KR20050099566A

KR20050099566A - 알카리 프로테아제

Info

Publication number: KR20050099566A
Application number: KR1020057018558A
Authority: KR
Inventors: 미키오 다카이와; 미츠요시 오쿠다; 가츠히사 사에키; 히로미 구보타; 준 히토미; 야스시 가제야마; 시츠우 시카타; 마사후미 노무라
Original assignee: 카오 가부시키가이샤
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 2005-10-13
Also published as: US20020064854A1; AU9457998A; US20040142837A1; AU732369B2; EP1029920B1; EP1029920A4; US6376227B1; US7297528B2; WO1999018218A1; DE69833031T2; CN1280621A; KR100832764B1; KR20010030974A; KR100601189B1; US6759228B2; DK1029920T3; JP3479509B2; ID24410A; DE69833031D1; CN1130462C

Abstract

본 발명은 다음 성질을 갖는 알카리 프로테아제, 이를 코드하는 유전자, 이 알카리 프로테아제를 생산하는 미생물 및 이를 함유하는 세정제 조성물에 관한다.

(i) pH 4∼13의 넓은 범위에서 작용하고, pH 6∼12에서 최적 pH 활성치의 80%이상을 나타내며; (ii) 40℃, 30분의 처리조건으로 pH 6∼11의 범위에서 안정하고; (iii) 등전점 8.9∼9.1 부근; (iv) 올레인산에 의해 카제인 분해활성의 저해를 받지 않는다.

이 알카리 프로테아제는 각종 계면 활성제에 극히 안정이고, 지방산 내성을 가지고, 또한, 산화제에도 높은 안정성을 가지므로, 표백제 성분을 함유하는 식기 세정기용 및 의복용 세정제용 효소로 유용하다.

Description

알카리 프로테아제 {ALKALINE PROTEASE}

본 발명은 세정제 배합용 효소로 유용한 알카리 프로테아제, 이를 코드하는 유전자, 이 알카리 프로테아제를 생산하는 미생물 및 이 알카리 프로테아제를 함유하는 세정제 조성물에 관한 것이다.

프로테아제는 의료용(衣料用) 세정제를 비롯한 각종 세정제, 화장료, 목욕용제, 식품개질제, 소화조제 또는 소염제 등의 의약품 등의 여러 분야에 이용되어 왔다.

그 중에서도 가장 대량으로 공업 생산되어 시장규모가 큰 것은 세제용 프로테아제이고, 예를 들면 알카라제, 사비나제(Novo Nordisk사제), 맥사칼(Genencor), 블랩(Henkel사제) 및 프로테아제 K(KAP, Kao Corporation 사제)등이 알려져 있다.

한편, 현재도 성능이 보다 향상된 세제용 효소의 탐색이 시도되고 있으며, 열 및 계면활성제에 대한 안정성이 높은 효소(일본국 특개평 6-70765호 공보 등), 젤라틴 등의 불용성 단백질에 작용하며, 높은 비활성을 가지는 효소(일본국 특개평 9-121855호 공보 등), 저온에서 활성이 우수한 효소(일본국 특개평 5-211868호 공보, 일본국 특개평 9-121856호 공보 등) 및 산화제에 대한 안정성을 향상시키는 방법(유럽 특허 제0130756호 공보)등이 개시되어 있다.

그러나, 의류 등의 오염은 단백질뿐만 아니라, 지질, 고체입자 등 복수의 성분이 포함되어 있는 것이 대부분이고, 이러한 실제의 복합 오염에 대하여 세정력이 높은 세정제가 요구되고 있다. 이에 대해서는 통상 복수 종류의 효소, 복수 종류의 계면활성제의 배합이 이루어지고 있다.

그러나, 복수 종류의 효소를 배합하더라도 그 배합한 개개의 효소가 복합오염의 조건하로 안정적이고, 충분한 활성을 유지하고 있지 않으면, 그 작용은 충분히 발휘되지 않는다. 이 점에서 종래의 효소는 아직 충분히 만족할 수 있는 것이 아니다.

본 발명의 목적은 복합 오염 조건하에서도 우수한 세정성을 가지며, 고농도의 지방산 존재하에서도 카제인 분해활성을 유지하는 알카리 프로테아제를 제공하는 것이다.

본 발명자는 고농도의 지방산 존재하에서도 카제인 분해활성을 유지하고, 단백질뿐만 아니라 피지 등의 오염이 있는 복합 오염조건하라도 우수한 세정성을 가지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기의 이화학적 성질을 갖는 알카리 프로테아제를 제공하는 것이다.

(i) 작용 pH범위 :

pH 4∼13의 넓은 범위에서 작용하고, pH 6∼12에서 최적 pH활성치의 80%이상을 나타낸다.

(ii) 안정 pH범위 :

40℃, 30분의 처리조건으로 pH 6∼11의 범위에서 안정하다.

(iii) 등전점 :

8.9∼9.1 부근

(iv) 지방산의 영향 :

올레인산에 의해 카제인 분해활성의 저해를 받지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 알카리 프로테아제를 코드하는 유전자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 알카리 프로테아제를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 알카리 프로테아제를 함유하는 세정제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 알카리 프로테아제는 상기 (i)∼(iv)의 이화학적 성질을 가지나, 특히 (iv)의 성질은 중요하다. 즉, 올레인산은 피지의 성분의 하나이며, 올레인산 10mM 존재하에서도, 올레인산 부재하의 경우와 동등의 카제인 분해활성을 유지한다.

본 발명의 알카리 프로테아제로서는 (v) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 (SDS-PAGE)에 의한 추정분자량이 약 43,000의 것이 바람직하다.

더욱이, 상기 (i)∼(v)의 성질 이외에 하기 (vi)∼(ix)의 성질을 갖는 알카리 프로테아제가 특히 바람직하다.

(vi) 작용온도 및 최적 온도:

작용 최적온도는 60℃∼70℃이지만, 20℃이하의 저온에서도 작용된다.

(vii) 금속이온의 영향 :

Hg²⁺ 및 Cu²⁺이온으로는 활성이 저해되며, Ca²⁺이온으로는 열안정성이 향상된다.

(viii) 저해제의 영향 :

에틸렌디아민4아세트산(EDTA) 및 p-클로로머큐리벤조산(PCMB)으로는 활성은 저해되지 않으나, 디이소프로필플루오로인산(DFP) 및 페닐메탄술포닐플루오라이드(PMSF)에서는 활성이 저해된다.

(ix) 계면활성제 내성 :

직쇄 알킬벤젠술폰산나트륨, 폴리옥시에틸렌알킬황산나트륨, 도데실황산나트륨, α-올렌핀술폰산나트륨 및 α-술포지방산에스테르로 활성은 저해되지 않는다.

본 발명의 알카리 프로테아제는 배열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 배열, 또는 이 아미노산 배열의 1 또는 2 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 가지는 것이 바람직하다. 배열번호 1과 2는 배열번호 2에서의 3위치 리진이 배열번호1에서는 결실되어 있는 점에서 다를 뿐이다. 배열번호 1 및 2에서의 Xaa는 임의의 아미노산을 표시하나, 각 위치의 Xaa의 바람직한 아미노산을 배열번호 2에 위치에서 하기 표에 나타낸다.

위치		위치
24	Ser 또는 Asn	30	Gly 또는 Asp
33	Asn 또는 Thr	47	Ala 또는 Val
48	Lys 또는 Ser	54	Gly 또는 Arg
71	Pro 또는 Leu	75	Gln 또는 Leu
90	Ile 또는 Val	103	Gln 또는 Lys
106	Lys 또는 Thr	129	Lys 또는 Gln
131	Ala 또는 Lys	132	Thr 또는 Val
133	Ser 또는 Arg	134	Thr 또는 Ser
147	Ile 또는 Lys	149	Arg 또는 Lys
161	Glu 또는 Thr	166	Val 또는 Leu
173	Lys 또는 Asn	184	Gln 또는 Glu
188	Phe 또는 Tyr	189	Ala 또는 Val
190	Ile 또는 Ala	195	Leu 또는 His
287	Ser 또는 Ala	307	Gly 또는 Ser
325	Tyr 또는 Phe	370	Gly 또는 Arg
432	Phe 또는 Tyr	502	Ile 또는 Val
532	Ser 또는 Ala	542	Ser 또는 Thr
585	Gln 또는 Arg	592	Thr 또는 Ser
593	Ser 또는 Ala	595	Tyr 또는 Phe
596	Asn 또는 Asp	597	Asp 또는 Asn
612	Ala 또는 Ser	633	Thr 또는 Asn

본 발명의 알카리 프로테아제에서의 전기 결실, 치환 또는 부가는 알카리 프로테아제 활성을 잃어버리지 않는 한 특히 제한되지 않으나, 배열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 배열의 바람직하기로는 70%이상, 보다 바람직하기로는 80%이상, 더욱 더 바람직하기로는 90%이상이 보존되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 알카리 프로테아제의 구체예로서는 배열번호 3, 4 또는 5로 표시되는 아미노산 배열, 또는 이 아미노산 배열의 1 또는 2 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 알카리 프로테아제를 들 수 있다.

본 발명의 알카리 프로테아제는 예를 들면, 바실루스속(Bacillus)에 속하는 알카리 프로테아제 생산균을 배양하고, 그 배양물에서 채취함으로서 제조할 수 있다. 여기에서 본 발명 알카리 프로테아제 생산균으로는 바실루스속에 속하는 야생주 및 상기의 아미노산 배열을 가지는 펩티드를 코드하는 유전자를 가지는 형질 전환체를 들 수 있다. 또, 이 야생주로는 예를 들면 KP43주, KP1790주 및 KP9860주를 들 수 있다. 이들의 균주의 균학적 성질을 이하 나타낸다.

	KP43	KP1790	KP9860
A. 형태학적 성질
(a) 그램 염색	양성	양성	양성
(b) 아미노펩티타제	부정형	부정형	부정형
(c) 운동성	있음	있음	있음
(d) 편모	주편모(周鞭毛)	주편모	주편모
(e) 포자(유무, 형태, 위치, 팽윤)	유포자, 원추형, 중앙,없음	유포자, 원추형, 중앙,없음	유포자, 원추형단 중앙 있음.

