DE69034159T2

DE69034159T2 - Enzymatische Waschmittelzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69034159T2
Application number: DE1990634159
Authority: DE
Inventors: Eric Casteleijn; Maarten Robert Egmond; Johan Haverkamp; John David Marugg; Arnoldus Theodorus Mooren; Sven Hastrup; Ole Hvilsted; Leif Noerskov-Lauritsen; Merete Simonsen; Dorrit Anita Aaslyng; Sven Branner
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1989-06-26
Filing date: 1990-06-26
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2010-06-27
Also published as: DE69034159D1; WO1991000334A1; CA2034486A1; EP0405901B1; JPH04500385A; ES2227508T3; EP0405901A1; BR9006827A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzymmutanten oder Enzymvarianten, die zur Formulierung von Waschmittelzusammensetzungen, die ein verbessertes Waschverhalten bzw. Waschleistung aufweisen, geeignet sind und Reinigungs- und Waschmittelzusammensetzungen, die diese Enzyme enthalten.
Hintergrund der Erfindung
In der Waschmittelindustrie werden Enzyme seit mehr als 20 Jahren in Waschmittelformulierungen eingesetzt. In derartigen Formulierungen verwendete Enzyme umfassen sowohl Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen als auch andere Enzyme, oder Gemische davon. In kommerzieller Hinsicht sind Proteasen am bedeutendsten.
Obwohl Proteasen in der Waschmittelindustrie seit mehr als 20 Jahren verwendet worden sind, ist immer noch nicht genau bekannt, welche physikalischen oder chemischen Eigenschaften für ein gutes Waschverhalten oder die Reinigunsfähigkeit einer Protease verantwortlich sind.
Die derzeit verwendeten Proteasen wurden gefunden, indem Proteasen aus natürlichen Quellen isoliert wurden und in Waschmittelformulierungen getestet wurden.
Bacillus Proteasen
Enzyme, die die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten, werden als Proteasen oder (austauschbar) als Peptidasen klassifiziert (siehe Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms. W. H. Freeman and Company, San Francisco, Kapitel 3). Bakterien der Bacillus-Spezies scheiden zwei extrazelluläre Proteasenspezies aus, eine neutrale oder Metalloprotease, und eine alkalische Protease, die funktionell eine Serin-Endopeptidase ist, welche als Subtilisin bezeichnet wird. Die Sekretion dieser Proteasen ist mit dem bakteriellen Wachstumszyklus in Verbindung gebracht worden, wobei die Expression der Protease während der stationären Phase am höchsten ist, wenn auch die Sporulation erfolgt. Joliffe et al. (1980, J. Bacterial 141: 1199–1208) haben vermutet, dass Bacillus Proteasen eine Bedeutung für die Erneuerung der Zellwände haben.
Subtilisin
Eine Serinprotease ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, und das an der aktiven Stelle einen essenziellen Serinrest aufweist (White, Handler und Smith, 1973 „Principles of Biochemistry", 5. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company, NY, S. 271–272).
Die bakteriellen Serinproteasen weisen Molekulargewichte im Bereich von 20 000 bis 45 000 auf. Sie werden durch Diisopropylfluorophosphat gehemmt, aber im Gegensatz zu Metalloproteasen sind sie gegenüber Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) resistent (obwohl sie bei hohen Temperaturen durch Calciumionen stabilisiert werden). Sie hydrolysieren einfache endständige Ester und ihre Aktivität ist der von eukaryotischen Chymotropsin, das auch eine Serinprotease ist, ähnlich. Der engere Begriff, alkalische Protease, der eine Subgruppe bezeichnet, spiegelt das hohe pH-Optimum einiger der Serinproteasen wieder, das im Bereich von pH 9,0 bis 11,0 liegt (zum Überblick siehe Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711–753).
In Bezug auf die vorliegende Erfindung ist ein Subtilisin eine durch grampositive Bakterien oder durch Pilze erzeugte Serinprotease. Es ist eine breite Vielfalt von Subtilisinen identifiziert worden, und die Aminosäuresequenz einer Vielzahl von Subtilisinen ist bestimmt worden. Diese schließen mindestens sechs Subtilisine von Bacillus-Stämmen ein, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin Amylosacchariticus und Mensentericopeptidase (Kurihara et al., 1972, J. Biol. Chem. 247: 5629–5631; Wells et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 7911–7925; Stahl und Ferrari, 1984, J. Bacteriol. 159: 811–819; Jacobs et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13: 8913–8926; Nedkov et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 421–430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196: 228–232), ein Subtilisin von einem Actinomyceten, Thermitase von Thermoactinomyces vulgaris (Meloun et al., 1985, FEBS Lett 1983: 195–200), und ein fungales Subtilisin, Proteinase K von Tritirachium album (Jany und Mayer, 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 584–492).
Subtilisine sind in physikalischer und chemischer Hinsicht gut charakterisiert. Zusätzlich zu der Kenntnis der Primärstruktur (Aminosäuresequenz) dieser Enzyme sind über 50 hochauflösende Röntgenstrukturen von Subtilisinen bestimmt worden, die die Bindung von Substrat, den Transitionszustand und Produkte von mindestens drei verschiedenen Protease-Inhibitoren beschreiben und die strukturellen Konsequenzen für die natürliche Variation definieren (Kraut, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46: 331–358).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet eine Subtilisinvariante oder eine mutierte Subtilisinprotease ein Subtilisin, das durch einen Organismus erzeugt worden ist, der ein mutiertes Gen exprimiert, das von einem Mikroorganismenstamm abgeleitet ist, der ein ursprüngliches oder elterliches Gen besitzt und das entsprechende Stammenzym erzeugt, wobei das elterliche Gen mutiert worden ist, zur Herstellung der Gen-Mutante, die die mutierte Subtilisinprotease erzeugt, wenn sie in einem geeigneten Wirt exprimiert wird.
Zufällige und ortsgerichtete Mutationen des Subtilisin-Gens erwuchsen aus der Kenntnis der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Enzyms und lieferten Informationen bezüglich der katalytischen Aktivität, der Substratspezifität, der Tertiärstruktur usw. von Subtilisin (Wells et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 1219–1223; Wells et al., 1986, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A. 317: 415–423; Hwang und Warshel, 1987, Biochem. 26: 2669–2673; Rao et al., 1987, Nature 328: 551–554).
Insbesondere der ortsgerichteten Mutagenese von Subtilisin-Genen ist viel Beachtung geschenkt worden, und verschiedene Mutationen sind in den nachfolgenden Patentanmeldungen und Patenten beschrieben:
EP 130756 (GENENTECH) (entspricht US 4760025 (GENENCOR)) betrifft ortsspezifisch oder zufällig erzeugte Mutationen in „Carbonylhydrolyasen" und das nachfolgende Durchmustern der mutierten Enzyme bezüglich verschiedener Eigenschaften, wie k_cat/K_m-Verhältnis, pH-Aktivitätsprofil und Oxidationsstabilität. Abgesehen von der Feststellung, dass die ortsspezifische Mutation machbar ist, und dass die Mutation von Subtilisin BPN' in bestimmten spezifischen Positionen, d. h. ^–1Tyr, ³²Asp, ¹⁵⁵Asn, ¹⁰⁴Tyr, ²²²Met, ¹⁶⁶Gly, ⁶⁴His, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ³³Ser, ²²¹Ser, ²¹⁷Tyr, ¹⁵⁶Glu oder ¹⁵²Ala, Enzyme liefert, die veränderte Eigenschaften aufweisen, trägt diese Anmeldung nicht zu der Lösung des Problems bei, aufzuklären, wo Mutationen eingeführt werden müssen, um Enzyme mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten.
EP 214435 (HENKEL) betrifft die Klonierung und Expression von Subtilisin Carlsberg und zwei Mutanten davon. In dieser Anmeldung wird kein Grund für eine Mutation von ¹⁵⁸Asp zu ¹⁵⁸Ser und ¹⁶¹Ser zu ¹⁶¹Asp angegeben.
In WO 87/04461 (AMGEN) wird vorgeschlagen, die Anzahl der in dem Stammenzym vorhandenen Asn-Gly-Sequenzen zu verringern, zur Gewinnung von mutierten Enzymen, die einen verbesserten pH-Wert und verbesserte Wärmestabilitäten aufweisen, in dieser Anmeldung liegt die Betonung auf dem Entfernen, Mutieren oder Modifizieren der ¹⁰⁹Asn- und ²¹⁸Asn-Reste in Subtilisin BPN'.
WO 87/05050 (GENEX) offenbart eine zufällige Mutation und das nachfolgende Durchmustern einer großen Zahl von Mutanten von Subtilisin BPN' bezüglich verbesserter Eigenschaften. In dieser Anmeldung werden Mutationen in den Positionen ²¹⁸Asn, ¹³¹Gly, ²⁴⁵Thr, ¹⁶⁶Gly, ¹¹⁶Ala, ¹⁸⁸Ser, ¹²⁶Leu und ⁵³Ser beschrieben.
In EP 87303761 (GENENTECH) wird beschrieben, wie Betrachtungen hinsichtlich der Homologie sowohl auf der Ebene der Primär- als auch der Tertiärstruktur angewendet werden können, zu identifizieren, ob äquivalente Aminosäurereste konserviert sind oder nicht. Diese Information und der Kenntnisstand bezüglich der Tertiärstruktur von Subtilisin BPN' veranlasste die Erfinder eine Vielzahl von Positionen auszuwählen, die für eine Mutation geeignet sind und die erwarten ließen, dass die erhaltenen Mutanten veränderte Eigenschaften aufweisen. Die so identifizierten Positionen sind: ¹²⁴Met, ²²²Met, ¹⁰⁴Tyr, ¹⁵²Ala, ¹⁵⁶Glu, ¹⁶⁶Gly, ¹⁶⁹Gly, ¹⁸⁹Phe, ²¹⁷Tyr. Auch ¹⁵⁵Asn, ²¹Tyr, ²²Thr, ²⁴Ser, ³²Asp, ³³Ser, ³⁶Asp, ⁴⁶Gly, ⁴⁸Ala, ⁴⁹Ser, ⁵⁰Met, ⁷⁷Asn, ⁸⁷Ser, ⁹⁴Lys, ⁹⁵Val, ⁹⁶Leu, ¹⁰⁷Ile, ¹¹⁰Gly, ¹⁷⁰Lys, ¹⁷¹Tyr, ¹⁷²Pro, ¹⁹⁷Asp, ¹⁹⁹Met, ²⁰⁴Ser, ²¹³Lys und ²²¹Ser, die Positionen sind, von denen erwartet wird, dass sie verschiedene Eigenschaften des Enzyms beeinflussen. Es werden ebenfalls eine Vielzahl von Mutationen beispielhaft aufgeführt, die diese Vorschläge stützen. Zusätzlich zu einzelnen Mutationen in diesen Positionen führten die Anmelder der vorliegenden Erfindung auch vielzählige multiple Mutationen durch. Des weiteren identifizierten die Erfinder ²¹⁵Gly, ⁶⁷His, ¹²⁶Leu, ¹³⁵Leu und Aminosäurereste innerhalb der Abschnitte 97–103, 126–129, 213–215 und 152–172 als Aminosäurereste, die von Interesse sein könnten, in keiner dieser Positionen wurden jedoch beispielhaft Mutationen angeführt.
EP 260105 (GENENCOR) beschreibt die Modifizierung bestimmter Eigenschaften in Enzymen, die eine katalytische Triade enthalten, indem ein Aminosäurerest innerhalb von etwa 15 Å aus der katalytischen Triade ausgewählt wird und der ausgewählte Aminosäurerest durch einen anderen Rest ersetzt wird. Es wird besonders erwähnt, dass die in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Enzyme des Subtilisin-Typs zu einer Klasse von Enzymen gehören, die eine katalytische Triade enthält. Die Po sitionen 222 und 217 in den Subtilisinen sind als bevorzugte Positionen für den Ersatz gekennzeichnet.
WO 88/06624 (GIST-BROCADES NV) offenbaren die DNA und Aminosäuresequenzen einer als PB92 bezeichneten Subtilisinprotease, deren Aminosäuresequenz zu der Aminosäuresequenz von Subtilisin 309 zu annähernd 100% homolog ist.
WO 88/07578 (GENENTECH) beansprucht mutierte Enzyme, die von einem Stammenzym durch den Ersatz oder die Modifikation mindestens einer katalytischen Gruppe eines Aminosäurerestes abgeleitet sind. Die Erfinder führen aus, dass dadurch ein mutiertes Enzym erhalten wird, das mit Substraten reagiert, die die modifizierte oder ersetzte katalytische Gruppe enthalten (Substrat-gestützte Katalyse).
Die allgemeine Theorie basiert auf B. amyloliquefaciens Subtilisin (BPN'), in dem Modifizierungen in den Positionen ⁶⁴His beschrieben sind, das, allein oder in Kombination mit einer "Helfer"-Mutation von Ser-24-Cys zu ⁶⁴Ala modifiziert wurde. Es werden auch Mutationen in den Aminosäureresten ³²Asp und ²²¹Ser und eine "Helfer"-Mutation von Ala-48-Glu vermutet.
WO 88/08028 (GENEX) offenbart genetische Umwandlungen, die die Metallionen-Bindungsstellen betreffen, zur Stabilisierung von Proteinen. Diese Veröffentlichung verwendet ebenfalls Subtilisin BPN' als Beispiel und führt die nachfolgenden Aminosäurereste als Kandidaten für die Substitution auf: ¹⁷²Pro (P172D, P172E), ¹³¹Gly(G131D), ⁷⁶Asn(N76D; N76D+ P172D(E)), ⁷⁸Ser (S78D). Des weiteren gibt es Vorschläge hinsichtlich der kombinierten Mutanten N76D + S78D + G131D + P172D(E); N76D + G131D; S78D + G131D; S78D + P172D(E) und S78D + G131D + P172D(E).
WO 88/08033 (AMGEN) offenbart eine Vielzahl von Subtilisin-Analogen mit einer modifizierten Calcium-Bindungsstelle und in denen entweder Asn oder Gly in jeder der in dem Molekül vorhandenen Asn-Gly-Sequenz ersetzt sein können, wodurch Enzyme erhalten werden, die eine verbesserte thermische und pH-Stabilität aufweisen. Es wird offenbart, dass eine der Calcium-Bindungsstellen die Aminosäurereste ⁴¹Asp, ⁷⁵Leu, ⁷⁶Asn, ⁷⁷Asn, ⁷⁸Ser, ⁷⁹Ile, ⁸⁰Gly, ⁸¹Val, ²⁰⁸Thr und ²¹⁴Tyr einschließt; andere potenzielle Calcium-Bindungsstellen werden bei ¹⁴⁰Asp und ¹⁷²Pro; ¹⁴Pro, und ²⁷¹Gln; und ¹⁷²Pro und ¹⁹⁵Glu oder ¹⁹⁷Asp vorgeschlagen. Es wird auch die Mutation der ¹⁰⁹Asn und ²¹⁸Asn Positionen vorgeschlagen. Die hergestellten Mutanten sind N109S, N109S + N218S, N76D + N109S + N218S, N76D + N77D + N109S + N218S, N76D + I79E + N109S + N218S.
WO 88/08164 (GENEX) beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von Resten in einem Protein, in dem eine Cystein-Substitution vorliegen kann, wodurch die Bildung potenziell stabilisierender Disulfidbindung ermöglicht wird. Das Verfahren basiert auf der genauen Kenntnis der dreidimensionalen Proteinstruktur und nutzt einen Computer zum Auswählen der Positionen. In Bezug auf Subtilisinproteasen wurde Subtilisin BPN' als Modellsystem verwendet. Die Anwendung des Verfahrens auf Subtilisin BPN' führte zu 11 Kandidaten für das Einführen von Disulfidbindungen (1: T22C + S 87C, 2: V26C + L235C, 3: G47C + P57C, 4: M50C + N109C, 5: E156C + T164C, 6: V165C + K170C, 7: V165C + S191C, 8: Q206C + A216C, 9: A230C + V270C, 10: I234C + A274C, 11: H238C + W241C). Davon wurden 4 hergestellt (1, 2, 4 und 8), von denen 2 keinerlei stabilisierende Wirkung lieferten (2 und 4). Weitere Mutanten wurden hergestellt, indem zwei dieser Mutanten miteinander kombiniert wurden, und eine mit einer anderen Mutation, nämlich T22C + S87C + N218S, und T22C + S87C + Q206C + A216C. Es wurde auch eine Vielzahl erfolgloser Mutanten hergestellt, nämlich A1C + S78C, S24C + S87C, K27C + S89C, A85C + A232C, I122C + V147C, S249C + A273C, und T253C + A273C.
Von Thomas, Russell und Fersht, Nature 318: 375–376 (1985) ist auch gezeigt worden, dass der Austausch von ⁹⁹Asp zu ⁹⁹Ser in Subtilisin BPN' die pH-Abhängigkeit des Enzyms verändert.
In einem nachfolgenden Artikel, J. Mol. Biol. (1987), 193: 803–813, beschreiben die gleichen Autoren die Substitution von ¹⁵⁶Ser anstelle von ¹⁵⁶Glu.
Diese beiden Mutationen liegen innerhalb eines Bereichs, der etwa 15 Å von dem wirksamen ⁶⁹His entfernt ist.
In Nature 328: 496–500 (1987) beschreiben Russell und Fersht die Ergebnisse ihrer Versuche und legen Richtlinien für die Veränderung der pH-Aktivitätsprofile durch Mutation eines Enzyms vor, wodurch Veränderungen in der Oberflächenladung erhalten werden.
Isoelektrischer Punkt (pI₀)
Der isoelektrische Punkt pI₀ wird als der pH-Wert definiert, bei dem der Enzym-Molekül-Komplex (der gegebenenfalls Metalle oder andere Ionen bindet) neutral ist, d. h. die Summe der elektrostatischen Ladungen (elektrostatische Netto-Ladung = NEC) auf dem Komplex ist gleich Null. In diese Summe muss natürlich die positive oder negative Natur der elektrostatischen Ladungen mit in Betracht gezogen werden.
Der isoelektrische Punkt wird zweckmäßigerweise berechnet, indem Betrachtungen bezüglich des Gleichgewichts unter Nutzung von pK-Werten für die verschiedenen geladenen Reste in dem in Frage kommenden Enzym angewendet werden und anschließend durch Iteration der pH-Wert ermittelt wird, an dem die NEC des Enzymmoleküls gleich Null ist.
Ein Problem bei dieser Berechnung besteht darin, dass die pK-Werte für die geladenen Reste von ihrer Umgebung abhängig sind und in der Folge der Variation unterliegen. Sehr gute Ergebnisse werden jedoch erhalten, indem geladenen Resten, unabhängig von ihrem tatsächlichen Wert, spezifische pK-Annäherungswerte zugeteilt werden. Es ist auch möglich, differenziertere Berechnungen durchzuführen, in denen die Umgebung teilweise mit in Betracht gezogen wird.
Der pI₀-Wert kann auch experimentell durch isoelektrische Fokussierung oder durch Titration einer Enzym enthaltende Lösung ermittelt werden. Die verschiedenen pK-Werte für die geladenen Reste können auch experimentell durch Titration ermittelt werden.
Industrielle Anwendungen von Subtilisinen
Es wurde festgestellt, dass Proteasen, wie Subtilisine, einen großen industriellen Nutzen besitzen, insbesondere in Waschmittelformulierungen, da sie zur Entfernung proteinhaltiger Verfärbungen geeignet sind.
Derzeit sind die nachfolgenden Proteasen bekannt und sie werden in großen Mengen in viele Länder der Welt verkauft.
Subtilisin BPN' oder Novo ist z. B. von SIGMA, St. Louis, USA verfügbar.
Subtilisin Carlsberg wird von Novo-Nordisk a/s (Dänemark) als ALCALASE^® und von IBIS (Holland) als MAXATASE^® vertrieben;
ein Bacillus lentus-Subtilisin wird von NOVO INDUSTRI A/S (Dänemark) als SAVINASE^® vertrieben;
Enzyme, die SAVINASE sehr ähnlich sind, wie MAXACAL^®, werden von IBIS vertrieben, und OPTICLEAN^® wird von MILES KALI CHEMIE (BRD) vertrieben;
ein Bacillus lentus-Subtilisin wird von Novo-Nordisk a/s (Dänemark) als ESPERASE^® vertrieben;
KAZUSASE^® wird von SHOWA DENKO (Japan) vertrieben.
Um wirksam zu sein, müssen derartige Enzyme jedoch nicht nur unter Waschbedingungen Aktivität aufweisen, sondern sie müssen auch mit anderen Waschmittelbestandteilen während der Herstellung und Lagerung der Waschmittel verträglich sein.
Subtilisine können beispielsweise in Kombination mit anderen Enzyme, die gegen andere Substrate wirksam sind, verwendet werden, und das ausgewählte Subtilisin sollte gegenüber derartigen, Enzymen stabil sein, und das ausgewählte Subtilisin sollte vorzugsweise auch nicht den Abbau der anderen Enzyme katalysieren. Das ausgewählte Subtilisin sollte auch gegen der Wirkung anderer in der Waschmittelformulierung vorhandener Bestandteile resistent sein, wie gegen Bleichmitteln, Oxidationsmittel usw., insbesondere sollte ein in Waschmittelformulierungen zu verwendendes Enzym im Hinblick auf die Oxidationskraft, die Calcium-bindenden Eigenschaften und die pH- Bedingungen stabil sein, die durch nicht-enzymatische Bestandteile in dem Waschmittel während der Lagerung und in der Waschlösung während des Waschvorgangs erbracht werden.
Die Fähigkeit eines Enzyms, den Abbau verschiedener natürlich vorkommender Substrate, die auf den zu reinigenden Gegenständen vorhanden sind, z. B. während eines Waschvorgangs zu katalysieren, wird häufig als seine Waschfähigkeit, Waschkraft, Reinigungswirkung oder sein Waschverhalten bezeichnet. In der vorliegenden Erfindung wird zur Beschreibung dieser Eigenschaft der Begriff Waschverhalten verwendet.
Es ist festgestellt worden, dass natürlich vorkommende Subtilisine Eigenschaften besitzen, die in Bezug auf ihre Waschkraft oder -fähigkeit sehr variabel sind, wenn Variationen von Parametern, wie die des pH-Werts, erfolgen. Mehrere der vorstehenden kommerziell verfügbaren Waschmittelproteasen weisen in der Tat ein besseres Verhalten als diejenigen auf, die etwa 20 Jahre zuvor vertrieben wurden, jedes Enzym benötigt jedoch für ein optimales Verhalten seine eigenen spezifischen Bedingungen hinsichtlich der Formulierung und den Waschbedingungen, z. B. pH-Wert, Temperatur, Ionenstärke (= I), Wirksystem (Tenside, oberflächenaktive Mittel, Bleichmittel, usw.), Builder, usw..
Daher wird festgestellt, dass ein Enzym, das bei einem geringen pH-Wert und einer geringen I die gewünschten Eigenschaften aufweist, unter mehr alkalischen Bedingungen und hoher I weniger bevorzugt ist, oder dass ein Enzym, das gute Eigenschaften bei hohem pH und hoher I aufweist, unter den Bedingungen eines geringen pH-Werts und einer geringen I weniger bevorzugt ist.
Der Beginn und die Entwicklung rekombinanter DNA-Verfahren hatten einen tiefgreifenden Einfluss auf das Gebiet der Proteinchemie.
Es ist vorstellbar geworden, dass es durch diese Verfahren möglich sein wird, Peptide und Proteine, wie Enzyme und Hormone, gemäß den gewünschten Spezifizierungen zu gestalten, wo durch die Herstellung von Verbindungen ermöglicht wird, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen.
Es ist jetzt möglich, Enzyme mit gewünschten Aminosäuresequenzen zu konstruieren, und wie vorstehend ausgeführt, wurde der Gestaltung von Subtilisinen mit veränderten Eigenschaften angemessene Forschungsarbeit gewidmet. Von den Vorschlägen entspricht das Verfahren zur Herstellung und zum Durchmustern einer großen Anzahl mutierter Enzyme, wie es in EP 130756 (GENENTECH) ( US 4760025 (GENENCOR)) und WO 87/05050 (GENEX) beschrieben ist, den klassischen Verfahren zum Isolieren nativer Enzyme und zum Durchmustern hinsichtlich ihrer Eigenschaften, es ist jedoch infolge der gegenwärtigen Kenntnis einer großen Anzahl verschiedener mutierter Enzyme wirksamer.
Da ein Subtilisin-Enzym typischerweise 275 Aminosäurereste umfasst, von denen jeder einer von den 20 möglichen natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann, ist ein äußerst beträchtlicher Nachteil dieses Verfahrens die sehr große Anzahl an erzeugten Mutationen, die vor der weiteren Testung der ausgewählten Mutanten mit den interessierenden Eigenschaften in dem ersten Durchmusterungsschritt durch ein vorausgehendes Durchmustern bestimmt werden müssen, da es keine Richtlinie gibt, anhand der bestimmt werden kann, welcher Aminosäurerest auszutauschen ist, um das gewünschte Enzym mit verbesserten Eigenschaften für die in Frage kommende Anwendung zu erhalten, wie in diesem Fall zur Formulierung von Waschmittelzusammensetzungen, die ein verbessertes Waschverhalten unter den spezifizierten Bedingungen der Waschflüssigkeit aufweisen.
Ein in dieser Erfindung aufgeführtes Verfahren wird daher nur geringfügig besser sein, als die herkömmlichen zufälligen Mutationsverfahren, die seit vielen Jahren bekannt sind.
Die anderen bekannten Verfahren betreffen die Veränderung spezifischer Eigenschaften, wie die Transveresterungs- und Hydrolysegeschwindigkeit ( EP 260105 (GENENCOR)), das pH-Aktivitätsprofil (Thomas, Russell und Fersht, vorstehend) und die Substratspezifität (WO 88/07578 (GENENTECH)). Keine dieser Veröffentlichungen betrifft die Veränderung des Waschverhaltens von Enzymen.
Ein weiteres Verfahren, das entwickelt wurde, betrifft die Anwendung genauer Informationen bezüglich der dreidimensionalen Proteinstruktur zum Analysieren der potenziellen Konsequenzen der Substitution bestimmter Aminosäuren. Dieses Verfahren ist angewendet worden und in EP 260105 (GENENCOR), WO 88/07578 (GENENTECH), WO 88/08028 (GENEX), WO 88/08033 (AMGEN) und WO 88/08164 (GENEX) beschrieben.
Somit ist, wie vorstehend gekennzeichnet, bislang keine Beziehung zwischen den gut definierten Eigenschaften eines Enzyms, wie jenen vorstehend erwähnten, und dem Waschverhalten eines Enzyms identifiziert worden.
In der unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DK88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) wird vorgeschlagen, das Konzept des Homologievergleichs anzuwenden, um zu bestimmen, welche Aminosäure-Positionen für die Mutation ausgewählt werden sollten und welche Aminosäuren in diesen Positionen substituiert werden sollten, um eine gewünschte Veränderung im Waschverhalten zu erhalten.
Durch die Anwendung eines derartigen Verfahrens verringert sich die Problematik des Durchmusterns drastisch, da die Zahl der erzeugten Mutanten sehr viel kleiner ist, dieses Verfahren sieht jedoch nur vor, dass Enzyme, die die kombinierten nützlichen Eigenschaften des Stammenzyms aufweisen und die in dem Vergleich verwendeten Enzyme erhalten werden können.
Das Problem scheint zu sein, dass trotz der umfangreichen Forschungsarbeit, die auf die Aufklärung des Mechanismus der Enzymwirkung gerichtet ist, noch immer wenig über die Faktoren bezüglich der Struktur und der Kombination der Aminosäurereste bekannt ist, die die Eigenschaften der Enzyme in Bezug auf ihr Waschverhalten bestimmen.
Daher gibt es Bedarf für weitere Verbesserungen und für ein passendes Zuschneiden von Enzymen auf Waschsysteme, und es ist auch erforderlich, den Wirkmechanismus von Proteasen bei ihre praktischen Verwendung in Reinigungs- oder Waschmittelzusammensetzungen besser zu verstehen. Das könnte zu Richtlinien führen, die auf die Auswahl von Mutationen angewendet werden könnten, und die mit einem angemessenen Grad an Bestimmtheit zu einem Enzym führen, das unter speziellen Bedingungen in einer Waschflüssigkeit ein verbessertes Waschverhalten zeigt.
Kurzdarstellung der Erfindung
Durch weitere Untersuchungen hinsichtlich dieser Problematik ist jetzt überraschenderweise festgestellt worden, dass einer der kritischen Faktoren bei der Verwendung von Subtilisin-Enzymen in Waschmittelzusammensetzungen die Adsorption des Enzyms an das Substrat ist, d. h. an das von den Textilien zu entfernende Material, an harte Oberflächen oder an zu reinigende Materialien.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung Mutationen des Subtilisin-Gens, die zu veränderten Eigenschaften der Subtilisin-Enzymmutante, welche durch ein derartiges mutiertes Gen exprimiert wird, führen, wodurch die Subtilisin-Enzymmutante ein verbessertes Verhalten in Waschmittelzusammensetzungen aufweist. Mutationen werden in spezifischen Nucleinsäuren in dem Subtilisin-Stammgen erzeugt, das für die Expression spezifischer Aminosäuren in spezifischen Positionen in dem Subtilisin-Enzym verantwortlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Auswählen der Positionen und der zu mutierenden Aminosäuren und damit mutatis mutandis die zu verändernde Aminosäure in dem in Frage kommenden Subtilisin Gen.
Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil Mutationen von Subtilisin 309 und Subtilisin Carlsberg Genen, obwohl sie nicht darauf beschränkt ist und sie liefert die daraus folgenden Subtilisin 309- und Subtilisin Carlsberg-Enzyme, die in verschiedenen Waschmittelzusammensetzungen ein verbessertes Waschverhalten aufweisen, was zu Waschflüssigkeiten mit variierenden pH-Werten führt.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Enzymmutanten in Reinigungszusammensetzungen und Reinigungszusammensetzungen, die die Enzymmutanten umfassen, insbesondere Waschmittelzusammensetzungen, die die Subtilisin-Enzymmutanten umfassen.
Abkürzungen
Aminosäuren

