy posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu, przy czym korzystniej mutanta proteazy wybrano z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198-].

178 045

Termin „ulepszone właściwości” stosowany w tym opisie łącznie z terminem „zmutowane proteazy” oznacza enzymy o ulepszonych zdolnościach piorących lub ulepszonej stabilności przy zachowanej zdolności piorącej w stosunku do odpowiadającej proteazy typu dzikiego.

Termin „zdolność piorąca” zmutowanych proteaz jest zdefiniowany w tym opisie jako dodatkowy udział zmutowanej proteazy w praniu w stosunku do wpływu kompozycji detergentu bez enzymu w stosownych warunkach prania.

Termin „stosowne warunki prania” stosuje się dla wskazania warunków, zwłaszcza temperatury prania, czasu, urządzeń piorących, stężenia roztworu piorącego, typu detergentu i twardości wody faktycznie stosowanych w gospodarstwach domowych na danym obszarze rynku detergentów.

Termin „ulepszona zdolność piorąca” stosuje się dla wskazania, że zdolność piorąca zmutowanej proteazy, biorąc pod uwagę jej wagę, jest w stosownych warunkach prania co najmniej większa niż 100% w stosunku do odpowiadającej proteazy typu dzikiego.

Termin „zachowana zdolność piorąca” stosuje się dla wskazania, że zdolność piorąca zmutowanej proteazy, biorąc pod uwagę jej wagę, wynosi w stosownych warunkach prania co najmniej 80% w stosunku do odpowiadającej proteazy typu dzikiego.

Termin „ulepszona stabilność” stosuje się dla wskazania lepszej w stosunku do odpowiadającego enzymu typu dzikiego stabilności zmutowanych enzymów proteolitycznych w detergentach piorących podczas przechowywania i/lub ich stabilności w roztworach piorących, która obejmuje stabilność wobec czynników utleniających, czynników maskujących, autolizy, środków powierzchniowo czynnych i wysokiej zasadowości.

Europejskie zgłoszenie patentowe numer -Ρ_Α-0328229 opisuje metodę, w której przygotowywanie zmutowanych proteaz połączone jest ze skuteczną, procedurą selekcji zdolności piorącej tych proteaz. Układ testowy opiera się na usuwaniu wrażliwych na proteazy plam z pasm materiału testowego w pralkach laboratoryjnych typu Lauder-O-meter lub Terg-O-meter, imitujących stosowne warunki prania. Odpowiednimi pasmami materiału testowego są, na przykład, komercjalnie dostępne pasma —MPA (—idgenossische Materiał Prufungs und Versuch Anstalt, St. Gallen, Szwajcaria) sztucznie zabrudzone plamami białkowymi. Stosowne do testowania proteaz plamy na pasmach obejmują krew, trawę, czekoladę i inne plamy białkowe. Zgłoszenie ujawnia także, że w tym układzie testowym inne stosowne czynniki, takie jak skład detergentu, stężenie roztworu piorącego, twardość wody, urządzenie piorące, czas, pH i temperatura, sąkontrolowane w taki sposób, że można imitować warunki typowe dla stosowanych w gospodarstwach domowych na określonym obszarze rynku.

Zdolność piorącą proteaz dogodnie mierzy się przez ich zdolność do usuwania pewnych reprezentatywnych plam w odpowiednich warunkach testowych. Zdolność tą można odpowiednio określać przez pomiary odbicia światła od materiału testowego, po praniu z enzymami i bez enzymów w pralkach laboratoryjnych typu Lauder-O-meter lub Terg-O-meter. Testowy układ laboratoryjnego stosowania według wynalazku jest reprezentatywny dla stosowania w gospodarstwach domowych, gdy wykorzystuje się go dla proteaz, które zmodyfikowano przez mutagenezę D—A.

W celu praktycznego stosowania niniejszego wynalazku, można wykorzystywać zasadniczo tą samą metodę przygotowywania, przeszukiwania i selekcji dalszych zmutowanych enzymów pochodzących z enzymów typu dzikiego, wytwarzanych przez alkalofilowe Bacilli. Korzystnymi mutantami są te kodowane przez gen pochodzący z genu typu dzikiego kodującego proteazę serynowąPB97 lub proteazę serynową Subtilisin 309 i wykazujące ulepszone właściwości w wymienionych powyżej warunkach testowych. Bardzo odpowiednie są również geny kodujące bardzo zbliżone proteazy serynowe, korzystnie posiadające homologię wyższą niz około 70%, a zwłaszcza wyższą niż około 90%.

Będzie oczywiste, że do tworzenia mutacji w genie wybranej proteazy można stosować albo ukierunkowanamutagenezę wspomaganą oligonukleotydami, albo mutagenezę losową wybranego regionu, bądź każdą inną odpowiednią metodę.

178 045

Zgodnie z wynalazkiem otrzymano różne mutanty o nieoczekiwanie ulepszonych właściwościach, tj. znacząco wyższej zdolności piorącej, ulepszonej zdolności usuwania plam w niskiej temperaturze prania lub znacząco ulepszonej stabilności podczas przechowywania przy podobnej, a nawet lepszej zdolności piorącej. Te ulepszenia były zaskakujące, ponieważ ani nie sugerowały ich, ani nie wynikały w żaden sposób z inforMacji zawartych w europejskim zgłoszeniu patentowym numer —P_A_328229 lub żadnej innej wcześniejszej pracy, ani osobno, ani rozpatrywanych łącznie.

Dlatego też, niniejszy wynalazek dostarcza zmutowaną proteazę do stosowania w detergentach, która charakteryzuje się:

posiadaniem co najmniej 70% homologii do albo sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92 o sekwencji aminokwasowej:

H₂—-A-Q-S-V-—-W-G-I-S-R-V-Q-A-—-A-A-H-—-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-AV-l-D-T-G-I-S-T-H-—-D-L-—-I-R-G-G-A-S-F-V-—-G-E-—-S-T-Q-D-G-—G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-—-N-S-I-G-V-L-G-V-A-—-—-A-E-L-Y-A-VK-V-LsG-A-S-G-SsG-S-V-SsS-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-—s—-G-M-H-V-A-—-LS-L-G-S---S---S-A-T-LsE-Q-A-Vs--SsA-TsS-R-GsV-LsVsV-A-A-S-GsNSsG-A-G-SsI-S-Y-S-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-TsD-Q-N---Ns--A-S-F-Ss

