DE69833031T2

DE69833031T2 - Alkalische protease

Info

Publication number: DE69833031T2
Application number: DE69833031T
Authority: DE
Inventors: Mikio Haga-gun TAKAIWA; Mitsuyoshi Haga-gun OKUDA; Katsuhisa Haga-gun SAEKI; Hiromi Haga-gun Kubota; Jun c/o Kao Corporation Research Lab HITOMI; Yasushi Haga-gun KAGEYAMA; Shitsuw Wakayama-shi Shikata; Masafumi Wakayama-shi Nomura
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2018-10-08
Also published as: KR100832764B1; US6759228B2; KR20050099566A; EP1029920A4; KR100601189B1; US20040142837A1; KR20010030974A; ID24410A; EP1029920A1; EP1029920B1; US7297528B2; CN1280621A; WO1999018218A1; US6376227B1; DE69833031D1; CN1130462C; AU9457998A; DK1029920T3; AU732369B2; US20020064854A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine alkalische Protease, die als ein in einem Detergens inkorporiertes Enzym nützlich ist, ein dieselbe codierendes Gen, einen dieselbe produzierenden Mikroorganismus und eine Detergens-Zusammensetzung, welche dieselbe enthält.
Hintergrund der Erfindung
Protease wurde in einer Vielzahl von Detergenzien wie Wäschedetergenzien, kosmetischen Zusammensetzungen, Badezusätzen, Nahrungsmittel-modifizierenden Mitteln und pharmazeutisch wirksamen Mitteln wie Verdauungshilfen und Antiphlogistika weithin genutzt.
Von diesen werden die in Detergenzien verwendeten Proteasen in den größten Mengen im industriellen Maßstab produziert und machen daher einen bedeutenden Teil der Handelsware aus. Beispiele für solche Proteasen umfassen Alcalase, Savinase (Produkt von Novo Nordisk), Maxacal (Produkt von Genencor), Blap (Produkt von Henkel) und Protease K (KAP, Produkt von Kao Corporation).
Inzwischen wurden Versuche unternommen, die Leistung von in Detergenzien verwendeten Enzymen zu verbessern. Zum Beispiel offenbart eine Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 6-70765 ein Enzym mit einer hohen Stabilität gegenüber Hitze und einer grenzflächenaktiven Substanz. Die Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 9-121855 offenbart ein Enzym, welches auf unlösliche Proteine wie Keratin wirkt und eine hohe spezifische Aktivität hat. Die Offengelegten Japanischen Patentanmeldungen (kokai) Nr. 5-211868 und 9-121856 offenbaren ein Enzym mit einer ausgezeichneten Aktivität in einem niedrigen Temperaturbereich. Das europäische Patent Nr. 0130756 offenbart ein Verfahren zur Erhöhung der Stabilität eines Enzym gegenüber einem oxidierenden Mittel.
In vielen Fällen beinhaltet Schmutz auf Wäsche eine Vielzahl von Komponenten wie Lipide und feste Partikel, die nicht Protein sind. Daher gibt es einen Bedarf für ein Detergens mit einer ausgezeichneten Waschkraft gegenüber solchen komplexen Schmutzarten. Um der Anforderung zu entsprechen, wurde im Allgemeinen eine Vielzahl von Enzymen und grenzflächenaktiven Substanzen in ein Detergens inkorporiert.
Auch wenn eine Vielzahl von Enzymen inkorporiert ist, können ihre Wirkungen jedoch nicht voll ausgeübt werden, wenn die Enzyme in Gegenwart von komplexen Schmutzarten unstabil sind und keine konstante und ausreichende Aktivität zeigen. Konventionelle Enzyme sind in dieser Hinsicht nicht zufriedenstellend.
Offenbarung der Erfindung
Hinsichtlich des Vorstehenden haben die hier genannten Erfinder eine alkalische Protease entdeckt, welche sogar in Gegenwart einer Fettsäure in einer hohen Konzentration eine konstante Casein-abbauende Aktivität hat und sogar unter komplexen Schmutzbedingungen, z. B. Schmutzarten, welche Protein und Sebum enthalten, eine ausgezeichnete Waschkraft zeigt.
Entsprechend wird in einer Hinsicht der vorliegenden Erfindung eine alkalische Protease bereitgestellt, welche:

(a) eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 oder 2 gezeigt, umfasst oder
(b) welche die Aminosäuresequenz von (a) umfasst, in welcher eine Sequenz, in der eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, die folgenden physico-chemischen Eigenschaften hat:
(i) Wirkungs-pH-Bereich über einen breiten pH-Bereich von 4–13 wirkend und bei einem pH-Wert von 6–12 80% oder mehr der Aktivität beim pH-Optimum zeigend;
(ii) Stabiler pH-Bereich über einen pH-Bereich von 6–11 stabil, wenn bei 40°C für 30 Minuten behandelt;
(iii) Isoelektrischer Punkt mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 8,9–9,1 und
(iv) Wirkung einer Fettsäure eine Casein-abbauende Aktivität, die nicht durch Oleinsäure gehemmt wird,

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein die vorstehend beschriebene alkalische Protease codierendes Gen bereitgestellt.
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein hinterlegter erfindungsgemäßer Mikroorganismus, der hier im Folgenden beschrieben wird und der die vorstehend beschriebene alkalische Protease produziert, bereitgestellt.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Detergens-Zusammensetzung, enthaltend die vorstehend beschriebene alkalische Protease, bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkungen des pH-Wertes auf die Aktivität der alkalischen Protease KP43. 2 zeigt die Wirkungen des pH-Wertes auf die Stabilität der alkalischen Protease KP43 (40°C, 30 Minuten). 3 zeigt die Wirkungen des pH-Wertes auf die Stabilität der alkalischen Protease KP43 (10°C, 24 Stunden). 4 zeigt die Wirkungen der Temperatur auf die Aktivität der alkalischen Protease KP43. 5 zeigt die Wirkungen der Temperatur auf die Stabilität der alkalischen Protease KP43. 6 zeigt die Wirkung eines oxidierenden Mittels (50 mM Wasserstoffperoxid) auf die Aktivität der alkalischen Protease KP43. 7 zeigt die N-terminalen Sequenzen der Protease KP9860 und teilweise abgebauter Produkte davon. 8 zeigt Primersequenzen, die von einer N-terminalen Sequenz der Protease KP9860 abgeleitet wurden. 9 zeigt durch PCR amplifizierte Fragmente von 57 Bp und die Primerentwürfe.
Beste Art und Weise zur Ausführung der Erfindung
Die erfindungsgemäße alkalische Protease hat die vorstehend beschriebenen physikalisch/chemischen Eigenschaften (i) bis (iv). Von diesen ist Eigenschaft (iv) besonders wichtig. Die alkalische Protease hat eine Casein-abbauende Aktivität in Gegenwart von 10 mM Oleinsäure, ein Bestandteil von Sebum, welche so hoch ist wie in Abwesenheit von Oleinsäure.
Die erfindungsgemäße alkalische Protease hat vorzugsweise (v) ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 43.000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).
Besonders bevorzugt ist eine alkalische Protease, die zusätzlich zu den Eigenschaften (i) bis (v), die Eigenschaften (vi) bis (ix) hat, wie nachstehend beschrieben.

(vi) Wirkungstemperatur und optimale Temperatur wirkend bei einer optimalen Temperatur von 60°C–70°C und ebenfalls wirkend bei einer so niedrigen Temperatur von 20°C oder niedriger;
(vii) Wirkungen von Metallionen eine Aktivität, die durch Hg²⁺ und Cu²⁺ gehemmt wird und eine Hitzestabilität, welche durch Ca²⁺ verstärkt wird;
(viii) Wirkungen von Hemmstoffen eine Aktivität, die nicht durch Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und p-Chloroquecksilberbenzoesäure (PCMB) gehemmt wird und eine Aktivität, die durch Diisopropylfluorphosphat (DFP) und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) gehemmt wird und
(ix) Wirkungen von oberflächenaktiven Mitteln eine Aktivität, die nicht durch lineares Natriumalkylbenzolsulfonat, Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natrium-α-Olefinsulfonat oder α-Sulfofettsäureester gehemmt wird.