A = Ala = Alanin
V = Val = Valin
L = Leu = Leucin
I = Ile = Isoleucin
P = Pro = Prolin
F = Phe = Phenylalanin
W = Trp = Tryptophan
M = Met = Methionin
G = Gly = Glycin
S = Ser = Serin
T = Thr = Threonin
C = Cys = Cystein
Y = Tyr = Tyrosin
N = Asn = Asparagin
Q = Gln = Glutamin
D = Asp = Asparaginsäure
E = Glu = Glutaminsäure
K = Lys = Lysin
R = Arg = Arginin
H = His = Histidin

Nucleinsäurebasen

A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin (nur in DNA)
U = Uracil (nur in RNA)

Mutationen
Bei der Beschreibung der verschiedenen Mutanten, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt oder in Betracht gezogen werden, wird die nachfolgende Nomenklatur zum leichteren Verständnis der Bezüge angewendet:
Ursprüngliche Position(en) der Aminosäure(n)-substituierte(n) Aminosäure(n)
Demgemäß wird die Substitution von Glutaminsäure durch Glycin in Position 195 bezeichnet als:
Gly 195 Glu oder G195E
eine Deletion von Glycin in der gleichen Position ist:
Gly 195 * oder G195*
und eine Insertion eines zusätzlichen Aminosäurerestes, wie Lysin, ist:
Gly 195 GlyLys oder G195GK
Liegt eine Deletion, wie in Tabelle I gekennzeichnet, vor oder ist sie in einem nicht in Tabelle I ausgewiesenen Subtilisin vorhanden, wird eine Insertion in einer derartigen Position, wie folgt gekennzeichnet:
* 36 Asp oder *36D
für die Insertion einer Asparaginsäure in Position 36.

Multiple Mutationen werden durch ein Pluszeichen extra gekennzeichnet, d. h.:
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu oder R170Y + G195E
wodurch Mutationen in den Positionen 170 und 195 dargestellt werden, die Tyrosin und Glutaminsäure durch Arginin bzw. Glycin ersetzen. Tabelle I Vergleich der Aminosäuresequenz für verschiedenen Proteasen

a =	Subtilisin BPN' (Wells et al., 1983, vorstehend)
b =	Subtilisin amylosacchariticus (Kurihara et al., 1972, vorstehend)
c =	Subtilisin 168 (Stahl and Ferrari, 1984, vorstehend)
d =	Subtilisin mesentericopeptidase (Svendsen et al., 1986, vorstehend)

e =	Subtilisin DY (Nedkov et al., 1985, vorstehend)
f =	Subtilisin Carlsberg (Smith et al., 1968, vorstehend)
g =	Subtilisin Carlsberg (Jacobs et al., 1985, vorstehend)
h =	Subtilisin 309 (Internationale Patentanmeldung PCT/DK 88/00002)
i =	Subtilisin 147 (Internationale Patentanmeldung PCT/DK 88/00002)
j =	Thermitase (Meloun et al., 1985, vorstehend)
k =	Proteinase K (Betzel et al., 1988, Eur. J. Biochem. 178: 155 ff.), und Gunkel et al., 1989, Eur. J. Biochem. 179: 185 ff.)
l =	Aqualysin (Kwon et al., 1988, Eur. J. Biochem. 173: 491 ff.)
m =	Bacillus PB92 Protease ( EP 0283075 )
n =	Protease TW7 (Tritirachium album)(Internationale Patentanmeldung PCT/US88/01040)
o =	Protease TW3 (Tritirachium album)(Internationale Patentanmeldung PCT/US88/01040)
* =	kennzeichnet eine Deletion

Tabelle I Fortsetzung
Tabelle I Fortsetzung
Tabelle I Fortsetzung
Tabelle I Fortsetzung
Tabelle I Fortsetzung
Tabelle I Fortsetzung
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird des weiteren genauer in den nachfolgenden Teilen dieser Beschreibung in Bezug auf die Zeichnungen beschrieben, worin:
1 die Konstruktion von Plasmid pSX88 darstellt,
2 die Restriktionskarte von Plasmid pSX88 darstellt,
3 die Konstruktion der Subtilisin 309-Genmutanten zur Expression der Enzyme der vorliegenden Erfindung veranschaulicht,
4 die Restriktionskarte von Plasmid pSX92 darstellt, und
5 die Beziehung zwischen dem pH-Wert des Verhaltensmaximums und dem berechneten pI-Wert der Enzymmutanten der vorliegenden Erfindung grafisch darstellt.
Vorstehend wurde ausgeführt, dass die vorliegende Erfindung mutierte Subtilisine betrifft, in denen die Aminosäuresequenz durch die Mutation des Gens des zu modifizierenden Subtilisin-Enzyms verändert worden ist, in Kodons, die für die Expression von Aminosäuren verantwortlich sind, die sich auf oder nahe der Oberfläche des entstehenden Enzyms befinden.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird ein Subtilisin als eine Serinprotease definiert, die durch grampositive Bakterien oder durch Pilze erzeugt wird. Im engeren Sinne und anwendbar auf viele Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bedeutet Subtilisin auch eine Serinprotease von grampositiven Bakterien. Gemäß einer anderen Definition ist ein Subtilisin eine Serinprotease, in der die relative Reihenfolge der Aminosäurereste in der katalytischen Triade Asp-His-Ser (Positionen 32, 64 und 221) beträgt. In einem noch spezifischeren Sinn betreffen viele der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Serinproteasen von grampositiven Bakterien, wobei die in der vorstehenden Tabelle I aufgeführten Subtilisine hinsichtlich ihrer Struktur in eine im Wesentlichen eindeutige homologe Form übertragen werden können.
Unter Anwendung des Nummerierungssystems, das sich von der Aminosäuresequenz von Subtilisin BPN' ableitet, welches in der vorstehenden Tabelle I dargestellt ist und das mit der Aminosäuresequenz einer Vielzahl anderer bekannter Subtilisine abgestimmt ist, ist es möglich, die Position eines Aminosäurerestes in einem Subtilisin-Enzym eindeutig zu kennzeichnen. Positionen, die sich in Subtilisin BPN' vor dem Aminosäurerest Nummer 1 befinden, wird eine negative Zahl zugeordnet, wie -6 für das N-terminale Y in Thermitase, oder 0 wie für das N-terminale A in Proteinase K. Aminosäurereste, die in Bezug auf Subtilisin BPN'-Insertionen sind, werden nummeriert, indem der vorhergehenden Zahl von Subtilisin BPN' Buchstaben in alphabetischer Reihenfolge hinzugefügt werden, wie 12a, 12b, 12c, 12d, 12e für das "Insert" S-T-S-P-G in Proteinase K zwischen ¹²Ser und ¹³Thr.
Isoelektrischer Punkt (pI₀)
In der Annahme, dass das Substrat unter Waschbedingungen eine dem Enzym entgegengesetzte elektrostatische Ladung besitzt, kann erwartet werden, dass die Adsorption und somit das Waschverhalten des Enzyms hinsichtlich des Substrats verbes sert würde, indem die elektrostatische Netto-Ladung, NEC, des Enzyms erhöht wird.
Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, dass eine Abnahme der NEC des Enzyms unter derartigen Umständen zu einem verbesserten Waschverhalten des Enzyms führt.
Anders ausgedrückt, es wurde festgestellt, dass die Veränderung des isoelektrischen Punkts pI₀ des Enzyms in Richtung eines geringen pH-Werts gleichfalls den pH-Wert des optimalen Waschverhaltens des Enzyms zu einem geringeren Wert verschiebt, was bedeutet, dass für die Gestaltung eines Enzyms für eine Waschflüssigkeit mit einem geringen pH-Wert, in der das Enzym aktiv ist, Verbesserungen des Waschverhaltens eines bekannten Subtilisin-Enzyms erreicht werden können, indem das Gen für das bekannte Subtilisin-Enzym zur Gewinnung einer Enzymmutante mit einem geringen pI₀ mutiert wird.
Dieses Ergebnis führte zu Versuchen, die zeigen, dass das Gegenteil ebenfalls möglich ist. Das bedeutet, dass ein bekanntes Subtilisin-Enzym auch für die Verwendung in Waschmitteln mit hohem pH-Wert gestaltet werden kann, indem sein pI₀ zu höheren Werten verschoben wird, wodurch das pH-Optimum des Waschverhaltens für das Enzym zu höheren pH-Werten verschoben wird.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung hinsichtlich eines Aspekts eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung, umfassend eine mutierte Subtilisinprotease, wobei die molekulare elektrostatische Netto-Ladung der Protease im Vergleich zu der Stammprotease bei dem gleichen pH-Wert so geändert wurde, dass es in der Protease im Verhältnis zu der Stammprotease weniger oder mehr positiv geladenen Aminosäurerest(e) und/oder mehr oder weniger negativ geladene Aminosäurerest(e) gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation unter den Aminosäureresten an beliebigen von einer oder mehreren Positionen 1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 27, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 272 durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach) benachbart zu den ausgewiesenen Positionen bewirkt wird, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine mutierte Subtilisinprotease darstellt, umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus den Reihen S005, S011, S012, S013, S014, S018, S022, S024, S204 worin:

S005)	K251E
S011)	R170Y + K251E
S012)	R170Y + G195E + K251E
S013)	T71D + R170Y + K251E
S014)	T71D + R170Y + G195E + K251E
S018)	G195E + K251E
S022)	*36D + R170Y + G195E + K251E
S024)	*36D + H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E
S204)	H120D + G195E + K235L + K251E,

wobei die Subtilisinprotease einen isoelektrischen pH-Wert (pI₀) unterhalb von jenem der Stammprotease aufweist.