Q-γ-G-A-G-L-D-IsVsA-——GsV-—-V-Q-—-T-Y-——G-S-T-Y-A-S-L———G-T-SM-A—T-P-H-V-A—G-A-A—A-L-V-K-Q-K—N-P-S-W-S-N-y-G-I-R-—-H-L-K-—T-A-T-S-L-G-S—T-—-L-Y—G-S-G-L-V-—-A—E—A-A-T-R-COOH albo sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H8—-AsQ-S-V-—-W-G-I-S-R-V-Q-A-—-A-A-H-—-R-G-L-T-G-—-G-V-K-V-AV-L-D-T-G-I—S—T-H-—-D—L-—-I-R-G—G-A-S-F—V-—-G—E-—-S-T-Q-D-G-—G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-—-—-S-I-G-V-L-G-V-A-—-S-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-SsG-S-V-SsS-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-—-—sGsM-H-VsA-—-L—-L-^S-—-—-—^S-^A-T-L-E-Q-A-V^—-—-A-T-S-^R-G-Y-L-Y-Y-A-A-S-G-N· —-GsA-G-S-I-—-Y-—sAsR-Y-As—-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-—-—-—-R-A-S-F-—· Q-γ-G-A-G-L-D-I-V-A-—-G-V-—sV-Q-S-TsYs—-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S· M-A-T-—-H-Vs.A-G-A-AsA-LsV-K-Q-K-—-—-S-W-S-—-VsQ-I-R-N-H-L“K-—·

T-A-T-S-L-G-S-T-—-L-Y-G-S-G-L-V-—-A-E-A-A-T-R-COCH odróżnianiem się co najmniej jednąresztąamiinokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,

160,164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216wrzeczonee proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309,

178 045 posiadaniem ulepszonej zdolności piorącej i/lub ulepszonej stabilności w stosunku do rzeczonej proteazy serynowej PB92 lub rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309.

Korzystną grupą zmutowanych proteaz, według wynalazku, są te mutanty proteazy PB92 lub Subtilisin 309, które różnią się co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [V 102_], [V 102 _,M2 16S], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I,G 116V,S 126V,P 127M], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZjestjakimkolwiekzmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164Y], [V102N,N198G], [V102N,N197T,N198G], [¥102^198—^203—], [V102N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [V102P], [V102P,M216S], [V102Q], [¥102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [G116V,S126L,P127N,S128V,_156E], [—1^,8126^127^128^203—], [G116V,S126L,P127Q,S128_,S160D], [G116V,S126L,P127Q,S128_,M216S], [G11 6V,S 12 6N,P 127S,S 12 8_], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216Q], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126VP127E,S128K,S160D], [G116V,S 126VJP127M,S 160D], [G116V,S126V,P127M,N198G], [G116V,S126Y,P127M,V203W], [Gn6V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S12óM,P127_,S128G,S160D], [S126M,P127_,S128G,M216Q], [S126VJP127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [-156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,_166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198C], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203C], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193_], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193_], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E];

posiadaniem ulepszonej zdolności piorącej i/lub ulepszonej stabilności w stosunku do rzeczonej proteazy serynowej PB92 i rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309.

Korzystnie, zmutowane proteazy, według wynalazku, mają zasadniczo czystą postać.

Pewne nowe zmutowane proteazy wykazują znacząco ulepszoną oporność na utlenianie, podczas gdy ich zdolność piorąca równieżjest lepsza, a w wielu przypadkach znacząco lepsza niż zdolność piorąca odpowiadającej proteazy typu dzikiego. Wspólną cechą tych zmutowanych enzymów jest to, że metionina („M”) w pozycji 216 jest zastąpiona innym aminokwasem, korzystnie seryną(„S”) lub glutaminą („Q”). Odpowiednie jest również zastąpienie fenyloalamną(„F”) lub alaniną („_”). Dalsze podstawienia obejmują pozycje 60, 99, 102, 116, \2Ί, 128,130,154,

156,158,197,198,203,211 i 212. Korzystnymi enzymami sąte mutanty M216S i M216Q, w których podstawiono ponadto pozycję 102 i jedną lub więcej z pozycji 116, 126, 127 i 128. Także mutanty M216S i M216Q z podstawieniami w pozycjach 197,198 i 203 są przedmiotem szczególnego zainteresowania. Korzystnymi mutantami są [N60E,M216S], [S99G,M216S], [V102_,M216S], [V102L,M216S], [V102N,M216S], [V102P,M216S], [V102Q,M216S], [V102S,M216S], [G216V,S126L,P127Q,S128_,M216S], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [P127E,S128T,M216S], [V197T,M216S], [N198G,M216S], [Y203W,M216S], [L211E,M216S], [G116V,S126N,P127S,S128_,M216Q], [S126M,P 127_,S 128G,M216Q], [V102L,M216F].

Należy zauważyć, że europejskie zgłoszenie patentowe numer EP-—-0328229 opisuje ulepszoną stabilność w warunkach utleniających przy zachowanej zdolności piorącej pewnych mu20

178 045 tantów M216S i M216— PB92 i podobnych mocno zasadowych proteaz serynowych. Jednakże, zgłoszenie to ani nie podaje informacji ani nie sugeruje, że mutanty „216” PB92 lub Subtilisin 309 ze wspomnianymi powyżej mutacjami mogądawać nawet znacząco ulepszoną zdolność piorącą.

Pewne nowe zmutowane proteazy, które nie są na ogół odporne na utlenianie, wykazują znacząco ulepszoną zdolność piorącą. Te zmutowane enzymy posiadająjedno lub więcej podstawień w pozycjach 87,97,99, 102,116, 11Ί, 126, 127, 130, 133,134,154,156,158,159,160,

164.166.169.175.180.182.193.197.198.203.211 i 212. Korzystnymi mutantami są te, które posiadają co najmniej dwie modyfikacje wśród tych zdefiniowanych pozycji. Modyfikacje te obejmują pozycje: 99 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 102, 130 lub 203; 102 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 87, 97,116,117,126,127,128,130,