B. 생리학적 성질
(a) 질산염의 환원	음성	음성	음성
(b) 인돌생성	음성	음성	음성
(c) 생육의 pH범위	pH 6.2∼11.7에서 생육 pH8∼10에서 양호하게 생육,	pH 6.2∼11.7에서 생육pH8.5∼10에서 양호하게 생육	pH 6.2∼10.0에서 생육 pH 9에서 양호하게 생육
(d) 염화나트륨에 대한 내성	7%이상 NaCl함유배지에서 생육할 수 없음	7%이상NaCl함유배지에서 생육할 수 없음	7%이상 NaCl 함유배지에서 생육할 수 없음
(e) 생육의 온도범위	10∼40℃	10∼40℃	20∼40℃
(f) β-갈락토시다제	양성	양성	양성
(g) 알기닌디히드로라제	음성	음성	음성
(h) 리진디히드로라제	음성	음성	음성
(i) 옥시다제	양성	양성	양성
(j) 시트르산의 이용	음성	음성	음성
(k) 요소의 이용	음성	음성	음성
(l) 카타라제	양성	양성	양성
(m) 글루코오즈 및 질산염에서 가스의 생성	음성	음성	음성
(n) 혐기조건하 생육	음성	음성	음성
(o) VP테스트	음성	음성	음성
전분	+	+	+

	KP43	KP1790	KP9860
(p) 당에서의 산생성
D-글루코오즈	+	ㅁ	+
L-아라비노오즈	-	-	-
D-크실로오즈	-	-	-
D-만니톨	+	+	+
D-갈락토오즈	ㅁ	-	-
슈크로오즈	+	+	+
D-만노오즈	+	ㅁ	+
이노시톨	-	-	-
D-솔비톨	+	-	-
트레할로오즈	ㅁ	+	+
락토오즈	-	-	-
글리세롤	-	-	-
말토오즈	+	ㅁ	+
D-푸락토오즈	+	+	+
라피노오즈	-	-	-
메리비오즈	+	-	-

이상의 균학적에 성질에 대하여「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilkins사, 1984년)의 기재에 준하여 검토한 결과, 상기의 3균주는 바실루스속에 속하게 하는 것이 타당하다. 그러나, 종에 대해서는 기지의 바실루스속 종의 제반 성질과는 완전하게 일치하지 않는 것으로부터 신규 미생물이다. 그래서 상기 4균주를 일본 공업기술원 생명공학기술연구소에 바실루스 에스피(Bacillus sp.) KSM-KP43(FERM BP-6532), 바실루스 에스피(Bacillus sp.) KSM-KP1790(FERM BP-6533), 바실루스 에스피(Bacillus sp.) KSM-KP9860(FERM BP-6534)으로 기탁했다(원기탁일: 1996년 9월 18일).

상기의 균주를 이용하여 본 발명 알카리 프로테아제를 생산하기 위하여는 균주를 자화성(資化性)의 탄소원, 질소원 기타 필수영양소를 함유하는 배지에 접종하고, 통상의 방법에 따라 배양하면 좋다.

이렇게 얻어진 배양액으로부터 알카리 프로테아제의 채취 및 정제는 일반 효소의 체취 및 정제 방법에 준하여 행할 수 있다. 예를 들면, 배양액에서 원심분리 또는 여과함으로서 균체를 제거하고, 배양 상청액에서 통상의 방법의 정제 수단에 의해 목적 효소를 얻는다. 이와 같이 하여 얻어지는 효소액은 그대로 이용할 수 있으나, 다시 공지의 방법에 의해 정제, 결정화할 수도 있다.

본 발명의 알카리 프로테아제는 이 알카리 프로테아제를 코드하는 유전자를 취득하고, 이를 이용하여 재조합 벡터를 제작하고, 이 재조합 벡터를 이용해 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어진 형질 전환체를 배양하고, 배양물에서 알카리 프로테아제를 채취함으로서 얻을 수 있다.

본 발명의 알카리 프로테아제 유전자는 예를 들면, 상기 3균주에서 크로닝할 수가 있다. 이 크로닝수단으로는 공지의 수단, 예를 들면, (1) 적당한 제한효소에 의한 염색체 DNA의 전부 분해 또는 부분 분해로 얻어진 DNA 단편을 적당한 벡터에 끼워 넣고, 대장균이나 바실루스 섭틸리스 등에 도입해 발현시키는 숏건법, (2) 적당한 프라이머를 합성하고 PCR법으로 목적하는 유전자를 크로닝하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 알카리 프로테아제 유전자의 염기배열의 일례를 배열번호 3∼5에 나타낸다. 이 염기배열은 배열번호 3∼5에 한정되는 것이 아니며, 배열번호 1 또는 2에 나타난 아미노산 배열을 코드하는 염기배열, 또는 이 아미노산 배열의 1 또는 2 이상의 아미노산이 결실하고, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 코드하는 염기이면 좋지만, 배열번호 3∼5에서 표시되는 염기배열, 또는 이 염기배열의 1 또는 2 이상의 염기가 결실, 또는 부가된 염기배열을 가지는 것이 바람직하다. 여기에서 결실, 또는 부가는 상기 아미노산 배열 변이의 범위내인 것이 바람직하다.

전기 알카리 프로테아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제작하기 위하여는 목적하는 숙주내에서 유전자를 발현하는데 적합한 임의의 벡터에 알카리 프로테아제 유전자를 끼워 넣으면 좋다. 이러한 벡터로는 대장균을 숙주로 하는 경우, pUC18, pBR322, pUCl9 등을 들 수 있고, 바실루스 섭틸리스를 숙주로 하는 경우, pUB110 등을 들 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 재조합 벡터를 이용하여 숙주를 형질 전환하는 데는 통상의 방법, 예를 들면 프로토플라스트법, 콘피텐트 셀법 등으로 행해진다. 숙주로는 특별히 제한되지 않으나, 미생물이 바람직하고, 바실루스속 세균 등의 그램 양성균, 대장균(Escherichia coli) 등의 그램 음성균; 사카로마이세스속 효모, 아스페르질루스속 곰팡이 등의 진균 등을 들 수 있다.

얻어진 형질 전환체를 배양하여 본 발명의 알카리 프로테아제를 채취하기 위하여는 예를 들면, 상기의 야생주를 이용한 배양, 채취, 정제의 수단에 준하면 좋다.

본 발명의 알카리 프로테아제는 전술한 바와 같이 우수한 알카리 내성을 가지며, 지질 존재하에서도 우수한 프로테아제 활성을 가지며, 또한 산화제에 대한 내성 및 계면활성제 내성을 가지므로, 각종 세정제 조성물 배합용 효소로 유용하다.

세정제 조성물 속에서의 상기 알카리 프로테아제의 배합양은 알카리 프로테아제가 활성을 나타내는 양이면 특별히 제한되지 않으나, 세정제 조성물 l kg당 0.1∼5000U, 특히 1∼500U가 바람직하다.

또한, 본 발명의 알카리 프로테아제 함유 세정제 조성물로는 공지의 세정제 성분을 배합할 수 있고, 이 공지의 세정 성분으로는 WO94/26881의 5페이지, 우상란, 제 14행∼우하란, 제 29행의 것을 들 수 있다.

이들 계면활성제는 세정제 조성물 중 0.5∼60중량%(이하, 간단히 "%"로 표시한다)배합되고, 특히 분체상 세정제 조성물에 대해서는 10∼45%, 액체 세정제 조성물에 대해서는 20∼50%배합하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명 세정제 조성물이 표백 세정제 또는 자동식기용 세정제인 경우, 계면활성제는 일반적으로 1∼10%, 바람직하게는 1∼5%배합된다.

2가금속 이온포착제는 0.01∼50%, 바람직하게는 5∼40% 배합된다.

알카리제 및 무기염은 0.01∼80%, 바람직하기로는 1∼40% 배합된다.

재오염 방지제는 0.001∼10%, 바람직하게는 1∼5% 배합된다.

본 발명의 알카리 프로테아제 이외에 셀룰라제, 아밀라제, 프로토펙티나제, 펙티나제, 리파아제, 헤미셀룰라제, β-글리코시다제, 글루코오즈옥시다제, 콜레스테롤옥시다제 등을 사용할 수 있다. 이들 효소는 0.001∼5%, 바람직하기로는 0.1∼3% 배합할 수 있다.

표백제(예를 들면, 과산화수소, 과탄산염 등)는 1∼10% 배합할 수 있다.

표백제를 사용하는 경우, 표백활성화제는 0.01∼10%배합할 수 있다.

형광제는 비페닐형광제(예를 들면, Cinopearl CBS-X)나 스틸벤형 형광제(예를 들면, DM형 형광염) 등을 들 수 있다. 형광제는 0.001∼2% 배합할 수 있다.

상기 세정제 조성물의 형태는, 예를 들면 액체, 분말, 과립 등으로 할 수가 있다. 또한, 이 세정제 조성물은 의료용 세정제, 자동 식기세정기용 세정제, 배수관 세정제, 의치 세정제, 표백제 등으로 사용할 수 있다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 (알카리 프로테아제 생산균의 스크리닝)

토양 샘플 l g을 생리 식염수(10 ㎖)에 현탁하고, 80℃에서 10분간 열처리한 후, 이하에 나타낸 조성을 가지는 프로테아제 생산균 액체집적배지에 접종하고, 20℃에서 배양했다. 3회 정도 이 배지에 계속 이식하고, 집적한 후, 이하에 나타낸 조성을 가지는 프로테아제 생산판정 플레이트에 도말하고, 20℃에서 5∼7일간 배양했다. 생육한 집락 주위에 스킴 밀크의 분해로 생긴 투명대를 지표로 프로테아제 생산균을 분리했다. 그 결과, 알카리 프로테아제 생산균으로서 바실루스 에스피 KSM-KP43주, KSM-KP1790주 및 KSM-KP9860주를 얻었다.

스크리닝용 액체 집적배지(pH 11)의 조성
인산1칼륨 황산마그네슘 효모엑기스(디프코사제) 젤라틴(도쿄카세이사제) 글루코오즈탄산나트륨	0.1%0.02%0.05%1.0%0.5%0.3%
스크리닝용 한천평판배지
뉴트리엔트 아가 (디프코사제)스킴 밀크 (디프코사제)탄산나트륨	2.3%0.3%1.0%

실시예 2

실시예1에서 얻어진 바실루스 에스피 KSM-KP43 주를 폴리펩톤S l%, 효모엑기스 0.05%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.02%, 글루코오즈(별도멸균) 1%, 탄산나트륨(별도멸균) 0.5%의 조성의 액체 배지에 접종하고 30℃, 24시간 배양했다. 이 때의 배양상청의 효소농도는 약 1.5 U/ℓ이었다. 이 배양액을 4℃에서 원심 분리하여 얻어진 배양상청에 교반하면서 분쇄한 황산암모늄을 90%포화농도가 되도록 첨가했다. 교반하여 4℃으로 하루동안 방치 후, 원심 분리하여 침전을 회수하고, 얻어진 침전을 5 mM의 염화칼슘을 포함하는 10 mM 트리스-염산 완충액 pH 7.5에 용해하고, 동일 완충액에 대하여 투석했다. 이어서, 이 투석내액을 5 mM의 염화칼륨을 포함하는 10 mM 트리스-염산완충액 pH 7.5로 평형화시킨 DEAE-Sepharose FF(팔마시아사제)칼럼을 통과시켜 비흡착 획분을 회수했다. 이 회수액을 2 mM 염화칼슘을 포함하는 50 mM HEPES 완충액 pH 7.5에 대하여 투석하고, 동일 완충액으로 평형화시킨 SP-세파로오즈 FF 칼럼을 통과시켜 비흡착획분보다 약간 늦게 용출되는 활성 획분을 회수했다. 활성 회수율 15%의 이 샘플을 이용하여 SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동을 행한 결과 단일밴드로 검출됐다.