Die erfindungsgemäße alkalische Protease hat vorzugsweise eine in Sequenz Nr. 1 oder 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder eine solche Sequenz, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind. Xaa in den Sequenzen Nr. 1 und 2 bezieht sich auf eine beliebige Aminosäure. Bevorzugte Aminosäuren für Xaa an jeder Position in Sequenz Nr. 2 werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
Tabelle
Deletionen, Substitutionen und Additionen in der erfindungsgemäßen alkalischen Protease sind nicht besonders eingeschränkt. Die in Sequenz Nr. 1 oder 2 gezeigte Aminosäuresequenz ist jedoch in einer Höhe von 90% oder mehr konserviert.
Beispiele von alkalischen Proteasen umfassen alkalische Proteasen mit einer Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 3, 4 oder 5 gezeigt werden.
Die erfindungsgemäße alkalische Protease kann durch Züchtung der alkalischen Protease produzierenden, zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen und Sammeln des Enzyms aus der Kulturbrühe hergestellt werden. Beispiele von alkalische Protease produzierenden Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Wildstämme, die zur Gattung Bacillus gehören, und eine Transformante, die ein Gen enthält, welches ein Peptid mit der vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenz codiert. Beispiele der Wildstämme umfassen KP-43, KP-1790 und KP-9860. Mykologische Charakteristika dieser Stämme werden nachstehend gezeigt. Tabelle 1-a
(fortgesetzt in Tabelle 1-b)
Tabelle 1-b
Basierend auf den vorstehend beschriebenen mykologischen Charakteristika wurden die drei Stämme mit Bezug auf die einschlägigen Beschreibungen in „Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984) untersucht und es wurde angenommen, dass sie zur Gattung Bacillus gehören. Diese Stämme waren jedoch neue Mikroorganismen, dahingehend dass die Charakteristika dieser Arten nicht vollständig denen bekannter Arten, die zur Gattung Bacillus gehören, entsprechen. Daher wurden die drei Stämme beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305-0046, JAPAN) als Bacillus sp. KSM-KP43 (FERM BP-6532), Bacillus sp. KSM-KP1790 (FERM BP-6533) und Bacillus sp. KSM-KP9860 (FERM BP-6534) hinterlegt (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 18. September, 1996).
Um die erfindungsgemäße alkalische Protease unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Stämme herzustellen, werden die Stämme in ein Medium, enthaltend eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und essenzielle Nährstoffe, geimpft und mittels eines üblichen Verfahrens gezüchtet.
Das Sammeln und die Reinigung einer alkalischen Zielprotease aus der so erhaltenen Kulturbrühe kann gemäß konventioneller Verfahren, anwendbar auf das Sammeln und die Reinigung üblicher Enzyme, durchgeführt werden. Zum Beispiel werden die Zellen durch Zentrifugation oder Filtrierung von der Kulturbrühe getrennt und alkalische Zielprotease kann durch ein üblichen Reinigungsverfahren aus dem Überstand erhalten werden. Die so erhaltene Enzymflüssigkeit kann als solche verwendet werden oder mit einem bekannten Verfahren weiter gereinigt und kristallisiert werden.
Alternativ kann die erfindungsgemäße alkalische Protease durch die folgenden Schritte hergestellt werden: Erhalten eines die alkalische Protease codierenden Gens, Herstellung eines rekombinanten Vektors unter Verwendung des Gens, Transformieren einer Wirtszelle unter Verwendung des rekombinanten Vektors, Züchtung der erhaltenen Transformante und Sammeln der alkalischen Zielprotease aus dem gezüchteten Produkt.
Das die erfindungsgemäße alkalische Protease codierende Gen kann aus einer beliebigen der vorstehend beschriebenen Stämme cloniert werden. Die Clonierung kann mit bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele dieser Verfahren umfassen (1) das Schrotschussverfahren, umfassend die Herstellung eines DNA-Fragments durch vollständige oder teilweise Spaltung der chromosomalen DNA unter Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuclease, Kombination des Fragments in einen geeigneten Vektor und Expression durch Einführen in Escherichia coli oder Bacillus subtilis und (2) ein Verfahren, umfassend die Synthese eines geeigneten Primers und die Clonierung eines Zielgens durch PCR.
Beispiele der Nucleotidsequenz der erfindungsgemäßen alkalischen Protease werden in den Sequenzen Nr. 3 bis 5 gezeigt. Die Nucleotidsequenz ist nicht auf die Sequenz Nr. 3 bis 5 beschränkt und annehmbare Sequenzen können eine Nucleotidsequenz, codierend die Aminosäuresequenz, gezeigt in Sequenz Nr. 1 oder 2, und eine Nucleotidsequenz, codierend eine solche Aminosäuresequenz, in welcher eine oder mehrere Aminosäure deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, umfassen. Von diesen werden Nucleotidsequenzen, die durch die Sequenzen Nr. 3 bis 5 dargestellt werden, oder solche Sequenzen, in denen eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, bevorzugt. In diesen Fällen tritt Deletion, Substitution oder Addition bevorzugt innerhalb der vorstehend beschriebenen Variation der Aminosäuresequenz auf.
Um einen rekombinanten Vektor, umfassend das vorstehend beschriebene Gen, welches eine alkalische Protease codiert, herzustellen, kann das Gen in einen beliebigen Vektor, der geeignet ist, um das Gen in einem Wirt von Interesse zu exprimieren, eingebaut werden. Beispiele für Vektoren umfassen pUC18, pBR322 und pUC19 für den Fall, dass Escherichia coli als Wirt dient, und pUB110 für den Fall, dass Bacillus subtilis als Wirt dient.
Ein Wirt wird unter Verwendung des so erhaltenen rekombinanten Vektors mit einem üblichen Verfahren wie das Protoplasten-Verfahren oder das Verfahren der kompetenten Zellen transformiert. Obwohl keine bestimmte Einschränkung für den Wirt gilt, werden Mikroorganismen bevorzugt. Beispiele umfassen Gram-positive Bakterien wie Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, Gram-negative Bakterien wie Escherichia coli, zu Saccharomyces gehörende Hefen und zu Aspergillus gehörende Pilze.
Um die erfindungsgemäße alkalische Protease durch Züchtung der erhaltenen Transformante herzustellen, können die Züchtung, das Sammeln und die Reinigung in Übereinstimmung mit einem Verfahren durchgeführt werden, das in dem Fall angewendet wird, in dem der vorstehend beschriebene Wildstamm verwendet wird.
Wie vorstehend beschrieben, weist die erfindungsgemäße alkalische Protease eine ausgezeichnete Resistenz gegen alkalische Bedingungen auf und besitzt ausgezeichnete Proteaseaktivität sogar in Gegenwart von Lipiden. Daher ist die alkalische Protease nützlich für ein Enzym, das in einer Vielfalt von Detergens-Zusammensetzungen inkorporiert wird.
Es gilt keine besondere Einschränkung bezüglich der Menge der vorstehend beschriebenen alkalischen Protease, die in einer Detergens-Zusammensetzung inkorporiert wird, und die Menge ist vorzugsweise 0,1–5000 U basierend auf 1 kg, besonders bevorzugt 1–500 U der Detergens-Zusammensetzung.
Bekannte Detergens-Bestandteile können in die erfindungsgemäße Detergens-Zusammensetzung, enthaltend die alkalische Protease, inkorporiert werden. Zum Beispiel können die Bestandteile, die in WO94/26881 (S. 5 obere rechte Spalte, Zeile 14, untere rechte Spalte, Zeile 29) beschrieben werden, angewendet werden.
Eine grenzflächenaktive Substanz wird in die Detergens-Zusammensetzung in einer Menge von 0,5–60 Gewichts-% (im Folgenden einfach als „%" bezeichnet), besonders bevorzugt 10–45%, in eine pulvrige Detergens-Zusammensetzung und in einer Menge von 20–50% in eine flüssige Detergens-Zusammensetzung inkorporiert. Wenn eine erfindungsgemäße Detergens-Zusammensetzung als bleichende Detergens-Zusammensetzung oder als Detergens-Zusammensetzung für einen automatischen Geschirrspüler dient, wird eine grenzflächenaktive Substanz typischerweise in einer Menge von 1–10%, vorzugsweise 1–5%, inkorporiert.
Ein Fänger für bivalente Metallionen wird in einer Menge von 0,01–50%, vorzugsweise 5–40%, inkorporiert.
Ein alkalisches Mittel und ein anorganisches Salz werden in einer Menge von 0,01–80%, vorzugsweise 1–40%, inkorporiert.
Ein Mittel gegen Wiederablagerung wird in einer Menge von 0,001–10%, vorzugsweise 1–5%, inkorporiert.
Die Detergens-Zusammensetzung kann ein anderes Enzym als die erfindungsgemäße alkalische Protease enthalten. Beispiele umfassen Cellulase, Amylase, Protopektinase, Pektinase, Lipase, Hemicellulase, β-Glucosidase, Glucoseoxidase und Cholesterin-Oxidase. Diese Enzyme werden in einer Menge von 0,001–5%, vorzugsweise 0,1–3%, inkorporiert.
Ein Bleichmittel wie Wasserstoffperoxid oder Percarbonat wird vorzugsweise in einer Menge von 1–10% inkorporiert. Wenn ein Bleichmittel inkorporiert wird, kann ein Bleich-Aktivator in einer Menge von 0,01–10% inkorporiert werden.
Beispiele für Fluoreszenzmittel, die in die Zusammensetzung inkorporiert werden, umfassen eine Biphenylverbindung wie Cinopearl CBS-X und eine Stilben-Verbindung wie ein Fluoreszenzmittel vom DM-Typ. Das Fluoreszenzmittel wird vorzugsweise in einer Menge von 0,001–2% inkorporiert.
Die vorstehend beschriebene Detergens-Zusammensetzung kann zu einer Vielzahl von Formen wie flüssig, pulverförmig und granulär verarbeitet werden. Die Detergens-Zusammensetzung kann für Wäsche, einen automatischen Geschirrspüler, Abflussleitungen und Gebisse verwendet werden und kann als Bleichmittel verwendet werden.
Beispiele
Beispiel 1 (Durchmusterung nach alkalische Protease produzierenden Mikroorganismen)
Eine Bodenprobe (1 g) wurde in physiologischer Kochsalzlösung (10 ml) suspendiert und bei 80°C für 10 Minuten thermisch behandelt, gefolgt von Impfung in ein flüssiges Anreicherungsmedium für Protease-produzierende Mikroorganismen, wobei das Medium folgende Zusammensetzung hat, um sie damit bei 20°C zu züchten. Nachdem die Anreicherung der Unterkultur etwa dreimal in demselben Medium wiederholt wurde, wurde das gezüchtete Produkt zur Beurteilung der Proteaseproduktion auf eine Schale geschmiert und bei 20°C für 5–7 Tage gezüchtet. Die Kolonien, um die herum sich durch Dissoziation der Magermilch eine durchsichtige Zone gebildet hatte, wurden für die Gewinnung der Protease-produzierenden Mikroorganismen ausgewählt. Mittels des vorstehenden Verfahrens wurden der Stamm Bacillus sp KSM-KP43, der Stamm KSM-KP1790 und der Stamm KSM-KP9860 als alkalische Protease-produzierende Mikroorganismen erhalten. Tabelle 2 Zusammensetzung des flüssigen Anreicherungsmedium für die Durchmusterung pH11