133.134.154.156.158.159.160.164.166.169.175.180.182.193.197.198.203.211 lub 212, korzystnie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 130,164,197,198,203 lub 211; 116,126,127,128 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 99, 102, 130, 156,160, 197, 198, 203,211,212, korzystnie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 102,156,160,198,203,211; 126 i 127, korzystnie zjedną dodatkowąmutacjąw pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 102, 156, 160, 198,203 lub 211; 130 i 203, 154 i 160; 158 i 159; 160,166 i 169; 160 i 212; 198 i 203; 203 i 182; 203 i 193; 211 i 212. Korzystnymi mutantami są [S99G,V102N], [S99G,V102L], [S99G,V102I], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [V102I,S130G], [V102L,S130G], [V102N,R164Y], [V102N,N198G], [V102N,N 197T,N 198G], [V102N,N198G,Y203W], [V102N,Y203W], [V102N,L211E], [-1021,G116—,S 126—P 127M], [V102L,G116V,S126-,P127N], [G116-S126L,P127—,S128A,S160D], [G116V,S126-,P127N,S128V,A156E], [G116—,S126L,P127N,S128V,Y203W], [G116V,S126N,P127S,S128A], [G116—,S126—P127E,S128K,S160D], [G116—,S126—,P127N,S160D], [G116V,S126—,P127M,N198G], [G116—S126—,P127M,Y203W], [G116V,S126V,P127M,Y203G], [S126M,P127A,S128G,S160D], [P127-,-211-], [P127E,Y203W], [S126F,P127A], [S126F,P127D], [S126F,P127H], [S126F,P127N], [S126F,P127Q], [S126V,P127M], [S130G,Y203W], [S154G,S160G], [S154D,S160G], [S158E,I159L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [N198G,Y203W], [Y203T,S182N], [Y203V,V193A], [Y203L,— 193A], [L211G,N212D], [L211N,N212D], [L211V,N212D], [L211Y,N212S].

Pewne nowe zmutowane proteazy PB92 i Subtilisin 309 wykazują nieoczekiwaną aktywność wobec plam z kakao, której w żaden sposób nie można było przewidzieć z wcześniejszych prac. Takie zmutowane proteazy posiadająjedno lub więcej podstawień w pozycjach 102, 116, 117, 126, 127, 128, 133, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 197,198, 203, 211 i 216. Korzystnymi mutantami są te, które posiadają co najmniej dwie modyfikacje spośród tych zdefiniowanych pozycji. Modyfikacje te obejmująpozycje: 102 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycji wybranej z grupy obejmującej pozycje 164 lub 211; 127 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją wybraną z grupy obejmującej pozycje 203 lub 211; 154 i 160; 158 i 159. Ponadto, modyfikacje te obejm-uu^pozycje M216S i M216— łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycjach 102 i 211. Korzystnymi mutacjami są: [V102N,R164Y], [V102N,L211E], [V102N,N198G], [P127-,Y203W], [P127E,-211E], [S154G,S160G], [S154D,S160G], [S158-,I159-], [M216S,—102Q], [M216S,-211E], Ponadto, korzystnymi mutantami są mutanty M216S PB92 z dalszymi podstawieniami V102Q i L211E.

Pewne zmutowane proteazy PB92 i Subtilisin 309 wykazują ulepszoną zdolność usuwania plam w niskich temperaturach prania, np. w temperaturze 20°C. Mutanty te posiadająjedno lub więcej podstawień w pozycjach 99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 197, 198 i 203 enzymu PB92 lub Subtilisin 309. Korzystnymi mutantami są te, które posiadają co najmniej dwie modyfikacj e w tych zdefiniowanych pozycj ach. Modyfikacj e te obej muj ąpozycje: 99, łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycjach 102 lub 103, korzystnie z mutac^ąw pozycji 130; 102 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją wybraną z grupy obejmującej pozycje 197, 198 lub 203, korzystnie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycjach 99

178 045 lub 198, najkorzystniej z dodatkową mutacją w pozycjach 99 lub 198; 126 łącznie z co najmniej jedną dodatkową mutacją w pozycjach 116, 127,128 lub 160, korzystnie 126 łącznie z 127. Korzystnymi mutantami są [S99G,S130G], [S99—,V102N], [S99G,V102I], [V102N,N198G], [V102N,Y203W], [V102N,V197I,N198G], [S126—P127M], [S126F,P127N], [G116V,S 126V,P 127M,S 160D], [G116V,S 126L,P 127Q,S 128A,S 160D].

Użyteczne mutanty można także przygotować przez połączenie którejkolwiek z opisanych w tym opisie mutacji lub zespołów mutacji. Poza tym, możliwe jest łączenie ujawnionych tu użytecznych mutacji z mutacjami w innych miejscach, które mogą powodować lub nie powodować zasadniczych zmian właściwości enzymu.

Dla zilustrowania znaczenia podejścia zastosowanego w tym wynalazku dla otrzymywania nowych proteaz odpowiednich do stosowania w detergentach piorących, tj. przez wykorzystanie reprezentatywnego testowania stosowania w praniu jako głównego kryterium selekcyjnego, wyniki testów zdolności piorącej zmutowanych proteaz PB92 porównywano z parametrami biochemicznymi jakie zazwyczaj określa się w badaniach biochemicznych i enzymologicznych białek. Wyniki te pozwalają na wniosek, że brak jest jakiejkolwiek zależności pomiędzy parametrami określającymi powinowactwo wobec określonych substratów i kinetykę reakcji proteolitycznej a zdolnością piorącą.

Dlatego też, jest oczywiście również możliwe łączenie dwóch lub więcej mutantów o różnych właściwościach w jednym produkcie enzymatycznym lub w tym samym procesie prania. Taka kombinacja może mieć wpływ synergistyczny lub go nie mieć.

Możliwe jest także stosowanie jednego lub więcej zmutowanych enzymów proteolitycznych, takich jak zdefiniowano w tym opisie wcześniej, w kompozycji detergentu lub w procesie prania. Taka kompozycja detergentu może zawierać również jeden lub więcej innych enzymów, na przykład amylazę, celulazę lub lipazę, które powinny być kompatybilne z wybraną proteazą lub proteazami. Wybór najlepszej kombinacji enzymów zazwyczaj zależy od wymagań lub potrzeb klienta, ale na ogół nie wymaga kwalifikacji wynalazczych.

Ostatecznie, będzie oczywiste, że delecje lub insercje aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym proteazy, albo tworzone sztucznie przez mutagenezę, albo naturalnie występujące w pśoSeazach homologicznych do proteazy PB92 lub Subtilisin 309, mogązmienić numerację aminokwasów. Jednakże, należy rozumieć, że pozycje homologiczne do pozycji aminokwasowych proteazy PB92 lub Subsilisin 309 będą pozostawać w zakresie zastrzeżeń.

Zmutowane proteazy według wynalazku można przygotowywać zasadniczo w ten sam sposób, jak opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP-A-0328229. Również przygotowywanie genów kodujących pożądane zmutowane proteazy, klonowanie i ekspresja rzeczonych genów, wybór odpowiedniego gospodarza, warunki fermentacji, odzyskiwanie, oczyszczanie, przeszukiwanie i selekcja enzymów itp. są zasadniczo takie same jak opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP-A-0328229 i nie przekraczają kwalifikacji zwykłego pracownika.

Następujące przykłady przedstawiono w celu zilustrowania wynalazku, a niejego ograniczenia.