실시예 3

얻어진 바실루스 에스피 KSM-KP1790주 및 KSM-KP9860주를 실시예 2와 동일 배지에서 배양하고, 실시예 2와 같이 배양액을 정제하여 알카리 프로테아제를 채취했다.

실시예 4

실시예 2 및 3으로 얻어진 알카리 프로테아제의 효소학적 성질을 검토했다. 그 실험방법 및 결과를 이하에 나타낸다.

I. 실험재료 및 실험방법

(1) 활성측정법

(a) 카세인법

1 %(w/v) 카세인(Hammerstein: Merck Inc. 제)을 함유하는 50 mmol/ℓ 각종 완충액 l ㎖를 40℃에서 5분간 보온한 후, 0.1 ㎖의 효소용액을 첨가하고, 40℃에서 10분간 반응을 행했다. TCA용액(0.11 mol/ℓ 트리클로로아세트산: 0.22 mol/ℓ 아세트산나트륨: 0.33 mol/ℓ 아세트산) 2㎖를 첨가하고, 반응을 정지하고, 실온에서 10분간 방치한 후, 산변성 단백질을 여과(No. 2 여과지: Whattmann사제)했다. 그리고, 여과액 0.5 ㎖에 알카리성 구리시약(1 %(w/v) 주석산칼륨·나트륨: 1 %(w/v) 황산구리: 2 %(w/v) 탄산나트륨, 0.l mol/ℓ 수산화나트륨=1:1:100(v/v)) 2.5 ㎖를 첨가하고, 30℃, 10분간 보온한 후, 희석 페놀시약(페놀시약(Kanto Chemical사제)을 이온교환수로 2배 희석한 것) 0.25 ㎖를 가해, 30℃, 30분간 보온한 후, 660 nm에서의 흡광도를 측정했다. 상기의 효소 반응계에 반응정지액을 혼합한 후, 효소 용액을 가한 계를 블랭크로 했다.

또한, 효소 1단위(P.U)는 상기의 반응조건에서 1분간 l mmol의 티로신에 상당하는 산가용성 단백질 분해물을 유리하는 효소량으로 했다.

(b) 합성 기질법

0.9 ㎖의 100 mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0, 2 mmol/ℓ 염화칼슘함유)에 50 mmol/ℓ 합성기질 용액(숙시닐-알라닐-알라닐-프로릴-로이신·파라니트로아닐라이드를 디메틸술폭사이드에 용해) 0.05 ㎖를 혼합하고, 30℃에서 5분간 보온한 후, 0.05 ㎖의 효소용액을 가하고, 30℃, 10분간 반응을 행했다. 5 %(w/v) 시트르산 용액 2㎖를 첨가하여 반응을 정지시키고, 420 nm에서의 흡광도를 측정했다.

또한, 효소 1단위(U)는 상기의 반응조건에서 1분간에 1mmol의 티로신에 상당하는 산가용성 단백질분해물을 유리하는 효소량으로 했다.

(c) 헤모글로빈법

안손의 방법(M. L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79(1983))에 따라, 요소(尿素)를 사용하여 우혈청 헤모글로빈을 변성하고, 수산화나트륨으로 pH 10.5로 하였다. 이 기질용액(헤모글로빈으로2.2%) 0.5㎖에 효소액 0.1㎖(1.0×10^-5∼1.0×10^-3A.U)을 첨가하고, 25℃, 10분간 배양한다. 4.9%의 트리클로로아세트산 1.0㎖을 가하여 반응을 정지한다. 반응종료후, 원심분리(3,000rpm, 10분)을 행하고, 이 상청액중에 함유된 단백질 분해물을 포린-로리법(O. H. Lowry et al., J,Biol. Chem., 193, 265(1951))으로 정량한다.

또한, 효소 1단위(U)는 상기의 반응조건에서 1분간에 1 mmol의 티로신에 상당하는 산가용성 단백질분해물을 유리하는 효소량으로 했다.

(2) 최적 pH

카세인 1 %(w/v)를 포함하는 50 mmol/ℓ의 브릿튼·로빈슨 완충액 1 ㎖에 효소용액(3.0×10^-5mP.U) 0.1 ㎖를 가하고, 카세인법으로 활성측정을 행했다.

(3) pH 안정성

브릿튼·로빈슨 완충액(20 mmol/ℓ, 2 mmol/ℓ 염화칼슘 함유)속에 효소 용액을(8.0×10^-4mP.U.)혼합하고, 40℃, 30분간 또는 10℃, 24시간 처리를 행했다. 이 처리액을 빙냉 후, 50 mmol/ℓ 붕산 완충액으로 40배로 희석한 후, 카세인법으로 잔존활성을 측정했다.

(4) 최적 온도

카세인 1 %(w/v)를 함유하는 50 mmol/ℓ붕산 완충액(pH 10.0) 1 ㎖속에 효소용액 2.0×10^-5mP.U.) 0.1 ㎖를 가하고, 10∼80℃까지의 각 온도에서 카세인법에 의해 활성 측정을 행했다. 또한, 활성 측정은 5 mmol/ℓ 염화칼슘의 존재하 및 비존재하의 양계(兩系)에서 행하였다.

(5) 내열성

20 mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0) 중, 5 mmol/ℓ 염화칼슘의 존재하 및 비존재하의 양계있어서, 효소용액(2.5×10^-4mP.U.)을 가해, 각 온도에서 10분간 열처리를 행했다. 빙냉후, 50 mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0)으로 5배 희석하고, 카세인법으로 잔존활성을 측정했다.

(6) 금속이온의 영향

l mmol/ℓ 각종 금속염을 포함하는 20 mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0)속에 효소용액(4.0×10^-4mP.U.)을 첨가하여 30℃, 20분간 처리를 행했다. 그 후, 50 mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0)으로 5배 희석하고, 카세인법으로 활성 측정을 행했다.

(7) 저해제의 영향

10 mmol/ℓ 인산 완충액(pH 7.0)에 각종 저해제를 소정 농도가 되도록 조제하고, 효소용액(1.0×10^-3mP.U.)을 첨가하여 30℃, 20분간 처리를 행했다. 그 후, 이온교환수로 20배 희석하고, 카세인법으로 잔존활성을 측정했다.

(8) 계면활성제의 영향

1 %의 계면활성제를 용해한 100 mmol/ℓ 붕산 완충액에 효소용액(7.0×10^-4mP.U.)을 첨가하여 40℃, 4시간 처리를 했다. 그 후, 50mmol/ℓ 붕산 완충액(pH 10.0)으로 20배 희석하고, 카세인법으로 잔존활성을 측정했다.

(9) 산화제(과산화수소)의 영향

과산화수소수 및 염화 칼슘을 포함하는 브릿튼·로빈슨 완충액(최종농도: 50 mmol/ℓ 과산화수소, 2 mmol/ℓ 염화칼슘, 20 mmol/ℓ 브릿튼·로빈슨)(pH 8.0) 2.7 ㎖를 30℃, 15분간 보온한 후, 0.3 ㎖의 효소용액을 첨가했다. 경시적으로 미리 준비해 둔 5 ㎕의 카타라제(Boehringer Mannheim Co.: 20 ㎎/ℓ)가 주입된 시험관에 0.8㎖ 샘플링하고, 산화반응을 정지시켰다. 그리고, 각 샘플을 2 mmol/ℓ 염화칼슘으로 적당하게 희석한 후, 합성기질법을 이용하여 잔존활성을 측정했다.

(10) 지방산의 영향

1 %(w/v) 카세인을 포함하는 50 mM 인산완충액(pH 7)을 기질 용액으로 하여 0∼10mM의 올레인산나트륨 존재하에서 20℃, 15분간 반응을 행하고, 카세인법으로 활성을 측정했다.

II. 실험결과

(1) 최적 pH

3종류의 프로테아제(KP43, KP1790, KP9860)에 미치는 pH의 영향을 검토했다. 지적pH에서의 활성을 100%으로 하고 각 pH으로의 상대활성을 도 1에 나타냈다. 그 결과, 어느 쪽의 프로테아제도 작용 최적 pH는 pH 6∼12에 있으며, 상당히 넓은 pH 영역에서 높은 단백질 분해 활성능 범위를 가지는 것이 밝혀졌다.

(2) pH 안정성

처리전의 효소활성을 100%으로 하고 40℃에서 30분간 및 10℃에서 24시간 보존후의 각 pH에서 KP43의 잔존활성을 도 2 및 도 3에 나타냈다. 그 결과, 40℃, 30분간의 처리에서는 양쪽 모두 pH 6∼12의 광범위하고 안정적이며, 칼슘 이온의 부가에 의해 pH 5에서의 안정성도 개선되는 것이 밝혀졌다. 한편, 10℃, 24시간의 처리로는 양쪽 모두 pH 5∼12의 광범위하고 안정적이었다.

(3) 최적온도

기질에 카세인을 이용하여 각각의 프로테아제에 미치는 온도의 영향을 검토했다. 칼슘 무첨가계에서의 최고활성을 100%으로 하고, 각 온도에서 KP43의 상대활성을 도 4에 나타냈다. 이 결과로부터 칼슘이온 무첨가계에서 3종류의 프로테아제는 최적온도를 60℃에 가지는 것으로 판명되었다. 또, 칼슘이온첨가계에 의해 모두 최적온도는 70℃로 되고, 기존의 세제용 프로테아제와 동일하게 칼슘이온 첨가계에 의한 최적온도의 고온쪽으로의 이행이 관찰되었다.

(4) 내열성

30∼80℃까지의 각 온도에서(pH 10.0, 5mmol/ℓ 염화칼슘첨가 및 무첨가계), 10분간 열처리하고, 잔존활성을 측정했다. 미처리시의 활성을 100%으로 하고, 각 처리에서의 KP43의 잔존활성을 도 5에 나타낸다. 그 결과, 어느 쪽의 프로테아제도 염화칼슘 무첨가계에서는 60℃까지 안정적이고, 염화칼슘(5 mmol/ℓ)의 첨가에 의해 온도안정성은 10℃정도의 고온쪽으로 시프트되는 것이 밝혀졌다. 시판되는 세제용 효소와 비교할 때, 가장 내열성이 우수하다고 하는 에스페라제에 필적하는 내열성을 보유한 것이라고 생각되었다.

