JP4028592B2 - 高アルカリ性セリンプロテアーゼ - Google Patents
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Description
序文
技術分野
本発明は、洗剤で使用する、改善された特性を有する、新規の高アルカリ性セリンプロテアーゼ変性体に関する。これらの特性に含まれるものには、洗濯用洗剤洗浄組成物における改善された汚れ除去能力、低い洗濯温度における改善された汚れ除去能力、貯蔵時の洗濯用洗剤中での安定性の向上、及び該洗剤から調製されたセッケン水中での安定性の向上がある。
発明の背景
汚れの基となるタンパク質の除去を可能にする洗剤組成物中の酵素添加物、特にタンパク質分解酵素の使用が、数多く報告されている。例えば公開された欧州特許出願第EP-A-0220921号及び欧州特許出願第EP-A-0232269号、米国特許第4,480,037号及びRe第30,602号、並びに論文“微生物酵素の産生”（Microbial Technology、Vol.1:281-311（1979）（アカデミック出版））を参照。
硬質表面（hard surface）の清掃、トイレ清掃、皿洗い及び洗濯に使用される洗剤組成物は、粉末、液状又はペースト状であることができる。洗濯用洗剤は、一般に、液状及び粉末の主な２種類に分類される。
タンパク質分解酵素は一般に、洗剤組成物と組み合わせることは困難である。これらは使用時に、例えば温度が約10℃から60℃以上の範囲で洗濯中に、布からタンパク質性の汚れを除去する際に、安定でありかつ活性を有さなければならない。さらにこれらは、洗剤製品での貯蔵期間に長期に渡って安定でなければならない。従って、酵素類は、金属イオン封鎖剤、界面活性剤、高アルカリ、時には漂白剤の存在下、並びに上昇した温度において、安定でありかつ機能を果たさなければならない。
世界中で使用されている万能洗濯用洗剤も、万能の洗浄条件（pH、温度、セッケン水の濃度、水の硬度）も存在しないので、酵素類の必要性は、それが使用された洗剤の種類、及び洗浄条件によって変ってくる。
プロテアーゼの商品として重要なものは、好アルカリ性バチルス由来の、いわゆる高アルカリ性プロテアーゼである。市販の高アルカリ性プロテアーゼ製品であるマクサカル（MAXACAL）（登録商標）（ギスト-ブロケード（Gist-brocades）/IBIS）は、バチルスnovo種PB92由来のセリンプロテアーゼ“PB92”を含んでいる（米国特許Re第30,602号参照）。そのアミノ酸配列は、欧州特許出願第EP-A-0283075号及び欧州特許出願第EP-A-0284126号に記載されている。同じくサビナーゼ（SAVINASE）（登録商標）（ノボ-ノルディスク（Novo-Nordisk））も、この群の一種である。サビナーゼは、“ズブチリシン309”酵素を含み、これはバチルス株NCIB 10147由来である（米国特許第3,723,750号）。そのアミノ酸配列は、国際特許出願第WO 89/06279号に開示されていて、この中で前記株は、バチルスレンタス（Bacillus lentus）と呼ばれている。これら２種類のプロテアーゼのアミノ酸配列は、85番目のみ異なっていることが明らかであり（PB92プロテアーゼ残基の一次構造決定を行い、これはBNP'一次構造における87番目に相当する。）、PB92は85番目に、アスパラギン酸（アミノ酸１文字表記では“N”）を、並びに“ズブチリシン309”は、セリン（“S”）を有す。
PB92プロテアーゼは、pH値がアルカリ性で、汚れ除去の活性を示すので、これは通常、界面活性剤、ビルダー及び酸化剤のような洗剤成分とともに、洗剤添加物として使用される。酸化剤は主として粉末の形状で使用される。前述の洗剤添加物は、該プロテアーゼと適合性があるかぎりは、同様に他の酵素類、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及び／又はリパーゼを含むこともできる。PB92プロテアーゼは、例えば当該技術分野で周知である“古典的”スブチリシン類のような他のプロテアーゼ類と比べて、優れた汚れ除去力を持つ。このことは、同じ洗浄効果を得るために必要なPB92プロテアーゼが少ないことを意味する。酸化に対する敏感さは、PB92プロテアーゼ及び洗剤中で使用される他の全ての公知のセリンプロテアーゼ類の重大な欠点である。
元来、マクサカル（登録商標）のような、市販のアルカリ性プロテアーゼ類は、40〜60℃の範囲の温められた温度で、洗剤中で使用するために開発された。しかし現在では、経済性を重視するため、低温へと変わりつつある。その結果、低い温度、例えば15〜25℃で、洗浄効果が劣ることは、市販のアルカリ性プロテアーゼの大きな欠点である。
意企する用途のために新規な酵素を得る方法がいくつかあり、これらはすべて当業者にとって公知である。タンパク質工学による現存する酵素類の修飾は、現在最も盛んで効果的な方法であるように思われる。
修飾された酵素を得る最も特異的な方法は、別の所望のアミノ酸を用いて、１個以上のアミノ酸を特定して置換することができる、部位特異的突然変異誘発によるものである。欧州特許出願第EP-A-0130756号は、修飾されたタンパク質分解酵素を産生するように発現することができる変異体プロテアーゼ遺伝子をもたらすために、この技術を使用することを例証している。非常に効果的な方法は、オリゴヌクレオチドに媒介された部位特異的突然変異誘発であり、これは、１本鎖合成オリゴヌクレオチドの調製物を使用することによって、多くの異なる突然変異をDNA塩基配列の特定の部分に引き起こすことができるようにする。
各種の洗剤組成物及び酵素、それらの物理的形態、前記酵素が最大の機能を発揮する条件、現在使用できる酵素の酵素洗剤組成物中での使用に際しての問題点及び限界、変性体プロテアーゼの調製及びスクリーニングなどの包括的要約のために、本願明細書中に参照として組み込まれた欧州特許出願第EP-A-0328229号に言及することができる。
国際特許出願第W0 89/06279号は、特に、“ズブチリシン309”プロテアーゼの変性体をクレームしていて、これは下記の位置で１個以上の残基が置換されている（原型のBPN'残基の一次構造を採用）：6,9,11-12,19,25,36-38,53-59,67,71,89,104,111,115,120,121-122,124,128,131,140,153-166,168,169-170,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,218,219,222,226,234-238,241,260-262,265,268又は275。実際に産生されかつ試験された変性体を記載しているこの参考文献における変性体の数は、わずか８個に限られていて、４種類の位置のみが関連している。これらの変性体は、S153A,G195D,G195E,N218S,［G195E,M222A］,［G195E,M222C］,M222A,及びM222Cである。
欧州特許出願第EPA-A-0328229号は、PB92セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性を有し、かつ該PB92セリンプロテアーゼの32,33,48-54,58-62,94-107,116-118,123-134,150,152-156,158-161,164,166,169,175-186,197,198及び203-216,235,243及び259に対応する選択されたサイトで少なくとも１個のアミノ酸残基が異なり、かつ該PB92セリンプロテアーゼと比べて改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する、変性体プロテアーゼを特に、開示しクレームしている。この参考文献は、17種類の位置が関連している、69個の変性体に限定されている。
過去数年間に達成されたように思われる進歩にもかかわらず、洗剤で使用することをさらに興味深いものとするような改善された特性を有する、新規のタンパク質分解酵素の開発に関する関心は続いている。これらの特性は、より良い洗浄効果、改善された低い洗濯温度での汚れ除去能力、貯蔵時の安定性の向上、又は使用時の安定性の向上を含むが、これらに限定されるものではない。
発明の要約
本発明のある態様において、洗剤、特に洗濯洗剤での使用に非常に適したものにするような、かなり改善された特性をもたらす、特異的な変性を示している新規のPB92又はスブチリシン309変性体セリンプロテアーゼを提供する。これらのPB92又はスブチリシン309変性体は、60,87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211,212及び216の位置での変性を有する。
本発明の好ましい実施態様において、102番目に変性を有するPB92及びスブチリシン309変性体、好ましくは少なくとも１個の他の変性と組み合わされた変性体が提供されている。これらの中で、PB92変性体、［S99G,V102N］及び［V102N,N198G］が、最も好ましい。