Materiały i Metody, które obejmują konstruowanie mutantów, wytwarzanie mutantów, oczyszczanie, wysokosprawną chromatografię cieczową (HPL—) z zastosowaniem żywicy kationowymiennej i kolumny do sączenia molekularnego, elektroforezę w żelu poliakścloamidowym, miareczkowanie miejsca aktywnego i określanie parametrów kinematycznych są podobne lub identyczne do tych opisanych w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP-A-0328229, z wyjątkami, gdzie stwierdzono inaczej. Mutanty oznaczone w przykładach +dt oczyszczano i przechowywano w obecności 2 mM disiotreisolu (DTT).

Przykład I.

Zdolność piorącą różnych mutantów proteazy PB92 określano w specjalnie opracowanym teście prania, który szczegółowo opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym numer EP-A-0328229. Poza zawierającym tripolifosforan sodowy (STPP) detergentem w postaci proszku, IE—-STPP, w przykładzie tym użyto również nie zawierającego fosforanów detergentu w postaci proszku (IE--zeoliSe). Typowe cechy obu układów testowych, które zastosowano do testowania zdolności piorącej nowych mutantów proteaz podsumowano poniżej:

178 045

Układ prania	IE--STPP	IE--zeolit
Dawka detergentu/wybielacza	4 g/l	7 g/l
objętość roztworu piorącego na naczynie (ml)	250	200
temperatura (°-)	40	30
czas (minuty)	30	30
detergent	IE--STPP	IE--zeolit
dawka detergentu (g/l)	3,68	5,6
czterowodny nadboran sodu (g/l)	0,32	1,4
TAED (mg/l)	60	210
EMPA 116/117 (5x5 cm)	2/2	2/2
-FT AS-3 zaplamione kakao (5x5 cm)	0	2
czyste pasmo EMPA 221 (10x10 cm)	0	2
kulki ze stali nierdzewnej (0 6 mm)	0	15
[-a²⁺] (mM)	2	2
[Mg²⁺] (mM)	0,7	0,7
[Na-O3] (mM)	2,5	0

Detergent w postaci proszku IE--STPP (IE- Test Detergent Type I, formuła z maj a 1967) i detergent w postaci proszku IE--zeolit (formuła z kwietnia 1988) zakupiono w WFK-Testgewebe GmbH, AdlerstraBe 44, D-4150, Krefeld, Niemcy. Zdolność piorąca w stosunku do kakao mierzono na pasmach -FT AS-3 (zakupionych w FT, -enter For Test Materials, PO Box 120, —laardingen, Holandia). Dwa mutanty, E87S i E87Q, testowano w układzie IE--STPP przy 10 g/litr proszku zawierającego STPP/wybielacz, jak wskazano w tabeli 2. Ponadto dokonano pomiarów zdolności piorącej przy 4 g/litr w układzie IE--STPP, który nieznacznie zmodyfikowano (wskazany w tabelach jako ADE+: zamiast temperatury 40°-, 30 minut i 2 mM -a²+ testy zdolności piorącej przeprowadzono w temperaturze 30°O podczas 20 minut w obecności 5 mM -a²⁺. Ponadto włączono 2 pasma EMPA 221 i 15 kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 6 mm.

Wyniki podsumowano w załączonych tabelach 1, 2 i 3.

Przykład II.

W celu określenia zdolności piorącej niektórych z nowych mutantów proteazy PB92 w warunkach niskiego stężenia detergentu dla naśladowania typowych warunków stosowanych w Stanach Zjednoczonych Ameryki, określono zdolność piorącą w teście prania podobnym do testu opisanego w przykładzie II, ale z pewnymi modyfikacjami. Główne parametry testu podsumowano poniżej:

Objętość roztworu piorącego na naczynie (ml)	200
-zas (minuty)	20
Dawka detergentu A (g/l)	1,3
EMPA 116/117(5x5 cm)	2/2
-FT AS-3 zaplamione kakao (5x5 cm)	2
-zyste pasmo EMPA 221 (10x10 cm)	2
Kulki ze stali nierdzewnej (0 6 mm)	15
[-a²⁺] (mM)	2
[Mg²⁺] (mM)	0,7

178 045

Tabela 1

Odporne na utlenianie mutanty proteazy PB92 M216 - zdolność piorąca >100% Dotyczą pozycji: 60, 99, 102, 116, 126, 127, 128, 197, 198, 203, 211

Mutant proteazy	STPP 4 g/l %	Zeolit 7 g/l %	Kka l/s	Km mM
Proteaza PB92 (niezmodyfikowana)	100	100	105	1,0
Mutant PB92 z M216S i: N60E	120	76¹¹⁷	7	2,3
S99G		119	6	1,3
V102A		113	n.o.	n.o.
— 102L		125	20	2,1
V102N		113	26	4,3
V102P		135	n.o.	n.o.
V102S		106	n.o.	n.o.
G116V,S126L,P127Q,S128A	100		23	8,7
G116V,S126N,P127S,S128A	110		7	4,4
G116V,S126R,P127Q,S128-	120		7	1,3
P127E,S128T	160	45	5	1,0
Y197T		129	9	1,7
N198G		133	6	1,2
Y203W		132	13	1,8
Mutant PB92 z M216Q i: G116V,S126N,P127S,S128A	130	70	3	4,5
S126M,P127A,S128G	100		36	5,1
Mutant PB92 z M216F i: Y102L		135	9	1,3

i 1 : Zdolność piorąca mierzona na EMPA 117 n.o.: nie określano

Tabela 2

Nieodporne na utlenianie mutanty proteazy PB 92 (zdolność piorąca > 100%)

Dotyczy pozyzcji: 87, 97, 99,102,116, 117,126, 127,128,130,133,134, 154, 156,158,

160, 164, 166, 169, 175, 180, 182, 193, 197, 198, 203, 211 i 212

Mutant proteazy	STPP 4 g/l %	Zeolit 7 g/l %	K_ka l/s	Km mM
1	2	3	4	5
Proteaza PB92 (niezmodyfikowana)	100	100	105	1,0
E87S	1400-.	126	134	1,7
E87Q	145^11GL	115¹¹⁷	100	1,3
S97D	160		35	0,4
S99G		170	63	0,5
S99G,V102I		226	202	1,2
S99G,V102L		209	166	1,0
S99G,V102N		213	206	2,4
S99G,S130G		190	64	1,2
S99G,Y203W		148	77	0,6
S99T		137	81	1,0
VI02A		110'*7	23	0,3
V102G		111	217	0,5
V102H		106	78	0,6