Monokaliumphosphat 0,1%

Magnesiumsulfat 0,02%

Hefeextrakt (Difco) 0,05%

Keratin (Tokyo Kasei) 1,0%

Glucose 0,5%

Natriumcarbonat 0,3%

Agarplattenmedium für die Durchmusterung

Nähragar (Difco) 2,3%

Magermilch (Difco) 0,3%

Natriumcarbonat 1,0%
Beispiel 2
Der in Beispiel 1 erhaltene Stamm Bacillus sp KSM-KP43 wurde in ein Flüssigmedium, umfassend Polypepton S (1%), Hefeextrakt (0,05%), Kaliumphosphat (0,1%), Magnesiumsulfat (0,02%), Glucose (getrennt sterilisiert) (1%) und Natriumcarbonat (getrennt sterilisiert) (0,5%) geimpft, um damit bei 30°C für 24 Stunden gezüchtet zu werden. Die Konzentration von Enzym in der Überstandsflüssigkeit war etwa 1,5 U/l. Die Überstandsflüssigkeit, welche durch Zentrifugation bei 4°C von den Zellen getrennt wurde, wurde unter Rühren mit pulverförmigem Ammoniumsulfat versetzt, so dass eine zu 90% gesättigte Konzentration erreicht wurde. Die Lösung wurde für einen ganzen Tag und eine ganze Nacht bei 4°C unter Rühren gehalten und der entstehende Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 10 mM einer Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 5 mM Calciumchlorid, gelöst, gefolgt von Dialyse durch die Pufferlösung. Anschließend wurde die dialysierte Flüssigkeit auf eine DEAE-Sepharose-FF-Säule (Produkt von Pharmacia) aufgetragen, welche mit 10 mM einer Tris-Salzsäure-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 5 mM Calciumchlorid äquilibriert wurde, um dadurch die nicht absorbierte Fraktion zu gewinnen. Die fraktionierte Flüssigkeit wurde durch 50 mM HEPES-Pufferlösung (pH 7,5), enthaltend 2 mM Calciumchlorid, dialysiert und auf eine SP-Sepharose-FF-Säule, welche mit derselben Pufferlösung äquilibriert wurde, aufgetragen, um dadurch eine aktive Fraktion zu sammeln, welche geringfügig nach der nicht absorbierten Fraktion eluierte. Während die aktive Fraktion, welche eine Rückgewinnungrate von 15% hatte, als eine Probe verwendet wurde, wurde eine SDS-Polyacrylamidelektrophorese durchgeführt und als Ergebnis wurde eine einzelne Bande für das entsprechende Enzym erhalten.
Beispiel 3
Die erhaltenen Stämme Bacillus sp KSM-KP1790 und KSM-KP9860 wurden in demselben Medium wie in Beispiel 2 gezüchtet und die alkalische Protease wurde in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 2 gereinigt.
Beispiel 4
Die enzymatischen Eigenschaften der in den Beispielen 2 und 3 erhaltenen alkalischen Proteasen wurden untersucht. Die Verfahren und Ergebnisse der Experimente werden nachstehend beschrieben.
I. Materialien und Verfahren für die Experimente
(1) Verfahren zur Aktivitätsmessung
(a) Verfahren, in welchem Casein als Substrat verwendet wird
Nachdem 1 ml von 50 mMol/l verschiedener Pufferlösungen, enthaltend 1% (Gew./Vol.) Casein (Hammerstein: Produkt von Merck Inc.), bei 40°C für 5 Minuten gehalten wurden, wurden 0,1 ml einer Enzymlösung zu der Lösung gegeben, gefolgt von Inkubation bei 40°C für 10 Minuten. 2 ml einer TCA-Lösung (0,11 Mol/l Trichloressigsäure: 0,22 Mol/l Natriumacetat: 0,33 Mol/l Essigsäure) wurden zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und das Gemisch wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde das durch Säure denaturierte Protein filtriert (Nr. 2 Filterpapier: Produkt von Whatman). Zu 0,5 ml des Filtrats wurden 2,5 ml eines alkalischen Kupferreagenzes (1% (Gew./Vol.) Natrium-Kalium-Tartrat: 1% (Gew./Vol.) Kupfersulfat: 2% (Gew./Vol. Natriumcarbonat, 0,1 Mol/l Natriumhydroxid = 1:1:100 (Vol./Vol.) zugegeben und, nachdem die Lösung für 10 Minuten bei 30°C gehalten wurde, wurden 0,25 ml verdünntes Phenolreagenz (Phenolreagenz (Produkt von Kanto Chemical) zweifach verdünnt mit entionisiertem Wasser) zugegeben und nachdem sie für 30 Minuten bei 30°C gehalten wurde, wurde die Lösung einer Absorptionsmessung bei 660 nm unterzogen. Die folgende Lösung wurde als Leerwert verwendet: zu dem vorstehend beschriebenen System einer Enzymreaktion wurde eine Reaktionsstopplösung gemischt und dann wurde die Enzymlösung zugegeben.
Eine Einheit (P.U.) der enzymatischen Aktivität wurde als die Menge Enzym definiert, welche säurelösliche Protein-Abbauprodukte, entsprechend 1 mMol Tyrosin, pro Minute unter den vorstehenden Reaktionsbedingungen freisetzte.
(b) Verfahren, in welchem ein synthetisches Oligopeptid als Substrat verwendet wird
0,05 ml einer 50 mMol/l synthetischen Oligopeptidlösung (Succinyl-Alanyl-Alanyl-Prolyl-Leucin-Paranitroanilid, gelöst in Dimethylsulfoxid) wurden in 0,9 ml einer 100 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0, enthaltend 2 mMol/l Calciumchlorid) gemischt und, nachdem die Lösung für 5 Minuten bei 30°C gehalten wurde, wurden 0,05 ml einer Enzymlösung zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 30°C für 10 Minuten. 2 ml einer 5-%igen (Gew./Vol.) Zitronensäure wurden zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und die Absorption bei 420 nm wurde gemessen.
Eine Einheit (U) der enzymatischen Aktivität wurde als die Menge eines Enzyms definiert, welche säurelösliche Protein-Abbauprodukte, entsprechend 1 mMol Tyrosin, pro Minute unter den vorstehenden Reaktionsbedingungen freisetzte.
(c) Verfahren, in welchem Hämoglobin als Substrat verwendet wird
Gemäß dem Verfahren von Anson (M. L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79 (1983)) wurde Hämoglobin aus Rinderblutserum unter Verwendung von Harnstoff denaturiert und mit Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt. 0,1 ml einer Enzymlösung (1,0 × 10^–5–1,0 × 10^–3 A.U.) wurden zu 0,5 ml der Substratlösung (2,2% bezogen auf Hämoglobin) gegeben und die entstehende Lösung wurde für 10 Minuten bei 25°C inkubiert. Zu der entstehenden Lösung wurde 1,0 ml einer 4,9-%igen Trichloressigsäure gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach Vollendung der Reaktion wurde eine Zentrifugation (3.000 UpM, 10 Minuten) durchgeführt und die Proteinabbauprodukte in der Überstandsflüssigkeit wurden quantitativ gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren bestimmt (O. H. Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)).
Eine Einheit (A U) enzymatischer Aktivität wurde als die Menge Enzym definiert, welche säurelösliche Protein-Abbauprodukte, entsprechend 1 mMol Tyrosin, pro Minute unter den vorstehenden Reaktionsbedingungen freisetzte.
(2) Optimaler pH-Wert
0,1 ml einer Enzymlösung (3,0 × 10^–5 mP. U.) wurden zu 1 ml einer 50 mMol/l Britton-Robinson-Pufferlösung, enthaltend 1% (Gew./Vol.) Casein, gegeben und die Aktivität wurde gemäß dem Caseinverfahren gemessen.
(3) pH-Stabilität
Eine Enzymlösung (8,0 × 10^–4 mP. U.) wurde in eine Britton-Robinson-Pufferlösung (20 mMol/l, enthaltend 2 mMol/l Calciumchlorid) gemischt, gefolgt von Behandlung bei 40°C für 30 Minuten oder bei 10°C für 24 Stunden. Nach Kühlung auf Eis wurde die behandelte Lösung 40-fach mit 50 mMol/l Borsäure-Pufferlösung verdünnt, gefolgt von Messung der Restaktivität gemäß dem Verfahren, in welchem Casein als Substrat verwendet wird.
(4) Optimale Temperatur
0,1 ml der Enzymlösung (2,0 × 10^–5 mP. U.) wurden zu 1 ml einer 50 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0), enthaltend 1% (Gew./Vol.) Casein, gegeben und die Aktivität des Enzyms wurde bei Temperaturen zwischen 10 und 80°C gemäß dem Caseinverfahren gemessen.
Die Aktivitätsmessungen wurden in beiden Systemen durchgeführt, d. h. in Gegenwart und in Abwesenheit von 5 mmol/l Calciumchlorid.
(5) Hitzestabilität