本発明の別の態様において、このような新規の変性体タンパク質分解酵素を少なくとも１種、他の酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼと、組み合せた又は組み合せない状態で含むようなタンパク質分解酵素製品を含む、新規の酵素洗剤組成物を提供する。
本発明のこれら及び他の態様は、さらに下記の詳細な説明によって、明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本願明細書において“変性体プロテアーゼ”とともに使用される用語“改善された特性”は、対応する野生型プロテアーゼと比較して、改善された洗浄効果、もしくは保持された洗浄効果を伴う改善された安定性を示すタンパク質分解酵素を意味する。
本願明細書において、用語、変性体プロテアーゼの“洗浄効果”は、適切な洗浄条件下での酵素を含まない洗剤組成物の効果に加えられた、変性体プロテアーゼの洗濯洗浄に対する貢献と定義される。
用語“適切な洗浄条件”は、洗剤業界において、実際に家庭用に使用された条件、特に洗浄温度、時間、洗濯機、セッケン水の濃度、洗剤の種類及び水の硬度を意味する。
用語“改善された洗浄効果”は、適切な洗浄条件下で、重量に対する、変性体プロテアーゼの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも100％以上であることを意味する。
用語“保持された洗浄効果”は、適切な洗浄条件下で、重量に対する、変異体プロテアーゼの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも80％であることを意味する。
用語“改善された安定性”は、貯蔵時の洗濯用洗剤中の変異体タンパク質分解酵素のより良い安定性、及び／又はセッケン水中のそれらの安定性を意味し、これは対応する野生型酵素と比較して、酸化剤、金属イオン封鎖剤、自己分解、界面活性剤及び高アルカリに対する安定性を含んでいる。
欧州特許出願第EP-A-0328229号は、変性体プロテアーゼの調製を、これらのプロテアーゼの効果に関する有効な選択方法と組み合わせた方法を開示している。この試験システムは、適切な洗浄条件を模倣している、ラウンデロメーター（launderometer）又はテルゴトメーター（tergotometer）中で、試験用スワッチからプロテアーゼに感受性を持つ汚れを除去することを基本としている。適切な試験用スワッチは、例えば市販のEMPAスワッチ（アイゲノシシュマテリアルプルフング及びベルサッチアンスタルト社（Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt）、St．ガーレン、スイス）に人工的にタンパク質性の汚れをつけたものである。プロテアーゼ試験用のスワッチに適した汚れは、血液、草、チョコレート、及び他のタンパク質性の汚れである。同じくこの参考文献は、この試験システムにおいて、ある業界で家庭用として典型的な条件を模倣することができるように、他の適切な因子、例えば洗剤組成物、セッケン水の濃度、水の硬度、洗濯機、時間、pH及び温度は、調節されることを明らかにしている。
好都合なことに、プロテアーゼの洗浄効果は、妥当な試験条件下で、ある典型的な汚れを除去するそれらの能力によって測定される。この能力は、ラウンデロメーター又はテルゴトメーターにおいて、酵素類が存在する状態と存在しない状態で洗浄した後に、試験布の反射率を測定することによって、適切に調べることができる。本発明の実験的用途の試験システムは、DNAの突然変異誘発によって修飾されたプロテアーゼ類を家庭で使用する場合に相当している。
本発明を本質的に実施するために、好アルカリ性バチルス類によって産生された野生型酵素に由来したさらなる変異体酵素類の、調製、スクリーニング及び選択に、同じ方法を使用することができる。好ましい変異体は、PB92セリンプロテアーゼ又はズブチリシン309セリンプロテアーゼをコードしている野生型遺伝子由来の遺伝子によってコードされた変異体であって、前述の試験条件において改善された特性を示す変異体である。同じく、近似したセリンプロテアーゼ類をコードしている遺伝子、好ましくは約70％以上の相同性を有する遺伝子、さらに詳細に述べると約90％以上の相同性を有する遺伝子が、好く適している。
突然変異誘発を指示したオリゴヌクレオチドが媒介した（aided）サイト又はランダム突然変異誘発を指示した領域を使用することができるか、もしくは特別のプロテアーゼ遺伝子において効率的に突然変異を発生するいずれか他の適切な方法かの、どちらかであることは明らかであろう。
本発明において、予想外の改善された特性、すなわちかなり高い洗浄効果、低い洗濯温度での改善された汚れ除去能力、もしくは同様の又はより良い洗浄効果を伴うかなり改善された貯蔵安定性を有する、各種の変異体が得られた。これらの改善点は、欧州特許出願第EP-A-328229号の内容又はいずれか他の先行技術の、一方又は組み合わせによって、示唆されることもなく、さらにそれらを推論することもできなかったことから、驚くべきことであった。
従って本発明は、洗剤で使用する変性体プロテアーゼを提供し、これらは下記を含む：
下記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも70％の相同性を有する変性体プロテアーゼ：
下記のアミノ酸配列を有するPB92セリンプロテアーゼのアミノ酸配列：
もしくは下記のアミノ酸配列を有するズブチリシン309セリンプロテアーゼのアミノ酸配列：
前記PB92セリンプロテアーゼ又は前記ズブチリシン309セリンプロテアーゼにおいて位置60,87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,169,175,180,182,193,197,198,203,211及び216に相当する選択されたサイトで少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる変性体プロテアーゼ；
前記PB92セリンプロテアーゼ又は前記ズブチリシン309セリンプロテアーゼと比較して、改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する変性体プロテアーゼである。
本発明の変性体プロテアーゼの好ましい群は、下記の変性の中の少なくとも１個で異なるような、PB92又はズブチリシン309プロテアーゼの変異体である：
［N60E］、［N60E,M216S］、［E87Q］、［E87S］、［S97D］、［S99G］、［S99G,V102I］、［S99G,V102L］、［S99G,V102N］、［S99G,S130G］、［S99G,Y203W］、［S99G,M216S］、［S99T］、［V102A］、［V102A,M216S］、［V102E］、［V102G］、［V102H］、［V102I］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102I,S130G］、［V102L］、［V102L,G116V,S126V,P127M］、［V102L,S130G］、［V102L,M216F］、［V102L,M216S］、［V102M］、［V102N］、［V102N,XYZ（X,Y,Zは、修飾されたアミノ酸のいずれか）］、［V102N,R164Y］、［V102N,N198G］、［V102N,N197T,N198G］、［V102N,N198G,Y203W］、［V102N,Y203W］、［V102N,L211E］、［V102N,M216X（Xは、Mを除くアミノ酸のいずれか）］、［V102N,M216S］、［V102P］、［V102P,M216S］、［V102Q］、［V102Q,M216S］、［V102S］、［V102S,M216S］、［V102T］、［V102Y］、［G116V,S126L,P127N,S128V,A156E］、［G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S］、［G116V、S126N、P127S、S128A］、［G116V、S126N、P127S、S128A、M216Q］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216S］、［G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S］、［G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S］、［G116V,S126V,P127E,S128K,S160D］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126V,P127M,N198G］、［G116V,S126V,P127M,Y203W