178 045

Tabela 2 (ciąg dalszy)

1	2	3	4	5
V102I		180	252	1,3
V102I,G116V,S126V,P127M		182	206	2,5
V102I,S130G		180	141	2,0
V102L		180	194	0,8
V102L,G116V,S126V,P127M		147	160	2,3
V102L,S130G		154	159	1,7
S126V,P127M		200	191	1,7
P127E	200	140	137	1,6
S130G		170	85	1,5
S130G,Y203W		142	65	1,2
L133W		125	274	1,5
L133Y		125	n.o.	5,9
L134-+-^rr	200—⁺	170	n.o.	n.o.
S154E		36	1,0
S154G		110	70	0,9
S154N		133	79	1,1
A156-	19₅ai>e+	120	77	0,9
A156G		104	61	0,5
S158G		105	82	0,9
S158N		138	71	0,6
S160—,A 166—,M169I	200	120	13	1,2
S160-,N212-	120	115¹¹⁷	12	1,5
S160G	100	29	1,7
R164M		110	99	1,0
R164V		131	121	1,2
R164Y		135	115	0,8
D175E		113	99	0,9
-180-		120	106	0,9
S182N,Y203T		125	94	0,7
V193A,Y203L		132	85	0,6
V193A,Y203V		132	86	0,6
V197N		113	99	1,0
V102M		136	253	1,3
V102N		170	199	2,3
V102N,N198G		253	223	3,0
V102N,N 197T,N 198G		227	247	3,1
V102N,N 198G,Y203W		162	210	2,3
V102N,Y203W		178	252	1,9
V102P		145	13	0,4
V102Q		150	87	1,0
V102S		136	47	0,4
V102T		165	109	0,9
V102Y		124	275	0,3
G116V,S126L,P127—,S128A,S160—	200		65	9,1
G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W		138	253	3,6
G116V,S126N,P127S,S128A	130		64	2,4
G116V,S126V,P127E,S128K,S160—	175		30	4,4
G116V,S126V,P127M,S160—	235		28	3,4
G116V,S 126V,P 127M,N 198G		159	162	1,9
G116V,S126V,P127M,Y203W		132	186	1,4
G116V,S126V,P127M,Y203G		108	154	1,8
S126F,P127A	130		223	10,0
S126F,P127D	120		112 ,	8,2
S126F,P127H	150		197	7,8
S126F,P127N	200		80	3,3
S126F,P127Q	150		104	5,0
S126M,P127A,S128G,S160-	300		200	1,9
V197T		120	146	1,1
V-97W		115	62	0,9
N198-		124	n.o.	n.o.

178 045

Tabela 2 (ciąg dalszy)

1	2	3	4	5
N198G		152	92	1,1
N198-,Y203W		132¹'⁷	82	0,7
N198S		125	84	0,7
N198—		121	104	0,8
Y203E		130	111	0,6
Y203G		135	91	1,1
Y203K		108	103	0,6
Y203L		10617	132	0,6
Y203T		135	92	0,6
Y203—		135	90	0,6
Y203W		165	144	1,0
L211E		164	9	0,9
L211G,N212D		105	39	1,2
L211N,N212D		132	16	0,7
L211V,N212D		106	26	1,4
L211Y,N212S	123		81	0,5
N212E	140		94	1,2

¹¹⁷ Zdolność piorąca mierzona na EMPA 117 n o nie określano

Tabela 3

Mutanty proteazy PB92 i ich zdolność piorąca wobec kakao Dotyczy pozycji: 102, 116, 117, 126, 127, 128, 133, 154, 156, 158, 159, 160, 164, 197, 198, 203,211 i 216

Mutant proteazy PB92	Zdolność piorąca zeolit przy 7 g/l (%)	Parametry kinetyczne
1)6	117	choc	Kka, 1/s	Km mM
1	2	3	4	5	6
— 102E	87		133	55	2,2
V102N,R164Y	108	87	124	247	2,8
V102N,L211E	101	80	142	48	2,8
G 116V,S 126L,P127N,S 128 V,A 156E	108	73	118	170	2,5
M117L	126	120	147	64	0,7
P127E,Y203W	105	103	134	135	1,0
P127E,l211e	63	47	119	9	1,1
L133I	126		135	43	0,7
L133M	113		126	108	0,6
S154D,S160—	109		116	32	1,7
S154G,S160-	124		132	34	2,2
A156E	140	137	173	105	1,3
S158D	139	126	190	91	1.1
S158E	123	121	176	101	1,1
S158E,I159L	118	132	132	90	1,0
S160E	104	110	145	17	0,5
R164I	119	117	126	127	1,1
—197L	79	106	119	60	0,8
N198D	110	110	153	92	0,8
N198E	102	123	159	87	0,7
N198Q_+Dtt Y203Q	100	111	110	64	0,7
95	107	129	n.o.	n.o.
Mutant PB92 z M216S i: — 102Q	96	87	106	n.o.	n.o.
L211E	100		127	2	1,1

¹16 Zdolność piorąca mierzona na EMPA 116 ^ll7. Zdolność piorąca mierzona na EMPA 117 ^choc Zdolność piorąca mierzona na CFT AS-3 n o nie określano

178 045

Skład detergentu A był następujący:

Składniki	% wagowy
Etoksylan alkoholu	13%
LAS-90	7%
Poliakrylan	1%
Zeolit	35%
Krzemian sodowy	3%
Na₂CO₃	20%
Cytrynian trisodowy · 2H₂O	4%
Na₂SO₄	8%
Woda	do 100%

Przed dodaniem proteazy PB92 lub jej mutantów; pH płynu piorącego doprowadzano do 10,2. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

Ponadto określono zdolność piorącą niektórych mutantów w niższej temperaturze. Wyniki uzyskane w temperaturze 20°C przedstawiono w tabeli 4. Wszystkie mutanty, które przedstawiono wykazywały znacząco lepszą zdolność piorącą w temperaturze 20°C w tych warunkach niż typ dziki. Bardzo niespodziewanie, niektóre z mutantów, takie jak [V102N,S99G], [Y102N], [G116V,S126V,P127M,S160D], wykazują lepszą zdolność piorącą w temperaturze 20°C niż w temperaturze 30°C. Jest to sprzeczne z tym, czego oczekiwano na podstawie zachowania PB92 typu dzikiego: zdolność piorąca PB92 spada po obniżeniu temperatury prania. Wydaje się zatem, że nasze podejście do ulepszania zdolności piorącej proteazy zasadowej przez ukierunkowaną inżynierię może także przesunąć temperaturę, przy której te proteazy wykazują optymalną zdolność piorącą

Tabela 4

Zdolność piorąca nowych mutantów PB92 w różnych temperaturach

Zdolność piorąca (%)
Mutanty proteazy PB92	temperatura
30°C	20°C
1	2	3
S99G	123	n.o.
S99G,S“30G	188	17311
—102I,S99G	117““	n.o.
V“02N, S99G	163	181
— 102N,N198G	168	“69““ “55^hoc
— 102N,Y203W	165	“3“
V“02N,V“971,N198N	“39““	n.o.
— 102N	146	1^5^*17
V102I	“21 ‘1	n.o.
— 102L	124“ “	n.o.
S126—,P127M	“79““	n.o.