Eine Enzymlösung (2,5 × 10^–4 mP. U.) wurde zu 20 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0) in beiden Systemen gegeben, d. h. in Gegenwart und in Abwesenheit von 5 mMol/l Calciumchlorid, und thermisch bei der geeigneten Temperatur für 10 Minuten behandelt. Nachdem sie mit Eis gekühlt worden war, wurde die behandelte Lösung 5-fach mit 50 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0) verdünnt und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemessen.
(6) Wirkungen von Metallionen
Eine Enzymlösung (4,0 × 10^–4 mP. U.) wurde zu 20 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0), enthaltend 1 mMol/l verschiedene Metallsalze, gegeben, und die entstehende Lösung wurde für 20 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Lösung wurde 5-fach mit 50 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0) verdünnt, gefolgt von der Messung der Aktivität unter Verwendung von Casein als Substrat.
(7) Wirkungen von Inhibitoren
Die Enzymlösung (1,0 × 10^–3 mP. U.) wurde zu 10 mMol/l Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,0), enthaltend verschiedene Inhibitoren, gegeben, so dass man eine vorherbestimmte Konzentration erhielt, und die Lösung wurde für 20 Minuten bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung 20-fach mit entionisiertem Wasser verdünnt und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemessen.
(8) Wirkungen von grenzflächenaktiven Substanzen
Eine Enzymlösung (7,0 × 10^–4 mP. U.) wurde zu 100 mMol/l Borsäure-Pufferlösung, enthaltend gelöste grenzflächenaktive Substanzen in einer Menge von 1%, gegeben und die entstehende Lösung wurde für 4 Stunden bei 40°C inkubiert. Die Lösung wurde 20-fach mit 50 mMol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10,0) verdünnt und die Restaktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemessen.
(9) Wirkungen von oxidierenden Mitteln (Wasserstoffperoxid)
2,7 ml einer Britton-Robinson-Pufferlösung, enthaltend Wasserstoffperoxid und Calciumchlorid (Endkonzentration: 50 mMol/l Wasserstoffperoxid, 2 mMol/l Calciumchlorid, 2 mMol/l Britton-Robinson) (pH 8,0), wurde für 15 Minuten bei 30°C gehalten und dann wurden 0,3 ml einer Enzymlösung zugegeben. Mit der Zeit wurde eine Probe von 0,8 ml der entstehenden Lösung in ein zuvor vorbereitetes Teströhrchen, enthaltend 5 μl Katalase (Boehringer Mannheim Co.: 20 mg/l) gegeben, um dadurch die Oxidationsreaktion zu stoppen. Jede Probe wurde in geeigneter Weise mit 2 mMol/l Calciumchlorid verdünnt und die Restaktivität wurde gemäß dem Verfahren, in welchem synthetisches Oligopeptid als Substrat verwendet wird, gemessen.
(10) Wirkungen von Fettsäuren
Unter Verwendung von 50 mM Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7), enthaltend 1% (Gew./Vol.) Casein als Substratlösung, wurde eine Reaktion in Gegenwart von 0–10 mM Natriumoleat für 15 Minuten bei 20°C ausgeführt und die Aktivität wurde unter Verwendung von Casein als Substrat gemessen.
II. Ergebnisse
(1) Optimaler pH-Wert
Die Wirkungen des pH-Werts auf drei Arten von Proteasen (KP43, KP1790 und KP9860) wurden untersucht. 1 zeigt die in Bezug auf die Aktivität bei einem optimalen pH-Wert normalisierten Aktivitäten (100%) von KP43 bei jedem pH-Wert, was zeigt, dass der optimale pH-Arbeitsbereich von erfindungsgemäßen Proteasen bei 6–12 ist. Daher zeigen diese Enzyme eine hohe proteinabbauende Aktivität im sehr breiten pH-Arbeitsbereich.
(2) pH-Stabilität
Nachdem man ihn für 30 Minuten bei 40°C oder für 24 Stunden bei 10°C stehen ließ, wurde die Restaktivität von KP43 über einen Bereich von pH-Werten gemessen. Die 2 und 3 zeigen die Restaktivitäten, die in Bezug auf die Enzymaktivität vor der Behandlung (100%) normalisiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Enzyme über einen pH-Bereich von 6–12 nach Behandlung für 30 Minuten bei 40°C stabil sind und dass der Zusatz von Calciumionen die Enzymstabilität bei pH 5 verbessert. Ähnlich zeugen die Ergebnisse, dass die erfindungsgemäßen Enzyme über einen breiten pH-Bereich von 5–12 nach Behandlung für 24 Stunden bei 10°C stabil sind.
(3) Optimale Temperatur
Unter Verwendung von Casein als Substrat wurden die Wirkungen der Temperatur auf die Proteasen untersucht. 4 zeigt die Aktivitäten von KP43 über einen Temperaturbereich, die in Bezug auf die höchste Aktivität in Abwesenheit von Calciumionen (100%) normalisiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass für alle drei Arten von Proteasen in Abwesenheit von Calciumionen die optimale Temperatur 60°C und in Gegenwart von Calciumionen 70°C ist. Daher zeigen die Ergebnisse, dass die optimale Temperatur durch Zugabe von Calciumionen nach oben verschoben wird, wie es mit konventionellen Proteasen für ein Detergens der Fall ist.
(4) Hitzestabilität
Die Hitzebehandlung wurde für 10 Minuten bei Temperaturen im Bereich von 30–80°C ausgeführt (pH 10,0 in Gegenwart und in Abwesenheit von 5 mMol/l Calciumchlorid) und die Restaktivität wurde gemessen. 5 zeigt die Restaktivität von KP43 bei jeder Behandlungstemperatur, normalisiert in Bezug auf die Aktivität vor der Behandlung (100%). Die Ergebnisse zeigen, dass die Proteasen in Abwesenheit von Calciumchlorid bei Temperaturen von bis zu 60°C stabil sind und dass die Zugabe von Calciumchlorid (5 mMol/l) die Wirkung des Verschiebens der Temperaturstabilität um etwa 10°C nach oben hat. Im Vergleich mit im Handel erhältlichen Detergensenzymen haben diese Enzyme eine hohe Temperaturstabilität, nämlich eine Stabilität, die vergleichbar zu der von Esperase ist, welche die ausgezeichnetste Temperaturstabilität unter den im Handel erhältlichen Enzymen hat.
(5) Wirkungen von Metallionen
In einer 20 mmol/l Borsäure-Pufferlösung (pH 10) wurden 3 Arten von Proteasen mit verschiedenen Metallsalzen (1 mMol/l) für 20 Minuten bei 30°C behandelt und die Restaktivität wurde gemessen. Die Restaktivität wurde in Bezug auf die Enzymaktivität, erhalten für die in derselben Art und Weise mit Ausnahme der Zugabe von Metallsalzen behandelte Protease, normalisiert (100%) (vgl. Tabelle 3.). Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität durch Quecksilberchlorid und Silbernitrat gehemmt wird, aber dass die Aktivität für andere Metallsalze extrem stabil ist. Tabelle 3
Behandlungsbedingungen: 1 mM Metallsalz, 20 mM Boratpuffer (pH 10,0), 30°C, 20 Minuten
(6) Wirkungen von Metallionen
Die Wirkungen von allgemeinen Enzyminhibitoren auf die erfindungsgemäßen alkalischen Proteasen wurden untersucht. Eine Vielzahl von Inhibitoren wurde zu 10 mMol/l Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,0) gegeben, so dass die vorherbestimmte Konzentration erreicht wurde, und die entstehende Lösung wurde für 20 Minuten bei 30°C inkubiert, wonach die Restaktivität gemessen wurde. Die Restaktivität wurde in Bezug auf die Enzymaktivität, erhalten für die in derselben Art und Weise, wie vorstehend beschrieben, behandelte Protease in Abwesenheit von Inhibitoren (100%), normalisiert (vgl. Tabelle 4). Die Ergebnisse zeigen, dass die Aktivität für alle drei Arten von Proteasen durch Diisopropylfluorphosphorsäure (DFP), Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und Chymostatin, welche bekannte Serinproteaseinhibitoren sind, gehemmt wurde. Daher wird von den erfindungsgemäßen Proteasen angenommen, dass sie einen Serinrest in ihrem aktiven Zentrum haben. Im Gegensatz dazu wurden Wirkungen von Antipin und Leupeptin aus Actinomyceten, von welchen berichtet wurde, dass sie Serinproteasen hemmen, nicht gefunden. Tabelle 4

EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure (Sigma)
EGTA:: Ethylenglycoltetraessigsäure (Sigma)
DTT:: Dithiothreit (Sigma)
PCMB:: p-Chloroquecksilberbenzoat (Sigma)
NEM:: N-Ethylmaleimid (Sigma)
DFP:: Diisopropylfluorphosphorsäure (Sigma)
PMSF:: Phenylmethansulfonylfluorid (Sigma)

(7) Wirkungen von grenzflächenaktiven Substanzen
Jede Protease wurde mit einer Vielzahl von 1-%igen grenzflächenaktiven Mitteln für 4 Stunden bei 40°C in einer 0,1 Mol/l Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung (pH 9,0) behandelt und die Restaktivität wurde gemessen. Die Restaktivität wird in Bezug auf die Enzymaktivität im Fall ohne Behandlung (100%) normalisiert (vgl. Tabelle 5), was darauf hinweist, dass die drei Arten von Enzymen gegen grenzflächenaktive Substanzen, durch lineare Alkylbenzolsulfonsäuren (LAS) gekennzeichnet sind, extrem stabil sind. Entsprechend wurden die Enzyme als nützlicher Bestandteil von grenzflächenaktiven Substanzen enthaltenden Detergenzien angesehen. Tabelle 5
Behandlungsbedingungen: 1% grenzflächenaktive Substanz, 100 mM Boratpuffer (pH 10,0), 40°C, 4 Stunden
(8) Wirkungen von oxidierenden Substanzen
Jede Protease wurde bei 30°C in 50 mMol/l Britton-Robinson-Pufferlösung, enthaltend Wasserstoffperoxid (pH 8,0), behandelt und die Restaktivität wurde in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Wie in 6 gezeigt wird, zeigte KP43 eine viel höhere Stabilität als diejenige von im Handel erhältlicher Savinase oder KAP und zeigte eine Stabilität, die so hoch war wie die von Durazym (Novo Nordisk), welche durch Übertragung der Resistenz gegenüber oxidierenden Mitteln auf Savinase unter Verwendung von Proteinmanipulationsverfahren entwickelt wurde.
(9) Wirkungen von Fettsäuren
Wie in Tabelle 6 gezeigt wird, wurde die Aktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Proteasen nicht durch Oleinsäure, einer der Bestandteile von Sebum, gehemmt.
Tabelle 6 Relative Aktivität (%) in Gegenwart von Fettsäure
Beispiel 5 (Clonierung eines die KP9860-Protease codierenden Gens)
(1) Herstellung einer genomischen DNA von KSM-KP9860
Der Stamm KSM-KP9860 wurde bei 30°C für zwei Tage in einem flüssigen Medium gezüchtet (0,5% Glucose, 0,2% Polypepton-S, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% KH₂PO₄·7H₂O, 0,26% NaCO₃: pH 9,0) (500 ml) und die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Genomische DNA wurde aus den erhaltenen Zellen durch das Verfahren von Saito und Miura (Biochim. Biophys. Act. 72, 619 (1963)) hergestellt. (2) Begrenzte Proteolyse der KP9860-Protease 1) Denaturierung der KP9860-Protease

KP9860-Protease (5 mg/ml) 45 μl

PMSF (100 mM) 20 μl

EDTA (200 mM) 10 μl

SDS (0,08 mg/ml) 25μl
Eine Proteaselösung mit der vorstehenden Zusammensetzung wurde für 10 Minuten in kochendem Wasser erhitzt. Die Proteaselösung wurde gegen Ammoniumacetat (2 mM) dialysiert, um dadurch SDS, EDTA und PMSF zu entfernen, und wurde dann lyophilisiert. Anschließend wurde die lyophilisierte Protease in destilliertem Wasser (100 μl) gelöst, um dadurch als eine Probe von denaturiertem Protein zu dienen. 2) Begrenzte Proteolyse durch Trypsin