］、［G116V,S126V,P127M,Y203G］、［M117L］、［S126F,P127X,（Xは、Pを除くアミノ酸のいずれか）］、［S126M,P127A,S128G,S160D］、［S126M,P127A,S128G,M216Q］、［S126V,P127M］、［P127E］、［P127E,S128T,M216S］、［P127E,Y203W］、［P127E,L211E］、［S130G］、［S130G,Y203W］、［L133I］、［L133M］、［L133W］、［L133Y］、［E134C］、［S154D,S160G］、［S154G,S160G］、［S154E］、［S154G］、［S154N］、［A156D］、［A156E］、［A156G］、［S158D］、［S158E］、［S158E,I159L］、［S158N］、［S159E,I158L］、［S160D,A166D,M169I］、［S160D,N212D］、［S160D,M216Q］、［S160E］、［S160G］、［R164I］、［R164M］、［R164V］、［R164Y］、［D175E］、［R180I］、［V197L］、［V197N］、［V197T］、［V197T,M216S］、［V197W］、［N198C］、［N198D］、［N198E］、［N198G］、［N198G,Y203W］、［N198G,M216S］、［N198Q］、［N198S］、［N198V］、［Y203C］、［Y203E］、［Y203G］、［Y203K］、［Y203L］、［Y203L,V193A］、［Y203T］、［Y203T,S182N］、［Y203V］、［Y203V,V193A］、［Y203W］、［Y203W,M216S］、［L211E］、［L211X,N212Z,（Xは、Lを除くアミノ酸のいずれかで、かつZはNを除くアミノ酸のいずれか）］、［L211E,M216S］及び［N212E］；並びに、前記PB92セリンプロテアーゼ又は前記ズブチリシン309セリンプロテアーゼと比較して改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する変性体プロテアーゼである。
好ましくは、本発明の変性体プロテアーゼは、実質的に純系（pure form）である。
本発明の態様において、ある新規の変性体プロテアーゼは、それらの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼの洗浄効果よりも同様により良く、かつ多くの場合顕著によいことから、かなり改善された抗酸化性を示す。これらの変異体酵素は、通常216番のメチオニン（“M”）が他のアミノ酸、好ましくはセリン（“S”）又はグルタミン（“Q”）で置換されている。同様にフェニルアラニン（“F”）又はアラニン（“A”）による置換も適している。さらに置換は、60,99,102,116,127,128,130,154,156,158,197,198,203,211及び212の位置を含んでいる。好ましい酵素は、102、もしくは116,126,127及び128の１個以上の位置がさらに置換された、M216S及びM216Q変異体である。同様に197,198及び203の位置が置換された、M216S及びM216Q変異体も特に興味深い。好ましい変異体は、［N60E,M216S］、［S99G,M216S］、［V102A,M216S］、［V102L,M216S］、［V102N,M216S］、［V102P,M216S］、［V102Q,M216S］、［V102S,M216S］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216S］、［G116V,S216R,P127Q,S128D,M216S］、［P127E,S128T,M216S］、［V197T,M216S］、［N198G,M216S］、［V203W,M216S］、［L211E,M216S］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216Q］、［S126M,P127A,S128G,M216Q］、［V102L,M216F］である。
欧州特許出願第EP-A-0328229号が、PB92のM216S及びM216Q変異体及び類似の高アルカリ性セリンプロテアーゼの、保持された洗浄効果を伴う改善された酸化に対する安定性について記載していることを特記しなければならない。しかし、この参考文献は、前述の変性を伴うPB92又はズブチリシン309の“216”変異体が、顕著に改善された洗浄効果をさらにもたらすことは、教示又は示唆してはいない。
本発明の他の態様において、一般に抗酸化性でないある新規変性体プロテアーゼが、かなり改善された洗浄効果を示す。これらの変異体酵素類は、87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211及び212の位置に、１個以上の置換を有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置の中から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記の位置を含む：102,130又は203を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、99；87,97,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは130,164,197,198,203又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、102；99,102,130,156,160,197,198,203,211又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは102,156,160,198,203又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、116,126,127,128；好ましくは102,156,160,198,203又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、126及び127；130又は203；154及び160；158及び159；160、166及び169；160及び212；198及び203；203及び182；203及び193；211及び212である。好ましい変異体は、［S99G,V102N］、［S99G,V102L］、［S99G,V102I］、［S99G,S130G］、［S99G,Y203W］、［V102I,S130G］、［V102L,S130G］、［V102N,R164Y］、［V102N,N198G］、［V102N,N197T,N198G］、［V102N,N198G,Y203W］、［V102N,Y203W］、［V102N,L211E］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102L,G116V,S126V,P127M］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］、［G116V,S126LP127N,S128V,A156E］、［G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W］、［G116V,S126N,P127S,S128A］、［G116V,S126V,P127E,S128K,S160D］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126V,P127M,N198G］、［G116V,S126V,P127M,Y203W］、［G116V,S126V,P127M,Y203G］、［S126M,P127A,S128G,S160D］、［P127E,L211E］、［P127E,Y203W］、［S126F,P127A］、［S126F,P127D］、［S126F,P127H］、［S126F,P127N］、［S126F,P127Q］、［S126V,P127M］、［S130G,Y203W］、［S154G,S160G］、［S154D,S160G］、［S158E,I159L］、［S160D,A166D,M169I］、［S160D,N212D］、［N198G,Y203W］、［Y203T,S182N］、［Y203V,V193A］、［Y203L,V193A］、［L211G,N212D］、［L211N,N212D］、［L211V,N212D］、［L211Y,N212S］である。