Hinsichtlich dieser Aspekte betrifft die vorliegende Erfindung kurz dargestellt Proteasemutanten, in denen der pI₀ der Proteasemutante unterhalb des pI₀ der Stammprotease liegt, und in denen der pH-Wert für ein optimales Waschverhalten ebenfalls unterhalb des pH-Optimums der Stammprotease liegt.
Im Allgemeinen wird angenommen (Thomas, Russell und Fersht, vorstehend), dass die kinetischen Eigenschaften durch Veränderungen in der elektrostatischen Oberflächenladung nahe der aktiven Stelle in dem Enzym beeinflusst werden können, jetzt wurde jedoch überraschenderweise festgestellt, dass Veränderungen der kinetischen Eigenschaften eines Enzyms auch durch die Modifizierung der Oberflächenladungen, die sich entfernt von der aktiven Stelle befinden, erreicht werden.
Folglich umfasst die vorliegende Erfindung auch Subtilisin-Enzymmutanten, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste in einem Abstand von mehr als 15 Å von der katalytischen Triade des Enzyms im Vergleich zu der Aminosäuresequenz ihres Stammenzyms verändert worden sind, und in einer Weise, die eine Proteasemutante liefert, deren isoelektrischer Punkt (= pI₀) in die gleiche Richtung verschoben wurde, wie es für eine Verschiebung des pH-Werts für ein optimales Waschverhalten des Enzyms ist gewünscht, dessen pH-Optimum so nahe wie möglich an dem pH-Wert der Waschflüssigkeit, für die die Proteasemutante verwendet werden soll, liegen sollte.
Gemäß mehreren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden Proteasemutanten und die diese enthalten Waschmittelzusammensetzungen bereitgestellt, wobei die Aminosäuresequenz der Proteasemutante eine Insertionsmutation an Position 36 enthält, beispielsweise zum Einführen eines negativ geladenen Aminosäurerestes (z. B. D oder E) oder eines neutralen polaren Restes (wie A, Q oder N) oder eines positiven Aminosäurerestes wie R oder K.
Dies ist insbesondere auf die Subtilisinproteasen 309 und 147 und PB92 und auf jede beliebige andere Sequenz, die eine derartige Homologie aufweist, dass sie in ihrer natürlichen Form an Position 36 keinen Aminosäurerest besitzt, bezogen auf die Sequenz von Subtilisin BPN', anwendbar.
Insertionsmutanten an Position 36 können weitere Mutationen enthalten, beispielsweise an einer oder mehreren der Positionen 120, 170, 195, 235, und/oder 251, und/oder an Position 76.
Geeignete Mutationen an Position 76 sind z. B, negativ geladenen Reste wie N76D oder N76E.
Mutationen an Position 36 (insbesondere die Insertion eines negativen oder polaren neutralen Restes) und an Position 76 (Subsitution durch einen negativ geladenen Rest) können häufig eine stabilisierende Wirkung auf die Proteasemutante haben, und sie können in Kombination verwendet werden. Es ist festgestellt worden, dass Mutationen an beispielsweise einer oder mehreren der Positionen 120, 170, 195, 235 und 251 mit einer erhöhten Enzymaktivität assoziiert sind. Sogar in Fällen, in denen diese späteren Mutationen individuell mit einem geringen Verlust an Stabilität verbunden sind, können sie annehmbar sein und es ist sinnvoll, sie mit Mutationen an einer oder beiden der Positionen 36 und 76 zu kombinieren.
Innerhalb geeigneter Beispiele derartiger Proteasemutanten sind diejenigen, die die nachfolgenden Mutationen aufweisen:

S022) *36D + R170Y + G195E + K251E

S024) *36D + H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E
Unter einigen Bedingungen kann es von Vorteil sein, eine Proteasemutante, in der eine Insertion eines negativen Restes an Position 36 vorliegt, mit einer weiteren Mutation auszustatten, zum Einfügen einer positiven Ladung an einer anderen Stelle in dem Molekül. Dadurch kann die Wasserlöslichkeit der entstehenden Proteinasemutante erhöht werden, wenn z. B. die weitere Mutation eine positive Ladung liefert, z. B. einen positiv geladenen Rest an Position 213, z. B. T213K.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es weiterhin bevorzugt, dass die Subtilisin-Enzymmutante eine Mutation eines Stammenzyms, ausgewählt aus Subtilisin BPN', Subtilisin amylosacchariticus, Subtilisin 168, Subtilisin mesentericopeptidase, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin 309, Subtilisin 147, Thermitase, Bacillus PB92-Protease, und Proteinase K, vorzugsweise Subtilisin 309, Subtilisin 147, Subtilisin Carlsberg, Aqualysin, Bacillus PB92-Protease, Protease TW7, oder Protease TW3, darstellt.
Hinsichtlich eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung werden die vorstehenden Beobachtungen bezüglich des pI₀ des weiteren in einem Verfahren zum Bestimmen oder Auswählen der Position(en) und der in dem Stammenzym zu deletierenden, substituierenden oder einzufügenden Aminosäure(n) angewendet, wobei das Auswählen derart erfolgt, dass die elektrostatische Netto-Ladung (= NEC) in der entstehenden Enzymmutante im Vergleich zu der NEC in dem Stammenzym der Wahl, die bei dem gleichen pH-Wert berechnet wurde, verändert wird.
Ein anderer Weg, das durch die vorliegende Erfindung abgedeckte Prinzip auszudrücken, ist, dass die Position(en) und der/die in dem Stammenzym zu deletierende(n), substituierende(n) oder inserierende(n) Aminosäure(n) derart ausgewählt wird/werden, dass die Gesamtzahl der Ladung oder die Gesamtladung (= TTC), und/oder die NEC in einer entstehenden Enzymmutante so verändert wird, dass eine Proteasemutante wird, deren isoelektrischer Punkt (= pI₀) in die gleiche Richtung verschoben wurde, wie es für eine Verschiebung des pH-Werts für ein optimales Waschverhalten des Enzyms gewünscht ist, dessen pH-Optimum so nahe wie möglich an dem pH-Wert der Waschflüssigkeit, für die die Proteasemutante verwendet werden soll, liegen sollte.
Wie vorstehend ausgewiesen, ist der pI₀ eines Makromoleküls, wie eines Enzyms, der pH-Wert, an dem die NEC des Moleküls gleich Null ist. Das Verfahren wird in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, die Prinzipien sind jedoch in diesem Teil genauer beschrieben.
Jedem potenziell geladenen Aminosäurerest werden pK-Werte zugeordnet. Anschließend wird das Verhältnis des Auftretens eines Aminosäurerestes bei einem vorgegebenen pH-Wert in geladener oder ungeladener Form (geladen/ungeladen, C/U(i)) sowohl für die negative als auch die positive Ladung unter Anwendung der Formeln Ia und Ib berechnet: C/U(i) = exp(ln10(pH – pKi)) (negative Ladung) (Ia)bzw. C/U(i) = exp(ln10(pKi – pH)) (positive Ladung) (Ib)
Aus den Formeln Ia und Ib ist ersichtlich, dass der pH gleich dem pKi ist, C/U (i) ist gleich 1.
Anschließend wird die relative Ladung, Qr(i), oder die Ladung, die jedem geladenen Rest zugeteilt ist, unter Anwendung der Formeln IIa und IIb berechnet: Qr(i) = C/U(i)/(1 + C/U(i)) (negative Ladung) (IIa) Qr(i) = –C/U(i)/(1 + C/U(i)) (positive Ladung) (IIb)
Der pH-Wert, an dem die Summe aller Ladungen aus den geladenen Resten gleich Null ist, wird durch Iteration oder durch Interpolieren einer geeigneten Summentabelle der pH-Ladungsdichte bestimmt.
Waschmittelzusammensetzungen, umfassend die Enzymmutanten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der Enzymmutanten der vorliegenden Erfindung in Reinigungs- und Waschmittelzusammensetzungen und eine derartige Zusammensetzung, umfassend die Subtilisin-Enzymmutanten.
Derartige Zusammensetzungen umfassen zusätzlich zu einer oder mehreren Subtilisin-Enzymmutanten gemäß jedem der vorhergehenden Ansprüche der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination jeden beliebigen der üblichen Bestandteile, die in derartige Zusammensetzungen eingeschlossen sind und die dem Fachmann gut bekannt sind.
Derartige Bestandteile umfassen Builder, wie Phosphat- oder Zeolithbuilder, Tenside, wie anionische, kationische oder nichtionische Tenside, Polymere, wie Acryl- oder äquivalente Polymere, Perborat- oder Amino-enthaltende Bleichmittelvorstufen oder -aktivatoren, Strukturierungsmittel, wie Silicat-Strukturierungsmittel, Alkali oder Säuren zum Einstellen des pH-Wert, Feuchthaltemittel und/oder neutrale anorganische Salze.
In mehreren geeigneten Ausführungsformen können die Waschmittelzusammensetzungen wie nachfolgend formuliert sein:

a) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschpulver, enthaltend Phosphatbuilder, anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Acryl- oder äquivalentes Polymer, Perboratbleichmittelvorstufe, Amino-enthaltender Bleichmittelaktivator, Silicat- oder anderes Strukturierungsmittel, Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutrales anorganisches Salz.
b) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschpulver, enthaltend Zeolithbuilder, anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Acryl- oder äquivalentes Polymer, Perboratbleichmittelvorstufe, Amino-enthaltenden Bleichmittelaktivator, Silicat- oder anderes Strukturierungsmittel, Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutrales anorganisches Salz.
c) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als eine wässrige Waschmittelflüssigkeit, umfassend anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Feuchthaltemittel, organische Säure, basisches Alkali, mit einem pH, eingestellt auf einen Wert zwischen 9 und 10.
d) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als eine nichtwässrige Waschmittelflüssigkeit, umfassend ein flüssiges nichtionisches Tensid, bestehend im Wesentlichen aus linearem alkoxyliertem primärem Alkohol, Triacetin, Natriumtriphosphat, basisches Alkali, Perboratmonohydratbleichmittelvorstufe, und einen tertiären Amin-bleichmittelaktivator, mit einem pH, eingestellt auf einen Wert zwischen 9 und 10.
e) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschpulver in Form von Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 550 g/l, z. B. mindestens 600 g/l, enthaltend anionische und nichtionische Tenside, z. B. anionisches Tensid und ein Gemisch von nichtionischen Tensiden mit entsprechenden Alkoxylierungsgraden von etwa 7 und etwa 3, gering oder im Wesentlichen Nullneu-trales anorganisches Salz, Phosphatbuilder, Perbo ratbleichmittelvorstufe, tertiären Aminbleichmittelaktivator, Natriumsilicat, und geringfügige Zusätze und Feuchtigkeit.
f) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschpulver in Form von Granulat mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, enthaltend anionisches Tensid und ein Gemisch von nichtionischen Tensiden mit entsprechenden Alkoxylierungsgraden von etwa 7 und etwa 3, gering oder im Wesentlichen Null-neutrales anorganisches Salz, Zeolithbuilder, Perboratbleichmittelvorstufe, tertiären Aminbleichmittelaktivator, Natriumsilicat, und geringfügige Zusätze und Feuchtigkeit.
g) Eine Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschpulver, enthaltend anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Acryl-Polymer, Fettsäureseife, Natriumcarbonat, Natriumsulfat, Tonpartikel mit oder ohne Amine, Perboratbleichmittelvorstufe, tertiären Aminbleichmittelaktivator, Natriumsilikat, und geringfügige Zusätze und Feuchtigkeit.
h) Waschmittelzusammensetzung, formuliert als ein Waschmittel(Seifen)riegel, enthaltend Seife, die auf einem in einem Seifensiedekessel verseiften (pan-saponified) Gemisch von Talg- und Kokosnussöl basiert, neutralisiert mit Orthophosphorsäure, gemischt mit Protease, auch vermischt mit Natriumformiat, Borax, Propylenglycol und Natriumsulfat, und anschließend stranggepresst auf einer Seifenherstellungsstraße.
j) Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung, derart formuliert, dass sie in der Waschflüssigkeit einen pH-Wert von 9 oder weniger liefert, wenn sie in einer Menge verwendet wird, die 0,4–0,8 g/l Tensid entspricht.
k) Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung, derart formuliert, dass sie in der Waschflüssigkeit einen pH-Wert von 8,5 oder mehr liefert, wenn sie in einer Menge verwendet wird, die 0,4–0,8 g/l Tensid entspricht.
l) Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung, derart formuliert, dass sie in der Waschflüssigkeit eine Ionenstärke von 0,03 oder weniger liefert, z. B. 0,02 oder weniger, wenn sie in einer Menge verwendet wird, die 0,4–0,8 g/l Tensid entspricht.
m) Eine enzymatische Waschmittelzusammensetzung, derart formuliert, dass sie in der Waschflüssigkeit eine Ionenstärke von 0,01 oder mehr liefert, z. B. 0,02 oder mehr, wenn sie in einer Menge verwendet wird, die 0,4–0,8 g/l Tensid entspricht.