(5) 금속이온의 영향

3종류의 프로테아제에 대하여 각종 금속염(l mmol/ℓ)으로 20 mmol/ℓ 붕산 완충액 중(pH 10), 30℃, 20분간 처리를 행하고, 잔존활성을 측정했다. 잔존활성은 금속염 무첨가계로 동일한 처리를 행한 경우의 효소활성을 100%로 하는 상대치로 나타냈다(표 3 참조). 그 결과, 어느 쪽의 프로테아제도 염화수은 및 질산은에 의한 저해가 관찰되었으나, 다른 각종 금속염에 대해서는 상당히 안정적인 것이 판명되었다.

금속염(1mM)	상대활성(%)
금속염(1mM)	KP43	KP1790	KP9860
무첨가AgN0₃ NiCℓ₂CaCℓ₂CoCℓ₂ FeCℓ₃ ZnCℓ₂CuCℓ₂HgCℓ₂MgCℓ₂	100669297919385913892	100709595101113949637103	10045961019896919433100

처리조건 : 1 mM 금속염, 20 mM 붕산 완충액 (pH 10.0)30℃, 20분

(6) 각종 저해제의 영향

일반적인 효소 저해제가 본 발명 프로테아제에 주는 영향을 검토했다. 10 mmol/ℓ 인산 완충 액(pH 7.0)에 각종 저해제를 소정의 농도가 되도록 첨가하고, 30℃, 20분간 처리를 행하여 잔존활성을 측정했다. 잔존활성은 저해제 무첨가계로 동일한 처리를 한 경우의 효소 활성을 100%로 하는 상대치로 나타냈다(표 4 참조). 이 결과로부터 밝혀진 바와 같이, 3종류의 프로테아제는 어느 쪽도 세린 프로테아제(serine protease)의 저해제인 디이소프로필플루오로인산(DFP), 페닐메탄술포닐플루오라이드(PMSF) 및 키모스타틴(chymostatin)으로 저해된 사실로 활성 중심에 세린잔기를 가지는 프로테아제라고 생각되었다. 또, 악티노마이세테스 유래로 세린프로테아제의 저해 작용이 보고되고 있는 안티파인이나 로이펩틴에 의한 영향은 인정되지 않았다.

저해제	잔존활성(%)
저해제	농도(mM)	KP43	KP1790	KP9860
무첨가 EDTA EGTA o-페난트롤린 DTT PCMB NEM DFT PMSF 키모스타틴 안티파인 로이펩틴 E-64 엘라스타티날	-555515110.10.10.10.10.1	10011092100104125971408710310210499	1009791103102115100170879910199102	10010190100105126100160809793103102

EDTA : 에틸렌디아민4아세트산 (시그마사제)

EGTA : 에틸렌글리콜4아세트산 (시그마사제)

DTT : 디티오쓰레이톨 (시그마사제)

PCMB : p-클로로머큐리벤조산 (시그마사제)

NEM : N-에틸말레이미드 (시그마사제)

DFP : 디이소프로필플루오로인산 (시그마사제)

PMSF : 페닐메탄술포닐플루오라이드 (시그마사제)

(7) 계면활성제의 영향

각종 프로테아제를 0.l mol/ℓ 트리스염산 완충액(pH 9.0)에, 1%의 각종 계면활성제로 40℃, 4시간 처리를 하고, 잔존활성을 측정했다. 잔존활성은 처리시간 0분에서의 효소활성을 100%으로 하는 상대치로 나타냈다(표 5 참조). 그 결과, 3 종류의 효소는 직쇄알킬벤젠술폰산(LAS)을 비롯하여 계면활성제에 상당히 안정적인 사실로서 계면활성제를 함유하는 세정제 성분으로 유용하다고 생각되었다.

계면활성제(농도 : 1%)	잔존활성(%)
계면활성제(농도 : 1%)	KP43	KP1790	KP9860
무첨가 직쇄알킬벤젠 술폰산나트륨(LAS) 폴리옥시에틸렌알킬 황산나트륨(ES) 도데실황산나트륨(SDS) α-올레핀술폰산 나트륨(AOS) 알킬황산나트륨(AS) α-술포지방산에스테르 (α-SFE) 소프탄올 70H	100100101104100113112109	1008810297111107113109	100100104103100107105104

처리조건 : 1% 계면활성제, 100 mM 붕산 완충액(pH 10,0) 40℃, 4시간 처리

(8) 산화제의 영향

각종 프로테아제를 50mmol/ℓ 과산화수소를 포함하는 브릿튼·로빈슨 완충액(pH 8.0)에 30℃로 처리를 하고, 경시적으로 잔존활성을 측정했다. 도 6에 나타난 바와 같이, KP43은 시판 세제용 효소인 사비나제나 KAP를 크게 상회하는 안정성을 보여 주고, 단백 공학적 수법을 이용하여 사비나제에 산화제내성을 부여한 듀라자임(Durazyme, Novo Nordisk사제)와 동등한 우수한 안정성을 보여주었다.

(9) 지방산의 영향

결과를 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명 알카리 프로테아제는 피지 성분의 하나인 올레인산의 존재하에서 활성을 전혀 잃어버리지 않았다.

지방산 존재하에서의 상대활성(%)
올레인산 농도 (mM)
0	1	2	5	10
KP43 프로테아제 100 KP1790 프로테아제 100 KP9860 프로테아제 100	100100100	100100100	103103100	119121106

실시예5 (KP9860 프로테아제 유전자의 크로닝)

(1) KSM-KP9860주 게놈DNA의 조제법

KSM-KP9860주를 액체배지(0.5% 글루코오즈, 0.2% 폴리펩톤-S, 0.05% 효모엑기스, 0.1% KH₂PO₄·7H₂O, 0.26% NaCO₃: pH 9.0) 500㎖에서 30℃, 2일간 배양한 후, 원심분리에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체에서 Saito와 Miura들의 방법(Biochim. Biophys. Act, 72, 619(1963))의 방법으로 게놈 DNA를 조제했다.

(2) KP9860 프로테아제의 부분분해와 분해산물의 회수

1) 열실활에 의한 KP9860 프로테아제의 변성

KP9860 프로테아제(5 ㎎/㎖) 45㎕

PMSF(100 mM) 20㎕

EDTA(200 mM) 10㎕

SDS(0.08 ㎎/㎖) 25㎕

상기 조성의 프로테아제 용액을 비등수에서 10분간 가열했다. 프로테아제 용액을 2 mM 아세트산암모늄으로 투석하고 SDS, EDTA, PMSF를 제거한 후, 동결 건조한 후, 100 ㎕의 증류수에 용해하여 변성 단백질 샘플로 했다.

2) 트립신에 의한 부분분해

변성 단백질 샘플 100㎕

트립신(1 ㎍/㎖, Sigma) 100㎕

1M Tris-HCI(pH 7.5) 50㎕

증류수 750㎕

트립신을 1)에서 얻어진 변성 단백질 샘플에 상기의 조성으로 어름중에서 3시간 작용시켰다. 반응의 정지는 SDS(0.08 ㎎/㎖), EDTA(200 mM), PMSF(100 mM)를 각각 300 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕ 가해 비등 수중에서 3분간 가열했다.

2 mM 아세트산암모늄에서 투석하고, SDS, EDTA, PMSF를 제거한 후, 동결 건조한 후, 100 ㎕의 증류수에 용해하여 SDS-PAGE용의 샘플로 했다.

3) 부분분해물의 회수

2)로 얻어진 용액을 Ready-gel-J (Bio-Rad 사제) 12%에서 전기영동하고, Quick CBB염색액(Bio-Rad 사제)으로 CBB염색하여 단백질 밴드를 검출했다. 단백질 밴드 부분을 면도칼로 자르고, 1.5㎖ 튜브중에서 파쇄한 후, 5배량의 SDS-PAGE 영동 버퍼(조성: 글리신 14.4%(W/V), Tris 3.03%, SDS (Bio-Rad) 10%)를 가하고, 실온에서 교반하여 단백질 밴드를 용출시켰다. 얻어진 용출액을 2mM 아세트산암모늄으로 투석, 동결 건조하여 프로테인 시퀀서(Protein Sequencer 476A형: Applied Biosystem사제)를 사용한 해석에 제공하였다.

얻어진 부분분해물의 N말단배열을 도 7에 나타낸다.

(3) PCR

증폭되는 DNA영역의 각각의 +쇄, -쇄의 5’말단에 상당하는 20∼30염기수의 프라이머를 합성하고, 주형 DNA 100ng, 프라이머 20pmol을 이용하여 PwoDNA polymerase(Boehringer Mannheim사제)를 이용하여 100㎕의 반응계에서 PCR반응을 행했다. 또한, 인버스PCR을 행하는 경우는 Expand^TMlong template PCR system(Boehringer Mannheim사제)을 이용하여 50㎕의 반응계로 행했다. 프라이머인 9860-N2와 9860-25k-RV를 사용한 PCR에 의해 527bp의 DNA 단편을 취득하였다.

(4) PCR산물의 서브크로닝

PCR산물을 High pure PCR product purification kit(Boehringer Mannheim사제)을 이용하여 정제한 후, pUC18의 Sma I 사이트에 Ligation kit ver.2(Takara사제)를 이용하여 16℃, 하룻밤 반응에 의해 삽입했다. 얻어진 재조합 플라스미드와 콘피텐트 셀 E. coli JM109주(Takara사제)를 혼합하고, 42℃, 45초간의 히트 쇼크를 주어 E. coli JM109주를 형질 전환했다. 균액에 LB를 가하고, 37℃에서 1시간 보온한 후에 IPTG(0.1 mM, Sigma) 및 X-gal[0.004%(w/v), Sigma], 앰피실린(50 ㎍/㎖, Sigma)을 함유하는 LB플레이트에 도포했다. 37℃에서 하룻밤 배양하고, 생육한 화이트 콜로니를 재조합 플라스미드가 도입된 형질 전환체로 선발했다.

(5) 염기배열의 결정

형질 전환체를 앰피실린 50 ㎍/㎖를 함유한 LB에서, 37℃에서 하룻밤 배양하고, 균체를 원심분리로 회수후, High pure plasmid isolation kit(Boehringer Mannheim사제)을 이용하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 얻어진 재조합 플라스미드 1㎍을 주형DNA으로서, 프라이머와 DNA Sequencing kit(PERKIN ELMER사제)를 이용하여 20㎕의 반응계에서 PCR반응을 행했다. 반응 생성물을 Quick spin column(Boehringer mannheim사제)을 이용하여 정제한 후에 원심 에바포레이터에서 건조시켜, DNA sequencer 377형(Applied Biosystem사제)을 이용한 해석으로 제공했다.