さらに本発明の他の態様において、PB92及びズブチリシン309プロテアーゼのある新規な変異体は、先行技術から予想できる方法がないカカオの汚れに対し、予想外の活性を示す。このような変性体プロテアーゼは、１個以上の置換を、102,16,117,126,127,128,133,154,156,158,159,160,164,197,198,203,211及び216の位置に有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記の位置を含む：164又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、102；203又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、127；154及び160；158及び159である。さらに、これらの修飾は、102又は211に追加の変性を少なくとも１個伴う、M216S及びM216Qを含む。好ましい変異体は、［V102N,R164Y］、［V102N,L211E］、［V102N,N198G］、［P127E,Y203W］、［P127E,L211E］、［S154G,S160G］、［S154D,S160G］、［S158E,I159L］、［M216S,V102Q］、［M216S,L211E］である。さらに好ましい変異体は、置換V102Q及びL211Eをさらに伴う、PB92のM216S変異体である。
さらに他の本発明の態様において、PB92及びズブチリシン309プロテアーゼのある新規な変異体は、より低い洗濯温度、例えば約20℃での、改善された汚れ除去能力を示す。このような変異体は、PB92又はズブチリシン309酵素において、通常１個以上の置換を、99,102,116,126,127,128,130,160,197,198及び203の位置に有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置の中から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記を含む：102又は130を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは130の変異を伴う、99；197、198又は203を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは99又は198に追加の変性を少なくとも１個伴う、最も好ましくは99又は198に追加の変性を含む、102；116,127,128又は160に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは127に伴う、126である。好ましい変異体は、［S99G,S130G］、［S99G,V102N］、［S99G,V102I］、［V102N,N198G］、［V102N,Y203W］、［V102N,V197I,N198G］、［S126V,P127M］、［S126F,P127N］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］である。
同じく有効な変性体を、本願明細書中に記載された変性又は変性の組みのいずれかと組み合わせることによって、産生することができる。さらに、本願明細書中に記載したような有効な変性を、該酵素の特性の実質的な変化を引き起こすことができるまたはできないような、他のサイトの変性と組み合わせることが可能である。
洗濯用洗剤としての用途に適した新規のプロテアーゼを得るために本発明で使用された研究法の意義を詳細に説明するために、すなわち一次選択の基準として典型的な洗濯用途の試験を用いることによって、変異体PB92プロテアーゼの洗浄効果試験の結果を、タンパク質の生化学的及び酵素学的研究において通常測定される、生化学的パラメーターで比較した。これらの結果は、洗浄効果と、限定された基質に対する親和性及びタンパク質分解反応の動力学を決定するパラメーター類との間に何ら関係がないという結論をもたらす。
従って、１酵素含有製品又は同一の洗浄工程において、異なる特性を有する２種以上の変異体を組み合わせることも当然可能である。このような組み合わせは、相乗効果を示すこともあれば、そうでない場合もある。
同じく本発明は、洗剤組成物中又は洗浄方法における、前述の変異体タンパク質分解酵素を１種以上使用することも含んでいる。このような洗剤組成物は、選択された１個又は複数のプロテアーゼと適合性がある、１種以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ又はリパーゼなども含むことができる。酵素の最良の組み合わせの選択は、通常使用者の要求及び必要性によって決まるが、一般に独創的な技術は必要としない。
最後に、PB92プロテアーゼ又はズブチリシン309に対し相同性を有するプロテアーゼが、突然変異誘発によって人為的に作られた場合も、自然に生じた場合にも、該プロテアーゼのポリペプチド鎖のアミノ酸の欠失又は挿入によって、このアミノ酸の一次構造を変更することができることは明らかであろう。しかし、PB92プロテアーゼ又はズブチリシン309のアミノ酸配列に対し相同な配列は、本出願の請求の範囲であると理解される。
本発明の変性体プロテアーゼは、本質的に欧州特許出願第EP-A-0328229号で開示された方法と同じ方法で産生することができる。同様に、所望の変性体プロテアーゼをコードした遺伝子の調製、前記遺伝子のクローニング及び発現、適した宿主の選択、培養（fermentation）条件、該酵素の回収、精製、スクリーニング及び選択などは、実質的に欧州特許出願第EP-A-0328229号記載のものと同じであり、かつ当業者の技術の範囲内である。
下記の実施態様は、詳細に説明するために提供するが、限定するためのものではない。
実施例
前記変異体の構造、前記変異体の生成、精製、陽イオン交換樹脂及びゲルろ過カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、活性部位の滴定及び動力学的パラメーターの測定を含む材料及び方法は、別法を記載した場合を除き、欧州特許出願第EP-A-0328229号に開示されたものと、類似又は同一である。実施例において記号+DTTが記された変異体は、ジチオトレイトール（DTT）2mMの存在下で、精製し、貯蔵した。
実施例１
各種のPB92プロテアーゼ変異体の洗浄効果を、欧州特許出願第EP-A-0328229号に詳細が開示された、特別に開発された洗浄試験で測定した。本実施例において、粉末洗剤IEC-STPPを含む、ナトリウムトリポリリン酸（STPP）系に加え、粉末洗剤（IEC-ゼオライト）を含む非リン酸系を使用した。新規のプロテアーゼ変異体の洗浄効果を試験するために使用した両方の試験システムの典型的な特徴を、下記にまとめた：
IEC-STPP粉末洗剤（IEC試験洗剤タイプＩ、1976年５月調製）及びIEC-ゼオライト粉末洗剤（1988年４月調製）は、WFK-試験用布社（WFK-Testgewebe GmbH）（アドラーストラッセ44、D-4150、クレーフェルト、ドイツ）から購入した。カカオにおける効果は、CFT AS-3スワッチ（CFT（試験材料センター）、PO Box 120、ヴラールデンゲン、オランダ）を用いて測定した。E87S及びE87Qの２種類の変異体は、表IIに示したように、粉末洗剤を含むSTPP／漂白剤が10g/リットルの、IEC-STPPシステムで試験した。さらに4g／リットルでの効果の測定は、少し変更したIEC-STPPシステム（表中、ADE+で示した。）において行った：この洗浄効果試験は、40℃、30分及び2mM Ca2+の代わりに、5mM Ca2+の存在下で、30℃、20分間行った。さらにEMPA 221スワッチを２個、並びに直径6mmのステンレススチールボールを15個用いた。
この結果を、添付した表I、II、IIIにまとめた。
実施例２
典型的に米国（U.S.）の条件を模倣するために、低洗浄性の条件下で、新規PB92プロテアーゼ変異体のいくつかの洗浄効果を測定するために、洗浄効果を、実施例１に記載された試験と類似だが、いくつか変更を加えた洗浄試験を用いて測定した。この試験の主な特徴を下記に示した：
洗剤Ａは、下記を含む：
PB92プロテアーゼ又はそれらの変異体を添加する前に、洗浄用アルコール（washliquor）のpHを10.2に調節する。この結果を、表IVに示す。
さらにいくつかの該変異体の洗浄効果を、低温で測定した。20℃で得られた結果を、表IVに示す。示された変異体のすべてが、これらの条件で野生型が示すものよりも、20℃で顕著な向上を示した。非常に驚くべきことに、該変異体のいくつか、例えば［V102N,S99G］、［V102N］、［G116V,S126V,P127M,S160D］は、20℃の方が30℃よりもよい洗浄効果を示す。これは、野生型PB92の性質から予想されたもの：PB92の洗浄効果は、洗濯温度が低くなるにつれて低下して行く、とは対照的である。サイトに特異的な遺伝子操作によるアルカリ性プロテアーゼの洗浄効果の向上に対する我々の研究は、これらのプロテアーゼが最適な効果を発揮する温度を、シフトすることもできることを示している。
すべての実験において、洗浄効果は、PB92野生型プロテアーゼと比較して調べた。前述の洗剤Ａに加え、さらにいくつかの市販されてる米国の洗剤類についても洗浄効果を測定した。洗浄の結果は類似していた。