178 045

Tabela 4 (ciąg dalszy)

1	2	3
S126F,P127N	M7¹¹⁷	n.o.
S126V,P127M,— 116V,S160D	156	185
S126L,P127Q,S128,G116V,S160D	212	187
S 126M,P 127,S 128—,S 160D	158	14317
P127E	103, 130^ch°c	n.o.
S130G	132	n.o.

: Zdolność piorąca mierzona na EMP_ 117 ^c: Zdolność piorąca mierzona na CFT _S-3

n.o.: nie określano

We wszystkich doświadczeniach zdolność piorącąokreślano w stosunku do proteazy PB92 typu dzikiego. Poza wspomnianym powyżej detergentem _, określono również zdolność piorącą w porównaniu z innymi dostępnymi amerykańskimi detergentami.

Claims

1. Mutant proteazy do stosowania w detergentach, posiadający ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309, znamienny tym, że posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

h₂n_a_q_s_v_p_w_g_i_s_r_v_q_a_p_a_a_h_n_r_g_l_t_g_s_g_v_ _K_V__A__V_L_D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-e-v-p-g-e-p-s-tQ-D-G-N-G-H-G-TtH-V-D-D-Tt_-A-A-L-N-N-S-I-G-V_L-G_V_A_P-N-A_

-_L_Y_A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S_S-_-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-GM_H_V_A_N_L_S_L_G_S_p_S_p_S_A_T_L_E_Q_A_V_N_S_A_T_S_R_G_V_L_

V-v-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-QN-n-N-R-A-S-F-SiQiY-G-A-G-L-D-IiV-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-Si

T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-SN-V-Q-I-R-N-H-L_K-N-T-A-T-S_L-G_S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A_—-A_

A-T-R-COOH albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H₂N-A-Q-S-V-P-W-G-IdS-R-V_Q-A-P_A_A-H-N-R-G-L-T-G-S_G_

A_-K-_-V-_I^_-V-_G-DDTTG-liS-:^-i^-;^-_:y-I^--N:-R-G-G-_C^-^-_F^_V-_?^_G^_E__p,_Sl

T-Q-D-G-N-G-H-G-TtH-V-Aa_G-_TtI-A-A-L-N-N-S-I_G-V-L-G-V-A-P-S_

A--_L_-_A-V-K-V-L-G-A-S-G-S---S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A---N_N_

G_M_H_V_A_N_L_S_L_G_S_P_S_-_S_A_T_L_-_Q_A_V_N_S_A_T_S_R_G_V_

L-V-V-A-A-S-G-N-Sd--A-G--S-ι - S-Y-PaA-R-Y-A-N-A-M-A-V_G_A_T_D_ q_N-n-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-PdGsdT-YdAds-L^N^G-T^S-^M-AdT-?-^H^Vc^a-g-AdAdAd_L-v-k-q-k-N-Pd5^WS_n-v-q-i_r-n-h-L-K-N-T-A-T-S-L-G_S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N_A_-AdA-T-R-C(OH

178 045 i różni się co najmniej jedną resztąaminokwasnwąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160, 164,169,175,180, 11^^, 193,197,198,203,211 i 216 w rzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309.

2. Mutant proteazy według zastrz. 1, znamienny tym, że różni się od proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [V102A], [V102A,M216S], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I,G116Y,S126V,P127M], [V102I,G116V,S 126V,P 127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164Y], [V102N,N198G], [V102N,N 197T,N 198G], [V102N,N198G,Y203W], [V102N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [Y102N,M216S], [V102P], [V102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V1G2T], [V102Y], [G116VS126LP127NjS128V,A156E], [G116YS126-P127N1S128VY203W], [G116VS126ŁiP1^-JS1^-S160D], [G116VS 12(6—127—13128—3M216S], [G116V,S126N,P127S,S128A], [G116V3126N-127S,S128-MI216-]1 [G116V,S126N,P127S,S128—,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S 126R,P 127Q,S 128D,M216S], [G116V,S126V,P127E,S128K,S160D], [G116Y,S126V,P127M,S160D], [G116V,S126V—127M,N198G]i [G116V,S126V,P127M,Y203W], [G116V,S 126V,P 127M,Y203G], [M117L], [S126F,P 127X, gdzie X j est jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P127A,S128G,S160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,1158L], [S160DiA166DiM169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198C], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203C], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E].

3. Mutant proteazy PB92 według zasrrz. 1. znamienny tym , że posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu.

4. Mutnnt proeezzy PB22 wedhig aashz. 3 , znamienyy tym , ee wbbaano oo z grapy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198G].

5. Sekwencja DNA kodjjąca n^uU^nte ρη^ρ,. posaadającego ulepszona zdolność piorąeą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do prnteazp serowej PB92 lub ppoteezp serpnowej Subtilisin 309, znamienna tym, że kodowany przez niąmutant proteezp posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwaso-wej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminnkwesowej:

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-VK-v-A-V-L-D-TtG-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-TE---YiA-V-K-V-L-G-A-S-G--S-G--S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-GM-h-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-SiA-T-S-R-G-V-L4 178 045

V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Qn-n-n-r-a-s-f-s-q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-g-v-n-v-q-s-t-y-p-g-sT-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-GiA-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-—-SN-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-AA-T-R-COOH albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej :

H2N-A-Q-S-V-P---G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-GV-K-V-A-V-L-D-TtG-G-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-ST-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-TtI-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-SA-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-G-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-NG-M-H-V-A-N_L-SsL-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-VL-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-IsSyY-G-A-RyY-A_N-A-M-A-V-G-AiT-DQ-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-PiG-V-N-V-Q-S-TiY-P-GS-TiYiA-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-NiP-S--S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-GgS-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-Ei

A-A-T-R-COOH i różni się co najmniej jednąresztąaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160,

6. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że kodowany przez niąmutant proteazy różni się od proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [V102A], [V102A,M216S], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,G116V,S 126V,P 127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,—164y], [V102N,N198G], [V102N,N 197T,N 198G], [V102N,N198G,Y203W], [V102N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem m], [V102N,M216S], [V102P], [Y102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [G116V,S 126L,P 127N,S 128V,A156E], [G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W], [G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D], [G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S], [G116V,S126N,P127S,S128A], [G116V,S126N,P127S,S128AM216Q], [G116V,S126N,P127S,S128AM216S], [G116V,S 126R,P 127Q,S 128D,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S 126V,P127E,S 128K,S 160D], [G116V,S 126V,P127M,S 160D], [GH6V,S126V,P127M,N198G], [G116V,S126V,P127M,Y203W], [G116V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [SF26M,P127—,S128G,S160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S],

178 045 [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [S156G], [S158D], [S158E], [S158E,1159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198C], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203C], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyj ątkiem L, a Zj estj akimkolwiek aminokwasem z wyj ątkiem N], [L211 E,M216S] i [N212E].