Waschmittelzusammensetzung, umfassend Enzymmutanten in Kombination mit Lipase
Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass eine Abnahme des isoelektrischen Punkts pI und damit der Netto-Ladung einer Protease des Subtilisin-Typs unter Waschbedingungen nicht nur zu einem verbesserten Waschverhalten des Enzyms führen kann, sondern auch zu einer besseren Verträglichkeit mit Lipase.
Überraschenderweise ist auch festgestellt worden, dass die Verträglichkeit von Protease mit Lipase nicht nur durch den pI beeinflusst wird, sondern auch durch die Positionen, an denen sich die Ladungen befinden, in Bezug auf die aktive Stelle der Protease: Das Einführen einer negativen Ladung oder das Entfernen einer positiven Ladung in der Nähe der aktiven Stelle führt zu einer stärkeren Verbesserung der Verträglichkeit der Protease mit der Lipase.
Demgemäß liefern bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enzymatische Waschmittelzusammensetzungen, umfassend Lipase und ebenfalls umfassend mutierte Subtilisinprotease, worin die molekulare elektrostatische Netto-Ladung der mutierten Protease durch Insertion, Deletion oder Substitution eines Aminosäurerestes im Vergleich zu der Stammprotease verändert worden ist, und wobei es in der Protease im Vergleich zu der Stammprotease weniger positiv gela dene(n) Aminosäurerest(e) und/oder mehr negativ geladene(n) Aminosäurerest(e) gibt, wobei die Subtilisinprotease einen isoelektrischen Punkt (pI₀) aufweist, der unterhalb jenem der Stammprotease liegt.
Eine bevorzugte Klasse von Lipasen für eine derartige Anwendung stammt von gramnegativen Bakterien und schließt z. B. Lipase-Enzyme der Gruppen ein, die in EP 0205208 und EP 0206390 (beide von Unilever) definiert sind (durch diesen Hinweis in diese Erfindung aufgenommen), einschließlich Lipasen, die immunologisch mit denen aus bestimmten Ps. fluorescens, P. gladioli und Chromobacter-Stämmen verwandt sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Subtilisinprotease-Enzymmutante zur Verwendung in Verbindung mit Lipase wie vorstehend ausgeführt, besitzt eine oder mehrere Mutationen an der Stelle eines Aminosäurerestes, der sich in dem Bereich von etwa 15A–20A in Bezug auf die aktive Stelle befindet, insbesondere beispielsweise an den Positionen 170, 120 oder 195.
Die Lipase kann geeigneter Weise in Form einer granulierten Zusammensetzung (wahlweise eine Lösung oder eine Aufschlämmung) eines lipolytischen Enzyms mit einem Trägermaterial (z. B. wie in EP 258068 (Novo Nordisk A/S) und Savinase^® und Lipolase^® von Novo Nordisk A/S) zugesetzt werden.
Die zugesetzte Menge an Lipase kann innerhalb eines breiten Bereichs ausgewählt sein, beispielsweise 50 bis 30 000 LU/g pro Gramm des Tensidsystems oder der Waschmittelzusammensetzung, z. B. häufig mindestens 100 LU/g, vor allem mindestens 500 LU/g, manchmal vorzugsweise oberhalb 1000, oberhalb 2000 LU/g oder oberhalb 4000 LU/g oder mehr, sehr häufig im Bereich von 50–4000 LU/g und möglich im Bereich von 200–1000 LU/g. In dieser Beschreibung sind die Lipase-Einheiten wie in EP 258068 definiert.
Das lipolytische Enzym kann aus einem breiten Bereich an Lipasen ausgewählt sein: insbesondere die Lipase, beschrieben in beispielsweise den nachfolgenden Patentbeschreibungen, EP 214761 (Novo Nordisk A/S), EP 0258068 und besonders Lipasen, die immunologische Kreuzreaktivität mit Antiseren zeigen, die gegen Lipase aus Thermomyces lanuginosus ATCC 22070 erzeugt wurden, EP 0205208 und EP 0206390 und insbesondere Lipasen, die immunologische Kreuzreaktivität mit Antiseren zeigen, die gegen Lipase aus Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL B-3673, oder gegen Lipase aus Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 und FERM-P 3783 erzeugt wurden, gleichfalls Lipasen, die in WO 87/00859 (Gist-Brocades) und EP 0204284 (Sapporo Breweries) beschrieben sind. Geeignet sind beispielsweise besonders die nachfolgenden kommerziell verfügbaren Lipase-Präparationen: Novo-Lipolase^®, die Amano-Lipasen CE, P, B, AP, M-AP, AML und CES, und die Meito-Lipasen MY-30, OF und PL, auch Esterase^® MM, Lipozym^®, SP225, SP285, Saiken-Lipase, Enzeco-Lipase, Toyo-Jozo-Lipase und Diosynth-Lipase (Handelsnamen).
Das genetische Erzeugen von Enzymen kann durch Extraktion eines geeigneten Lipase-Gens, z. B. des Gens für Lipase aus Thermomyces lanuginosus oder einer Mutante davon, und Einführen und Expression des Gens oder Derivats davon in einem zum Erzeugen geeigneten Organismus wie einem Aspergillus erreicht werden. Diese Verfahren in WO 88/02775 (Novo Nordisk A/S), EP 0243338 (Labofina), EP 0268452 (Genencor) und besonders können EP 0305216 (Novo Nordisk A/S) oder EP 0283075 (Gist-Brocades) angewendet und angepasst werden.
Ähnliche Betrachtungen verwenden mutatis mutandi im Fall anderer Enzyme, die auch vorliegen können. Ohne Einschränkung: Amylase kann, wenn vorhanden, beispielsweise in einer Menge im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 MU (Maltose-Einheiten) pro Gramm Waschmittelzusammensetzung verwendet werden (oder 0,014–1,4, z. B. 0,07–0,7, KNU/g (Novo-Einheiten)). Cellulase kann, wenn vorhanden, beispielsweise einer Menge im Bereich von etwa 0,3 bis etwa 35 CEVU-Einheiten pro Gramm Waschmittelzusammensetzung verwendet werden.
Die Waschmittelzusammensetzungen können des weiteren die nachfolgenden herkömmlichen Waschmittelbestandteile in den üb lichen Mengen einschließen. Sie können eingebaut oder nicht-eingebaut sein, und sie können diejenigen des Null-P-Typs sein (d. h. keine Phosphor-enthaltende Builder enthaltend). Somit kann die Zusammensetzung im Aggregat beispielsweise 1–50%, z. B. mindestens etwa 5% und häufig bis zu etwa 35–40% bezogen auf das Gewicht, an einem oder mehreren organischen und/oder anorganischen Buildern enthalten. Typische Beispiele derartiger Builder schließen diejenigen ein, die bereits vorstehend erwähnt wurden, und im weiteren Sinne schließen sie Alkalimetall-ortho-, -pyro- und -tripolyphosphate, Alkalimetallcarbonate, entweder allein oder in Beimengungen mit Calcit, Alkalimetallcitraten, Alkalimetallnitriltriacetaten, Carboxymethyloxysuccinaten, Zeolithen, Polyacetalcarboxylaten und so weiter ein.
Des weiteren können die Waschmittelzusammensetzungen 1–35% an einem Bleichmittel enthalten oder einer Bleichmittelvorstufe oder eines Systems, umfassend Bleichmittel und/oder Vorstufen mit Aktivatoren dafür. Weitere wahlweise Bestandteile sind Schaum-verstärkende Mittel, Schaum-unterdückende Mittel, Anti-Rostschutzmittel, Schmutz-suspendierende Mittel, Komplexbildner, Anti-Schmutz-ablagernde Mittel, Duftstoffe, Farbstoffe, stabilisierende Mittel für die Enzyme und so weiter.
Die Zusammensetzungen können zum Waschen von Textilien verwendet werden, insbesondere für Baumwolle und auf Polyester basierende Textilien und Gemischen davon, ohne auf diese beschränkt zu sein. Besonders geeignet sind beispielsweise Waschverfahren, die bei Temperaturen von etwa 60–65°C oder darunter, beispielsweise etwa 30–35°C oder darunter, durchgeführt werden. Es kann sehr günstig sein, die Zusammensetzungen in einer Menge zu verwenden, die geeignet ist z. B. etwa 0,4–0,8 g/l Tensid in der Waschflüssigkeit bereitzustellen, obwohl es natürlich auch möglich ist, geringere oder höhere Konzentrationen zu verwenden, wenn es gewünscht ist. Ohne Einschränkung kann beispielsweise festgelegt werden, dass eine Anwendungsmenge von etwa 3 g/l und bis zu 6 g/l der Waschmittelfor mulierung zur Verwendung geeignet ist, wenn die Formulierungen derart wie in den Beispielen sind.
Verfahren zum Erzeugen von Mutationen in Subtilisin-Genen
Auf dem Fachgebiet sind viele Verfahren zum Einführen von Mutationen in Gene bekannt. Nach einer kurzen Beschreibung der Klonierung von Subtilisin-Genen, werden Verfahren zum Erzeugen von Mutationen sowohl an zufälligen Stellen als auch an spezifischen Stellen innerhalb des Subtilisin-Gens beschrieben.
Klonierung eines Subtilisin-Gens
Das Subtilisin kodierende Gen kann aus jedem grampositiven Bakterium oder jedem Pilz durch die verschiedenen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren kloniert werden. Als erstes muss eine genomische und/oder cDNA-Library von DNA unter Verwendung von chromosomaler DNA oder Messenger-RNA aus dem Organismus, der das zu untersuchende Subtilisin erzeugt, konstruiert werden. Anschließend können, wenn die Aminosäuresequenz des Subtilisins bekannt ist, homologe, markierte Oligonucleotid-Sonden synthetisiert werden und zum Identifizieren von Subtilisin-kodierenden Klonen aus einer genomischen Library von bakterieller DNA oder aus einer fungalen cDNA-Library verwendet werden. Alternativ kann eine markierte Oligonucleotid-Sonde, enthaltend Sequenzen, die zu Subtilisin aus anderen Bakterienstämmen oder Pilzen homolog sind, als Sonde verwendet werden, um Subtilisin-kodierende Klone zu identifizieren, unter Anwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen von geringer Stringenz.
Ein anderes Verfahren zum Identifizieren von Subtilisinerzeugenden Klonen kann das Einführen von genomischen DNA-Fragmenten in einen Expressionsvektor, wie einem Plasmid, die Transformation eines Protease-negativen Bakteriums mit der entstehenden genomischen DNA-Library, und das anschließende Ausplattieren des transformierten Bakteriums auf Agar, enthaltend ein Substrat für Subtilisin, wie Magermilch, beeinhalten.
Die Bakterien, die das Subtilisin-tragende Plasmid enthalten, erzeugen Kolonien, die auf klarem Agar von einer Halo umgeben sind, infolge der Verdauung der Magermilch durch das exprimierte Subtilisin.
Erzeugen zufälliger Mutationen in dem Subtilisin-Gen
Ist das Subtilisin-Gen in einen geeigneten Vektor, wie einem Plasmid, kloniert worden, können mehrere Verfahren zum Einführen zufälliger Mutationen in das Gen verwendet werden.
Ein Verfahren kann sein, das klonierte Subtilisin-Gen als Teil eines wiederauffindbaren Vektors in einen Escherichia coli-Mutatorstamm einzubauen.
Ein anderes Verfahren kann das Erzeugen einer einsträngigen Form des Subtilisin-Gens einschließen, gefolgt von das Zusammenlagern (Annealing) des DNA-Fragments, das das Subtilisin-Gen enthält, mit einem anderen DNA-Fragment, derart, dass ein Teil des Subtilisin-Gens einsträngig verbleibt. Diese diskrete, einsträngige Region kann anschließend jedem beliebigen einer Vielzahl mutagenisierenden Mittel ausgesetzt werden, einschließlich Natriumbisulfit, Hydroxylamin, salpetriger Säure, Ameisensäure oder Hydrazalin, jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein spezielles Beispiel dieses Verfahrens zum Erzeugen zufälliger Mutationen ist von Shortle und Nathan beschrieben worden (1978, Proc. Acad. Sci. USA, 75: 2170–2174). Gemäß dem Verfahren von Shortle und Nathan kann das Plasmid, das das Subtilisin-Gen trägt, durch ein Restriktionsenzym, das innerhalb des Gens schneidet, eingekerbt werden. Diese Einkerbung kann unter Nutzung der Exonuclease-Wirkung von DNA-Polymerase I zu einer Lücke erweitert werden. Die entstehende einsträngige Lücke kann anschließend mit einem der vorstehend erwähnten mutagenisierenden Mittel mutagenisiert werden.
Alternativ kann das Subtilisin-Gen von einer Bacillus-Spezies einschließlich des natürlichen Promotors und anderer Kontrollsequenzen in einen Plasmidvektor kloniert werden, der Replikone sowohl für E. coli als auch für B. subtilis, einen selektierbaren phenotypischen Marker und den M13-Replikationsursprung zum Erzeugen einer einsträngigen Plasmid-DNA nach der Superinfektion mit der Helfer-Phage IR1 enthält. Einsträngige Plasmid-DNA, die das klonierte Subtilisin-Gen enthält, wird isoliert und mit einem DNA-Fragment zusammengelagert (Annealing), das Vektorsequenzen enthält, jedoch nicht die kodierende Region von Subtilisin, was zu einem Lücken-enthaltenden Duplex-Molekül führt. Mutationen werden in das Subtilisin-Gen entweder mit Natriumbisulfit, salpetriger Säure oder Ameisensäure eingeführt oder durch Replikation in einem Mutator-Stamm von E. coli wie vorstehend beschrieben. Da Natriumbisulfit in einer einsträngigen DNA ausschließlich mit Cytosin reagiert, sind die mit diesem Mutagen geschaffenen Mutationen nur auf die kodierende Region beschränkt. Die Reaktionszeit und die Bisulfit-Konzentration werden in verschiedenen Versuchen derart variiert, dass im Durchschnitt ein bis fünf Mutationen pro Subtilisin-Gen geschaffen werden. Die Inkubation von 10 μg Lücken-enthaltender Duplex-DNA in 4 M Natriumbisulfit, pH 6,0, über einen Zeitraum von 9 Minuten bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 400 μl desaminiert etwa 1% der Cytosine in der einsträngigen Region. Die kodierende Region des reifen Subtilisins enthält in Abhängigkeit von dem DNA-Strang etwa 200 Cytosine. Vorteilhafterweise wird die Reaktionszeit variiert, von etwa 4 Minuten (um eine Mutationsfrequenz von etwa eins in 200 zu erzeugen) bis auf etwa 20 Minuten (etwa 5 in 200).
Nach der Mutagenese werden die Lücken-enthaltenden Moleküle in vitro mit DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) behandelt, um vollständig doppelsträngige Moleküle zu erzeugen und die Mutationen zu fixieren. Kompetente E. coli werden anschließend mit der mutagenisierten DNA transformiert, um eine amplifizierte Library von Subtilisinmutanten herzustellen. Amplifizierte Mutanten-Libraries können auch hergestellt werden, indem die Plasmid-DNA in einem Mut D Stamm von E. coli kultiviert wird, der den Mutationsbereich, infolge seiner fehleranfälligen DNA-Polymerase erhöht.
Die Mutagene salpetrige Säure und Ameisensäure können ebenfalls verwendet werden, um Mutanten-Libraries herzustellen. Da diese Chemikalien nicht so spezifisch für einsträngige DNA sind wie Natriumbisulfit, werden die Mutagenese-Reaktionen gemäß dem nachfolgenden Verfahren durchgeführt. Der kodierende Teil des Subtilisin-Gens wird durch Standardverfahren in M13-Phage kloniert und es wird eine einsträngige Phage-DNA hergestellt. Die einsträngige DNA wird anschließend 15–60 Minuten bei 23°C mit 1 M salpetriger Säure, pH 4,3, oder 1–5 Minuten bei 23°C mit 2,4 M Ameisensäure umgesetzt. In diesen Reaktionszeitbereichen wird eine Mutationsfrequenz von 1 in 1000 bis 5 in 1000 erzeugt. Nach der Mutagenese wird ein allgemeiner Primer mit M13-DNA zusammengelagert (Annealing) und Duplex-DNA wird erzeugt unter Verwendung der einsträngigen DNA als ein Templat, sodass der kodierende Teil des Subtilisin-Gens vollständig doppelsträngig wird. An diesem Punkt kann die kodierende Region aus dem M13-Vektor mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden und in einen nicht mutagenisierten Vektor ligiert werden, sodass die Mutationen nur in dem Restriktionsenzym auftreten (Myers et al., Science 229: 247–257 (1985)).
Erzeugen von ortsgerichteten Mutationen in dem Subtilisin-Gen
Ist das Subtilisin-Gen kloniert worden und sind die gewünschten Stellen für die Mutation identifiziert, können diese Mutationen unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide eingeführt werden. Diese Oligonucleotide enthalten Nucleotidsequenzen, die die gewünschten Mutationsstellen flankieren; Nucleotidmutanten werden während der Oligonucleotid-Synthese eingeführt. In einem bevorzugten Verfahren wird eine einsträngige DNA-Lücke, die das Subtilisin-Gen verbindet, in einem Vektor geschaffen, der das Subtilisin-Gen trägt. Anschließend wird das synthetische Nucleotid, das die gewünschte Mutation trägt, an einen homologen Teil der einsträngigen DNA angelagert (Annealing). Die verbleibende Lücke wird anschließend durch DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und das Konstrukt wird unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Ein spezifisches Beispiel dieses Verfahrens ist in Moringa et al. beschrieben (1984, Biotechnology 2: 646–639). Gemäß Moringa et al. wird ein Fragment innerhalb des Gens unter Verwendung von Restriktionsendonuclease entfernt. Das Vektor/Gen, das jetzt eine Lücke enthält, wird anschließend denaturiert und an ein Vektor/Gen hybridisiert, das keine Lücke enthält und statt dessen mit einer anderen Restriktionsendonuclease an einer Stelle geschnitten worden ist, die außerhalb des Gebiets der Lücke liegt. Anschließend ist eine einsträngige Region des Gens für die Hybridisierung mit mutierten Oligonucleotiden verfügbar, die verbleibende Lücke wird durch das Klenow-Fragment von DNA Polymerase I aufgefüllt, die Insertionen werden mit T4-DNA-Ligase ligiert und nach einem Replikationszyklus wird ein doppelsträngiges Plasmid erzeugt, das die gewünschte Mutation trägt. Das Moringa-Verfahren umgeht die zusätzliche Manipulation zur Konstruktion neuer Restriktionsstellen, und daher erleichtert es das Erzeugen von Mutationen an multiplen Stellen. US 4760025 von Estell et al., 26. Juni 1988, ist in der Lage, Oligonucleotide einzuführen, die multiple Mutationen tragen, indem geringfügige Veränderungen der Kassette erfolgen, durch das Verfahren von Moringa kann jedoch eine größere Variabilität an Mutationen an jedem beliebigen Zeitpunkt eingeführt werden, da eine Vielzahl von Oligonucleotiden mit variierenden Längen eingeführt werden kann.
Expression von Subtilisinmutanten
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein mutiertes Subtilisin-Gen, das durch die vorstehend beschriebenen Verfahren oder durch alternative Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt wurde, in Form des Enzyms unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert werden. Ein Expressionsvektor kann ganz allgemein als ein Klonierungsvektor definiert werden, da ein Expressionsvektor die Bestandteile eines typischen Klonierungsvektors einschließt, nämlich, ein Element, das die autonome Replikation des Vektors in einem Mikroorganismus unabhängig von dem Genom des Mikroorganismus gestattet, und einen oder mehrere phenotypische Marker für die Selektion. Ein Expressionsvektor schließt Kontrollsequenzen ein, die einen Promotor, einen Operator, eine Ribosomen-Bindungsstelle, das Translationsinitiationssignal und gegebenenfalls ein Repressor-Gen oder verschiedene Aktivator-Gene kodieren. Um die Sekretion des exprimierten Proteins zu ermöglichen, können vor der kodierenden Sequenz des Gens Nucleotide eingeführt werden, die eine "Signalsequenz" kodieren. Für die Expression unter Steuerung der Kontrollsequenzen wird ein Ziel-Gen, das gemäß der vorliegenden Erfindung zu behandeln ist, in arbeitsfähiger Weise an die Kontrollsequenzen in dem exakten Leserahmen gebunden. Die Promotorsequenzen, die in die Plasmidvektoren eingebaut sein können und die die Transkription der Subtilisin-Genmutante unterstützen, schließen den eukaryotischen β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727–3731) und den tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21–25) ein, sie sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Weitere Hinweise sind in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94 enthalten.