PCR에 의해 얻어진 DNA단편은 KP-9860 프로테아제의 N 말단 배열에 일치하는 아미노산 배열을 갖고 있었으나, 섭틸리신(subtilisin) 등의 알카리 프로테아제와의 활성중심을 구성하는 3개의 아미노산(Asp, His, Ser)중, Asp와 His 주변의 공통배열로 사료되는 배열이 관찰되는 것으로부터, KP9860 프로테아제 유전자의 일부분인 것으로 생각되었다.

(6) 서든 하이브리다이제이션 (Southern hybridization)

KP9860 염색체를 EcoR I, Sac I, Kpn I, Hind III, BamH I, Xho I, Pst I,Bgl II을 이용하여 처리하여 얻어진 527bp DNA에 서든 하이브리다이제이션을 행하여 상간성(相間性) 영역의 검출을 시행하였다.

그 결과, Kpn I을 제외한 각각의 랜에 하이브리다이제이션 밴드가 인정되었다.

(7) 인버스 PCR

얻어진 527 bp의 배열로부터 제작한 프리머 1∼4(도 9)를 사용하여 인버스 PCR을 행했다. KP 9860 염색체를 제한효소인 EcoR I , Hind III , Pst I , BgI II 에 의한 완전 소화를 행하였다. 각 샘풀은 Ligation Kit ver.2(Takara사제) 처리를 킷트를 따라 행했다. 얻어진 반응액을 인버스 PCR용 주형 DNA로 하였다. 앞에서 기술한 주형 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 1 및 4 각 10 pmol과 Expand long plate PCR system을 사용하여 PCR 반응(조건; (94℃ 10초, 60℃ 30초, 68℃ 4분) 10 사이클; (94℃ 10초, 60℃ 30초, 68℃ 4분 + 20 x 사이클수) 20 사이클; 68℃ 7분; 4℃ 1분)을 행하였다. 또, EcoR I , 제한효소처리 인버스 PCR용 주형 DNA 0.1 ㎍, 프라이머 2 및 3 각 10 pmol과 Expand long plate PCR system을 사용하여 PCR 반응(조건; 상동)을 행하였다. 얻어진 증폭 DNA 단편을 High Pure PCR Product Purification Kit를 사용하여 정제한 후, DNA blunting Kit(Takara사제)를 사용하여 말단을 평활하하였다. 얻어진 DNA 단편과 제한효소 Sma I 처리한 pUC18을 혼합하고, 킷트에 따라서 Ligation Kit ver.2처리하였다. 얻어진 처리반응을 사용하여 대장균 JM109주를 컨피텐트 셀법을 사용하여 형질전환하고, 재조합 플라스미드를 취득하였다. 얻어진 재조합 플라스미드에 삽입된 DNA 단편을 상기에 따라서 시퀀스하여 염기배열의 결정을 행하였다.

(8) KP-9860 프로테아제 유전자의 전염기배열의 해석

시퀀스 결과, KP-9860 프로테아제 유전자에는 1917bp, 639아미노산 잔기를 코드하는 Open Reading Frame(ORF)이 존재하고, ORF중에는 정제효소의 N말단배열에 일치하는 영역이 존재했다(NDVARHIVKADVAQSSYGLY). N말단배열에서 성숙형 프로테아제는 1302bp, 434아미노산잔기로 추정됐다(배열번호3, 분자량 45310Da). 또한 ORF의 상류에는 프로모터 영역(-35영역 : ttgtgt, -10영역 : tacgat) 및 리보솜 결합부위(SD배열 : aggagt)로 추정되는 배열이 인정되었다. 종지 코든(taa)의 하류에는 터미네이터로 추정되는 -26.2kcal/mol의 자유에너지를 가지는 인버테드·리피트가 존재했다.

실시예 5와 같이 하여 KP-43 프로테아제 및 KP-1790 프로테아제의 각각의 유전자의 전염기배열 및 아미노산 배열을 해석했다. 그 결과를 배열번호4 및 5에 나타낸다.

실시예 6

세정시험:

JIS K 3371에 준하여 세정시험을 행했다. 세정계는 표 7 기재의 배합성분으로 이루어진 세제를 71.2㎎ CaCO₃/ℓ(4°DH)의 물에서 사용농도로 용해후, 각종 프로테아제를 안손-헤모글로빈법에 따라 40 mAPU/ℓ되도록 각각 첨가하였다(표 8 참조).

시험포는 셔츠 컬러부분(3일간 착용)으로 하고, 비교할 수 있도록, 8 x 8 ㎝정도로 재단후, 효소첨가, 또는 효소무첨가의 세정계에서 Terg-O-Tometer(Ueshima Seisakusyo)를 사용하여 15℃, 100 rpm에서 10분간 세정하였다. 헹구고, 건조한 후, 컬러 천(15쌍)을 육안으로 대비 평가하였다. 판정방법은 때가 거의 완전하게 떨어진 경우을 5점, 때가 거의 떨어지지 않은 경우를 1점으로 하고, 15매의 컬러 천의 합계 평가점을 구하고, 효소 무첨가의 세정계에 의한 평가점을 100으로 한 경우의 비율을 세정력 지수로 나타냈다. 이 결과를 표 8에 나타낸다.

성분(%)	세제A	세제B	세제c
LASASAEAEPAES지방산염제올라이트탄산나트륨탄산칼륨비결정 규산염결정 규산염아황산나트륨황산나트륨AA-MA시트르산PEG모노에탄올아민에탄올수분	23.04.05.03.022.015.03.07.04.02.02.05.02.03.0	4.05.020.02.50.58.05.0잔부	20.02.020.07.02.023.010.02.07.0
형태	입상	액상	입상
사용농도	20g/30ℓ	20g/30ℓ	40g/30ℓ
세탁후의 pH	10.7	9.2	8.0

*) G는 과립을 나타낸다.

**) L은 액제를 나타낸다.

LAS: 직쇄알킬(C_12-14)벤젠술폰산나트륨

(액체세제는 유리산으로 배합)

AS: 알킬설페이트

AE: 폴리옥시에틸렌라우릴에테르(EO평균부가몰수 4)

AEP: 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌라우릴에테르

(EO평균부가몰수 8, PO평균부가몰수 3)

AES: 알킬에테르설페이트(EO평균부가몰수 2.5)

지방산: 팜유 유래지방산나트륨

제올라이트: 4A형 제올라이드, 평균입경 3㎛

탄산나트륨: 덴스 애쉬

비결정 규산염: JIS2호 규산나트륨

결정 규산염: SKS-6(Hoechst Tokuyama 사제) 분쇄품,

평균 입경 15㎛

AA-MA: Sokalan CP5, 아클릴산-말레인산 공중합체(BASF사제)

PEG: 폴리에틸렌글리콜, 평균분자량 8,000

	프로테아제	세정력 지수
	프로테아제	세제 A
본 발명품 1	바실루스 에스피. KSM-KP43(실시예 2)	106
본 발명품 2	바실루스 에스피. KSM-KP1790(실시예 3)	106
본 발명품 3	바실루스 에스피. KSM-KP9860(실시예 3)	105
비교품 1	Savinase 120T type White(상품명)(Novo Nordisk)	103.5
비교품 2	Durazym 6.0T(상품명)(Novo Nordisk)	103.5
비교품 3	없음	100

표 8로부터 활성이 동일한 조건에서도, 본 발명품을 배합한 세정제(세제 A)는 종래의 프로테아제 배합 세정제보다 우수한 세정력을 갖는 것을 알았다. 본 발명품의 우수한 세정효과는 동일하게 세제 B 및 세제 C에서도 얻어졌다.

실시예 7

표 9에 나타낸 조성의 세정제 100중량부에 실시예 2 및 3에서 얻어진 바실루스 에스피. KSM-KP43, KSM-KP1790 또는 KSM-KP9860 유래의 본 발명 프로테아제 정제 표품으로부터 일본국 특개소62-257990호 공보기재의 방법에 기초로 하여 조제한 조립물(6 APU/g)을 1중량부 배합하여 본 발명의 세정제 조성물을 조제하였다. 또한, 입상 세정제의 경우에는 효소, PC, AC-1, AC-2를 제외한 성분으로 입자화한 세제생지에 효소, PC, AC-1, AC-2를 각각 입자화한 것을 블렌드하여 제조했다. 각 세정제를 71.2 ㎎ CaCO₃/ℓ(4°DH)의 물에 사용농도로 용해한 후, 실시예 6과 동일하게 하여 컬러 천을 세정하였다. 얻어진 세정제는 우수한 세정력을 가지며, 의료용 세정제로서 유용하다.

성분(%)	본 발명품
성분(%)	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
LAS-2	20		20.5		12				5	10
LAS-3		15
AS-2			5		10		20
SAS	3
AOS		3
SFE		8
지방산염	2	6	4	10	3	3	2	1.5
AES-2								20
AE-3	3									10
AE-4		3	3	15		15	3		15
AE-5							2	20	20	25
AG									5	7
제올라이트	30	18	15	15		10	20
흡유성 담체				10		12
결정 규산염				20
비결정 규산염	12	1	8		10		5
STPP					25.5	20
탄산나트륨	10	27	25	10	10	15	17.5	0.1
탄산칼륨		3		2	5
아황산나트륨	2	2			1			0.2	0.2	0.2
황산나트륨	4.5	1.5		1	11	8	10
시트르산나트륨			4	2			5	1.5	1	1
NTA						2
모노에탄올아민								4	5	6
PAA					1	1.5	3
AA-MA		3	3	5
CMC	2
PEG	5	2	2	2	2			1.5
PVP							2
형광염료	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.1	0.1	0.1
향료	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.3	0.3	0.3
물	4	5	3	0.5	6	1	5	43.7	38.2	30.2
에탄올								5	5	5
프로필렌글리콜								2	5	5
효소	2	2	2	3	3	2	2	0.1	0.2	0.2
PC			3	3	10	3
AC-1			2
AC-2				1
합계	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
형태	입상	입상	입상	입상	입상	입상	입상	액상	액상	액상
사용농도	20g/30L	20g/30L	20g/30L	20g/30L	20g/30L	20g/30L	20g/30L	20mL/30L	20mL/30L	20mL/30L

LSA-2: 알킬벤젠술폰산(알킬쇄의 탄소수 10∼14)를 48% NaOH로 중화한 것.