本出願において言及されたあらゆる発表（特許出願を含む）は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。全ての発表は、それぞれ個々の発表が、参照として組み込まれることを明確かつ個別に示されたのと同じ範囲で、参照として本願明細書中に組み込まれている。
前述の発明は、理解を明確にする目的で、具体的説明及び実施例として、いくらか詳しく記載されているが、当該技術分野における通常の技術の１種において、付随したクレームの意図及び範囲から外れることなく、多くの変更及び修飾がそれに加えて行なわれることは明らかであろう。
技術分野
本発明は、洗剤で使用する、改善された特性を有する、新規の高アルカリ性セリンプロテアーゼ変性体に関する。これらの特性に含まれるものには、洗濯用洗剤洗浄組成物における改善された汚れ除去能力、低い洗濯温度における改善された汚れ除去能力、貯蔵時の洗濯用洗剤中での安定性の向上、及び該洗剤から調製されたセッケン水中での安定性の向上がある。
発明の背景
汚れの基となるタンパク質の除去を可能にする洗剤組成物中の酵素添加物、特にタンパク質分解酵素の使用が、数多く報告されている。例えば公開された欧州特許出願第EP-A-0220921号及び欧州特許出願第EP-A-0232269号、米国特許第4,480,037号及びRe第30,602号、並びに論文“微生物酵素の産生”（Microbial Technology、Vol.1:281-311（1979）（アカデミック出版））を参照。
硬質表面（hard surface）の清掃、トイレ清掃、皿洗い及び洗濯に使用される洗剤組成物は、粉末、液状又はペースト状であることができる。洗濯用洗剤は、一般に、液状及び粉末の主な２種類に分類される。
タンパク質分解酵素は一般に、洗剤組成物と組み合わせることは困難である。これらは使用時に、例えば温度が約10℃から60℃以上の範囲で洗濯中に、布からタンパク質性の汚れを除去する際に、安定でありかつ活性を有さなければならない。さらにこれらは、洗剤製品での貯蔵期間に長期に渡って安定でなければならない。従って、酵素類は、金属イオン封鎖剤、界面活性剤、高アルカリ、時には漂白剤の存在下、並びに上昇した温度において、安定でありかつ機能を果たさなければならない。
世界中で使用されている万能洗濯用洗剤も、万能の洗浄条件（pH、温度、セッケン水の濃度、水の硬度）も存在しないので、酵素類の必要性は、それが使用された洗剤の種類、及び洗浄条件によって変ってくる。
プロテアーゼの商品として重要なものは、好アルカリ性バチルス由来の、いわゆる高アルカリ性プロテアーゼである。市販の高アルカリ性プロテアーゼ製品であるマクサカル（MAXACAL）（登録商標）（ギスト-ブロケード（Gist-brocades）/IBIS）は、バチルスnovo種PB92由来のセリンプロテアーゼ“PB92”を含んでいる（米国特許Re第30,602号参照）。そのアミノ酸配列は、欧州特許出願第EP-A-0283075号及び欧州特許出願第EP-A-0284126号に記載されている。同じくサビナーゼ（SAVINASE）（登録商標）（ノボ-ノルディスク（Novo-Nordisk））も、この群の一種である。サビナーゼは、“ズブチリシン309”酵素を含み、これはバチルス株NCIB 10147由来である（米国特許第3,723,750号）。そのアミノ酸配列は、国際特許出願第WO 89/06279号に開示されていて、この中で前記株は、バチルスレンタス（Bacillus lentus）と呼ばれている。これら２種類のプロテアーゼのアミノ酸配列は、85番目のみ異なっていることが明らかであり（PB92プロテアーゼ残基の一次構造決定を行い、これはBNP'一次構造における87番目に相当する。）、PB92は85番目に、アスパラギン酸（アミノ酸１文字表記では“N”）を、並びに“ズブチリシン309”は、セリン（“S”）を有す。
PB92プロテアーゼは、pH値がアルカリ性で、汚れ除去の活性を示すので、これは通常、界面活性剤、ビルダー及び酸化剤のような洗剤成分とともに、洗剤添加物として使用される。酸化剤は主として粉末の形状で使用される。前述の洗剤添加物は、該プロテアーゼと適合性があるかぎりは、同様に他の酵素類、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及び／又はリパーゼを含むこともできる。PB92プロテアーゼは、例えば当該技術分野で周知である“古典的”スブチリシン類のような他のプロテアーゼ類と比べて、優れた汚れ除去力を持つ。このことは、同じ洗浄効果を得るために必要なPB92プロテアーゼが少ないことを意味する。酸化に対する敏感さは、PB92プロテアーゼ及び洗剤中で使用される他の全ての公知のセリンプロテアーゼ類の重大な欠点である。
元来、マクサカル（登録商標）のような、市販のアルカリ性プロテアーゼ類は、40〜60℃の範囲の温められた温度で、洗剤中で使用するために開発された。しかし現在では、経済性を重視するため、低温へと変わりつつある。その結果、低い温度、例えば15〜25℃で、洗浄効果が劣ることは、市販のアルカリ性プロテアーゼの大きな欠点である。
意企する用途のために新規な酵素を得る方法がいくつかあり、これらはすべて当業者にとって公知である。タンパク質工学による現存する酵素類の修飾は、現在最も盛んで効果的な方法であるように思われる。
修飾された酵素を得る最も特異的な方法は、別の所望のアミノ酸を用いて、１個以上のアミノ酸を特定して置換することができる、部位特異的突然変異誘発によるものである。欧州特許出願第EP-A-0130756号は、修飾されたタンパク質分解酵素を産生するように発現することができる変異体プロテアーゼ遺伝子をもたらすために、この技術を使用することを例証している。非常に効果的な方法は、オリゴヌクレオチドに媒介された部位特異的突然変異誘発であり、これは、１本鎖合成オリゴヌクレオチドの調製物を使用することによって、多くの異なる突然変異をDNA塩基配列の特定の部分に引き起こすことができるようにする。
各種の洗剤組成物及び酵素、それらの物理的形態、前記酵素が最大の機能を発揮する条件、現在使用できる酵素の酵素洗剤組成物中での使用に際しての問題点及び限界、変性体プロテアーゼの調製及びスクリーニングなどの包括的要約のために、本願明細書中に参照として組み込まれた欧州特許出願第EP-A-0328229号に言及することができる。
国際特許出願第W0 89/06279号は、特に、“ズブチリシン309”プロテアーゼの変性体をクレームしていて、これは下記の位置で１個以上の残基が置換されている（原型のBPN'残基の一次構造を採用）：6,9,11-12,19,25,36-38,53-59,67,71,89,104,111,115,120,121-122,124,128,131,140,153-166,168,169-170,172,175,180,182,186,187,191,194,195,199,218,219,222,226,234-238,241,260-262,265,268又は275。実際に産生されかつ試験された変性体を記載しているこの参考文献における変性体の数は、わずか８個に限られていて、４種類の位置のみが関連している。これらの変性体は、S153A,G195D,G195E,N218S,［G195E,M222A］,［G195E,M222C］,M222A,及びM222Cである。
欧州特許出願第EPA-A-0328229号は、PB92セリンプロテアーゼのアミノ酸配列と少なくとも70％の相同性を有し、かつ該PB92セリンプロテアーゼの32,33,48-54,58-62,94-107,116-118,123-134,150,152-156,158-161,164,166,169,175-186,197,198及び203-216,235,243及び259に対応する選択されたサイトで少なくとも１個のアミノ酸残基が異なり、かつ該PB92セリンプロテアーゼと比べて改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する、変性体プロテアーゼを特に、開示しクレームしている。この参考文献は、17種類の位置が関連している、69個の変性体に限定されている。
過去数年間に達成されたように思われる進歩にもかかわらず、洗剤で使用することをさらに興味深いものとするような改善された特性を有する、新規のタンパク質分解酵素の開発に関する関心は続いている。これらの特性は、より良い洗浄効果、改善された低い洗濯温度での汚れ除去能力、貯蔵時の安定性の向上、又は使用時の安定性の向上を含むが、これらに限定されるものではない。
発明の要約
本発明のある態様において、洗剤、特に洗濯洗剤での使用に非常に適したものにするような、かなり改善された特性をもたらす、特異的な変性を示している新規のPB92又はスブチリシン309変性体セリンプロテアーゼを提供する。これらのPB92又はスブチリシン309変性体は、60,87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211,212及び216の位置での変性を有する。