Gemäß einer Ausführungsform wird B. subtilis durch einen Expressionsvektor transformiert, der die mutierte DNA trägt. Findet die Expression in einem sekretierenden Mikroorganismus, wie B. subtilis, statt, kann dem Translationsinitiationssignal eine Signalsequenz folgen und der interessierenden DNA-Sequenz vorausgehen. Die Signalsequenz wirkt derart, dass sie die Expressionsprodukte zu den Zellwänden transportiert, wo sie nach der Sekretion von dem Produkt abgespalten wird. Der Begriff "Kontrollsequenz", wie vorstehend definiert, schließt, wenn vorhanden, auch eine Signalsequenz ein.
Ortsspezifische Mutation des Subtilisin-Gens erzeugt Mutanten mit geeigneten chemischen Eigenschaften
Material und Verfahren Bakterienstämme
B. subtilis 309 und 147 sind Varianten von Bacillus lentus, hinterlegt bei NCIB mit den Zugangsnummern NCBI 10147 und NCBI 10309, und beschrieben in US 3723250 vom 27. März 1973, und durch diesen Hinweis in seiner Gesamtheit in die vorliegende Erfindung aufgenommen.
B. subtilis DN 497 ist in US Ser.-Nr. 039298 vom 17. April 1987 beschrieben, welches EP 242220 entspricht, durch diesen Hinweis ebenfalls in die vorliegende Erfindung aufgenommen, und er ist eine aro + Transformante von RUB 200 mit chromosomaler DNA von SL 438, ein Sporulation- und Protease-Mangel-Stamm, der von Dr. Kim Hardy von Biogen erhalten wurde.
E. coli MC 1000 r^–m+ (Casadaban, M. J. und Cohen, S. N. (1980), J. Mol. Biol. 138: 179–207), wurde durch Standardverfahren in die r^–m+-Form umgewandelt und er ist gleichfalls in US 039298 beschrieben.
B. subtilis DB105 ist beschrieben in: Kawamura, F., Doi, R. H. (1984), Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases, J. Bacteriol. 160 (2), 442–444.
Plasmide
pSX50 (beschrieben in US Ser.-Nr. 039298, das durch diesen Hinweis in die vorliegende Erfindung aufgenommen ist) ist ein Derivat des Plasmids pDN 1050, umfassend den Promotor-Operator P1O1, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl R-Gen.
PSX62 (beschrieben in US Ser.-Nr. 039298, vorstehend) ist ein Derivat von pSX52 (ebenda), das ein Fusionsgen zwischen dem Prochymosin-Gen vom Kalb und dem B. pumilus xyn B-Gen, das in pSX50 inseriert wurde, umfasst (vorstehend). pSX62 wurde erzeugt, indem der E. coli rrrn B-Terminator in pSX52 hinter dem Prochymosin-Gen inseriert wurde.
pSX65 (beschrieben in US Ser.-Nr. 039298, vorstehend) ist ein Derivat von Plasmid pDN 1050, umfassend den Promotor-Operator P₂O₂, das B. pumilus xyn B-Gen und das B. subtilis xyl R-Gen.
pSX88 (beschrieben in der unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DK88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S)) ist ein Derivat von pSX50, umfassend das Subtilisin 309-Gen.
pSX92 wurde hergestellt durch Klonierung von Subtilisin 309 in das Plasmid pSX62 (vorstehend), geschnitten bei ClaI und HindIII, und bei ClaI aufgefüllt vor dem Einführen der Fragmente DraI–NheI und NheI–HindIII aus dem klonierten Subtilisin 309-Gen.
pSX93, dargestellt in 3, ist pUC13 (Vieira und Messing, 1982, Gene 19: 259–268), umfassend ein 0,7 kb XbaI–HindIII-Fragment des Subtilisin 309-Gens, das den in eine Polylinker-Sequenz eingefügten Terminator einschließt.
pSX119 (beschrieben in der unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DK88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S)) ist pUC13, enthaltend ein EcoRI–XbaI-Fragment von dem Subtilisin 309-Gen, das in den Polylinker eingefügt ist.
pSX120 ist ein Plasmid, in dem das HapI–HindIII-Fragment mit dem Subtilisin 309-Gen von pSX88 in EcoRV–HindIII auf pDN 1681 derart eingefügt ist, dass das Protease-Gen durch die amy M- und amy Q-Promotoren exprimiert wird. pDN 1681 wurde erhalten von pDN 1380 (Diderichsen, B. und Christiansen, L., 1988, FEMS Microbiology Letters 56: 53–69) mit einem eingefügten 2,85 Bp ClaI-Fragment von B. amyloliquefaciens, das das amy Q-Gen mit dem Promotor trägt (Takkinen et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 1007 ff.)
pUC13 ist beschrieben in: Vieira, J. und Messing, J., 1982, Gene 19: 259–268.
pUC19 ist beschrieben in: Yanisch-Perron, C. und Vieira, J., Messing, J., 1985, Gene 33: 103–119.
pUB110 ist beschrieben in: Lacey, R. W., Chopra, J., (1974), Genetic studies of a multiresistant strain of Staphy lococcus areus, J. Med. Microbiol. 7: 285–297, und in: Zyprian, E., Matzura, H., (1986), Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus areus plasmid pUB110 and development of a Gram-positive expression vector system, DNA 5 (3): 219–225.
Gene
Die Gene für die verschiedenen Subtilisine wurden erhalten, wie in der vorstehend erwähnten Literatur beschrieben. Insbesondere die Gene für die Subtilisin 309- und 147-Enzyme wurden erhalten, wie in der unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DK88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) beschrieben, die durch diesen Hinweis in ihrer Gesamtheit in der vorliegenden Erfindung aufgenommen sind.
Subtilisin Carlsberg Gen-Konstrukte
Ein synthetisches Gen wurde basierend auf der kodierenden Sequenz der reifen Subtilisin Carlsberg-Protease und ihres Transkriptionsterminators gestaltet (Jacobs, M., Eliasson, M., Uhlen, M., Flock, J.-I., 1985, Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic Acids Res. 13 (24): 8913–8926), an die pre und pro kodierenden Sequenzen von Subtilisin BPN' Protease gebunden (Wells, J. A., Ferrari, E., Henner, D. J., Estell, D. A., Chen, E. Y., 1983, Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis, Nuclei Acids Res. 11 (22): 7911–7925). Das Gen wurde in sieben Fragmente mit Längen im Bereich von 127 bis 313 Basenpaaren aufgeteilt, wobei jedes Fragment aus chemisch synthetisierten Oligos von 16 bis 77 Nucleotiden aufgebaut ist. Die Überlappung zwischen den Oligos der beiden Stränge wurde optimiert, um das einstufige Annealing jedes Fragments zu erleichtern (Mullenbach, G. T., Tabrizi, A., Blacher, R. W., Steimer, K. S., (1986), Chemical synthesis and expression in Yeast of a gene encoding connective tissue activating peptide-III, J. Biol. Chem. 261 (2), 719– 722). Jedes Fragment wurde in einen E. coli-Klonierungs- und Sequenzierungsvektor eingebaut und kloniert. Es wurde eine Sequenzanalyse dieser klonierten Fragmente durchgeführt, um die Korrektheit der Sequenzen in jedem Fragment zu bestätigen. Anschließend wurden alle der Fragmente in den Vektor pUB110 eingebaut und kloniert (Lacey, R. W., Chopra, J., (1974), Genetic studies of a multiresistant strain of Staphylococcus aureus, J. Med. Microbiol. 7: 285–297) und in B. subtilis DB105 übertragen (Kawamura, F., Doi, R. H., (1984), Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases, J. Bacteriol. 160 (2): 442–444). Die Transkription des Gens wurde durch den HpaII-Promotor auf dem pBU110 Plasmidvektor initiiert (Zyprian, E., Matzura, H., 1986, Characterization of signals promoting gene expression on the Staphylococcus aureus plasmid pUB110 and development of a Gram-positive expression vector system, DNA 5 (3): 219–225). Bei dem Vorgang Gen-Konstruktion stellte sich heraus, dass für das längste Fragment (#5; 313 Basenpaare) eine weitere Fragmentierung (Fragmente #8 und #9) erforderlich ist, um die Probleme zu überwinden, die aus dem Zusammensetzen dieses längeren Fragments entstehen.
Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz unterscheidet sich von der, die früher für die Subtilisin Carlsberg-Sequenz an den Positionen 129, 157, 161 und 212 veröffentlicht wurde (Smith, E. L., DeLange, R. J., Evans, W. H., Landon, W., Markland, F. S. (1968), Subtilisin Carlsberg V. The complete sequence: comparison with subtilisin BPN'; evolutionary relationships, J. Biol. Chem. 243 (9), 2184–2191). Eine fünfte Veränderung, die von Jacobs et al. (1985) beschrieben ist, konnte in dem hier beschriebenen Carlsberg-Gen nicht bestätigt werden.
Errechnen des isoelektrischen Punkts (pI₀)
Die Berechnung des isoelektrischen Punkts für das Subtilisin 309 Wildtyp-Enzym (S000) wird zur Veranschaulichung des verwendeten Verfahrens nachstehend beispielhaft durchgeführt. Das gleiche Verfahren ist natürlich auf das Errechnen jedes beliebigen Enzyms anwendbar, unabhängig davon, ob es eine Enzymmutante ist oder nicht.
Jedem potenziell geladenen Aminosäurerest (Tyr, Asp, Glu, Cys, Arg, His, Lys, N-terminal, C-terminal, Ca²⁺) wurden pK-Werte zugeordnet. In diesem Fall wurde die Umgebung in die Betrachtung mit einbezogen, wodurch verschiedene pK-Werte für den gleichen Aminosäurerest in Abhängigkeit von seiner benachbarten Umgebung verwendet wurden. Die zugeordneten Werte sind in Tabelle II ausgewiesen.
Anschließend wurde das Verhältnis des Auftretens der geladenen oder ungeladenen Form (geladen/ungeladen, C/U(i)) eines Aminosäurerestes bei einem festgelegten pH sowohl für die positive als auch für die negative Ladung unter Anwendung der Formeln Ia bzw. Ib berechnet. In Tabelle II ist dieses Verhältnis nur für den pH-Wert ausgewiesen, der gleich dem pI₀ ist.
Nachfolgend wurde die relative Ladung Q_r(i) oder die jedem geladenen Rest zugewiesene Ladung unter Anwendung der Formeln IIa und IIb berechnet:
Der pH-Wert, an die Summe aller Ladungen aus den geladenen Resten gleich Null ist, wurde durch Iteration ermittelt.
Tabelle II Berechnung des isoelektrischen Punkts für: S000 Subtilisin 309
Wie vorstehend und in Tabelle II ausgewiesen, unterscheidet sich der pK-Wert, der jeder Aminosäure zugeordnet ist, wenn ortsgegebene Variationen der Umgebung mit in Betracht gezogen werden. Das führt nur zu einer erhöhten Genauigkeit der Berechnung, die Erfahrung zeigt jedoch, dass konstant berechnete pK-Werte hilfreich sind, wenn gezeigt werden soll, in welche Richtung sich der pI₀ für eine vorgegebene Enzymmutante im Vergleich zu dem pI₀ des Stammenzyms bewegt. Das ist in Tabelle III ausgewiesen, in der die pI₀-Werte für geschätzte pK-Werte dargestellt sind.
Um verschiedene Enzyme und Enzymmutanten vergleichen zu können, sind Waschtests durchgeführt worden, die nachstehend genauer beschrieben sind. In der nachstehenden Tabelle III sind die Ergebnisse dieser Tests dargestellt, in denen das Stammenzym und die Enzymmutanten von Subtilisin 309 (bezeichnet als S000, usw.) und von Subtilisin Carlsberg (bezeichnet als C000, usw.) aufgelistet sind, um die Korrelation zwischen dem pI₀ und dem Waschverhalten bei verschiedenen pH-Werten der verwendeten Waschflüssigkeit zu veranschaulichen. In den Waschtests wurden eine flüssige Waschmittelzusammensetzung mit geringem Salzgehalt und einem pH-Wert von 8,3 gemäß dem Waschmittelbeispiel D7 und ein Waschpulver mit einem normalen Salzgehalt und einem pH-Wert von 10,2 gemäß dem Waschmittelbeispiel D2 verwendet.
In Tabelle III sind die Ergebnisse als relative Ergebnisse im Vergleich zu den Wildtyp-Enzymen (S000 bzw. C000) dargestellt. Die berechneten und tatsächlich beobachteten pI₀-Werte für die Enzyme sind ebenfalls ausgewiesen.
Tabelle 3 Vergleichende Waschtests bei verschiedenen pH-Werten
Aus Tabelle III ist ersichtlich, dass die Verschiebung des pI₀ zu niedrigeren Werte (S-Serie) zur Verbesserung des Waschverhaltens bei geringem pH-Wert (pH = 8,3) beiträgt, wohingegen die Verschiebung zu höheren pI₀-Werten (C-Serie) zu einer Verbesserung des Waschverhaltens bei hohem pH-Wert (pH = 10,2) beiträgt.
Es ist somit nachgewiesen, dass das Konzept des isoelektrischen Punkts für das Auswählen der Positionen der Aminosäuren, die in dem Stammenzym verändert werden sollten, sehr geeignet ist.
Ganz allgemein ist festgestellt worden, dass Mutationen in Kodons erfolgen sollten, die den Aminosäuren entsprechen, die sich an oder nahe der Oberfläche des Enzymmoleküls befinden, wobei die innere Struktur des Stammenzyms soweit wie möglich erhalten bleiben sollte.
Reinigung von Subtilisinen
Das Verfahren betrifft eine typische Reinigung eines 10 Liter-Fermentierungsansatzes von Subtilisin 147-Enzym, Subtilisin 309-Enzym oder Mutanten davon.
Annähernd 8 Liter der Fermentierungsbrühe wurden 35 Minuten bei 5000 U/min in 1 Liter-Bechergläsern zentrifugiert. Die Überstände wurden mit 10% Essigsäure auf pH 6,5 eingestellt und durch Seitz Supra S100-Filterplatten filtriert.
Die Filtrate wurden auf annähernd 400 ml konzentriert unter Anwendung einer Amicon CH2A UF-Einheit, die mit einer Amicon S1Y10 UF Patrone ausgerüstet ist. Das UF-Konzentrat wurde zentrifugiert und filtriert, bevor es bei Raumtemperatur an eine Bacitracin-Affinitätssäule bei pH 7 adsorbiert wurde. Die Protease wurde von der Bacitracin-Säule bei Raumtemperatur eluiert, unter Verwendung von 25% Isopropanol und 1 M Natriumchlorid in einer Pufferlösung mit 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 7.
Die Fraktionen aus dem Bacitracin-Reinigungsschritt, die Proteaseaktivität zeigen, wurden vereinigt und aufgetragen auf eine 750 ml Sephadex G25-Säule (5 cm Durchmesser), äquilibriert mit einem Puffer, enthaltend 0,01 Dimethylglutarsäure, 0,2 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 6,5.
Die Fraktionen von der Sephadex G25-Säule, die proteolytische Aktivität zeigen, wurden vereinigt und aufgetragen auf eine 150 ml CM Sepharose Cl 6B Anionenaustauschersäule (5 cm Durchmesser), äquilibriert mit einem Puffer, enthaltend 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,1 M Borsäure und 0,002 M Calciumchlorid, eingestellt auf pH 6,5.
Die Protease wurde unter Anwendung eines linearen Gradienten von 0–0,1 M Natriumchlorid in 2 Litern des gleichen Puffers (0–0,2 M Natriumchlorid im Fall von sub 147) eluiert.
In einem abschließenden Reinigungsschritt wurden die Protease enthaltenden Fraktionen von der CM Sepharose-Säule vereinigt und mit einer Amicon-Filtrationszelle konzentriert, die mit einer GR81PP-Membran (von Danish Sugar Factories Inc.) ausgerüstet ist.
Subtilisin 309 und die Mutanten
Gly 195 Glu (G195E (S001)):
Arg 170 Tyr (R170Y (S003)):
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu (R170Y + G195E (S004)):
Lys 251 Glu (K251E (S005)):
His 120 Asp (H120D (S006)):
Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 251 Glu (R170Y + G195E + K251E (S012)):
Lys 235 Leu (K235L (S015)):
His 120 Asp + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D + G195E + K235L (S017)):
His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu (H120D + R170Y + G195E + K235L (S019)):
His 120 Asp + Arg 170 Tyr + Gly 195 Glu + Lys 235 Leu + Lys 251 Glu (H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E (S020)):
wurden durch dieses Verfahren gereinigt.
Reinigung von Subtilisin Carlsberg-Proteasen(mutanten)
Die Fermentierungsmedien wurden entweder direkt auf eine Bacitracin-Affinitätssäule aufgetragen (5 cm Durchmesser × 15 cm; mit 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,9 äquilibriert; Fließgeschwindigkeit annähernd 500 ml/h) oder auf 500 ml konzentriert mittels eines Nephross Andante H. F. Dialysators (Organon Technika) unter Verwendung eines Rückdrucks von 10–12 psi und demineralisiertem Wasser im äußeren Kreislauf. Im letzteren Fall wurde die Protease aus dem Konzentrat durch Zugabe von 600 g/l Ammoniumsulfat ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und in annähernd 500 ml demineralisiertem Wasser wieder aufgelöst. Das Ammoniumsulfat wurde von der Protease-Lösung unter Verwendung des wie vorstehend beschriebenen Dialysators entfernt. Das Endvolumen betrug annähernd 300 ml, während der pH-Wert auf 6,0 eingestellt wurde. Die Protease wurde von den Bacitracin-Säulen (vorstehend erwähnt) eluiert, unter Verwendung von 10 mM Tris-Puffer (pH 7,9), enthaltend 2,7 M NaCl und 18% Isopropanol.
Nach der Dialyse des Bacitracin-gereinigten oder konzentrierten Protease-Materials wurde die weitere Reinigung durch Auftragen auf eine CM-Trisacryl-Ionenaustauschsäule (5 cm Durchmesser × 15 cm; äquilibriert mit 0,03 M Natriumphosphat pH 6,9) unter Anwendung einer Fließrate von 200 ml/h vervollständigt. Die Protease wurde von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl (2 × 500 ml) in dem Phosphatpuffer eluiert. Die Proteaseaktivität-enthaltenden Fraktionen wurden zusammengefaßt und bei –20°C in Gegenwart von Puffersalzen nach dem Gefriertrocknen gelagert.
Oligonucleotid-Synthese
Alle Fehlpaarungs-Primer wurden auf einem Applied Biosystems 380 A DNA-Synthesizer synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigt.
Assay bezüglich der proteolytischen Aktivität
Die proteolytische Aktivität der Enzymmutanten wurde bestimmt, um zu ermitteln, inwieweit die katalytische Aktivität des Enzyms erhalten bleibt. Die Bestimmungen wurden unter Anwendung des Dimethyl-Casein-Verfahrens (DMC) durchgeführt, das in der NOVO-Veröffentlichung AF 220-gb (oder spätere Ausgaben) beschrieben ist und das von Novo-Nordisk a/s, Bagsvard, Dänemark, verfügbar ist, welches durch diesen Hinweis in die vorliegende Erfindung aufgenommen ist.
Assay bezüglich des Waschverhaltens
A
Textilien für die Testung (2,2 cm × 2,2 cm), annähernd 0,1 g) wurden hergestellt, indem entschlichtete Baumwolle (100 Baumwolle, DS 71) durch das Grassaft enthaltende Gefäß einer Mathis Wasch- und Trocknungseinheit des TH-Typs (Werner Mathis AG, Zürich, Schweiz) durchlaufen gelassen wurden.
Abschließend wurden die Textilien in einem starken Luftstrom bei Raumtemperatur getrocknet, 3 Wochen bei Raumtemperatur gelagert und anschließend bis zur Verwendung bei –18°C gehalten.
Alle Tests wurden in einem Miniwaschmodellsystem durchgeführt. In diesem System werden 6 Testtextilien in einem 150 ml Becherglas, enthaltend 60 ml Waschmittellösung, gewaschen. Die Bechergläser werden unter magnetischem Rühren in einem Thermostat-Wasserbad bei 30°C gehalten.