LSA-3: 알킬벤젠술폰산(알킬쇄의 탄소수 10∼14)를 50% NaOH로 중화한 것.

AS-2: 도바놀 25 술페이트(C_12∼15 황산)의 나트륨염.

SAS: C₁₃∼C₁₈ 알칸술폰산나트륨

AOS: α-올레핀술폰산나트륨

SFE: 팜유 유래, α-술포지방산메틸에스테르 나트륨

지방산염: 팔미틴산나트륨

AES-2: 폴리옥시에틸렌알킬(C₁₂∼C₁₅)에테르황산나트륨 (EO 평균부가몰수 2)

AE-3: C₁₂∼C₁₃알코올에 EO를 평균 3몰 부가한 것

AE-4: C₁₂∼C₁₅알코올에 EO를 평균 7.2몰 부가한 것

AE-5: C₁₂∼C₁₅2급 알코올에 EO를 평균 7몰 부가한 것

AG: 알킬(팜유 유래)글루코시드(평균 중합도 1.5)

흡유성 담체: 비결정 알루미노규산나트륨, 흡유능 235 ㎖/100g

결정 규산염: SKS-6(δ-Na₂Si₂O₅, 결정성 층상 실리케이트, 평균입자경 20㎛)

비결정 규산염: JIS 1호 규산나트륨

STPP: 트리폴리인산나트륨

NTA: 니트릴로트리아세트산나트륨

PAA: 폴리아크릴산나트륨, 평균분자량 12,000

AA-MA: 아크릴산/말레인산 공중합체

CMC: 카르복시메틸셀루로오즈 나트륨

PEG: 폴리에틸렌글리콜, 평균분자량 6,000

PVP: 폴리비닐피롤리돈, 평균분자량 40,000, K치= 26∼35

형광염료: Tinopal CBS 및 Whitex SA(1:1 중량) 배합한 것(주의: 액체세제의 경우는 Cinopearl만 배합)

향료: 일본국 특개평 8-239700호 공보의 실시예 기재의 향료 조성을 사용.

효소: 리포라제 100T, 터마밀 60T 및 KAC 500(Kao Corpoation 제)를 중량비 1:1:1로 배합한것

PC: 과탄산나트륨, 평균입자경 400㎛, 메타붕산나트륨으로 피복한 것

AC-1: 테트라아세틸에틸렌디아민

AC-2: 라우로일옥시벤젠술폰산나트륨

실시예 8

표 10에 나타낸 조성중, 과탄산나트륨과 탄산나트륨(덴스 애쉬)를 교반 혼합하면서, 폴리아크릴산나트륨 40% 수용액 및 직쇄알킬벤젠술폰산나트륨 또는 비이온성 계면활성제 또는 라우로일옥시벤젠술폰산나트륨을 첨가했다. 이어서, 실시예 7에서 얻어진 바실루스 에스피. KSM-KP43 유래의 알카리 프로테아제 조립물을 첨가하고, 전체적으로 균일하게 되는 정도로 교반함으로서 표백제를 조제했다. 이어서, 각 표백제의 0.5% 수용액중에 컬러 천을 20℃, 30분간 침지한 후, 세제 A(실시예 6 참조)로 Terg-O-Tometer에서 100 rpm, 10분, 20℃에서 세정했다. 얻어진 표백제는 우수한 표백력을 가지며, 의료용 표백제로서 유용하다.

성분	본 발명품
성분	14	15	16	17
과탄산나트륨¹⁾탄산나트륨(덴스 애쉬)음이온성 계면활성제²⁾비이온성 계면활성제³⁾폴리아크릴산나트륨⁴⁾라우로일옥시벤젠술폰산나트륨	80.016.02.0-1.0-	80.012.02.0-1.04.0	80.016.0-2.01.0-	80.012.0-2.01.04.0
바실루스 에스피. KSM-KP43 알카리 프로테아제 (실시예 7)	1.0	1.0	1.0	1.0

1) 직경 500∼700 ㎛

2) 직쇄 알킬벤젠술폰산나트륨(탄소수 12∼14)

3) 폴리옥시에틸렌알킬에테르(알킬기의 탄소수 12∼14, EO 평균부가몰수 12)

4) 평균분자량 8,000

실시예 9

표 11에 나타낸 조성의 자동식기세정기용 세정제 조성물을 실시에 8과 동일하게 하여 조제했다. 얻어진 자동식기세정기용 세정제 조성물에 대하여 하기 조건에서 세정력 시험을 행하였다. 얻어진 세정제는 우수한 세정력을 가지며, 자동식기세정기용 세정제로서 유용하다.

성분	본 발명품
성분	18	19	20	21
플루로닉 L-61¹⁾소프타놀 EP-7085²⁾시트르산 3나트륨EDTA트리폴리인산나트륨과탄산나트륨탄산나트륨(덴스 애쉬)비결정 규산염³⁾AA-MA⁴⁾황산나트륨리포라제 100T(Novo Nordisk)Termamyl 60T(Novo Nordisk)	4-30--2020104100.51	-430--2020104100.51	4--30-2020104100.51	4---302020104100.51
바실루스 에스피. KSM-KP43 알카리 프로테아제 (실시예 7)	0.5	0.5	0.5	0.5

1) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(평균분자량 2,000)

2) 탄소수 12∼14의 sec-알코올의 에틸렌옥사이드 7몰 및 프로필렌옥사이드 8.5몰 부가물.

3) JIS 2호 규산나트륨

4) 아크릴산-말레인산 공중합체

(1) 오염 접시의 조제

직경 25cm의 자기제의 접시에 1매당 2.5 g의 난황을 부러쉬로 균일하게 도포하고, 115℃로 가온한 건조기중에서 60분간 건조시켜 시험에 사용하였다.

(2) 세정조건

사용 세정기: 미스시타덴키(주)제 전자동 식기세척기(기종 NP-810).

세정: 표준 코오즈

세정용수: 경도 62.3 ㎎ CaCO₃/ℓ(3.5°DH)의 물

세제농도: 0.2 중량%

(3) 평가방법

오염 접시 5매를 세척기에 넣고, 상기 세정조건에서 실시예의 세정제 조성물을 사용하여 세정하였다. 세청후의 접시를 1% 에리쓰로신 용액을 사용하여 단백염색하고, 잔류하는 단백 오염을 육안 판정하였다.

실시예 10

표 12에 나타낸 각 성분을 사용하여 자동식기세정기용 세정제 조성물을 얻었다. 이들 자동식기세정기용 세정제 조성물을 사용하여 실시예 9와 동일하게 세정력 시험을 행한 바, 모두 우수한 세정효과가 얻어졌다.

성분		본 발명품
성분		22	23	24	25	26
(a)	탄산나트륨탄산수소나트륨	30	25	30	25	50
(b)	Sokalan CP5¹⁾	5	6	5	5	5
(c)	과탄산수소나트륨	5		6
(d)	리모넨Softanol EP7045²⁾	2	2	2	11	11
(e)	비결정 알루미노규산나트륨 (합성예 1)³⁾비결정 알루미노규산나트륨 (합성예 2)⁴⁾	2	2	2	11	3
리포라제 100T(Novo Nordisk)		0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Termamyl 60T(Novo Nordisk)		1	1	1	1	1
바실루스 에스피. KSM-KP43 알카리 프로테아제 (실시예 7)		0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
말산나트륨			10		5
시트르산나트륨		15		10	4	8
황산나트륨		39	53	43	55	30

1) 아크릴산/말레인산 공중합체 ( BASF사제)

2) 탄소수 12∼14의 sec-알코올의 에틸렌옥사이드 7몰 및 프로필렌옥사이드 4.5몰 부가물

3, 4) 합성예는 일본국 특개평 6-179899호 공보에 기재

실시예 11

상기 세제 A(실시예 6 참조)에 하기 표 13 기재의 배합량으로 각종 효소를 첨가하고, 실시예 6과 동일하게 하여 셔츠의 컬러부분을 세정했다.

효소	본 발명품
효소	27	28	29	30	31	32	33
본 발명품 프로테아제¹⁾종래 프로테아제²⁾셀룰라제³⁾리파아제⁴	----	0.5---	0.50.6--	0.5-0.7-	0.5--0.5	0.50.60.7-	0.50.60.70.5

1) 실시예 2에서 얻어진 바실루스 에스피. KSM-KP43주 유래의 본 발명 프로테아제 정제표품에서 일본국 특개소 62-257990호 공보에 기재된 방법에 의해 조제한 조립물(6APU/g)

2) 일본국 특개평 5-25492호 공보에 기재된 프로테아제 K-16을 일본국 특개소 62-257990호 공보에 기재된 방법에 의해 5 APU/g로 한 것.

3) KAC-500 (셀룰라제, 500 U/g, Kao Corporation)

4) Lipolase 100T (Novo Nordisk)

본 발명의 알카리 프로테아제는 각종 계면 활성제에 극히 안정하며, 지방산 내성을 가지고, 또한, 산화제에도 높은 안정성을 가지므로, 표백제 성분을 함유하는 식기 세정기용 및 의복용 세정제용 효소로 유용하다.

도 1은 알카리 프로테아제 KP43의 pH 활성을 나타낸다.

도 2는 알카리 프로테아제 KP 43의 pH 안정성 (40℃, 30분)을 나타낸다.

도 3은 알카리 프로테아제 KP43의 pH 안정성(10℃, 24시간)을 보여준다.

도 4는 알카리 프로테아제 KP43의 온도에 대한 활성을 나타낸다.

도 5는 알카리 프로테아제 KP43의 내열성을 나타낸다.

도 6은 KP43 프로테아제의 산화제(50 mM 과산화수소)에 대한 안정성을 나타낸다.

도 7은 KP9860 프로테아제 및 그의 부분 분해물의 N말단배열을 나타낸다.

도 8은 KP9860 프로테아제의 N말단배열로부터 디자인한 프라이머 배열을 나타낸다.

도 9는 57 bp PCR 증폭 단편과 프라이머 디자인을 나타낸다.