本発明の好ましい実施態様において、102番目に変性を有するPB92及びスブチリシン309変性体、好ましくは少なくとも１個の他の変性と組み合わされた変性体が提供されている。これらの中で、PB92変性体、［S99G,V102N］及び［V102N,N198G］が、最も好ましい。
本発明の別の態様において、このような新規の変性体タンパク質分解酵素を少なくとも１種、他の酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ及びリパーゼと、組み合せた又は組み合せない状態で含むようなタンパク質分解酵素製品を含む、新規の酵素洗剤組成物を提供する。
本発明のこれら及び他の態様は、さらに下記の詳細な説明によって、明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本願明細書において“変性体プロテアーゼ”とともに使用される用語“改善された特性”は、対応する野生型プロテアーゼと比較して、改善された洗浄効果、もしくは保持された洗浄効果を伴う改善された安定性を示すタンパク質分解酵素を意味する。
本願明細書において、用語、変性体プロテアーゼの“洗浄効果”は、適切な洗浄条件下での酵素を含まない洗剤組成物の効果に加えられた、変性体プロテアーゼの洗濯洗浄に対する貢献と定義される。
用語“適切な洗浄条件”は、洗剤業界において、実際に家庭用に使用された条件、特に洗浄温度、時間、洗濯機、セッケン水の濃度、洗剤の種類及び水の硬度を意味する。
用語“改善された洗浄効果”は、適切な洗浄条件下で、重量に対する、変性体プロテアーゼの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも100％以上であることを意味する。
用語“保持された洗浄効果”は、適切な洗浄条件下で、重量に対する、変異体プロテアーゼの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼに対して少なくとも80％であることを意味する。
用語“改善された安定性”は、貯蔵時の洗濯用洗剤中の変異体タンパク質分解酵素のより良い安定性、及び／又はセッケン水中のそれらの安定性を意味し、これは対応する野生型酵素と比較して、酸化剤、金属イオン封鎖剤、自己分解、界面活性剤及び高アルカリに対する安定性を含んでいる。
欧州特許出願第EP-A-0328229号は、変性体プロテアーゼの調製を、これらのプロテアーゼの効果に関する有効な選択方法と組み合わせた方法を開示している。この試験システムは、適切な洗浄条件を模倣している、ラウンデロメーター（launderometer）又はテルゴトメーター（tergotometer）中で、試験用スワッチからプロテアーゼに感受性を持つ汚れを除去することを基本としている。適切な試験用スワッチは、例えば市販のEMPAスワッチ（アイゲノシシュマテリアルプルフング及びベルサッチアンスタルト社（Eidgenossische Material Prufungs und Versuch Anstalt）、St．ガーレン、スイス）に人工的にタンパク質性の汚れをつけたものである。プロテアーゼ試験用のスワッチに適した汚れは、血液、草、チョコレート、及び他のタンパク質性の汚れである。同じくこの参考文献は、この試験システムにおいて、ある業界で家庭用として典型的な条件を模倣することができるように、他の適切な因子、例えば洗剤組成物、セッケン水の濃度、水の硬度、洗濯機、時間、pH及び温度は、調節されることを明らかにしている。
好都合なことに、プロテアーゼの洗浄効果は、妥当な試験条件下で、ある典型的な汚れを除去するそれらの能力によって測定される。この能力は、ラウンデロメーター又はテルゴトメーターにおいて、酵素類が存在する状態と存在しない状態で洗浄した後に、試験布の反射率を測定することによって、適切に調べることができる。本発明の実験的用途の試験システムは、DNAの突然変異誘発によって修飾されたプロテアーゼ類を家庭で使用する場合に相当している。
本発明を本質的に実施するために、好アルカリ性バチルス類によって産生された野生型酵素に由来したさらなる変異体酵素類の、調製、スクリーニング及び選択に、同じ方法を使用することができる。好ましい変異体は、PB92セリンプロテアーゼ又はズブチリシン309セリンプロテアーゼをコードしている野生型遺伝子由来の遺伝子によってコードされた変異体であって、前述の試験条件において改善された特性を示す変異体である。同じく、近似したセリンプロテアーゼ類をコードしている遺伝子、好ましくは約70％以上の相同性を有する遺伝子、さらに詳細に述べると約90％以上の相同性を有する遺伝子が、好く適している。
突然変異誘発を指示したオリゴヌクレオチドが媒介した（aided）サイト又はランダム突然変異誘発を指示した領域を使用することができるか、もしくは特別のプロテアーゼ遺伝子において効率的に突然変異を発生するいずれか他の適切な方法かの、どちらかであることは明らかであろう。
本発明において、予想外の改善された特性、すなわちかなり高い洗浄効果、低い洗濯温度での改善された汚れ除去能力、もしくは同様の又はより良い洗浄効果を伴うかなり改善された貯蔵安定性を有する、各種の変異体が得られた。これらの改善点は、欧州特許出願第EP-A-328229号の内容又はいずれか他の先行技術の、一方又は組み合わせによって、示唆されることもなく、さらにそれらを推論することもできなかったことから、驚くべきことであった。
従って本発明は、洗剤で使用する変性体プロテアーゼを提供し、これらは下記を含む：
下記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも70％の相同性を有する変性体プロテアーゼ：
下記のアミノ酸配列を有するPB92セリンプロテアーゼのアミノ酸配列：
前記PB92セリンプロテアーゼ又は前記ズブチリシン309セリンプロテアーゼと比較して、改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する変性体プロテアーゼである。
本発明の変性体プロテアーゼの好ましい群は、下記の変性の中の少なくとも１個で異なるような、PB92又はズブチリシン309プロテアーゼの変異体である：
［N60E］、［N60E,M216S］、［E87Q］、［E87S］、［S97D］、［S99G］、［S99G,V102I］、［S99G,V102L］、［S99G,V102N］、［S99G,S130G］、［S99G,Y203W］、［S99G,M216S］、［S99T］、［V102A］、［V102A,M216S］、［V102E］、［V102G］、［V102H］、［V102I］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102I,S130G］、［V102L］、［V102L,G116V,S126V,P127M］、［V102L,S130G］、［V102L,M216F］、［V102L,M216S］、［V102M］、［V102N］、［V102N,XYZ（X,Y,Zは、修飾されたアミノ酸のいずれか）］、［V102N,R164Y］、［V102N,N198G］、［V102N,N197T,N198G］、［V102N,N198G,Y203W］、［V102N,Y203W］、［V102N,L211E］、［V102N,M216X（Xは、Mを除くアミノ酸のいずれか）］、［V102N,M216S］、［V102P］、［V102P,M216S］、［V102Q］、［V102Q,M216S］、［V102S］、［V102S,M216S］、［V102T］、［V102Y］、［G116V,S126L,P127N,S128V,A156E］、［G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S］、［G116V、S126N、P127S、S128A］、［G116V、S126N、P127S、S128A、M216Q］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216S］、［G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S］、［G116V,S126R,P127Q,S128D,M216S］、［G116V,S126V,P127E,S128K,S160D］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126V,P127M,N198G］、［G116V,S126V,P127M,Y203W］、［G116V,S126V,P127M,Y203G］、［M117L］、［S126F,P127X,（Xは、Pを除くアミノ酸のいずれか）］、［S126M,P127A,S128G,S160D］、［S126M,P127A,S128G,M216