Als Waschmittel wurden die nachfolgenden herkömmlichen flüssigen Waschmittel verwendet:

AE, Berol 160	15%
LAS, Nasa 1169/P	10%
Kokosnuss-Fettsäure	9%
Oleinsäure	1%
Triethanolamin	9%
Glycerin	10,5%
Ethanol	1,5%
Tri-Na-Citrat × 2H₂O	8%
CaCl₂ × 2H₂O	0,1
NaOH	1%
Wasser aus LAS	23,3
Wasser aus Glycerin	1,5%
Zugesetztes Wasser	34,9%

Die aufgeführten Prozente entsprechen dem prozentualen Anteil an aktivem Gehalt.
Der pH-Wert wurde mit 1 N NaOH auf 8,14 eingestellt. Der Härtegrad des verwendeten Wassers betrug 6° dH (Deutsche Härte).
Die Tests wurden durchgeführt bei Enzymkonzentrationen von: 0, 1,0 mg Enzymprotein/l und 10,0 mg Enzymprotein/l, und für jede der Mutanten wurden zwei unabhängige Testreihen durchgeführt. Die nachfolgend dargestellten Ergebnisse sind die Ergebnisse dieser Tests.
Das Waschen wurde über einen Zeitraum von 60 Minuten durchgeführt, und unmittelbar nach dem Waschen wurden die Textilien 25 Minuten unter fließendem Leitungswasser in einen Eimer gespült.
Anschließend wurden die Textilien über Nacht luftgetrocknet (geschützt gegen Tageslicht) und die Remission R wurde auf einem ELREPHO 2000-Photometer von Datacolor S. A., Dietkikon, Schweiz, bestimmt.
Im Ergebnis der Messung des Waschverhaltens wurde der Remissionsunterschied ΔR bestimmt, der gleich der Remission nach dem Waschen mit zugesetztem Enzym minus der Remission nach dem Waschen ohne zugesetztes Enzym ist.
B
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten wurde gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren für Baumwolltextilien getestet, die mit Grassaft gefärbt waren.
2,0 g/l eines herkömmlichen Flüssigwaschmittels aus den USA wurde verwendet.
Das Waschmittel wurde in einem 0,005 M Ethanolamin-Puffer in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaOH/HCl auf 8,0, 9,0, 10,0 bzw. 11,0 eingestellt.
Die Temperatur wurde 10 Minuten isotherm auf 30°C gehalten.
Die Dosierung an den Mutanten betrug jeweils 0,25 mg Enzymprotein/l.
C
Die Waschtests unter Anwendung der Waschmittelzusammensetzungen, die in den nachstehenden Waschmittelbeispielen beispielhaft veranschaulicht sind, wurden in einer Miniwaschanlage durchgeführt, indem auf Baumwolle basierende Testtextilien verwendet wurden, die Pigmente, Fett und Protein (Casein) enthalten. Die Bedingungen waren wie folgt:

a) 2 g/l Waschmittel D3 in 6°fH (Französische Härte) Wasser bei pH 8,3, oder
b) 5 g/l Waschmittel D2 in 15°fH Wasser bei pH 10,2.

Nach dem Spülen und Trocknen wurde die Reflexion bei 460 nm gemessen.
Der Faktor der Verbesserung wurde aus einer Dosis-Reaktions-Kurve bestimmt und bezieht sich auf die Enzymmenge, die benötigt wird, um einen vorgegebenen ΔR-Wert im Vergleich zu dem in Frage kommenden Wildtyp-Enzym (S000 und C000) zu erreichen, das bedeutet, dass ein Faktor der Verbesserung von 2 ausweist, dass nur die Hälfte der Enzymmenge benötigt wird, um den gleichen ΔR-Wert zu erhalten.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in der vorstehenden Tabelle III dargestellt.
D
Testversuche bezüglich der Lipase-Stabilität wurden beispielsweise unter Verwendung der nachfolgenden Materialien durchgeführt:
1 LU/ml Pseudomonas cepacia-Lipase wurde in Waschflüssigkeit mit jedem der beiden Typen, O und W (nachstehend beschrieben) inkubiert. In Abständen wurden Aliquote entnommen und bezüglich der Lipase-Aktivität getestet. Parallel wurden Inkubationen ohne Protease oder mit Protease verschiedener Typen wie nachstehend beschrieben durchgeführt, um die Wirkung der Protease auf die Aufrechterhaltung der Lipase-Aktivität zu testen. Wildtyp-Proteasen wurden mit einer Konzentration von 20 GU/ml getestet, mutierte Proteasen wurden mit einer Konzentration von 0,5 μg/ml getestet.
Waschmittelzusammensetzungen, umfassend Enzymvarianten
Waschmittel D1
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthaltend Phosphatbuilder, wird derart formuliert, dass es enthält: Gesamtgehalt an aktivem Waschmittel etwa 16%, anionisches Waschmittel etwa 9%, nichtionisches Waschmittel etwa 6%, Phosphat-enthaltender Builder etwa 20%, Acryl- oder äquivalentes Polymer etwa 3,5%, (alternativ weniger, bis etwa 2%), Perboratbleichmittelvorstufe etwa 6–18%, alternativ etwa 15–20%, Amino-enthaltender Bleichmittelaktivator etwa 2%, Silicat- oder anderes Strukturierungsmittel etwa 3,5%, alternativ bis zu etwa 8%, Enzym mit etwa 8 Glycin-Einheiten/mg Aktivität, mit Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutrales anorganisches Salz, und Enzyme (jeweils etwa 0,5% Enzym).
Das anionische Waschmittel ist ein Gemisch von Natriumdodecylbenzolsulfonat, alternativ lineares Natriumalkylbenzolsulfonat, 6%, und primärem Alkylsulfat 3%. Das nichtionische Waschmittel ist ein Ethoxylat eines annähernd primären C₁₃-C₁₅-Alkohols mit 7 Ethoxylat-Resten pro Mol. Der Phosphatbuilder ist Natriumtripolyphosphat. Das Polymer ist Polyacrylsäure, alternativ Acrylsäure/Maleinsäure-Copolymer. Die Perboratbleichmittelvorstufe ist Natriumtetraborat-tetrahydrat oder -monohydrat. Der Aktivator ist Tetraacetylethylendiamin. Das Strukturierungsmittel ist Natriumsilicat. Das neutrale anorganische Salz ist Natriumsulfat.
Die Enzyme umfassen Protease der Mutante S001, alternativ die Protease S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226, S223, S224 oder S225.
Waschmittel D1a
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthaltend Phosphatbuilder, wird derart formuliert, dass es enthält: Gesamtgehalt an aktivem Waschmittel etwa 15%, anionisches Waschmittel etwa 7%, nichtionisches Waschmittel etwa 6%, Phosphat-enthaltender Builder etwa 25%, Acryl- oder äquivalentes Polymer etwa 0,5%, Perboratbleichmittelvorstufe etwa 10%, Amino-enthaltender Bleichmittelaktivator etwa 2%, Silicat oder andere Strukturierungsmittel etwa 6%, Protease-Enzym mit etwa 8 Glycin-Einheiten/mg Reinheitsgrad, mit Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutrales anorganisches Salz, und Enzyme (jeweils etwa 0,5% Enzym).
Das anionische Waschmittel ist ein Gemisch von linearem Natriumdodecylbenzolsulfonat. Das nichtionische Waschmittel ist ein Ethoxylat eines annähernd primären C₁₃-C₁₅-Alkohols mit 7 Ethoxylat-Resten pro Mol oder ein Gemisch davon mit dem entsprechenden Alkohol, ethoxyliert auf einen Gehalt von 3 Resten pro Mol. Der Phosphatbuilder ist Natriumtripolyphosphat. Die Perborat- oder Persäurebleichmittelvorstufe ist Natriumtetraborattetrahydrat. Der Aktivator ist Tetraacetylethylendiamin. Das Strukturierungsmittel ist Natriumsilicat. Das neutrale anorganische Salz ist Natriumsulfat. Die Enzyme umfassen Protease der Mutante S001, alternativ die Protease S003, S004, S005, C001, C002, 0003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226.
Detergenz D2
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthaltend Zeolithbuilder, wird derart formuliert, dass es enthält: Gesamtgehalt an aktivem Waschmittel etwa 16%, anionischem Waschmittel etwa 9%, nichtionischem Waschmittel etwa 6%, Zeolith-enthaltendem Builder etwa 20%, Acryl- oder äquivalentem Polymer etwa 3,5%, Perboratbleichmittelvorstufe etwa 6–18%, Amino-enthaltendem Bleichmittelaktivator etwa 2%, Silicat oder andere Strukturierungsmittel etwa 3,5%, alternativ weniger bis etwa 2,5%, Enzym mit etwa 8 (alternativ etwa 15) Glycin-Einheiten/mg Reinheitsgrad, mit Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutrales anorganisches Salz, und Enzyme (jeweils etwa 0,5% Enzym).
Das anionische Waschmittel ist ein Gemisch von Natriumdodecylbenzolsulfonat, alternativ lineares Alkylbenzolsulfonat, 6% und primärem Alkylsulfat 3%. Das nichtionische Waschmittel ist ein Ethoxylat eines annähernd primären C₁₃-C₁₅-Alkohols mit 7 Ethoxylat-Resten pro Mol. Der Zeolithbuilder ist Zeolith des A-Typs. Das Polymer ist Polyacrylsäure. Die Perborat- oder Persäurebleichmittelvorstufe ist Natriumtetraborat-tetrahydrat oder -monohydrat. Der Aktivator ist Tetraacetylethylendiamin. Das Strukturierungsmittel ist Natriumsilicat. Das neutrale anorganische Salz ist Natriumsulfat. Die Enzyme umfassen Protease der Mutante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226.
Waschmittel D2a
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, enthaltend Zeolithbuilder, wird derart formuliert, dass es enthält: Gesamtgehalt an aktivem Waschmittel etwa 14%, anionischem Waschmittel etwa 7%, nichtionischem Waschmittel etwa 7%, Zeolith-enthaltendem Builder etwa 25%, Acryl- oder äquivalentem Polymer etwa 3%, Perborat- oder Persäurebleichmittelvorstufe etwa 10%, Amino-enthaltendem Bleichmittelaktivator etwa 2%, Silicat- oder anderem Strukturierungsmittel etwa 0,5%, Enzym mit etwa 6 Glycin-Einheiten/mg Reinheitsgrad, mit Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung, und neutralem anorganischem Salz, und Enzyme (jeweils etwa 0,5% Enzym).
Das anionische Waschmittel ist ein Gemisch von linearem Natriumdodecylbenzolsulfonat, das nichtionische Waschmittel ist ein Gemisch aus Ethoxylaten eines annähernd primären C₁₃-C₁₅-Alkohols mit 7 bzw. 3 Ethoxylat-Resten pro Mol. Der Zeo lithbuilder ist Zeolith des A-Typs. Das Polymer ist Acrylsäure/Maleinsäure-Copolymer. Die Perboratbleichmittelvorstufe ist Natriumtetraboratmonohydrat. Der Aktivator ist Tetraacetylethylendiamin. Das Strukturierungsmittel ist Natriumsilicat. Das neutrale anorganische Salz ist Natriumsulfat. Die Enzyme umfassen Protease der Mutante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S015, S017, S021, S226.
Waschmittel D3
Eine wässrige Waschmittelflüssigkeit gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird derart formuliert, dass sie enthält: Dodecylbenzolsulfonsäure 16%, linearen C₁₂-C₅₅-Alkohol, kondensiert mit 7 Mol/Mol Ethylenoxid 7%, Monoethanolamin 2%, Zitronensäure 6,5%, Natriumxylolsulfonat 6%, Natriumhydroxid etwa 4,1%, Protease 0,5%, geringfügige Zusätze und Wasser bis auf 100%. Der pH-Wert wird auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt. Das Enzym ist eine Protease gemäß Mutante S020, alternativ S019, S012, S004, S001, S003, S005, S015, S017, S021, S022, S023, S035, S201, S22306 oder S235.
Waschmittel D4
Eine nichtwässrige Waschmittelflüssigkeit gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird formuliert unter Verwendung von 38,5% primärem linearem C₁₃-C₁₅-Alkohol, alkoxyliert mit 4,9 Mol/Mol Ethylenoxid und 2,7 Mol/Mol Propylenoxid, 5% Triacetin, 30% Natriumtriphosphat, 4% Soda-Asche, 15,5% Natriumperboratmonohydrat, enthaltend einen geringfügigen Anteil an Oxoborat, 4% TAED, 0,25% EDTA, davon 0,1% als Phosphonsäure, Aerosil 0,6%, SCMC 1% und 0,6% Protease. Der pH-Wert wird auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt, z. B. auf etwa 9,8. Das Enzym umfasst Protease der Mutante S001, alternativ S003, S004, S021, S035, S201, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D5
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Form eines Granulats formuliert mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, enthaltend etwa 20 Gew.-% Tensid, davon sind etwa 10% Natriumdodecylsulfonat, und der verbleibende Anteil ist ein Gemisch von Synperonic A7 und Synperonic A3 (etwa 5,5% bis 4,5%) und Null-neutrales anorganisches Salz (z. B. Natriumsulfat), plus Phosphatbuilder etwa 33%, Natriumperborattetrahydrat etwa 16%, TAED-Aktivator etwa 4,5%, Natriumsilicat etwa 6%, und geringfügige Zusätze einschließlich Natriumcarbonat etwa 2%, und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10%. Enzyme (jeweils etwa 0,5%) sind eingeschlossen. Das Enzym umfasst Protease gemäß Mutante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D6
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Form eines Granulats formuliert mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, alternativ etwa 550 g/l, enthaltend etwa 20 Gew.-%, alternativ weniger bis zu etwa 16 Gew.-% Tensid, davon sind etwa 9%, alternativ etwa 7%, Natriumdodecylbenzolsulfonat, alternativ lineares Natriumalkylbenzolsulfonat, und der verbleibende Anteil ist ein Gemisch von Synperonic A7 und Synperonic A3 (oder ähnliche Ethoxylate) (entsprechend etwa 5% bis 6%, alternativ etwa 4% und 7%) und Null-neutrales anorganisches Salz (z. B. Natriumsulfat), plus Zeolithbuilder etwa 30%, alternativ etwa 25%, Natriumperborattetrahydrat, alternativ -monohydrat, etwa 14% oder 15%, TAED-Aktivator etwa 3,6%, und geringfügige Zusätze einschließlich Natriumcarbonat etwa 9%, oder bis zu 15%, Dequestη 2047 etwa 0,7%, und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10%. Enzyme (jeweils etwa 0,5% Enzym, oder etwa 0,2% Lipase und etwa 0,7% Protease) sind eingeschlossen. Das Enzym umfasst Protease gemäß Mutante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D6a
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Form eines Granulats formuliert mit einer Schüttdichte von mindestens 600 g/l, enthaltend etwa 15 Gew.-% Tensid, davon sind etwa 7% lineares Natriumalkylbenzolsulfonat, 2% primäres Alkoholsulfat und der verbleibende Anteil ist Synperonic A7 oder ein ähnliches Ethoxylat, und Nullneutrales anorganisches Salz (z. B. Natriumsulfat), plus Zeolith-Builder etwa 22%, Natriumperborattetrahydrat 15%, TAED-Aktivator etwa 7%, und geringfügige Zusätze einschließlich Natriumcarbonat etwa 15%, Dequestη 2047 etwa 0,7%, und einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10%. Enzyme (etwa 1,2%) schließen Protease gemäß Mutante S001 ein, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D7
Ein Waschpulver gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird derart formuliert, dass es enthält: Dodecylbenzolsulfonsäure 6%, linearen C₁₂-C₁₅-Alkohol, kondensiert mit 7 Mol/Mol Ethylenoxid 5%, Fettsäureseife 3%, Sokolanη CP5 Polymer 3%, Zeolith-A 22%, Natriumcarbonat 10%, Natriumsulfat 17%, Tonpartikel 8%, Natriumperborattetrahydrat 13%, Tetraacetylethylendiamin 2%, Protease 0,5%, geringfügige Zusätze und Wasser bis auf 100%. Der pH-Wert wird auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt. Das Protease-Enzym umfasst Protease gemäß Mu-tante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, 0004, C005, C008, S223, S224, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D8
Ein Waschmittel(Seifen)riegel gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird wie folgt formuliert: Seife, enthaltend ein auf einem Seifensiedekessel verseiftes (pansaponified) Gemisch aus 82% Talg, 18% Kokosnussöl, neutralisiert mit 0,15% Orthophosphorsäure, gemischt mit Protease (etwa 8 GU/mg der Riegelzusammensetzung) und auch vermischt mit Natriumformiat 2%, Borax 2%, Propylenglycol 2% und Natriumsulfat 1%, das anschließend in einer Seifenherstellungsstraße stranggepresst wird. Das Protease-Enzym umfasst Protease gemäß Mutante S001, alternativ S003, S004, S005, C001, C002, C003, C004, C005, C008, S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 oder S235.
Waschmittel D9
Strukturierte flüssige Waschmittel können beispielsweise zusätzlich zu der hier beschriebenen Protease 2–15% nichtionisches Tensid, 5–40% Gesamt-Tensid, umfassend nichtionisches und gegebenenfalls anionisches Tensid, 5–35% Phosphat-enthaltenden oder kein Phosphat enthaltenden Builder, 0,2–0,8% polymeres Verdickungsmittel, z. B. quervernetztes Acrylsäure-Polymer mit einem MW über 106, mindestens 10% Natriumsilicat, z. B. als neutrales Wasserglas, Alkali (z. B. Kalium-enthaltendes Alkali) zum Einstellen des gewünschten pH-Werts, vorzugsweise im Bereich von 9–10 oder darüber, z. B. über pH 11, mit einem Verhältnis von Natriumkation: Silicatanion (als freies Silica) (bezogen auf das Gewicht) unter 0,7 : 1, und einer Viskosität von 0,3–30 Pas (bei 20°C und 20 s^–1), enthalten.
Geeignete Beispiele enthalten etwa 5% nichtionischen C_13-15-Alkohol als Tensid, alkoxyliert mit etwa 5 EO-Gruppen pro Mol und mit etwa 2,7 PO-Gruppen pro Mol, 15–23% neutrales Wasserglas mit einem Gewichtsverhältnis von 3,5 zwischen Silica and Natriumoxid, 13–19% KOH, 8–23% STPP, 0–11% Natriumcarbonat, 0,5% Carbopolη 941.
Protease (z. B. 0,5%) schließen die Mutante S001, alternativ S021, S025, S035, S201, S202, S223, S224, S225, S226 oder S235, ein.
Waschmittel D10