7. Sekwencja DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że kodowany przez nią mutant proteazy PB92 posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu.

8. Sekwencja DNA według zastrz. 7, znamienna tym, że kodowany przez nią mutant został wybrany z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198G].

9. Sposób otrzymywania mutanta proteazy, posiadającego ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy serynowej Subtilisin 309, znamienny tym, że hoduje się szczepy mikroorganizmu gospodarza stransformowanego wektorem ekspresyjnym, zawierającym sekwencję DNA kodującą mutanta proteazy i odzyskuje się mutanta proteazy, przy czym sekwencja DNA kodująca mutanta proteazy, charakteryzuje się tym, że posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-^P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-VD-G-^ł^G^-HHGGTTHH-V-A3-I’-];-7^--^-LL-^-l-^-S-]:-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-LY-A-^'V^K-^_I^L-^_-^_c^_^(^__i^__G_S-V-S-S-IA-Q2-GLLEEWę-^7^-^G-^N-^N-^G^-^M-H-VA-N-LS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-O-A-Y-N-S-A-T-S-R-G-Y-L-Y-Y-A-AS-G-NS---A-G-S-I-S-YpP_A-R-Y-A-N-A-M-A-V--LALT-D-Q-N-N-NLRLAS-F-SQ-Y-G-A-G-L-D-I-V-_-PLG-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-_-SLL-NL

--T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-KκN-P-S-W-S-N-V-Q-ILRLN-HL

L-K-NT-A-T-S-LL--S-T-N-I_J-Y-G-S-G-L-V-N-AEL-A-AτT-RcCOOH albo do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-]:-S-R-VLQ-_-PLA-_-H-N-R-G-L-TL--S--L

V-κ-V-A-V-L-L-Ί^,τL---S-T-H-P-D-L-N-I-R-----A-S-F-V-P---E-P-SL

T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V~A-G-T-I-A-A-LLN----sI---V-L---V-A-P-S_-E-L-Y-A-y-K-V-L---A-S---S---S-V-SLS---A-Q-G-LEE-W-A---N-NL

--M-H-V-A-L-L-SsLLG-S-P-S-P-SLA-TLLLE-Q-A-V-N-SL_-TLS-R-GLV_LL_V-_VL_L_-SL--NLS---_--LSLILSLγLpL_-R-Y-_-N-_-M-ALV--L_-T-DL

Q-N-^J-^J-R-A-S-F-S-Q-Y-—-A-G-L-D-I-V-A-PLG-V-N--V-Q-S-T-Y-P-—6

178 045

S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-WS-N-V-Q-I-^R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-^G-^L-^V-^N-A-EA-A-T-R-COOH i różni się co najmniej jednąresztąaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99,102,116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158,159,160,

164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 wrzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309.

10. według zasrrz. 9 , tym , iz kodowany sekwencję DNA mutant proteazy różni się od proteazy serynowej PB92 lub rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T], [V102A], [V102A,M216S], [V102E], [V102G], [V102H], [V102I], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102I,G116Y,S 126V,P 127M], [V102I,S130G], [V102L], [V102L,G116V,S126V,P127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [V102N,XYZ, gdzie XYZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R16,Y], [V102N,N 198G], [V102N,N 197T,N 198G], [V102N,N198G,Y203W], [Y102N,Y203W], [V102N,L211E], [V102N,M216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [V102P], [V102P,M216S], [V102Q], [V102Q,M216S], [V102S], [V102S,M216S], [V102T], [V102Y], [G116V,S126L,P127N,S128V,A156E], [G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W], [G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D], [G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S], [G116V,S126N,P127S,S128A], [G11 6V,S 126N,P 127S,S 128A,M2 16Q], [G116V,S126N,P127S,S128A,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S], [G116V,S126V,P127E,S128K,S160D], [G116V,S126V,P127M,S160D], [G116V,S126V,P127M,N198G], [G116V,S126V,P127M,Y203W], [G116V,S126V,P127M,Y203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P127A,S128G,S160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [S126V,P127M], [P127E], [P127E,S128T,M216S], [P127E,Y203W], [P127E,L211E], [S130G], [S130G,Y203W], [L133I], [L133M], [L133W], [L133Y], [E134-], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154E], [S154G], [S154N], [A156D], [A156E], [A156G], [S158D], [S158E], [S158E,I159L], [S158N], [S159E,I158L], [S160D,A166D,M169I], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160E], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175E], [R180I], [V197L], [V197N], [V197T], [V197T,M216S], [V197W], [M198-], [N198D], [N198E], [N198G], [N198G,Y203W], [N198G,M216S], [N198Q], [N198S], [N198V], [Y203-], [Y203E], [Y203G], [Y203K], [Y203L], [Y203L,V193A], [Y203T], [Y203T,S182N], [Y203V], [Y203V,V193A], [Y203W], [Y203W,M216S], [L211E], [L211X,N212Z, gdzie X jestjakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212E].

11. Sposób wedkig zastrz. 9 , znannenny tym , że kodowany prxez sekweneję DNA nudam proteazy posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu.

12. Sposób według zastez . 11 , znamienny tym, że kodowany precz se^en^ę DNA mutant proteazy został wybrany z grupy, składającej się z [S99G,V102N] i [V102N,N198G].