Q］、［S126V,P127M］、［P127E］、［P127E,S128T,M216S］、［P127E,Y203W］、［P127E,L211E］、［S130G］、［S130G,Y203W］、［L133I］、［L133M］、［L133W］、［L133Y］、［E134C］、［S154D,S160G］、［S154G,S160G］、［S154E］、［S154G］、［S154N］、［A156D］、［A156E］、［A156G］、［S158D］、［S158E］、［S158E,I159L］、［S158N］、［S159E,I158L］、［S160D,A166D,M169I］、［S160D,N212D］、［S160D,M216Q］、［S160E］、［S160G］、［R164I］、［R164M］、［R164V］、［R164Y］、［D175E］、［R180I］、［V197L］、［V197N］、［V197T］、［V197T,M216S］、［V197W］、［N198C］、［N198D］、［N198E］、［N198G］、［N198G,Y203W］、［N198G,M216S］、［N198Q］、［N198S］、［N198V］、［Y203C］、［Y203E］、［Y203G］、［Y203K］、［Y203L］、［Y203L,V193A］、［Y203T］、［Y203T,S182N］、［Y203V］、［Y203V,V193A］、［Y203W］、［Y203W,M216S］、［L211E］、［L211X,N212Z,（Xは、Lを除くアミノ酸のいずれかで、かつZはNを除くアミノ酸のいずれか）］、［L211E,M216S］及び［N212E］；並びに、前記PB92セリンプロテアーゼ又は前記ズブチリシン309セリンプロテアーゼと比較して改善された洗浄効果及び／又は改善された安定性を有する変性体プロテアーゼである。
好ましくは、本発明の変性体プロテアーゼは、実質的に純系（pure form）である。
本発明の態様において、ある新規の変性体プロテアーゼは、それらの洗浄効果が、対応する野生型プロテアーゼの洗浄効果よりも同様により良く、かつ多くの場合顕著によいことから、かなり改善された抗酸化性を示す。これらの変異体酵素は、通常216番のメチオニン（“M”）が他のアミノ酸、好ましくはセリン（“S”）又はグルタミン（“Q”）で置換されている。同様にフェニルアラニン（“F”）又はアラニン（“A”）による置換も適している。さらに置換は、60,99,102,116,127,128,130,154,156,158,197,198,203,211及び212の位置を含んでいる。好ましい酵素は、102、もしくは116,126,127及び128の１個以上の位置がさらに置換された、M216S及びM216Q変異体である。同様に197,198及び203の位置が置換された、M216S及びM216Q変異体も特に興味深い。好ましい変異体は、［N60E,M216S］、［S99G,M216S］、［V102A,M216S］、［V102L,M216S］、［V102N,M216S］、［V102P,M216S］、［V102Q,M216S］、［V102S,M216S］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,M216S］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216S］、［G116V,S216R,P127Q,S128D,M216S］、［P127E,S128T,M216S］、［V197T,M216S］、［N198G,M216S］、［V203W,M216S］、［L211E,M216S］、［G116V,S126N,P127S,S128A,M216Q］、［S126M,P127A,S128G,M216Q］、［V102L,M216F］である。
欧州特許出願第EP-A-0328229号が、PB92のM216S及びM216Q変異体及び類似の高アルカリ性セリンプロテアーゼの、保持された洗浄効果を伴う改善された酸化に対する安定性について記載していることを特記しなければならない。しかし、この参考文献は、前述の変性を伴うPB92又はズブチリシン309の“216”変異体が、顕著に改善された洗浄効果をさらにもたらすことは、教示又は示唆してはいない。
本発明の他の態様において、一般に抗酸化性でないある新規変性体プロテアーゼが、かなり改善された洗浄効果を示す。これらの変異体酵素類は、87,97,99,102,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211及び212の位置に、１個以上の置換を有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置の中から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記の位置を含む：102,130又は203を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、99；87,97,116,117,126,127,128,130,133,134,154,156,158,159,160,164,166,169,175,180,182,193,197,198,203,211又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは130,164,197,198,203又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、102；99,102,130,156,160,197,198,203,211又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは102,156,160,198,203又は212を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、116,126,127,128；好ましくは102,156,160,198,203又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、126及び127；130又は203；154及び160；158及び159；160、166及び169；160及び212；198及び203；203及び182；203及び193；211及び212である。好ましい変異体は、［S99G,V102N］、［S99G,V102L］、［S99G,V102I］、［S99G,S130G］、［S99G,Y203W］、［V102I,S130G］、［V102L,S130G］、［V102N,R164Y］、［V102N,N198G］、［V102N,N197T,N198G］、［V102N,N198G,Y203W］、［V102N,Y203W］、［V102N,L211E］、［V102I,G116V,S126V,P127M］、［V102L,G116V,S126V,P127M］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］、［G116V,S126LP127N,S128V,A156E］、［G116V,S126L,P127N,S128V,Y203W］、［G116V,S126N,P127S,S128A］、［G116V,S126V,P127E,S128K,S160D］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126V,P127M,N198G］、［G116V,S126V,P127M,Y203W］、［G116V,S126V,P127M,Y203G］、［S126M,P127A,S128G,S160D］、［P127E,L211E］、［P127E,Y203W］、［S126F,P127A］、［S126F,P127D］、［S126F,P127H］、［S126F,P127N］、［S126F,P127Q］、［S126V,P127M］、［S130G,Y203W］、［S154G,S160G］、［S154D,S160G］、［S158E,I159L］、［S160D,A166D,M169I］、［S160D,N212D］、［N198G,Y203W］、［Y203T,S182N］、［Y203V,V193A］、［Y203L,V193A］、［L211G,N212D］、［L211N,N212D］、［L211V,N212D］、［L211Y,N212S］である。