Eine strukturierte, viskose, wässrige Waschmittelflüssigkeit, das als Textilwaschmittel geeignet ist, wird wie folgt formuliert (% bezogen auf das Gewicht):

Zitronensäure	2,5
Borax (10 aq)	4
NaOH	2
Glycerin	5
Lineares C₁₄-C₁₅-Alkylbenzolsulfonat oder primäres C_14-15-Alkoholsulfat	6,5
Synperonic A3 Nichtionisches C₁₂-C₁₅ 3EO	1,2
Synperonic A7 Nichtionisches C₁₂-C₁₅ 7EO	3,6
Zeolith	20
Protease	0,5
Amylase (Termamyl(TM) 300LDX)	0,2
Geringfügige Zusätze und Wasser	auf 100%

Der pH-Wert kann auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt werden. Das Enzym ist eine Protease gemäß Mutante S020. In alternativen Versionen dieses Waschmittels ist das Enzym ausgewählt aus S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S035, S201, S223–6 oder S235.
Waschmittel D11

Eine isotrope wässrige Waschmittelflüssigkeit, die als Textilwaschmittel geeignet ist, wird wie folgt formuliert (% bezogen auf das Gewicht):

Zitronensäure	2
Borsäure	1
NaOH	3
KOH	4,5
Glycerin	10
Ethanol	6,5
Nichtionisches Tensid (C₁₂-Alkohol 6,5 EO-Ethoxylat-Gruppen/Mol) oder primäres Natrium-Alkoholsulfat	10
Oleinsäure	16
Kokosnussöl-(C₁₂)-Seife	11
Protease	0,5
Geringfügige Zusätze und Wasser	auf 100%

Der pH-Wert kann auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt werden. Das Enzym ist eine Protease gemäß Mutante S020. In alternativen Versionen dieses Waschmittels ist das Enzym ausgewählt aus S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S223–6 oder S235.
Waschmittel D12

Eine wässrige flüssige Waschmittelzusammensetzung wird derart formuliert, dass sie enthält:

Natriumalkylbenzolsulfonat	14,5
C₁₈-Natriumseife	2
Nichtionisches Waschmittel (C_12-15-6EO)	9
Fettsäure (Oleinsäure)	4,5
Natriumalkenylsuccinat	11
Propandiol	1,5
Ethanol	3,6
Natriumcitrat	3,2
Komplexierungsmittel z. B. Dequest 2060	0,7
Protease	0,5
Amylase	0,1
Natriumchlorid	0,5
Geingfügige Zusätze und Wasser	auf 100%

Der pH-Wert kann auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt werden. Das Enzym ist eine Protease gemäß der Mutante S020. In alternativen Versionen dieses Waschmittels ist das Enzym ausgewählt aus S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223–6 oder S235.
Waschmittel D13

Natriumalkylbenzolsulfonat	8
Nichtionisches Waschmittel 6,5 EO	10
Oleinsäurediethylamid	10
Fettsäure (C₁₂/C₁₈ 75 : 25)	18
Natriumcitrat	1
Triethanolamin	5
Propanol	7
Ethanol	5
Dequest 2060	0,5
Protease	0,5
Amylase	0,1
Geringfügige Zusätze und Wasser	auf 100%

Der pH-Wert kann auf einen Wert zwischen 9 und 10 eingestellt werden. Das Enzym ist eine Protease gemäß Mutante S020. In alternativen Versionen dieses Waschmittels ist das Enzym ausgewählt aus S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223–6 oder S235.
Waschmittel D14

Eine nichtwässrige flüssige Waschmittelzusammensetzung wird derart formuliert, dass sie enthält (% bezogen auf das Gewicht):

flüssiges nichtionisches Waschmittel (C_10-12 6,2 EO)	41%
Triacetin	5
lineare Alkylbenzolsulfonsäure	6
Magnesiumoxid-Stabilisierungsmittel	1
Natriumcarbonat-Builder/Base	18
Calciumcarbonat-Builder	8
Bleichmittelaktivator TAED	3,5
Perboratmonohydrat-Bleichmittelvorstufe	10,5
teilweise-hydrophobes Silica	2
Protease	0,4
Lipase (Lipolaseη)	3
Geringfügige Zusätze oder zusätzliche flüssige nichtionisches Tensid (kein Wasser) auf	100%

Bei der Formulierung dieser Zusammensetzung werden das flüssige nichtionische Tensid und Triacetin als erstes zugesetzt, gefolgt von Magnesiumoxid und daran anschließend die anderen Bestandteile, ausgenommen das Enzym. Das Gemisch wird in einer Kolloidmühle gemahlen und gekühlt und abschließend wird/werden das/die Enzym(e) und jeder der anderen Wärmeempfindlichen geringfügigen Zusätze zugegeben.
Das Enzym ist eine Protease der Mutante S020. In alternativen Versionen dieses Waschmittels ist das Enzym ausgewählt aus S019, S012, S004, S001, S003, S005, S021, S025, S035, S201, S202, S223–6 oder S235.
Auch geeignet sind Waschmittelformulierungen wie sie in EP 0342177 beispielhaft veranschaulicht sind, mit Proteasemutanten wie sie in dem vorstehenden Beispiel D3 erwähnt sind.
Ergebnisse
Erzeugen von ortsspezifischen Mutationen in dem Subtilisin 309-Gen
Ortsspezifische Mutationen wurden entsprechend dem Verfahren von Moringa et al. (Biotechnology, vorstehend) durchgeführt. Die nachfolgenden Oligonucleotide wurden zum Einführen der Mutationen verwendet:
a) Gly 195 Glu (G195E (S001))
Ein 27-mer Fehlpaarungs-Primer, Nor-237, der auch eine neue SacI-Restriktionsstelle erzeugt:
b) Arg 170 Tyr (R170Y (S003))
Ein 25-mer Fehlpaarungs-Primer, Nor-577, der eine HaeIII-Stelle zerstört:
c) His 120 Asp (H120D (S006))
Ein 32-mer Fehlpaarungs-Primer, Nor-735, der eine SphI-Stelle zerstört:
d) Lys 251 Glu (K251E (S005))
Ein 32-mer Fehlpaarungs-Primer, Nor-736, der eine XhoI-Stelle erzeugt:
e) Lys 235 Leu (K235L (S015))
Ein 24-mer Fehlpaarungs-Primer, Nor77-856, der eine PstI-Stelle erzeugt:
f) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu (R170Y; G195E (S004))
Eine Kombination aus Nor-577 und Nor-237 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
g) Gly 195 Glu; 251 Glu (G195E; K251E (S018))
Eine Kombination aus Nor-237 und Nor-736 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
h) Arg 170 Tyr; Lys 251 Glu (R170Y; K251E (S011))
Eine Kombination aus Nor-577 und Nor-736 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
i) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 251 Glu (R170Y; G195E; K251E (S012))
Eine Kombination aus Nor-577, Nor-237 und Nor-736 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
j) Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (G195E; K235L)
Eine Kombination aus Nor-237 und Nor-856 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
k) Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (R170Y; G195E; K235L)
Eine Kombination aus Nor-577, Nor-237 und Nor-856 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
l) His 120 Asp; Lys 235 Leu (H120D; K235L (S016))
Eine Kombination aus Nor-735 und Nor-856 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
m) His 120 Asp; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D; G195E; K235L (S017))
Eine Kombination aus Nor-735, Nor-237 und Nor-856 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
n) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu (H120D; R170Y; G195E; K235L (S019))
Eine Kombination aus Nor-735, Nor-577, Nor-237 und Nor-856 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
o) His 120 Asp; Arg 170 Tyr; Gly 195 Glu; Lys 235 Leu; Lys 251 Glu (H120D; R170Y; G195E; K235L; K251E (S020)
Eine Kombination aus Nor-735, Nor-577, Nor-237, Nor-856, and Nor-736 wurde analog zu dem vorstehenden durchgeführt.
Die Lücken-erzeugende (gapped) Duplex-Mutagenese wurde unter Verwendung der Plasmide pSX93, pSX119 und pSX120 als Templats durchgeführt.
pSX93 ist in 3 dargestellt und ist pUC13 (Vieira, J. und Messing, J., 1982, Gene 19: 259–278), der ein 0,7 kb XbaI-HindIII Fragment des Subtilisin 309-Gens umfasst, das den in den Polylinker eingefügten Terminator einschließt.
Zum Einführen von Mutationen in den N-terminalen Teil des Enzyms wurde das Plasmid pSX119 verwendet. pSX119 ist pUC13, der ein EcoRI-XbaI-Fragment des in den Polylinker eingefügten Subtilisin 309-Gens umfasst. Die Template pSX93 und pSX119 umfassen somit das gesamte Subtilisin 309-Gen.
Das Plasmid pSX120 ist ein Plasmid, in dem das HpaI-HindIII-Fragment mit dem Subtilisin 309-Gen von pSX88 in EcoRV-HindIII auf pDN 1681 derart eingefügt ist, dass das Protease-Gen durch die amy M- und amy Q-Promotoren exprimiert wird. pDN 1681 wird aus pDN 1380 erhalten (Diderichsen, B. und Christiansen, L., 1988, FEMS Microbiology Letters 56: 53–60) mit einem eingefügten 2,85 Bp ClaI-Fragment von B. amyloliquefaciens, das das amy Q-Gen mit dem Promotor trägt (Takkinen et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 1007 ff.). Die Konstruktion von pSX120 ist in 1 ausgeführt, die zeigt, dass pDN 1681 mit EcoRV und HindIII geschnitten ist, und pSX88 mit HindIII und HpaI, wonach die Ligation zu pSX120 führt, der durch die amy M- und amy Q-Promotoren reguliert wird.
Vier weitere Plasmide pSX170, pSX172, pSX173 und pSX186 wurden für die Lücken-erzeugende (gapped) Duplex-Mutagenese des Subtilisin 309-Gens konstruiert:

– pSX170: SphI-KpnI, 700 Bp aus pSX120, inseriert in pUC 19 SphI-KpnI, aus dem Aminosäurerest 170 in reifem Subtilisin 309 an den Terminator.
– pSX172: EcoRI-SphI, 1360 Bp von pSX120, inseriert in pUC 19 EcoRI-SphI, aus dem Promotor an den Aminosäurerest 170 in reifem Subtilisin 309.
– pSX173: wie pSX170, aber mit G195E.
– pSX186: PvuII-EcoRI, 415 Bp aus pSX120, inseriert in pUC 19 HincI-EcoRI, aus dem Aminosäurerest 15 an den Aminosäurerest 206 in reifem Subtilisin 309.

2 zeigt eine etwas genauere Restriktionskarte von pSX120, auf der gekennzeichnet ist, welche Fragmente für die Konstruktion der Plasmide pSX170, pSX172, pSX173 und pSX186 verwendet wurden.
Die Mutation a) wurde durch Schneiden von pSX93 mit XbaI und ClaI ausgeführt, wie in 3 ausgewiesen und in dem Abschnitt "GENERATION OF SITE DIRECTED MUTATIONS IN THE SUBTILISIN GENE" und in der unveröffentlichten Patentanmeldung PCT/DK88/00002 (NOVO INDUSTRI A/S) beschrieben.
Die Mutationen b), d) und e) wurden dementsprechend durch Schneiden von pSX170 mit SphI und KpnI durchgeführt.
Die Mutationen f) und g) wurden wie vorstehend ausgeführt, jedoch mit pSX173 anstelle von pSX170.
Die Mutation c) wurde dementsprechend durch Schneiden von pSX186 mit PstI und EcoRI durchgeführt.
Die Mutationen h) bis o) wurden durch Kombination der DNA-Fragmente mit den einzelnen oder doppelten Mutationen b) bis g) unter Verwendung der Restriktionsstellen NheI, XbaI, ClaI, AvaII und KpnI, wie erforderlich, konstruiert.
Weitere Mutanten wurden unter Anwendung ähnlicher Verfahren oder allgemeiner, aus der Literatur bekannter Verfahren hergestellt.
Subtilisin Carlsberg-Mutanten
Für bestimmte beispielhafte Mutationen in Subtilisin-Carlsberg, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, wurden die nachfolgenden Veränderungen in der Nucleotidsequenz des Gens eingeführt:
Asp 14 Lys (D14K (C001)) (GAT -> AAG)
Asp 120 Lys (D120K (C002)) (GAT -> AAA)
Asp 140 Lys (D140K (C003)) (GAC -> AAA)
Asp 14 Lys + Asp 120 Lys (D14K + D120K (C004))
Lys 27 Asp (K27D (C005)) (AAA -> GAT)
Lys 27 Asp + Asp 120 Lys (K27D + D120K (C006))
Asp 172 Lys (D172K (C008)) (GAC -> AAA)
Asp 14 Lys + Asp 120 Lys + Asp 140 Lys + Asp 172 Lys (D14K + D120K + D140K + D172K (C010))
Val 51 Asp (V51D (C100))
Glu 54 Thr (E54T (C101)) (GGG -> ACA)
Glu 54 Tyr (E54Y (C102)) (GGG -> TAT)
Diese Veränderungen wurden eingeführt, indem die entsprechenden Oligos in den betreffenden Fragmenten verändert wurden. Die Korrektheit der neuen Sequenzen wurde bestimmt, wonach die ursprünglichen Oligos durch diese neuen Sequenzen ersetzt wurden und zu neuen DNA-Fragmenten zusammengesetzt wurden. Abschließend wurden die Fragmente in das neue Subtilisin-Carlsberg eingebaut.
Expression von Subtilisinmutanten
Nachdem die Korrektheit der Mutation durch die Sequenzanalyse bestätigt wurde, wurden die mutierten DNA-Fragmente in das Plasmid pSX92 oder pSX120 eingeführt, die zum Erzeugen der Mutanten verwendet wurden.
Das Plasmid pSX92 ist in 4 dargestellt und es wurde durch Klonieren des Sub 309-Gens in das bei ClaI geschnittene Plasmid pSX62, aufgefüllt mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und mit HindIII vor der Insertion der Fragmente DraI-NheI und NheI-HindIII aus dem klonierten Sub 309 Gen geschnitten, erzeugt.
Zur Expression der Mutanten wurden die mutierten Fragmente (XbaI–ClaI, HbaI–HindIII oder EcoRI–XbaI) aus dem sachgerecht mutierten Plasmid pSX93, pSX119, pSX170, pSX172, pSX173 bzw. pSX186 ausgeschnitten und in pSX92 oder pSX120 eingefügt, um Plasmid zu gewinnen, die verschiedene Mutanten exprimieren können.
Das mutierte pSX92 oder pSX120 wurde anschließend zum Transformieren von B. subtilis DN497 verwendet.
Die transformierten Zellen wurden dann auf LB-Agar-Platten mit 10 mM Phosphat, pH 7,6 μg/ml Chloramphenicol und 0,2% Xylose ausgestrichen, um den xyn-Promotor in dem Plasmid zu induzieren. Die Platten enthielten auch 1% Magermilch, damit die Protease-erzeugenden Mutanten durch die klare Halo nachgewiesen werden können, die durch den Abbau der Magermilch entsteht.
Nach ausreichendem Wachstum wurden die Mutanten gewonnen und gereinigt.
Fermentierung von Subtilisin Carlsberg-Spezies
Um das Protease-Enzym auf der Basis der Mikroorganismen, die die Gen-Mutanten für BPN' wie vorstehend beschrieben tragen, wird ein Chemoferm-Fermenter des Rushton-Typs im Allgemeinen mit einem Acht-Flachflügel-Schnellrührer und einem Arbeitsvolumen von 8 Litern verwendet. Die Konfiguration des Fermenters wurde gemäß den Sicherheitsbestimmungen für VMT hergestellt und besteht aus:

a) Druck-Kontrolleinheit (Typ 4-3122, Bell & Howell), die bei einem Überdruck von 0,1 Bar das Luftzubehör abschaltet. Das erfolgt, um das Verstopfen des Luftablassfilters zu verhindern.
b) Schaumabscheider auf der Gas-Ablassvorrichtung, hergestellt aus einem 20 l-Druckgefäß mit Anti-Schaummittel auf dem Boden.
c) Wasserkühlmantel ohne Dichtungen, um die Verunreinigung des Kühlwassers oder des Wasserabflusses zu verhindern.
d) Es wird ein Maschinenabgasfilter verwendet (Gelman acro 50, 0,45 μm).
e) Die Probenentnahme erfolgt durch ein Pumpenzubehör mit einem geringen Innenvolumen.