Denaturierte Proteinprobe 100 μl

Trypsin (1 μg/ml, Sigma) 100 μl

1 M Tris-HCl (pH 7,5) 50 μl

Destilliertes Wasser 750 μl
Trypsin lies man mit dem in 1) hergestellten denaturierten Protein in einem Eisbad für 3 Stunden in der Lösung mit der vorstehenden Zusammensetzung reagieren. Nach Zugabe von 300 μl SDS (0,08 mg/ml), 100 μl EDTA (200 mM) und 200 μl PMSF (100 mM) wurde die begrenzte Proteolyse durch Erhitzen für 3 Minuten in kochendem Wasser beendet.
SDS, EDTA und PMSF wurden durch Dialyse gegen Ammoniumacetat (2 mM) entfernt und die Lösung wurde lyophilisiert. Anschließend wurde das Lyophilisat in destilliertem Wasser (100 μl) gelöst, um dadurch als Probe für SDS-PAGE zu dienen.
3) Gewinnung des teilweise degradierten Produkts
Die in 2) erhaltene Probe wurde einer SDS-PAGE mit 12% Ready-Gel-J (Produkt von Bio-Rad) unterworfen. Die Proteinbanden wurden durch Färbung mit einer Quick-CBB-Färbelösung (Produkt von Bio-Rad) nachgewiesen. Das die Proteinbande enthaltende Gel wurde mit einer Rasierklinge geschnitten und das Gelstück wurde in einem 1,5 ml-Röhrchen in Stücke zerstoßen. Der Puffer für die SDS-PAGE (Zusammensetzung: Glycin 14,4% (Gew./Vol.), Tris 3,03%, SDS (Produkt von Bio-Rad) 10%) wurde in 5 Volumina des zerstoßenen Gels zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, um dadurch die Proteinbande zu eluieren. Das Eluat wurde gegen Ammoniumacetat (2 mM) dialysiert und dann lyophilisiert. Die lyophilisierte Probe diente für den Protein-Sequencer Type 476A (Produkt von Applied Biosystem), um die N-terminale Sequenz zu bestimmen.
Die erhaltenen N-terminalen Sequenzen werden in 7 gezeigt.
(3) PCR
Primer mit 20–30 Nucleotiden für das 5'-Ende der +-Kette und das der –-Kette, entsprechend den erhaltenen N-terminalen Sequenzen, wurden synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde in einem 100 μl-Reaktionssystem unter Verwendung einer Matrizen-DNA (100 ng), einem Primer (20 pMol) und PwoDNA-Polymerase (Produkt von Boehringer Mannheim) ausgeführt. Wenn eine umgekehrte PCR durchgeführt wurde, wurde das Expand^TM longtemplate PCR-System (Produkt von Boehringer Mannheim) in einem 50 μl-Reaktionssystem verwendet. Eine unter Verwendung dieser Primer 9860-N2 und 9860-25k-RV durchgeführte PCR lieferte ein Fragment von 527 Bp.
(4) Subclonierung des PCR-Produkts
Das PCR-Produkt wurde mit einem High Pure PCR Product Purification Kit (Produkt von Boehringer Mannheim) gereinigt und in die Sma-I-Stelle von pUC18 durch Reaktion über Nacht bei 16°C mit dem Ligation-Kit Ver. 2 (Produkt von Takara) eingefügt. Das entstehende rekombinante Plasmid und die kompetenten Zellen des Stamms E. coli JM109 (Produkt von Takara) wurden gemischt und das Gemisch wurde einem Hitzeschock (42°C, 45 Sekunden) unterzogen, um dadurch die E. coli JM109-Zellen zu transformieren. LB wurde zu den Zellen gegeben. Nachdem es für eine Stunde bei 37°C gehalten wurde, wurde das Gemisch auf eine LB-Platte, enthaltend IPTG (0,1 mM, Sigma), X-GaI [0,004% (Gew./Vol.), Sigma] und Ampicillin (50 μg/ml, Sigma) aufgetragen. Die Züchtung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt und gewachsene weiße Kolonien wurden als diejenigen Transformanten ausgewählt, die das rekombinante Plasmid tragen.
(5) Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Transformante wurde über Nacht bei 37°C in LB, enthaltend Ampicillin (50 μg/ml), gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Das rekombinante Plasmid wurde unter Verwendung des High Pure Plasmid Isolation Kit (Produkt von Boehringer Mannheim) erhalten. Die PCR für die Sequenzierung wurde in einem 20 μl-Reaktionssystem unter Verwendung eines Primers und eines DNA-Sequenzierungskits (Produkt von PERKIN ELMER) durchgeführt; das erhaltene rekombinante Plasmid (1 μg) diente als Matrizen-DNA. Das Reaktionsprodukt wurde unter Verwendung einer Quick Spin-Column (Produkt von Boehringer Mannheim) gereinigt und unter Verwendung einer Evaporationszentrifuge getrocknet. Die so behandelte Probe wurde einer Analyse unter Verwendung eines DNA Sequencer Type 377 (Produkt von Applied Biosystem) unterzogen.
Das durch PCR erhaltene DNA-Fragment hatte die Aminosäuresequenz, welche mit der N-terminalen Sequenz der KP-9860-Protease übereinstimmt, und es gab beobachtete Sequenzen, welche mit allgemeinen Sequenzen nahe Asp und His hinsichtlich drei Aminosäuren (Asp, His, Ser) übereinstimmen, die ein aktives Zentrum alkalischer Proteasen wie Subtilisin bilden. Daher wurde von dem DNA-Fragment angenommen, dass es ein Teil des KP-9860-Proteasegens ist.
(6) Southern-Hybridisierung
Das KP9860-Chromosom wurde mit EcoRI, SacI, KpnI, HindIII, BamHI, XhoI, PstI und BglII behandelt. Eine Southern-Hybridisierung wurde unter Verwendung der erhaltenen 527-Bp-DNA als Sonde durchgeführt, um dadurch eine komplementäre Region nachzuweisen.
Als Ergebnis wurden Hybridisierungsbanden in anderen Spuren als der zu KpnI gehörigen Spur beobachtet.
(7) Umkehr-PCR
Die Umkehr-PCR wurde unter Verwendung von Primern (1~4 (9), die von der erhaltenen 527-Bp-Sequenz synthetisiert wurden, durchgeführt. Das KP-9860-Chromosom wurde unter Verwendung von Restriktionsenzymen, d. h. EcoRI, HindIII, PstI und BgIII vollständig gespalten und jede Probe wurde unter Verwendung des Ligation Kit Ver. 2 (Produkt von Takara) zur Ringschließung behandelt. Jede der entstehenden Reaktionsgemische diente als eine Matrizen-DNA für die Umkehr-PCR. Die PCR-Reaktion (Bedingungen: (94°C–10 Sekunden, 60°C–30 Sekunden, 68°C–4 Minuten) × 10 Zyklen; (94°C–10 Sekunden, 60°C–30 Sekunden, 68°C–4 Minuten + 20 × die Anzahl der Zyklen) × 20 Zyklen; 68°C–7 Minuten und 4°C–1 Minute) wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Matrizen-DNA (0,1 μg), der Primer 1 und 4 (jeweils 10 pMol) und dem Expand Long Plate PCR System durchgeführt. Zusätzlich wurde eine PCR (Bedingungen wie vorstehend beschrieben) unter Verwendung der Matrizen-DNA aus dem mit EcoRI gespaltenen Chromosom (0,1 μg), den Primern 2 und 3 (jeweils 10 pMol) und dem Expand Long Plate PCR System durchgeführt. Die entstehenden amplifizierten DNA-Fragmente wurden unter Verwendung des High Pure PCR Product Purification Kit gereinigt und die Enden wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Produkt von Takara) in glatte Enden umgewandelt. Jedes der erhaltenen DNA-Fragmente und das mit SmaI gespaltene pUC18 wurden gemischt und das Gemisch wurde mit dem Ligation Kit Ver. 2 behandelt. Wie vorstehend beschrieben, wurde der E. coli-Stamm JM 109 durch das rekombinante Plasmid transformiert und das erhaltene rekombinante Plasmid diente als eine Matrizen-DNA für die Sequenzierung. So wurde die Nucleotidsequenz der amplifizierten DNA-Fragmente bestimmt.
(8) Analyse der gesamten Nucleotidsequenz des KP-9860-Proteasegens
Die Sequenzierung zeigte, dass das KP-9860-Proteasegen einen offenen Leserahmen (ORF) codierend die 1917 Bp, 639 Aminosäurereste, enthält und dass der ORF eine Region (NDVARHIVKADVAQSSYGLY) enthält, welche mit der N-terminalen Sequenz der gereinigten KP9860-Protease übereinstimmt. Ausgehend von der N-terminalen Sequenz wurde für die reife Region des KP9860-Proteasegens abgeleitet, dass sie aus 1302 Bp, codierend 434 Aminosäuren, besteht (Sequenz Nr. 3, Molekulargewicht 45310 Da). Stromaufwärts des ORF wurden Sequenzen beobachtet, von welchen vermutet wird, dass sie eine Promoterregion (-35-Region: ttgtgt, -10-Region: tacgat) und eine Ribosomenbindungsstelle (SD-Sequenz: aggagt) sind. Stromabwärts des Stoppcodons (taa) gab es eine umgekehrte Wiederholungssequenz mit einer freien Energie von –26,2 kcal/Mol, von welcher vermutet wird, dass sie ein Terminator ist.
Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt, um dadurch die gesamte Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz jedes der Gene der KP-43-Protease und der KP-1790-Protease zu analysieren. Die Ergebnisse werden in den Sequenzen Nr. 4 und 5 gezeigt.
Beispiel 6
Waschtest:
Ein Waschtest wurde gemäß JIS K 3371 durchgeführt. Detergenzien, deren Zusammensetzungen in Tabelle 7 gezeigt werden, werden in Wasser, enthaltend 71,2 mg CaCO₃/l (4° DH), gelöst, um die Konzentration einzustellen und jede Protease wurde zu der Detergenslösung gegeben, um die Konzentration der alkalischen Protease auf 40 mAPU/l gemäß dem Anson-Hämoglobinverfahren einzustellen (vgl. Tabelle 8).
Kragen von Hemden (getragen für 3 Tage) wurden als Proben verwendet. Zum Vergleich wurde der Stoff, nachdem der Stoff eines Kragens in die Größe von 8 × 8 cm geschnitten wurde, bei 15°C und 100 UpM für 10 Minuten unter Verwendung eines Terg-O-Tometer (Ueshima Seisakusyo) mit Zusatz des Enzyms oder ohne Zusatz des Enzyms gewaschen. Nachdem sie gespült und getrocknet wurden, wurden Paare von Kragenstoffen (15 Paare) verglichen und durch visuelle Beurteilung bewertet. Wenn der Schmutz beinahe vollständig gereinigt wurde, wurde eine Bewertung von 5 zugeordnet und wenn der Schmutz kaum gereinigt war, wurde eine Bewertung von 1 zugeordnet und die gesamten Punktzahlen von 15 Proben wurden berechnet. Der Waschkraftindex wurde als Punktzahl jeder Zusammensetzung ausgedrückt, wobei die Waschkraft einer Detergens-Zusammensetzung ohne Zusatz von Enzym als 100 angenommen wird. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 7