13. Kompo/Arnaa deeergentowa, zawieaąjąca stosowinee do produkeii środków piorących detergenty, wypełniacze i enzymatyczny dodatek do detergentów, który posiada ulepszoną zdolność piorącą i/lub ulepszoną stabilność w stosunku do proteazy serynowej PB92 lub proteazy sercnowej Subtilisin 309, znamienna tym, że jako enzymatyczny dodatek do detergentów zawiera jednego lub więcej mutanta proteazy, który posiada co najmniej 70% homologii do sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej PB92, o sekwencji aminokwasowej:

178 045

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-VK-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-TQ-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-GgTtI-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-AE-L-Y-A-V-K-V-L-—-A-S-—-S-G-S-VM-H-V-A-N-TL--L-G-S-P-S-PIS-AITILIE-Q-A-VIN-S-A-T-SIRIGτV-LV_V-_A-_A-_S_G__N__S---_A_-_S-]>s-γ-p__A-R-γ__A__N-A-M-A-V--IA-T-DIQN-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-—-V-N-V-Q-S-T-Y-P-—--ST-Y-A-S-LτN--τT-S-M-A-T-P-H-VIA-G-A-A-A-LτV-K-Q-K-N-Ρ-S-W-SN-V-Q-IIRIN-H-LIK-N-T-A-T-SILIG-SIT-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-EIAA-T-R-COOH albo sekwencji aminokwasowej proteazy serynowej Subtilisin 309, o sekwencji aminokwasowej:

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-GV-K-V-Ά-V-T-DDTτT-I-_S-T-H-P-D-L-N-I-R---G-A-S-F-V-P---E-Ρ-sT-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-AAG-TτI-A-A-L-N-N-S-IτG-V-L-—-V-A-P-SA-E-LIY-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S---S-V-S-S-IAA-Q-G-LEE-W-A-GτN-Nτ

G-M-H-V-AAN-L-SsL-G-S-P-S-Ρ-SIA-TILτE-QτA-V-N-S-A-T-S-R--τVL-v-v_a-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-PaA-RyY~A-N-A-M-A-V-G-A-T-DQ-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y---A-G-LID-I-V-A-Ρ---V-N-V-Q-S-T-Y-Ρ-GSIT-YIA-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-AIL-V-K-QIK-N-Ρ-S-WS-N-V-Q-I-R-N-H-L-KτN-T-A-T-S-L-GτS-T-N-LτY---S-GτL-V-N-AτEA-A-T-RI-OOH i różni się co najmniej jednąresztąaminokwasowąw wybranym miejscu, odpowiadającym pozycjom 60, 87, 97, 99, 102, 116, 117, 126, 127, 128, 130, 133, 134, 154, 156, 158, 159, 160,

164,169,175,180,182,193,197,198,203,211 i 216 w rzeczonej proteazie serynowej PB92 lub rzeczonej proteazie serynowej Subtilisin 309, i zawiera, jeśli jest to pożądane, jeden lub więcej enzymów wybranych z grupy, składającej się z amylaz, celulaz i lipaz.

14. kompozycja detergentowa według zastrz. 13, znamienna tym, że mutant proteazy różni się od rzeczonej proteazy serynowej PB92 lub rzeczonej proteazy serynowej Subtilisin 309 co najmniej jedną z następujących mutacji:

[N60E], [N60E,M216S], [E87Q], [E87S], [S97D], [S99G], [S99G,V102I], [S99G,V102L], [S99G,V102N], [S99G,S130G], [S99G,Y203W], [S99G,M216S], [S99T],

178 045 [V102A], [V102A,M216S], [-102-], [V102G], [-102H], [V102I], [V102I,G116V,S126V,P127M], [V102L], [V102L,G116V,S126V,:-127M], [V102L,S130G], [V102L,M216F], [V102L,M216S], [V102M], [V102N], [—'102N,XYZ, gdzie XVZ jest jakimkolwiek zmodyfikowanym aminokwasem], [V102N,R164V], [V102-,-198G], [V102N,N197T,N198G], [V102N,N198G,V203W], [V102N,V203W], [-102-,1.211—], [V102N.M1216X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem M], [V102N,M216S], [V102P], [-K^P^ĆS], [V102Q], [-102Q,M216S], [V102S], [-102SM216S] [-10211, [V1Q2Y], [G116-S126L,P127N,S1^A156-1, [G116-S176L.-127N,S128V^W1, [G11^^S1^JE^127(QS128^AS160D], [G116V,S126L,-127Q,S128AM216S]|, [G116-JS1^,-127S,S128A], [G116V,S1261-,P127S.S128Α,M716Q]. [G116V,S126N,P127S,S128A,M216S], [G116V,S126R,P127Q,S178D.M716S]. [G116V,S 126R,P 127Q,S 128D,M216S], [G116V,S126V,P 127E,S 128K,S 160D], [G11 6 V,S 126V,P n7M,S 160D], [G116V,S 126V,P 127M,N 198G], [-116ν,8126ν,Ρ12'7ΜΥ203^ [G116V,S126V,P127M,V203G], [M117L], [S126F,P127X, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem P], [S126M,P mA^^G^ 160D], [S126M,P127A,S128G,M216Q], [SnóYP^M], [P127-], [P127—.S128T.M716S]. [P127—,V203W1. [P127—,L211—], [S130G], [S130G,V203W], [L133I], [L133M],-[L133W], [L133V], [E134C], [S154D,S160G], [S154G,S160G], [S154-], [S154G], [S154N], [A156D], [A156-], [A156G], [S158D], [S158-], [S158-,I159L], [S158N], [S159-,I158L], [S160DA166D,M1691], [S160D,N212D], [S160D,M216Q], [S160-], [S160G], [R164I], [R164M], [R164V], [R164Y], [D175-], [R180I], [V197L], [-197N], [V197T], [-1971^2161], [V197W], [M198C], CN198D], [N198-], [N198G], [N198G,V203W], [N198G.M716S]. [N198Q], [N198S], [N198V], [V203C], [V203—], [V203G], [V203K], [V203L], [V203L,V193A], [V203T], [Y203T,S182N], [V203V], [V203V,V193A], [Y203W], [V203W,M216S], [L211-], [L211X,N212Z, gdzie X jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem L, a Z jest jakimkolwiek aminokwasem z wyjątkiem N], [L211E,M216S] i [N212-].

15. Kompozycja detergentowa według zastrz. 13, znamienna tym, że mutant proteazy posiada mutację aminokwasu 102 i co najmniej jednego innego aminokwasu.

16. Kompozycja detergentowa według zastrz. 15, znamienna tym, że mutanta proteazy wybrano z grupy, składającej się z [199-,-102-] i [-102-,-198-].

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych mutantów mocno zasadowej proteazy serynowej o ulepszonych właściwościach do stosowania w detergentach. Właściwości te obejmująulepszoną zdolność usuwania plam kompozycji detergentów piorących, ulepszoną zdolność usuwania plam w niskiej temperaturze prania, ulepszoną stabilność w detergentach piorących w czasie przechowywania oraz ulepszoną stabilność w roztworach piorących przygotowanych z detergentów.