Steuerungen
Die Gasflüsse wurden mittels eines Massen-Fluss-Meters (Brooks, Typ 5852, Bereich 0–10 l) gesteuert.
Der pH-Wert wurde mittels eines Hartmann- und Braun-Zeichengebers und einer Philips-Steuereinheit (Witromat) gesteuert. Als Neutralisierungsmittel wurde konzentrierte NaOH (3 M) verwendet.
Die Abgase wurden mittels eines Unor 4N (CO₂) und eines Oxygor 7N (O₂) von Maihak, Westinghouse, analysiert. Der Sauerstoffdruck in dem Medium wurde mittels einer industriellen polarografischen sterilisierbaren Sauerstoffsonde (Ingold, Typ 322756702) bestimmt.
Die Mediumtemperatur wurde mittels eines PT100-Sensors und einer Honeywell-Temperatur-Kontrolleinheit (Klasse 84) bestimmt.
Durch eine Kontaktelektrode wurde die Schaumbildung auf einem verträglichen Niveau gehalten, da eine Schalteinrichtung eine Anti-Schaum-Dosierungspumpe aktiviert.
Alle äußeren Kontrolleinheiten wurden durch einen Hewlett-Packard-Mikrocomputer (HP 220) gesteuert.
Kultivierungsbedingungen
Die Impflösungen wurden hergestellt, indem ein Schüttelkulturgefäß 16 h bei 30°C und 250 U/min in einem Rotationsschüttler (LH-Fermentation, Typ MKx) inkubiert wurde. 300 ml Impflösung wurden für 8 l Medium verwendet, das auf die tatsächlichen Fermentierungsbedingungen konditioniert ist (pH 7,0, 30°C, Luftfluss 3,5 l/min., Rührer 1000–1500 U/min). Die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde 25% oberhalb der Luftsättigung gehalten. Als Anti-Schaummittel wurde ein auf Silikonöl basierendes Material verwendet (Rhodorsil R426, Rhone-Poulenc).
Herstellung von Subtilisinprotease
Die Proteasen(mutanten) wurden unter Verwendung des B. subtilis DB105-Stamms hergestellt, der die unter Gen-Konstruktion beschriebene Gen-Mutante enthält. Das Kulturmedium besteht aus: 8 g/l NH₄Cl; 4 g/l KH₂PO₄; 4 g/l K₂HPO₄; 2 g/l NaCl; 1 g/l MgSO₄ × 2H₂O; 10 g/l Hefeextrakt; 2 g/l Saccharose; pH 7,0 und 45 min bei 120°C sterilisiert. Nach der Sterilisation wurden 25 mg/l Tryptophan; 20 mg/l Neomycin zugesetzt. Die Fermentierungen wurden nach 20–30 Stunden beendet. Aus den Medien wurden die Zellen durch Zentrifugierung abgetrennt.
Proteolytische Aktivität von Subtilisinmutanten
Die proteolytische Aktivität verschiedener Mutanten wurde gegen Casein als Proteinsubstrat gemäß dem DMC-Verfahren (vorstehend) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV dargestellt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass die Mutante (S005) eine geringfügig erhöhte Aktivität im Vergleich zu dem Stammenzym (S000) aufweist, wohingegen die verbleibenden Mutanten eine geringfügig verringerte Aktivität aufwiesen. Tabelle IV Proteolytische Aktivität von Subtilisinmutanten

Mutante Relative Aktivität

Keine (S000) 100

S001 95

S003 90

S004 85

S005 105

S006 100

S012 80

S017 90

S019 70

S020 75

S024 70
Waschverhalten von Subtilisinmutanten
A
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten in einer herkömmlichen Waschmittelflüssigkeit mit einem pH-Wert von 8,14 wurde in einem Modellsystem gegen Grassaft gemäß den in supra genauer beschriebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt.
Tabelle V ΔR-Werte
Aus der Tabelle ist ersichtlich, dass alle getesteten Mutanten ein verbessertes oder ein gleiches Waschverhalten im Vergleich zu dem Wildtyp-Stammenzym aufwiesen. Das Waschverhalten der Mutanten S019 und S020 wird verbessert, sodass schätzungsweise 1,0 mg/l dieser Enzyme, in der Lage sein soll ten, 10,0 mg/l eines Wildtyp-Stammenzyms zu ersetzen, was eine wesentliche Verbesserung in dem Waschverhalten für die Enzym-Mutanten der vorliegenden Erfindung darstellt.
B
Die Ergebnisse aus den Tests einiger der Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung in einer modifizierten kommerziellen Waschmittelflüssigkeit aus den USA bei verschiedenen pH-Werten in einem Modellsystem sind in Tabelle VI dargestellt.
Tabelle VI Waschverhalten bei verschiedenen pH-Werten
Die Ergebnisse zeigen klar, dass das Verschieben des pI₀ eines Enzyms in eine Richtung, in der es gewünscht ist, das pH-Optimum für das Waschverhalten des Enzyms zu verschieben, um den pH der Waschflüssigkeit anzunähern, das Waschverhalten des Enzyms verbessert.
D
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten wurde gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien gemäß dem in Assay A beschriebenen Verfahren getestet.
Es wurden 2,0 g/l einer Waschmittelflüssigkeit (Waschmittel D3) verwendet. Das Waschmittel wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaOH/HCl auf 9,1 eingestellt.
Die Temperatur wurde 10 min isotherm auf 20°C gehalten.
Die Dosierung der Mutanten betrug jeweils 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 und 10,0 mg Enzymprotein/l.
Die Stabilität der getesteten Mutanten wurde durch Messen der Denaturierungstemperatur (Maximum überschüssige Wärmekapazität) mittels differentieller abtastender Kalorimetrie, DSC, bestimmt. Die Erwärmungsgeschwindigkeit betrug 0,5°C/min.
Die Stabilität wurde in einer Lösung getestet, enthaltend annähernd 2 mg/ml der Mutante in 91% herkömmlicher Waschmittelflüssigkeit, deren Zusammensetzung in Assay A beschrieben ist. Die Lösung wurde hergestellt, indem 100 μl Enzymlösung (annähernd 20 mg Enzym/ml in einem Puffer aus 0,01 M Dimethylglutarsäure, 0,002 M CaCl₂, 0,2 M H₃BO₃ und 0–0,1 M NaCl pH 6,5) mit 1000 μl herkömmlicher Waschmittelflüssigkeit vermischt wurden.
Innerhalb der Gruppe der Subtilisin 309-Mutanten stimmten die durch DSC erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Stabilität mit den Ergebnissen überein, die durch die üblichen Tests bezüglich der Lagerungsstabilität erhalten wurden.
Ergebnisse
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten in Waschmittelflüssigkeit ist in Tabelle VII dargestellt. Die Ergebnisse sind als Faktoren der Verbesserung in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym angegeben. Der Faktor der Verbesserung ist wie in Assay C definiert.
In Tabelle VII ist auch die durch DSC ermittelte Denaturierungstemperatur in einer herkömmlichen Waschmittelflüssigkeit sowie die Unterschiede zwischen der Denaturierungstemperatur des Wildtyp-Stammenzyms und der in Frage kommenden Mutante dargestellt.
Tabelle VII
Aus Tabelle VII ist ersichtlich, dass alle der gestesteten Mutanten ein verbessertes Waschverhalten im Vergleich zu dem Wildtyp-Stammenzym aufweisen. Das beste Waschverhalten wird durch Mutanten erreicht, deren pI₀ gleich dem pH der Waschlösung ist oder darunter liegt.
Die mittels DCS bestimmte Denaturierungstemperatur zeigt, dass die Stabilität der einzelnen Mutanten S021 (*36D) und S201 (N76D) um 4,0°C bzw. 4,2°C in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym erhöht ist.
Es ist gezeigt worden, dass von den Mutationen, die in einer oder in mehreren der in Tabelle VII aufgeführten Mutanten eingebaut ist, die Mutationen R170Y und K251E die Mutante im Vergleich zu dem Wildtyp-Stammenzym destabilisieren, wohingegen die Mutationen H120D, G195E und K235L im Hinblick auf die Stabilität keinen Unterschied aufweisen.
Aus Tabelle VII ist ersichtlich, dass die Mutanten, die eine destabilisierende Mutation enthalten, sogar in den Fällen destabilisiert werden, in denen stabilisierende Mutationen eingeschlossen sind.
Die stabilisierenden Wirkungen von *36D und N76D sind additiv. Das ist anhand der Mutanten S025 und S035 ersichtlich. S025 enthält drei Mutationen, die sich bezüglich der Stabilität und der stabilisierenden Mutation *36D nicht unterscheiden. Die Denaturierungstemperatur für S025 steigt um 3,9°C in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym, was dem Anstieg entspricht, der für die einzelne Mutante *36D, S021 gemessen wurde. S035 enthält die gleiche Mutation N76D. Die Denaturierungstemperatur für S035 steigt um 7,3°C in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym, was, innerhalb des Versuchsfehlers, der Summe des Anstiegs entspricht, der für die einzelnen Mutanten *36D, S021 und N76D, S201 gemessen wurde.
E
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien gemäß dem in Assay A beschriebenen Verfahren wurde getestet.
Es wurden 2,0 g/l der Waschmittelflüssigkeit D3 verwendet. Das Waschmittel wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Der pH-Wert wurde mit NaOH/HCl auf 9,1 eingestellt.
Die Temperatur wurde 10 min isotherm auf 30°C gehalten. Die Dosierung der Mutanten betrug jeweils 1,0 und 10,0 mg Enzymprotein/l.
Ergebnisse
Das Waschverhalten der drei Mutanten in einer herkömmlichen Waschmittelflüssigkeit aus den USA wurde gegen Grassaft getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII dargestellt.
Tabelle VIII
Aus Tabelle VIII ist ersichtlich, dass alle der Mutanten in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym ein verbessertes Waschverhalten aufweisen. Weiterhin ist ersichtlich, dass das beste Waschverhalten durch die Mutante erreicht wird, deren pI₀ dem pH der Waschlösung am nächsten ist.
F
Das Waschverhalten von zwei Mutanten wurde gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien gemäß der in Beispiel E beschriebenen Bedingungen getestet.
Ergebnisse
Das Waschverhalten von zwei Mutanten in Waschmittel D3 wurde gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX dargestellt.
Tabelle IX
Aus Tabelle IX ist ersichtlich, dass alle die Mutanten in Bezug auf das Wildtyp-Stammenzym ein verbessertes Waschverhalten aufweisen. Weiterhin ist ersichtlich, dass das beste Waschverhalten durch die Mutante erreicht wird, deren pI₀ dem pH der Waschlösung am nächsten ist.
G
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien gemäß dem in Assay A beschriebenen Verfahren wurde getestet.
Es wurden 2,0 g/l des Waschmittels D3 verwendet.
Das Waschmittel wurde in Puffer gelöst (0,0025 M Borsäure und 0,001 M Dinatriumhydrogenphosphat, hergestellt in entionisiertem Wasser). Der pH wurde mit NaOH/HCl auf 7,0, 8,0, 9,0 bzw. 10,0 eingestellt. Die Temperatur wurde 10 min isotherm auf 30°C gehalten.
Die Dosierung der Mutanten betrug jeweils 0,2 mg Enzymprotein/l.
Das Waschverhalten einiger der Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen pH-Werten in einem Modellsystem ist in Tabelle X dargestellt.
Tabelle X
Die Ergebnisse in Tabelle X zeigen klar, dass das Verschieben des pI einer Protease zu dem pH der Waschflüssigkeit das Waschverhalten der Protease verbessert.
Die Ergebnisse zeigen auch, dass alle getesteten Varianten bei einem pH unter 10,0 ein verbessertes Waschverhalten im Vergleich zu dem Wildtyp-Stammenzym aufweisen.
H
Das Waschverhalten verschiedener Mutanten gegen mit Grassaft gefärbte Baumwolltextilien gemäß dem in Assay A beschriebenen Verfahren wurde getestet.
Es wurden 2,0 g/l der Waschmittelflüssigkeit D3 verwendet. Das Waschmittel wurde in 0,005 M Glycin, hergestellt in entionisiertem Wasser, gelöst. Der pH wurde mit NaOH auf 10,0, 10,25, 10,50, 10,75, 11,0, 11,5 bzw. 12,0 eingestellt. Die Temperatur wurde 10 min isotherm auf 30°C gehalten.
Die Dosierung der Mutanten betrug jeweils 0,2 mg Enzymprotein/l.
Das Waschverhalten einiger der Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen pH-Werten in einem Modellsystem ist in Tabelle XI dargestellt. In diesem Fall wurden Varianten untersucht, die einen geringfügig höheren pI aufweisen als das Wildtyp-Stammenzym. Der pH im Bereich von pH 10,0 bis 12,0 wird genauer als in den vorhergehenden Beispielen untersucht.
Tabelle XI
Die Daten in Tabelle XI zeigen, dass bei hohen pH-Werten das maximale Waschverhalten bei pH-Werten erreicht wird, die etwas oberhalb des berechneten pI liegen. Wird der pI der Protease noch weiter erhöht, steigt der pH des maximalen Waschverhaltens. Diese Wirkungen sind nicht so ausgeprägt, wie bei geringen pH-Werten (Assay B oder G).
I
Um die Korrelation zwischen dem isoelektrischen Punkt der Protease und dem pH, an dem die Protease ihr maximales Waschverhalten besitzt, zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse aus den Beispielen B, G und H dazu genutzt, den pH zu ermitteln, an dem jede der untersuchten Varianten (und das Wildtyp- Stammenzym) ihr maximales Waschverhalten besitzt. In 5 ist dieser pH_max als Funktion des berechneten pI₀ dargestellt.
Wenn in Betracht gezogen wird, dass der pH-Bereich in Schritten von 1,0 bezüglich des pH-Werts untersucht wird, dann ist die Korrelation offensichtlich.
Im Hinblick auf die Kombination der Mutanten der vorliegenden Erfindung mit Lipase führten die Versuchsergebnisse zu den nachfolgenden praktischen Schlussfolgerungen:
Lipase war eine Stunde bei 37°C in einer Waschflüssigkeit des Typs O stabil. Die Anwesenheit von Savinase^® führte zu einer schnellen Desaktivierung. Kazusase^® führte im Verlauf des Tests zu einer wesentlich geringeren Inaktivierung der Lipase.
Es war ersichtlich, dass Proteinase K gegenüber Lipase weniger aggressiv ist als Savinase^®, aber mehr als Kazusase^®. Subtilisin BPN' inaktivierte Lipase jedoch unter allen diesen Bedingungen nicht.
Bevorzugte Protease für die Verwendung z. B. in Verbindung mit Lipase in durch den Typ 0 dargestellten Waschmittelzusammensetzungen sind die Mutanten S001, S003, S004, S012, S019, S020, S021, S025, S035, S235.

Eine Waschlösung des Typs 0 war eine 5 g/l Lösung bei 37°C, abgeleitet von der nachfolgenden Waschmittelformulierung (% bezogen auf das Gewicht):

Anionisches Tensid	6
Nichtionisches Tensid	5
Fettsäure	2,8
Acryl-Polymer	3
Zeolith	22
Carbonat	10
Sulfat	17,5
Tonpartikel	g
Tertiäres Amin	2
Perboratmonohydrat	13
Geringfügige Zusätze und Wasser	auf 100

Bevorzugte Protease für die Verwendung z. B. in Verbindung mit Lipase in durch den Typ W dargestellten Waschmittelzusammensetzungen sind die Mutanten S020, S021, S025, S035, S235.
Eine Waschlösung des Typs W war eine 2 g/l Lösung eines flüssigen Waschmittels mit der nachfolgenden Formulierung (% bezogen auf das Gewicht):

Anionisches Tensid 16

Nichtionisches Tensid 7

Hydrotrop 6

Zitronensäure 6,5

NaOH 4,1

Monoethanolamin 2

Geringfügige Zusätze und Wasser auf 100
Obwohl die vorliegende Erfindung in Verbindung mit verschiedenen speziellen Ausführungsformen beschrieben und beispielhaft veranschaulicht worden ist, bedeutet das keine Einschränkung im Hinblick auf die Anwendbarkeit und den Umfang der Erfindung, die sich auf alle Kombinationen und Subkombinationen der vorstehend erwähnten und beschriebenen Merkmale als auch der beigefügten Ansprüche erstrecken.

Claims

Enzymatische Waschmittelzusammensetzung, umfassend eine mutierte Subtilisinprotease, wobei die molekulare elektrostatische Netto-Ladung der Protease im Vergleich zu der Stammprotease bei dem gleichen pH-Wert so geändert wurde, dass es in der Protease im Verhältnis zu der Stammprotease weniger oder mehr positiv geladene Aminosäurerest(e) und/oder mehr oder weniger negativ geladene Aminosäurerest(e) gibt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Mutation unter den Aminosäureresten an beliebigen von einer oder mehreren Positionen 1, 2, 3, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 27, 40, 43, 44, 51, 52, 60, 61, 62, 91, 98, 100, 105, 106, 108, 112, 113, 117, 133, 134, 137, 141, 143, 144, 145, 146, 165, 167, 173, 183, 184, 185, 191, 192, 209, 210, 211, 239, 240, 242, 243, 244, 245, 247, 252, 253, 255, 256, 257, 259, 263, 269, 272, durch Deletion, Substitution oder Insertion (einfach oder mehrfach) benachbart zu den ausgewiesenen Positionen bewirkt wird, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Protease eine mutierte Subtilisinprotease darstellt, umfassend eine oder mehrere Mutationen, ausgewählt aus den Reihen S005, S011, S012, S013, S014, S018, S022, S024, S204, worin: S011) R170Y + K251E S012) R170Y + G195E + K251E S013) T71D + R170Y + K251E S014) T71D + R170Y + G195E + K251E S018) G195E + K251E S022) *36D + R170Y + G195E + K251E S024) *36D + H120D + R170Y + G195E + K235L + K251E S204) H120D + G195E + K235L + K251E

wobei die Subtilisinprotease einen isoelektrischen pH (pI₀) unterhalb jenem von der Stammprotease aufweist.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease auf Subtilisin 147 als dem Stammsubtilisin basiert.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease auf Subtilisin Carlsberg als dem Stammsubtilisin basiert.
Waschmittelzusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Protease auf Bacillus PB92-Protease als dem Stammsubtilisin basiert.
Waschmittelzusammensetzung nach Ansprüchen 1–4, formuliert als Waschpulver, das Phosphat- oder Zeolithbuilder, anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Acryl- oder äquivalentes Polymer, Perboratbleichmittelvorstufe, Aminoenthaltenden Bleichmittelaktivator, Silicat oder anderes Strukturierungsmittel, Alkali zum Einstellen des gewünschten pH-Werts bei der Verwendung und neutrales anorganisches Salz enthält.
Waschmittelzusammensetzung nach Ansprüchen 1–4, formuliert als wässriges Flüssigwaschmittel, das anionisches Tensid, nichtionisches Tensid, Feuchthaltemittel, organische Säure, basisches Alkali mit einem pH, eingestellt auf einen Wert zwischen 9 und 10, umfasst, wobei ein pH-Wert zwischen 9 und 10 eingestellt ist.
Waschmittelzusammensetzung nach Ansprüchen 1–4, formuliert als eine nichtwässrige Waschmittelflüssigkeit, die ein flüssiges nichtionisches Tensid, das im Wesentlichen aus linearem alkoxyliertem primärem Alkohol, Triacetin, Natriumtriphosphat, basischem Alkali, Perboratmonohydratbleichmittelvorstufe und tertiärem Aminbleichmittelaktivator besteht, wobei ein pH-Wert zwischen 9 und 10 eingestellt ist.
Waschmittelzusammensetzung nach Ansprüchen 1–4, formuliert als Waschmittel(Seifen)riegel, der Seife, die auf einem in einem Seifensiedekessel verseiften (pan-saponified) Gemisch von Talg- und Kokosnussöl basiert, neutralisiert mit Orthophosphorsäure, gemischt mit Protease, auch vermischt mit Natriumformiat, Borax, Propylenglycol und Natriumsulfat, enthält, und dann in eine Seifenherstellungsstraße stranggepresst wird.