*) G steht für granulär.
**) L steht für flüssig.

LAS:: Lineares Natriumalkyl(C12-C14)benzolsulfonat (freie Säure in ein flüssiges Detergens inkorporiert)
AS:: Alkylsulfat
AE:: Polyoxyethylenlaurylether (durchschnittliche EO-Zugabe von 4 Mol)
AEP:: Polyoxyethylen-Polyoxypropylenlaurylether (durchschnittliche EO-Zugabe von 8 Mol, durchschnittliche PO-Zugabe von 3 Mol))
AES:: Alkylethersulfat (durchschnittliche EO-Zugabe von 2,5 Mol)
Fettsäure:: Natriumsalz der Fettsäure aus Palmöl
Zeolit:: Zeolit 4A, durchschnittliche Partikelgröße von 3 μm
Natriumcarbonat:: dichte Asche
Amorphes: Silikat: JIS Nr. 2-Natriumsilikat
Kristallines: Silikat: pulverisiertes SKS-6 (Produkt von Hoechst Tokuyama), durchschnittliche Partikelgröße von 15 μm
AA-MA:: Sokalan CP5, Acrylsäure-Maleinsäure-Kopolymer (Produkt von BASF)
PEG:: Polyethylenglycol, durchschnittliches Molekulargewicht von 8.000

Tabelle 8
Tabelle 8 zeigt, dass sogar unter denselben Aktivitätsbedingungen, eine das erfindungsgemäße Enzym enthaltende Detergens-Zusammensetzung (Detergens A) eine höhere Waschkraft im Vergleich zu Detergenzien, die konventionelle Proteasen enthalten, aufweist. Die Detergenzien B und C zeigen ebenfalls eine ausgezeichnete erfindungsgemäße Waschkraft.
Beispiel 7
Ein granuläres Produkt wurde mittels eines Verfahrens, das in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 62-257990 offenbart wird, unter Verwendung einer gereinigten Probe der erfindungsgemäßen Protease hergestellt, welche aus Bacillus sp. KSM-KP43, KSM-KP1790 oder KSM-KP9860 stammte und wie in Beispiel 2 oder 3 hergestellt wurde. Das granuläre Produkt (6 APU/g) (1 Gewichtsanteil) wurde in jedes der Detergenzien (100 Gewichtsanteile) mit den in Tabelle 9 gezeigten Zusammensetzungen eingeschlossen, um dadurch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu erhalten. Wenn das Detergens vom granulären Typ war, wurde ein solches Detergens durch Vermischen einer granulären Detergensbasis, welche frei von Bestandteilen ist, d. h. ein Enzym, PC, AC-1 und AC-2, mit einem granuliertem Enzym, granuliertem PC, granuliertem AC-1 und granuliertem AC-2 hergestellt. Jedes Detergens wurde in Wasser, enthaltend 71,2 mg CaCO₃/l (4° DH), in einer Gebrauchskonzentration gelöst und ein Kragen wurde in einer wie Beispiel 6 beschriebenen Art und Weise gewaschen. Die hier hergestellten Detergenzien zeigen eine ausgezeichnete Waschkraft und sind nützlich als Waschmittel. Tabelle 9

*) G steht für granulär.
**) L steht für flüssig.

LSA-2:: Alkylbenzolsulfonsäure (C10-C14-Alkylkette), welche mit 48-%iger NaOH neutralisiert wurde
LSA-3:: Alkylbenzolsulfonsäure (C10-C14-Alkylkette), welche mit 50-%iger NaOH neutralisiert wurde
AS-2:: Natriumsalz von Dovanol 25-Sulfat (C12-C15-Sulfat)
SAS:: Natrium C13-C18 Alkansulfonat
AOS:: Natrium-α-Olefinsulfonat
SFE:: Natriumsalz eines Palmöl-α-Sulfofettsäuremethylesthers
Fettsäuresalz:: Natriumpalmitat
AES-2:: Natriumpolyoxyethylenalkyl(C12-C15)ethersulfat (durchschnittliche EO-Zugabe von 2 Mol)
AE-3:: EO-Addukt (durchschnittlich 3 Mol) von C12-C13-Alkohol
AE-4:: EO-Addukt (durchschnittlich 7,2 Mol) von C12-C15-Alkohol
AE-5:: EO-Addukt (durchschnittlich 7 Mol) von sekundärem C12-C15 Alkohol
AG:: Alkyl (aus Palmöl)-Glucosid (durchschnittlicher Polymerisationsgrad von 1,5) öl-absorbierender Träger: Amorphes Natriumaluminosilikat, Ölabsorption von 235 ml/100 g
Kristallines Silikat:: SKS-6 (δ-Na₂Si₂O₅, kristallin-geschichtetes Silikat, durchschnittliche Partikelgröße von 20 μm)
Amorphes Silikat:: JIS Nr. 1-Natriumsilikat
STPP:: Natriumtripolyphosphat
NTA:: Natriumnitrilotriacetat
PAA:: Natriumsalz der Poly(acrylsäure), durchschnittliches Molekulargewicht von 12.000
AA-MA:: Acrylsäure/Maleinsäure-Kopolymer
CMC:: Natrium-Carboxymethylcellulose
PEG:: Polyethylenglycol, durchschnittliches Molekulargewicht von 6.000
PVA:: Polyvinylpyrrolidon, durchschnittliches Molekulargewicht von 40.000, K-Wert von 26–35
Fluoreszenzfarbstoff:: Tinopal CBS und Whitex SA (1:1 (Gew.)), nur Cinopearl in ein flüssiges Detergens inkorporiert
Parfüm:: Eine Parfümzusammensetzung, offenbart in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 8-239700
Enzym:: Lipolase 100T, Termamyl 60T und KAC 500^® (Produkt der Kao Corporation) 1 : 1 : 1 (Gew.)
PC:: Natriumpercarbonat, durchschnittliche Partikelgröße von 400 μm, beschichtet mit Natriummetaborat
AC-1:: Tetraacetylethylendiamin
AC-2:: Natriumlauroyloxybenzolsulfonat