<110> KAO CORPORATION <120> ALKALINE PROTEASE <130> M00P009 <150> JP 9-274570 <151> 1997-10-07 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 639 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg Xaa 20 25 30 Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa Gly 35 40 45 Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser 50 55 60 Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr Val 65 70 75 80 Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu 85 90 95 Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu Glu Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp 100 105 110 Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Xaa 115 120 125 Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu 130 135 140 Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Xaa 145 150 155 160 Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Asn Lys Glu Val 165 170 175 Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn Asp 180 185 190 Val Xaa Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val 195 200 205 Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu 210 215 220 Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr 225 230 235 240 Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr 245 250 255 Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly 260 265 270 His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr Asn 275 280 285 Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp 290 295 300 Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe 305 310 315 320 Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly 325 330 335 Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp 340 345 350 Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu 355 360 365 Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala 370 375 380 Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr 405 410 415 Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa Ile 420 425 430 Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn 435 440 445 His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro 450 455 460 Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn 465 470 475 480 Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala 485 490 495 Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp 500 505 510 Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu 515 520 525 Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr Ala 530 535 540 Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro 545 550 555 560 Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val 565 570 575 Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa Xaa 580 585 590 Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe 595 600 605 Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr 610 615 620 Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625 630 635 <210> 2 <211> 640 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Arg Xaa Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Xaa Asn Pro Ser Ala Gly Xaa Ala Arg 20 25 30 Xaa Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Xaa Xaa 35 40 45 Gly Phe Ser Lys Gln Xaa Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu 50 55 60 Ser Glu Asn Val Lys Leu Xaa Lys Gly Leu Xaa Lys Lys Leu Glu Thr 65 70 75 80 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Xaa Gln Phe Asn Gly Pro Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Xaa Leu Glu Xaa Thr Gly Ala Lys Ile Leu 100 105 110 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val 115 120 125 Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr 130 135 140 Leu Pro Xaa Tyr Xaa Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145 150 155 160 Xaa Leu Val Lys Ala Xaa Ala Leu Asp Thr Lys Gln Xaa Asn Lys Glu 165 170 175 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Xaa Ile Ala Gln Xaa Xaa Xaa Ser Asn 180 185 190 Asp Val Xaa Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp 195 200 205 Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly 210 215 220 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp 225 230 235 240 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn 260 265 270 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Xaa Thr 275 280 285 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met 290 295 300 Asp Ser Xaa Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu 305 310 315 320 Phe Ser Gln Ala Xaa Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp 325 330 335 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp 340 345 350 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn 355 360 365 Glu Xaa Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn 370 375 380 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro 405 410 415 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Xaa 420 425 430 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala 435 440 445 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr 450 455 460 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 465 470 475 480 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile 485 490 495 Ala Gly Ala Ala Asp Xaa Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly 500 505 510 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn 515 520 525 Glu Ser Ser Xaa Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Xaa Phe Thr 530 535 540 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 545 550 555 560 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu 565 570 575 Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Xaa Tyr Val Gly Asn Asp Phe Xaa 580 585 590 Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val 595 600 605 Phe Ile Asn Xaa Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala 610 615 620 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Xaa Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625 630 635 640 <210> 3 <211> 1920 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 3 atgagaaaga agaaggtgtt tttatctgtt ttatcagctg cagcgattct gtcgactgtt 60 gcattaaaca atccctcggc tggtgatgca aggacttttg atctggattt taaaggaatt 120 caaacaacaa ccgatgtcag tggtttctcc aaacagcgac aaacaggtgc ggctgcattt 180 ctggtggagt ctgaaaatgt gaaacttctt aaaggattgc taaagaaact tgaaacagta 240 ccggcaaata ataaactcca tattgtccaa ttcaatggcc ccattttaga agaaacaaaa 300 cagaagctag agacaactgg agcaaagatt ctcgactaca tccctgatta tgcatatatt 360 gtcgagtatg agggggatgt tcagtcaaaa gtccgctcca ttgaacacgt ggaatcagtg 420 gagccatact tgccgaaata caaaatagat ccccagcttt tcacaaaagg cgcatcgacg 480 ctggtgaaag cgttggcgct tgatacgaag cagaacaata aagaagtgca attaagaggc 540 atcgaggaaa tcgctcagta cgtagcaagc aatgacgtcc attatattac ggcaaagcct 600 gaatataagg tgatgaatga tgtggccaga ggtattgtca aagcggatgt ggcacagagc 660 agctacggtt tgtatggaca aggccagatt gtcgcagttg ccgatactgg attggataca 720 ggaagaaacg acagttcgat gcatgaagcc ttccgcggta aaataacagc actatatgca 780 ctgggtcgga cgaataatgc gaatgatacg aacggtcatg gtacccatgt ggcaggttcg 840 gtattaggaa atggcgcaac gaataaagga atggcacctc aagcgaatct ggtttttcaa 900 tccatcatgg atagcagtgg tgggcttgga ggcttgcctt ccaatctgca aaccttattc 960 agccaagcat tcagtgcagg tgccagaatt catacaaact cctggggggc agcggtgaat 1020 ggggcctaca cgacagattc cagaaatgtg gatgactatg taaggaaaaa tgatatgacg 1080 attcttttcg cggctgggaa tgaaaggccg aacggcggta ccatcagtgc acctggtacg 1140 gctaaaaacg ccataacagt cggcgcaacc gaaaacctgc gtccaagctt cggttcctat 1200 gcagataata ttaaccacgt tgcacagttc tcttcccgtg gcccgacaaa agatgggcga 1260 atcaagcctg atgtcatggc gccagggaca tacattttat cagcaagatc ttctcttgca 1320 cccgattcct ccttctgggc gaatcatgac agcaaatatg cctatatggg tggaacgtcc 1380 atggcaacac cgattgttgc ggggaatgtt gcacagctcc gtgagcattt tgtgaaaaat 1440 agaggaatca ctcctaagcc ttccctattg aaagcagctt tgattgcagg tgctgctgat 1500 gttggattgg gttatccgaa cggaaaccaa ggatggggcc gagtgaccct ggataaatcg 1560 ttgaacgttg cctatgtgaa cgaatccagt gccctatcaa ctagccaaaa agcgacatat 1620 acctttactg caacggcggg caagccattg aaaatctccc tggtatggtc ggatgcccct 1680 gcaagcacta ctgcttctgt aaccctggtc aatgatttgg atttggtcat tacagcacca 1740 aacggaacaa gatatgtcgg gaatgacttc tcagcaccat ttgacaataa ctgggatggc 1800 cgcaataacg tagaaaatgt atttattaat tcgccccaaa gtggaacata taccattgag 1860 gtgcaagcat ataatgtgcc ggttggacca caaaacttct cgttggcaat tgtgaactaa 1920 1920 <210> 4 <211> 639 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 Met Arg Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ser Thr Val Ala Leu Asn Asn Pro Ser Ala Gly Asp Ala Arg Thr 20 25 30 Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Val Ser Gly 35 40 45 Phe Ser Lys Gln Arg Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu Ser 50 55 60 Glu Asn Val Lys Leu Leu Lys Gly Leu Leu Lys Lys Leu Glu Thr Val 65 70 75 80 Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Val Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu 85 90 95 Glu Glu Thr Lys Glu Lys Leu Gln Thr Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp 100 105 110 Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Gln 115 120 125 Ser Lys Val Arg Ser Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu 130 135 140 Pro Lys Tyr Lys Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Thr 145 150 155 160 Leu Val Lys Ala Leu Ala Leu Asp Thr Lys Gln Asn Asn Lys Glu Val 165 170 175 Gln Leu Arg Gly Ile Glu Glu Ile Ala Gln Tyr Val Ala Ser Asn Asp 180 185 190 Val His Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val 195 200 205 Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu 210 215 220 Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr 225 230 235 240 Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr 245 250 255 Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly 260 265 270 His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ala Thr Asn 275 280 285 Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp 290 295 300 Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe 305 310 315 320 Ser Gln Ala Phe Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly 325 330 335 Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp 340 345 350 Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu 355 360 365 Arg Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala 370 375 380 Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr 405 410 415 Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Tyr Ile 420 425 430 Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn 435 440 445 His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro 450 455 460 Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn 465 470 475 480 Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala 485 490 495 Gly Ala Ala Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp 500 505 510 Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu 515 520 525 Ser Ser Ala Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Thr Phe Thr Ala 530 535 540 Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro 545 550 555 560 Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val 565 570 575 Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn Asp Phe Ser Ala 580 585 590 Pro Phe Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe 595 600 605 Ile Asn Ser Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr 610 615 620 Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625 630 635 <210> 5 <211> 1923 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 5 atgagaaaga agaaaaaggt gtttttatct gttttatcag ctgcagcgat tttgtcgact 60 gttgcgttaa gtaatccatc tgcaggtggt gcaaggaatt ttgatctgga tttcaaagga 120 attcagacaa caactgatgc taaaggtttc tccaagcagg ggcagactgg tgctgctgct 180 tttctggtgg aatctgaaaa tgtgaaactc ccaaaaggtt tgcagaagaa gcttgaaaca 240 gtcccggcaa ataataaact ccatattatc caattcaatg gaccaatttt agaagaaaca 300 aaacagcagc tggaaaaaac aggggcaaag attctcgact acatacctga ttatgcttac 360 attgtcgagt atgagggcga tgttaagtca gcaacaagca ccattgagca cgtggaatcc 420 gtggagcctt atttgccgat atacagaata gatccccagc ttttcacaaa aggggcatca 480 gagcttgtaa aagcagtggc gcttgataca aagcagaaaa ataaagaggt gcaattaaga 540 ggcatcgaac aaatcgcaca attcgcaata agcaatgatg tgctatatat tacggcaaag 600 cctgagtata aggtgatgaa tgatgttgcg cgtggaattg tcaaagcgga tgtggctcag 660 agcagctacg ggttgtatgg acaaggacag atcgtagcgg ttgccgatac agggcttgat 720 acaggtcgca atgacagttc gatgcatgaa gccttccgcg ggaaaattac tgcattatat 780 gcattgggac ggacgaataa tgccaatgat acgaatggtc atggtacgca tgtggctggc 840 tccgtattag gaaacggctc cactaataaa ggaatggcgc ctcaggcgaa tctagtcttc 900 caatctatca tggatagcgg tgggggactt ggaggactac cttcgaatct gcaaacctta 960 ttcagccaag catacagtgc tggtgccaga attcatacaa actcctgggg agcagcagtg 1020 aatggggctt acacaacaga ttccagaaat gtggatgact atgtgcgcaa aaatgatatg 1080 acgatccttt tcgctgccgg gaatgaagga ccgaacggcg gaaccatcag tgcaccaggc 1140 acagctaaaa atgcaataac agtcggagct acggaaaacc tccgcccaag ctttgggtct 1200 tatgcggaca atatcaacca tgtggcacag ttctcttcac gtggaccgac aaaggatgga 1260 cggatcaaac cggatgtcat ggcaccggga acgttcatac tatcagcaag atcttctctt 1320 gcaccggatt cctccttctg ggcgaaccat gacagtaaat atgcatacat gggtggaacg 1380 tccatggcta caccgatcgt tgctggaaac gtggcacagc ttcgtgagca ttttgtgaaa 1440 aacagaggca tcacaccaaa gccttctcta ttaaaagcgg cactgattgc cggtgcagct 1500 gacatcggcc ttggctaccc gaacggtaac caaggatggg gacgagtgac attggataaa 1560 tccctgaacg ttgcctatgt gaacgagtcc agttctctat ccaccagcca aaaagcgacg 1620 tactcgttta ctgctactgc cggcaagcct ttgaaaatct ccctggtatg gtctgatgcc 1680 cctgcgagca caactgcttc cgtaacgctt gtcaatgatc tggaccttgt cattaccgct 1740 ccaaatggca cacagtatgt aggaaatgac tttacttcgc catacaatga taactgggat 1800 ggccgcaata acgtagaaaa tgtatttatt aatgcaccac aaagcgggac gtatacaatt 1860 gaggtacagg cttataacgt accggttgga ccacagacct tctcgttggc aattgtgaat 1920 taa 1923 <210> 6 <211> 640 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 6 Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg 20 25 30 Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu 50 55 60 Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr 65 70 75 80 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu 100 105 110 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val 115 120 125 Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr 130 135 140 Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145 150 155 160 Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu 165 170 175 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn 180 185 190 Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp 195 200 205 Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly 210 215 220 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp 225 230 235 240 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn 260 265 270 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr 275 280 285 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met 290 295 300 Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu 305 310 315 320 Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp 325 330 335 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp 340 345 350 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn 355 360 365 Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn 370 375 380 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro 405 410 415 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Phe 420 425 430 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala 435 440 445 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr 450 455 460 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 465 470 475 480 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile 485 490 495 Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly 500 505 510 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn 515 520 525 Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr 530 535 540 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 545 550 555 560 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu 565 570 575 Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr 580 585 590 Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val 595 600 605 Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala 610 615 620 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 625 630 635 640 <210> 7 <211> 1923 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 7 atgagaaaga agaaaaaggt gtttttatct gttttatcag ctgcagcgat tttgtcgact 60 gttgcgttaa gtaatccatc tgcaggtggt gcaaggaatt ttgatctgga tttcaaagga 120 attcagacaa caactgatgc taaaggtttc tccaagcagg ggcagactgg tgctgctgct 180 tttctggtgg aatctgaaaa tgtgaaactc ccaaaaggtt tgcagaagaa gcttgaaaca 240 gtcccggcaa ataataaact ccatattatc caattcaatg gaccaatttt agaagaaaca 300 aaacagcagc tggaaaaaac aggggcaaag attctcgact acatacctga ttatgcttac 360 attgtcgagt atgagggcga tgttaagtca gcaacaagca ccattgagca cgtggaatcc 420 gtggagcctt atttgccgat atacagaata gatccccagc ttttcacaaa aggggcatca 480 gagcttgtaa aagcagtggc gcttgataca aagcagaaaa ataaagaggt gcaattaaga 540 ggcatcgaac aaatcgcaca attcgcaata agcaatgatg tgctatatat tacggcaaag 600 cctgagtata aggtgatgaa tgatgttgcg cgtggaattg tcaaagcgga tgtggctcag 660 agcagctacg ggttgtatgg acaaggacag atcgtagcgg ttgccgatac agggcttgat 720 acaggtcgca atgacagttc gatgcatgaa gccttccgcg ggaaaattac tgcattatat 780 gcattgggac ggacgaataa tgccaatgat acgaatggtc atggtacgca tgtggctggc 840 tccgtattag gaaacggctc cactaataaa ggaatggcgc ctcaggcgaa tctagtcttc 900 caatctatca tggatagcgg tgggggactt ggaggactac cttcgaatct gcaaacctta 960 ttcagccaag catacagtgc tggtgccaga attcatacaa actcctgggg agcagcagtg 1020 aatggggctt acacaacaga ttccagaaat gtggatgact atgtgcgcaa aaatgatatg 1080 acgatccttt tcgctgccgg gaatgaagga ccgaacggcg gaaccatcag tgcaccaggc 1140 acagctaaaa atgcaataac agtcggagct acggaaaacc tccgcccaag ctttgggtct 1200 tatgcggaca atatcaacca tgtggcacag ttctcttcac gtggaccgac aaaggatgga 1260 cggatcaaac cggatgtcat ggcaccggga acgttcatac tatcagcaag atcttctctt 1320 gcaccggatt cctccttctg ggcgaaccat gacagtaaat atgcatacat gggtggaacg 1380 tccatggcta caccgatcgt tgctggaaac gtggcacagc ttcgtgagca ttttgtgaaa 1440 aacagaggca tcacaccaaa gccttctcta ttaaaagcgg cactgattgc cggtgcagct 1500 gacatcggcc ttggctaccc gaacggtaac caaggatggg gacgagtgac attggataaa 1560 tccctgaacg ttgcctatgt gaacgagtcc agttctctat ccaccagcca aaaagcgacg 1620 tactcgttta ctgctactgc cggcaagcct ttgaaaatct ccctggtatg gtctgatgcc 1680 cctgcgagca caactgcttc cgtaacgctt gtcaatgatc tggaccttgt cattaccgct 1740 ccaaatggca cacagtatgt aggaaatgac tttacttcgc catacaatga taactgggat 1800 ggccgcaata acgtagaaaa tgtatttatt aatgcaccac aaagcgggac gtatacaatt 1860 gaagtacagg cttataacgt accggttgga ccacagaact tctcgttggc aattgtgaat 1920 taa 1923 <210> 8 <211> 656 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 8 Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg 20 25 30 Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu 50 55 60 Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr 65 70 75 80 Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu 100 105 110 Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val 115 120 125 Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr 130 135 140 Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser 145 150 155 160 Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu 165 170 175 Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn 180 185 190 Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp 195 200 205 Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly 210 215 220 Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp 225 230 235 240 Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn 260 265 270 Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr 275 280 285 Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met 290 295 300 Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu 305 310 315 320 Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp 325 330 335 Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp 340 345 350 Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn 355 360 365 Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn 370 375 380 Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn 385 390 395 400 Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser 405 410 415 Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro 420 425 430 Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Phe 435 440 445 Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala 450 455 460 Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr 465 470 475 480 Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys 485 490 495 Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile 500 505 510 Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly 515 520 525 Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn 530 535 540 Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr 545 550 555 560 Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala 565 570 575 Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu 580 585 590 Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr 595 600 605 Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val 610 615 620 Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala 625 630 635 640 Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Asn Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn 645 650 655