さらに本発明の他の態様において、PB92及びズブチリシン309プロテアーゼのある新規な変異体は、先行技術から予想できる方法がないカカオの汚れに対し、予想外の活性を示す。このような変性体プロテアーゼは、１個以上の置換を、102,16,117,126,127,128,133,154,156,158,159,160,164,197,198,203,211及び216の位置に有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記の位置を含む：164又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、102；203又は211を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、127；154及び160；158及び159である。さらに、これらの修飾は、102又は211に追加の変性を少なくとも１個伴う、M216S及びM216Qを含む。好ましい変異体は、［V102N,R164Y］、［V102N,L211E］、［V102N,N198G］、［P127E,Y203W］、［P127E,L211E］、［S154G,S160G］、［S154D,S160G］、［S158E,I159L］、［M216S,V102Q］、［M216S,L211E］である。さらに好ましい変異体は、置換V102Q及びL211Eをさらに伴う、PB92のM216S変異体である。
さらに他の本発明の態様において、PB92及びズブチリシン309プロテアーゼのある新規な変異体は、より低い洗濯温度、例えば約20℃での、改善された汚れ除去能力を示す。このような変異体は、PB92又はズブチリシン309酵素において、通常１個以上の置換を、99,102,116,126,127,128,130,160,197,198及び203の位置に有す。好ましい変異体は、これらの限定された位置の中から少なくとも２個の修飾を有するものである。これらの修飾は下記を含む：102又は130を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは130の変異を伴う、99；197、198又は203を含む群から選択された位置に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは99又は198に追加の変性を少なくとも１個伴う、最も好ましくは99又は198に追加の変性を含む、102；116,127,128又は160に少なくとも１個の追加の変性を伴う、好ましくは127に伴う、126である。好ましい変異体は、［S99G,S130G］、［S99G,V102N］、［S99G,V102I］、［V102N,N198G］、［V102N,Y203W］、［V102N,V197I,N198G］、［S126V,P127M］、［S126F,P127N］、［G116V,S126V,P127M,S160D］、［G116V,S126L,P127Q,S128A,S160D］である。
同じく有効な変性体を、本願明細書中に記載された変性又は変性の組みのいずれかと組み合わせることによって、産生することができる。さらに、本願明細書中に記載したような有効な変性を、該酵素の特性の実質的な変化を引き起こすことができるまたはできないような、他のサイトの変性と組み合わせることが可能である。
洗濯用洗剤としての用途に適した新規のプロテアーゼを得るために本発明で使用された研究法の意義を詳細に説明するために、すなわち一次選択の基準として典型的な洗濯用途の試験を用いることによって、変異体PB92プロテアーゼの洗浄効果試験の結果を、タンパク質の生化学的及び酵素学的研究において通常測定される、生化学的パラメーターで比較した。これらの結果は、洗浄効果と、限定された基質に対する親和性及びタンパク質分解反応の動力学を決定するパラメーター類との間に何ら関係がないという結論をもたらす。
従って、１酵素含有製品又は同一の洗浄工程において、異なる特性を有する２種以上の変異体を組み合わせることも当然可能である。このような組み合わせは、相乗効果を示すこともあれば、そうでない場合もある。
同じく本発明は、洗剤組成物中又は洗浄方法における、前述の変異体タンパク質分解酵素を１種以上使用することも含んでいる。このような洗剤組成物は、選択された１個又は複数のプロテアーゼと適合性がある、１種以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、セルラーゼ又はリパーゼなども含むことができる。酵素の最良の組み合わせの選択は、通常使用者の要求及び必要性によって決まるが、一般に独創的な技術は必要としない。
最後に、PB92プロテアーゼ又はズブチリシン309に対し相同性を有するプロテアーゼが、突然変異誘発によって人為的に作られた場合も、自然に生じた場合にも、該プロテアーゼのポリペプチド鎖のアミノ酸の欠失又は挿入によって、このアミノ酸の一次構造を変更することができることは明らかであろう。しかし、PB92プロテアーゼ又はズブチリシン309のアミノ酸配列に対し相同な配列は、本出願の請求の範囲であると理解される。
本発明の変性体プロテアーゼは、本質的に欧州特許出願第EP-A-0328229号で開示された方法と同じ方法で産生することができる。同様に、所望の変性体プロテアーゼをコードした遺伝子の調製、前記遺伝子のクローニング及び発現、適した宿主の選択、培養（fermentation）条件、該酵素の回収、精製、スクリーニング及び選択などは、実質的に欧州特許出願第EP-A-0328229号記載のものと同じであり、かつ当業者の技術の範囲内である。
下記の実施態様は、詳細に説明するために提供するが、限定するためのものではない。
実施例
前記変異体の構造、前記変異体の生成、精製、陽イオン交換樹脂及びゲルろ過カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、活性部位の滴定及び動力学的パラメーターの測定を含む材料及び方法は、別法を記載した場合を除き、欧州特許出願第EP-A-0328229号に開示されたものと、類似又は同一である。実施例において記号+DTTが記された変異体は、ジチオトレイトール（DTT）2mMの存在下で、精製し、貯蔵した。
実施例１
各種のPB92プロテアーゼ変異体の洗浄効果を、欧州特許出願第EP-A-0328229号に詳細が開示された、特別に開発された洗浄試験で測定した。本実施例において、粉末洗剤IEC-STPPを含む、ナトリウムトリポリリン酸（STPP）系に加え、粉末洗剤（IEC-ゼオライト）を含む非リン酸系を使用した。新規のプロテアーゼ変異体の洗浄効果を試験するために使用した両方の試験システムの典型的な特徴を、下記にまとめた：
この結果を、添付した表I、II、IIIにまとめた。
実施例２
典型的に米国（U.S.）の条件を模倣するために、低洗浄性の条件下で、新規PB92プロテアーゼ変異体のいくつかの洗浄効果を測定するために、洗浄効果を、実施例１に記載された試験と類似だが、いくつか変更を加えた洗浄試験を用いて測定した。この試験の主な特徴を下記に示した：
さらにいくつかの該変異体の洗浄効果を、低温で測定した。20℃で得られた結果を、表IVに示す。示された変異体のすべてが、これらの条件で野生型が示すものよりも、20℃で顕著な向上を示した。非常に驚くべきことに、該変異体のいくつか、例えば［V102N,S99G］、［V102N］、［G116V,S126V,P127M,S160D］は、20℃の方が30℃よりもよい洗浄効果を示す。これは、野生型PB92の性質から予想されたもの：PB92の洗浄効果は、洗濯温度が低くなるにつれて低下して行く、とは対照的である。サイトに特異的な遺伝子操作によるアルカリ性プロテアーゼの洗浄効果の向上に対する我々の研究は、これらのプロテアーゼが最適な効果を発揮する温度を、シフトすることもできることを示している。
本出願において言及されたあらゆる発表（特許出願を含む）は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。全ての発表は、それぞれ個々の発表が、参照として組み込まれることを明確かつ個別に示されたのと同じ範囲で、参照として本願明細書中に組み込まれている。
前述の発明は、理解を明確にする目的で、具体的説明及び実施例として、いくらか詳しく記載されているが、当該技術分野における通常の技術の１種において、付随したクレームの意図及び範囲から外れることなく、多くの変更及び修飾がそれに加えて行なわれることは明らかであろう。
Claims (5)
- （i）下記の第一のアミノ酸配列：
または下記の第二のアミノ酸配列：
において［V102N,S99G］の変性を有する、実質的に純粋なズブチリシン変性体。 - （i）下記の第一のアミノ酸配列：
または下記の第二のアミノ酸配列：
において［V102N,N198G］の変性を有する、実質的に純粋なズブチリシン変性体。 - （i）下記の第一のアミノ酸配列：
または下記の第二のアミノ酸配列：
において［V102N］の変性を有する、実質的に純粋なズブチリシン変性体。 - （i）下記の第一のアミノ酸配列：
または下記の第二のアミノ酸配列：
において［S126V,P127M,G116V,S160D］の変性を有する、実質的に純粋なズブチリシン変性体。 - （i）下記の第一のアミノ酸配列：
または下記の第二のアミノ酸配列：
において［M117L］の変性を有する、実質的に純粋なズブチリシン変性体。
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