Beispiel 8
Unter den in Tabelle 10 gezeigten Bestandteilen wurden Natriumpercarbonat und Natriumcarbonat (dichte Asche) unter Rühren vermischt. Zu dem Gemisch wurde eine 40-%ige wässrige Lösung von Natriumpolyacrylat und linearem Natriumalkylbenzolsulfonat (oder nichtionische grenzflächenaktive Substanz oder Natriumlauroylbenzolsulfonat) zugegeben. Anschließend wurde ein Granulationsprodukt der alkalische Protease, welche aus Bacillus sp. KSM-KP43 stammte und wie in Beispiel 7 hergestellt wurde, zu dem Gemisch gegeben. Das entstehende Gemisch wurde homogen gerührt, um dadurch ein Bleichmittel herzustellen. Ein Kragen wurde für 30 Minuten bei 20°C in eine 0,5-%ige wässrige Lösung eines jeden Bleichmittels getaucht und anschließend mit Detergens A (Beispiel 6) in einem Terg-O-Tometer bei 100 UpM für 10 Minuten bei 20°C gewaschen. Die erhaltenen Bleichmittel habe eine ausgezeichnete Bleichfähigkeit und sind nützlich als Bleichmittel für Wäsche. Tabelle 10

¹⁾ Partikelgröße: 500–700 μm
²⁾ Lineares Natriumalkylbenzolsulfonat (C12-C14)
³⁾ Polyoxyethylenalkylether (C12-C14-Alkyl, durchschnittliche EO Zugabe von 12 Mol)
⁴⁾ Durchschnittliches Molekulargewicht von 8.000

Beispiel 9
Das Verfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, um dadurch die Detergens-Zusammensetzungen für einen automatischen Geschirrspüler mit einer in Tabelle 11 gezeigten Zusammensetzung herzustellen. Die Waschkraft der erhaltenen Zusammensetzungen wurde unter den folgenden Bedingungen geprüft. Die erhaltenen Detergenzien haben eine ausgezeichnete Waschkraft und sind nützlich als ein Detergens für einen automatischen Geschirrspüler. Tabelle 11

¹⁾ Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Kopolymer (durchschnittliches Molekulargewicht von 2.000)
²⁾ Ethylenoxid (7 Mol) und Propylenoxid (8,5 Mol)-Addukt von sekundärem C12-C14-Alkohol
³⁾ JIS Nr. 2-Natriumsilikat
⁴⁾ Acrylsäure-Maleinsäure-Kopolymer

(1) Herstellung eines verschmutzten Geschirrs
Eigelb (2,5 g) wurde gleichmäßig auf einen Keramikteller mit einem Durchmesser von 25 cm gebürstet. Der Teller wurde in einem Trockner für 60 Minuten bei 115°C getrocknet.
(2) Waschbedingungen
Verwendete Spülmaschine: Ein vollautomatischer Geschirrspüler (NP-810, Produkt von Matsushita Electric Industry Co., Ltd.)
Art des Waschens: Standardgang
Wasser zum Waschen: Härte von 62,3 mg CaCO₃/l (3,5° DH)
Konzentration des Detergens: 0,2 Gew.-%
(3) Auswertungsverfahren
Fünf verschmutzte Teller wurden in einer Spülmaschine unter den vorstehenden Bedingungen unter Verwendung von Detergens-Zusammensetzungen aus Beispiel 9 gewaschen. Das gewaschene Geschirr wurde mit einer 1-%igen Erythrosinlösung gefärbt, um dadurch das verbliebene Protein anzufärben. Der Grad der Proteinverschmutzung wurde visuell beurteilt.
Beispiel 10
Detergens-Zusammensetzungen für einen automatischen Geschirrspüler wurden aus den in Tabelle 12 gezeigten Komponenten erhalten. Die Waschkraft dieser Zusammensetzungen wurden durch einen Test, ähnlich dem aus Beispiel 9, bewertet. Die Zusammensetzungen stellten eine ausgezeichnete Waschwirkung bereit. Tabelle 12

¹⁾ Acrylsäure/Maleinsäure-Kopolymer (Produkt von BASF)
²⁾ Ethylenoxid (7 Mol)- und Propylenoxid (4,5 Mol)-Addukt von sekundärem C12-C14-Alkohol
³⁾, ⁴⁾ Synthetisches Beispiel, offenbart in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 6-179899

Beispiel 11
Enzyme wurden zu dem vorstehend beschriebenen Detergens A (Beispiel 6) in Mengen, die in der folgenden Tabelle 13 gezeigt werden, zugegeben. Ein Kragenteil eines weißen Hemds wurde in einer Weise, ähnlich der von Beispiel 6, gewaschen. Tabelle 13

¹⁾ Ein granuläres Produkt, hergestellt durch ein Verfahren, offenbart in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 62-257990, unter Verwendung einer gereinigten Probe der erfindungsgemäßen Protease, welche aus dem Stamm Bacillus sp. KSM-KP 43 stammte und wie in Beispiel 2 (6 APU/g) hergestellt wurde.
²⁾ Die Protease K-16 offenbart in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 5-25492, welche durch ein in der Offengelegten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 62-257990 offenbartes Verfahren so modifiziert war, dass sie 5 APU/g hatte.
³⁾ KAC-500^® (Cellulase, 500 U/g, Produkt der Kao Corporation)
⁴⁾ Lipolase 100T^® (Produkt von Novo Nordisk)

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Kombination der erfindungsgemäßen Protease mit einer konventionellen Protease, Cellulase oder Lipase eine Waschwirkung verstärkt.
Industrielle Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäße alkalische Protease hat eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber einer Vielfalt von grenzflächenaktiven Substanzen, Resistenz gegenüber Fettsäuren und hohe Stabilität gegenüber einem oxidierenden Mittel und ist daher nützlich als ein Enzym für ein Detergens für einen automatischen Geschirrspüler und als ein Wäschedetergens, wobei beide eine bleichende Komponente enthalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Alkalische Protease, die: (a) eine wie in SEQ ID Nr. 1 oder 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; oder (b) die die Aminosäuresequenz von (a) umfasst, in der eine oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder hinzugefügt sind, und die die folgenden physico-chemischen Eigenschaften aufweist (i) aktiver pH-Bereich: aktiv über einen weiten pH-Bereich von 4–13 und weist bei einem pH-Wert von 6–12 eine Aktivität von 80% oder mehr der Aktivität beim pH-Optimum auf; (ii) stabiler pH-Bereich: ist stabil über einen pH-Bereich von 6–11 nach einer Behandlung bei 40°C über 30 Minuten; (iii) isoelektrischer Punkt: weist einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,9–9,1 auf; und (iv) Wirkung einer Fettsäure: Casein-abbauende Aktivität wird durch Oleinsäure nicht inhibiert, und wobei die Aminosäuresequenz zu 90% oder mehr mit SEQ ID Nr. 1 oder 2 identisch ist.
Alkalische Protease gemäß Anspruch 1, die ein geschätztes Molekulargewicht von ungefähr 43.000 aufweist, wenn dies mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt wird.
Nucleotidsequenz, die eine alkalische Protease gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.
Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 3, die eine wie unter einer der SEQ ID Nr. 3 bis 5 gezeigte Sequenz umfasst.
Vektor, umfassend die Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 3 oder 4.
Wirtszelle, die mit der Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 3 oder 4 oder mit dem Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert ist.
Mikroorganismus, der FERM BP-6532, FERM BP-6533 oder FERM BP-6534 ist.
Verfahren zur Herstellung von alkalischer Protease gemäß Anspruch 1, umfassend das Züchten der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 oder des Mikroorganismus gemäß Anspruch 7 und Sammeln des Proteins aus dem Kulturmedium.
Detergens-Zusammensetzung, enthaltend eine alkalische Protease gemäß Anspruch 1 oder 2 oder eine alkalische Protease wie erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 8.