Claims

배열번호 1로 표시되는 아미노산 배열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 배열에 있어서, 하기 위치의 아미노산 또는 상당하는 아미노산이 하기에 표시된 것임을 특징으로 하는 알카리 프로테아제.

23위치는 Ser 또는 Asn이고,

29위치는 Gly 또는 Asp이고,

32위치는 Asn 또는 Thr이고,

46위치는 Ala 또는 Val이고,

47위치는 Lys 또는 Ser이고,

53위치는 Gly 또는 Arg이고,

71위치는 Pro 또는 Leu이고,

74위치는 Gln 또는 Leu이고,

89위치는 Ile 또는 Val이고,

102위치는 Gln 또는 Lys이고,

105위치는 Lys 또는 Thr이고,

128위치는 Lys 또는 Gln이고,

130위치는 Ala 또는 Lys이고,

131위치는 Thr 또는 Val이고,

132위치는 Ser 또는 Arg이고,

133위치는 Thr 또는 Ser이고,

146위치는 Ile 또는 Lys이고,

148위치는 Arg 또는 Lys이고,

160위치는 Glu 또는 Thr이고,

165위치는 Val 또는 Leu이고,

172위치는 Lys 또는 Asn이고,

183위치는 Gln 또는 Glu이고,

187위치는 Phe 또는 Tyr이고,

188위치는 Ala 또는 Val이고,

189위치는 Ile 또는 Ala이고,

194위치는 Leu 또는 His이고,

286위치는 Ser 또는 Ala이고,

306위치는 Gly 또는 Ser이고,

324위치는 Tyr 또는 Phe이고,

369위치는 Gly 또는 Arg이고,

431위치는 Phe 또는 Tyr이고,

501위치는 Ile 또는 Val이고,

531위치는 Ser 또는 Ala이고,

541위치는 Ser 또는 Thr이고,

584위치는 Gln 또는 Arg이고,

591위치는 Thr 또는 Ser이고,

593위치는 Ser 또는 Ala이고,

594위치는 Tyr 또는 Phe이고,

595위치는 Asn 또는 Asp이고,

596위치는 Asp 또는 Asn이고,

611위치는 Ala 또는 Ser이고,

632위치는 Thr 또는 Asn임.
배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열과 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 배열에 있어서, 하기 위치의 아미노산 또는 상당하는 아미노산이 하기에 표시된 것임을 특징으로 하는 알카리 프로테아제.

24위치는 Ser 또는 Asn이고,

30위치는 Gly 또는 Asp이고,

33위치는 Asn 또는 Thr이고,

47위치는 Ala 또는 Val이고,

48위치는 Lys 또는 Ser이고,

54위치는 Gly 또는 Arg이고,

72위치는 Pro 또는 Leu이고,

75위치는 Gln 또는 Leu이고,

90위치는 Ile 또는 Val이고,

103위치는 Gln 또는 Lys이고,

106위치는 Lys 또는 Thr이고,

129위치는 Lys 또는 Gln이고,

131위치는 Ala 또는 Lys이고,

132위치는 Thr 또는 Val이고,

133위치는 Ser 또는 Arg이고,

134위치는 Thr 또는 Ser이고,

147위치는 Ile 또는 Lys이고,

149위치는 Arg 또는 Lys이고,

161위치는 Glu 또는 Thr이고,

166위치는 Val 또는 Leu이고,

173위치는 Lys 또는 Asn이고,

184위치는 Gln 또는 Glu이고,

188위치는 Phe 또는 Tyr이고,

189위치는 Ala 또는 Val이고,

190위치는 Ile 또는 Ala이고,

195위치는 Leu 또는 His이고,

287위치는 Ser 또는 Ala이고,

307위치는 Gly 또는 Ser이고,

325위치는 Tyr 또는 Phe이고,

370위치는 Gly 또는 Arg이고,

432위치는 Phe 또는 Tyr이고,

502위치는 Ile 또는 Val이고,

532위치는 Ser 또는 Ala이고,

542위치는 Ser 또는 Thr이고,

585위치는 Gln 또는 Arg이고,

592위치는 Thr 또는 Ser이고,

594위치는 Ser 또는 Ala이고,

595위치는 Tyr 또는 Phe이고,

596위치는 Asn 또는 Asp이고,

597위치는 Asp 또는 Asn이고,

612위치는 Ala 또는 Ser이고,

633위치는 Thr 또는 Asn임.
청구항 1 또는 2 기재의 알카리 프로테아제를 코드하는 유전자.
청구항 1 또는 2 기재의 알카리 프로테아제를 생산하는 미생물.
청구항 1 또는 2 기재의 알카리 프로테아제를 함유하는 세정제.